ヒトiPSCベースの血液脳バリアチップの生成
Summary
血液脳関門(BBB)は、多細胞神経血管の単位は、密接に脳の恒常性を調節します。ヒトiPSCと臓器オンチップ技術を組み合わせることで、疾患モデリングやCNS薬物浸透性予測に適したパーソナライズされたBBBチップを生成しました。BBBチップの生成と動作に関する詳細なプロトコルについて説明します。
Abstract
血液脳関門(BBB)は、繊細な脳機能を破壊する可能性のある血液中枢神経系(CNS)を様々な要因から保護する神経血管ユニット(Nvus)によって形成される。したがって、BBBは、CNSへの治療薬の送達に対する主要な障害である。蓄積された証拠は、BBBが神経疾患の発症および進行において重要な役割を果たしていることを示唆している。したがって、健康と病気におけるBBBの役割を解明するだけでなく、CNS標的薬の浸透を予測できるBBBモデルが非常に必要とされています。
最近、臓器オンチップと誘導多能性幹細胞(iPSC)技術を組み合わせて、人間に完全にパーソナライズされたBBBチップを生成しました。この新しいプラットフォームは、ヒトBBBを横断する薬物および分子輸送の予測に適した細胞、分子、および生理学的特性を表示する。さらに、患者固有のBBBチップを用いて、神経疾患モデルを生成し、個別化された予測医療用途の可能性を実証しました。ここでは、iPSC由来のBBBチップを生成する方法を示す詳細なプロトコルを提供し、iPSC由来の脳微小血管内皮細胞(iBME)の分化から始まり、神経前駆細胞を含む混合神経培養を生み出す結果、分化されたニューロン、およびアストロサイト。また、制御された層流下でBBBチップを培養して臓器チップに細胞を播種する手順についても説明する。最後に、BBBチップ分析の詳細な説明は、薬剤および分子透過性を評価するための細胞内透過性アッセイ、ならびにチップ内の細胞タイプの組成を決定するための免疫細胞化学的方法を含む提供される。
Introduction
BBBは循環血液からCNSを分離する非常に選択的な障壁である。これは、潜在的に破壊的な物質、要因、および異種生物学から重要な脳機能を保護する一方で、脳の恒常性を維持するために必要な栄養素やその他の代謝産物の流入を可能にする1.BBBは、多細胞NVUであり、ペリサイト、アストロサイトエンドフィート、およびニューロンプロセスが脳微小血管内皮細胞(BMECs)と直接接触する。これらの相互作用により、BMEC は、密閉ジャンクション2、3でサポートされる特殊なバリア プロパティを形成できます。このバリアの形成は、分子の傍細胞通過を制限しますが、分子をCNSに積極的に輸送したり、血液1に戻すために偏光輸送体を含んでいます。これらのユニークなバリア特性により、BBBはバイオ医薬品の脳への送達に対する大きな障害となり、FDA承認低分子の5%未満がCNS4に到達できると推定される。
動物モデルはBBBの浸透およびBBB開発に関与する分子機構を研究するために広く使用されている5.動物モデルは、複雑な多細胞インビボ環境を忠実に表すが、BBBトランスポーターの発現および活性の違いならびに種間の基質特異性は、ヒトへの動物データの正確な外挿を妨げる場合が多い6。したがって、ヒトベースのモデルは、ヒトBBBを研究し、CNSを標的にするように設計された薬物の開発に使用するために重要である。この必要性は、医薬品開発分野における生物学的、ヒト特異的薬物の優位性の増加に伴ってさらに明らかになる。蓄積された証拠は、侵害されたBBBが脳腫瘍および神経疾患7、8、9を含む多くの重度のCNS障害に関連していることを示唆している。これらの疾患を忠実に反映するヒトモデルは、1)創薬の対象となり得る新しい経路を同定し、2)CNS浸透を予測し、前臨床試験における時間と資源を減少させ、臨床試験における失敗率を低下させる可能性がある。
インビトロモデルは、BMECとNVUの他の細胞との相互作用を研究し、将来のBBB透過性薬物10のスクリーンを実施するために広く実施されている。ヒトBBBの重要な側面を再現するには、インビトロモデルは生理学的に関連する特性(すなわち、低い細胞内透膜透過性および生理的に関連する内皮単層にわたる経内皮性電気抵抗[TEER])を示さなければならない。また、インビトロ系の分子プロファイルには、代表的な機能的輸送システムの発現が含まれなければならない。典型的には、インビトロモデルは、BBB特性を増強するために他のNVU細胞の組み合わせと半透過性膜上で共培養される内皮細胞で構成される11。このアプローチにより、バリア機能と分子透過性を簡単かつ比較的迅速に評価できます。このような細胞ベースのBBBモデルは、外科的切除または不死化BMEC線から単離された細胞を含む動物またはヒト細胞源で確立することができる。
近年、BMECsにヒト多能性細胞を分化するプロトコルが、インビトロヒトBBBモデル12、13の魅力的な供給源として導入された。人工多能性幹細胞(iPSC)由来BMECs(iBMECs)は、非常にスケーラブルであり、ヒトBBBの重要な形態学的および機能的特徴を実証し、患者の遺伝学を運ぶ。培養では、iBMECsは、タイトな接合マーカーを表現し、生体内のようなタイトなジャンクション複合体に表示する単層を形成する。これらの細胞はまた、BBBグルコーストランスポーター、グルコーストランスポーター1(GLUT1)を含むBBBマーカーを発現する。重要なことは、ヒトBMECの他の代替細胞源とは異なり、iBMECはvivo14で測定されたものと同じくらい高い値を持つバリア特性を獲得し、バソ辺膜軸に沿って偏光し、機能的な流出ポンプを発現する。さらに、様々な被験者のiPSCを用い、両方とも1)は、BBBの側面を個別化した医薬の方法で試験する機会を歓迎し、2)NVUの追加細胞タイプを生成するための柔軟な供給源を提供する。アイソジェニック細胞源からこれらの細胞を生成してパーソナライズされたBBBチップを作成することは、薬物応答の個人差間を理解するのにも役立ちます。
iBMEIcを皿の単層として、または半透水性トランスウェルインサートで使用すると、BBBモデリングのための強力なアプローチを表します。これらのシステムは、堅牢で再現性が高く、コスト効率が高い傾向があります。さらに、TEERや透透度などの機能解析は比較的簡単に行えます。しかし、2次元(2D)系では生体内組織の3D性を再現できず、血液や血液細胞の循環によって生じる生理的剪断力が欠如しています。これは、これらのモデルにおける血管内皮の能力を制限し、固有のBBB特性および機能を開発し維持する。
生きた細胞が並ぶマイクロエンジニアリングシステムは、オルガンオンチップと呼ばれる概念で様々な器官機能をモデル化するために実装されています。生体構造の多細胞構造、組織組織のインターフェース、物理化学的微小環境、血管灌流を再現することにより、これらのマイクロエンジニアリングプラットフォームは、組織および器官の機能性のレベルを生成する従来の2D培養システム。また、生体内組織や臓器のコンテキストで生きた細胞と同様の生化学的、遺伝的、代謝のプロファイルを高解像度、リアルタイムイメージング、および分析することができます。しかし、オルガン・オン・チップの特定の課題は、これらのマイクロエンジニアリングチップの設計、製造、および応用には、生物学的指向の学術ラボに通常欠けている専門的なエンジニアリング専門知識が必要です。
最近、iPSCとオルガンオンチップの技術を組み合わせて、パーソナライズされたBBBチップモデル15,16を生成しました。説明されている技術的な課題を克服するために、市販のChip-S1は、シンプルで堅牢な方法でチップのメンテナンスを自動化するように設計された、カルチャーモジュールと一緒に使用されます(Emulate Inc.)。BBBチップは、神経細胞と内皮細胞の相互作用を再現し、統合された金電極17を有するカスタムメイドのオルガンチップによって測定される生理学的に関連するTEER値を達成する。さらに、BBBチップは低い細胞透過性を示し、臓器レベルでの炎症の手掛かりに応答し、活性な流出ポンプを発現し、可溶性バイオマーカーおよびバイオ医薬品の予測輸送を示す。特に、いくつかの個体から生成されたBBBチップは、神経疾患15を有する健康な個人と患者との間の期待される機能的な違いを捉える。
以下に詳述するプロトコルは、動的流動条件下でヒトiPSCベースのBBBチップを生成するための信頼性、効率的、および再現性のある方法を記述しています。BBBチップで直接、またはサンプリング排水から実行できるアッセイおよびエンドポイント分析のタイプに関するガイダンスが提供されます。このように、このプロトコルは、人間関連モデルにおける生物学的および機能的特性および応答を評価するために適用できる技術のスペクトルを示す。
iPSCベースのBBBチップの簡単な説明は、ここに提供されています。ヒトiPSCは、最初に分化され、EZ球と呼ばれる神経前駆物質の自由浮遊凝集体として組織培養フラスコに伝播される。Chip-S116,18,19のトップチャンネルには、細胞が7日間にわたって分化して神経前駆細胞(iNPCs)、iAストロサイト、およびiニューロンの混合培養に分化するため、チップの「脳側」を形成する解化されたEZ球体が播種されます。ヒトiPSCは、組織培養プレート内でもiBMECsに分けられます。チップの底流路はiBMECsで播種され、内皮管を形成するように発達する「血液側」を形成する(図1)。上下のチャネルを分離する多孔性細胞外マトリックス(ECM)コーティング膜は、チャネルと2との間の細胞間相互作用の形成を可能にし、2)は、ユーザーが従来の光顕微鏡を使用していずれかのチャネルで透過性アッセイおよび画像細胞を実行することを可能にする。
Protocol
Representative Results
Discussion
NVUのオルガン・オンチップ技術とiPSC由来細胞の組み合わせは、ヒトBBBの正確なモデリングを約束しています。ここでは、最近公開されたiPSCベースのBBBチップ16のシンプルで堅牢なアプリケーションのための詳細なプロトコルを提供します。シードパラダイムの概要とタイミングを図 3に示します。BBB モデリングに適したバリア機能を得て維持するには…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
批判的な編集に対するソシャナ・スヴェンセン博士に感謝します。この研究は、イスラエル科学財団助成金1621/18、科学技術省(MOST)、イスラエル3-15647、カリフォルニア再生医療研究所助成金DISC1-08800、シャーマンファミリー財団、NIH-NINDS助成金1UG3NS105703、ALS協会助成金18-SI-389によって支援されました。AHはワレンバーグ財団(助成金番号2015.0178)によって資金提供されました。
Materials
| Accutase | EMD Millipore | SCR005 | Dissociation solution |
| B27 | Gibco | 12587010 | |
| Bfgf | Peprotech | 100-18B | |
| Chip-S1 | Emulate Inc | Chip-S1 | Organ-Chip |
| Collagen IV | Sigma | C5533 | |
| DAPI | Invitrogen | D3571 | |
| Dextran-FITC | Sigma | 46944 | |
| DMEM: F12 | Thermo Fisher Scientific | 31330038 | |
| Donkey serum | Sigma | D9663 | |
| Emulate Reagent 1 (ER-1) | Emulate Inc | ER-1 | |
| Emulate Reagent 2 (ER-2) | Emulate Inc | ER-2 | |
| Fibronectin | Sigma | F1141 | |
| Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) | Dako | Z0334 | |
| GLUT-1 | Invitrogen | MA5-11315 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050038 | Glutamine supplement |
| hBDNF | Peprotech | 450-02 | |
| KOSR | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | Basement membrane matrix |
| mTeSR1 | StemCell Technologies, Inc. | 85851 | |
| NEAA | Biological industries | 01-340-1B | |
| Nestin | Millipore | MAB353 | |
| NutriStem | Biological industries | 05-100-1A | Alternate media |
| PECAM-1 | Thermo Fisher Scientific | 10333 | |
| Platelet-poor plasma-derived bovine serum (PPP) | Biomedical Technologies | J64483AB | |
| Retinoic acid (RA) | Sigma | R2625 | |
| S100β | Abcam | ab6602 | |
| Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit | Millipore | SCGP00525 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| ZO-1 Monoclonal Antibody | Invitrogen | 33-9100 | |
| βIII-tubulin (Tuj1α) | Sigma | T8660 | |
| β-mercaptoethanol | Life Technologies | 31350010 |
References
- Pardridge, W. M. Blood-brain barrier endogenous transporters as therapeutic targets: a new model for small molecule CNS drug discovery. Expert Opinion on Therapeutic Targets. 19 (8), 1059-1072 (2015).
- Gastfriend, B. D., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Modeling the blood-brain barrier: beyond the endothelial cells. Current Opinion in Biomedical Engineering. 5, 6-12 (2018).
- Jamieson, J. J., Linville, R. M., Ding, Y. Y., Gerecht, S., Searson, P. C. Role of iPSC-derived pericytes on barrier function of iPSC-derived brain microvascular endothelial cells in 2D and 3D. Fluids and Barriers of the CNS. 16 (1), 15 (2019).
- El-Habashy, S. E., et al. Novel treatment strategies for brain tumors and metastases. Pharmaceutical Patent Analyst. 3 (3), 279-296 (2014).
- Lim, R. G., et al. Huntington’s disease iPSC-derived brain microvascular endothelial cells reveal WNT-mediated angiogenic and blood-brain barrier deficits. Cell Reports. 19 (7), 1365-1377 (2017).
- Dumitrescu, A. M., Liao, X. H., Weiss, R. E., Millen, K., Refetoff, S. Tissue-specific thyroid hormone deprivation and excess in monocarboxylate transporter (mct) 8-deficient mice. Endocrinology. 147 (9), 4036-4043 (2006).
- Spencer, J. I., Bell, J. S., DeLuca, G. C. Vascular pathology in multiple sclerosis: reframing pathogenesis around the blood-brain barrier. Journal of Neurology and Neurosurgical Psychiatry. 89 (1), 42-52 (2018).
- Yamazaki, Y., Kanekiyo, T. Blood-brain barrier dysfunction and the pathogenesis of Alzheimer’s disease. International Journal of Molecular Sciences. 18 (9), 1965 (2017).
- Ben-Zvi, A., et al. Mfsd2a is critical for the formation and function of the blood-brain barrier. Nature. 509 (7501), 507 (2014).
- Heng, M. Y., Detloff, P. J., Albin, R. L. Rodent genetic models of Huntington disease. Neurobiology of Disease. 32 (1), 1-9 (2008).
- Ho, R., et al. ALS disrupts spinal motor neuron maturation and aging pathways within gene co-expression networks. Nature Neuroscience. 19 (9), 1256 (2016).
- Griep, L. M., et al. BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomedical Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).
- Prabhakarpandian, B., et al. Synthetic tumor networks for screening drug delivery systems. Journal of controlled release. 201, 49-55 (2015).
- Delsing, L., et al. Barrier properties and transcriptome expression in human iPSC-derived models of the blood-brain barrier. Stem Cells. 36 (12), 1816-1827 (2018).
- Park, T. E., et al. Hypoxia-enhanced Blood-Brain Barrier Chip recapitulates human barrier function and shuttling of drugs and antibodies. Nature Communications. 10 (1), 2621 (2019).
- Vatine, G. D., et al. Human iPSC-Derived Blood-Brain Barrier Chips Enable Disease Modeling and Personalized Medicine Applications. Cell Stem Cell. 24 (6), 995-1005 (2019).
- Henry, O. Y. F., Villenave, R., Cronce, M. J., Leineweber, W. D., Benz, M. A., Ingber, D. E. Organs-on-chips with integrated electrodes for trans-epithelial electrical resistance (TEER) measurements of human epithelial barrier function. Lab on a Chip. 17 (13), 2264-2271 (2017).
- Sances, S., et al. Human iPSC-derived endothelial cells and microengineered organ chip enhance neuronal development. Stem Cell Reports. 10 (4), 1222-1236 (2018).
- Workman, M. J., et al. Enhanced utilization of induced pluripotent stem cell–derived human intestinal organoids using microengineered chips. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 669-677 (2018).
- Ebert, A. D., et al. EZ spheres: a stable and expandable culture system for the generation of pre-rosette multipotent stem cells from human ESCs and iPSCs. Stem Cell Research. 10 (3), 417-427 (2013).
- Shelley, B. C., Gowing, G., Svendsen, C. N. A cGMP-applicable expansion method for aggregates of human neural stem and progenitor cells derived from pluripotent stem cells or fetal brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (88), e51219 (2014).
- Vatine, G. D., et al. Modeling psychomotor retardation using iPSCs from MCT8-deficient patients indicates a prominent role for the blood-brain barrier. Cell Stem Cell. 20 (6), 831-843 (2017).
- Svendsen, C. N., et al. A new method for the rapid and long term growth of human neural precursor cells. Journal of Neuroscience Methods. 85 (2), 141-152 (1998).
- Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources. Scientific Reports. 4, 4160 (2014).
- Canfield, S. G., et al. An isogenic blood-brain barrier model comprising brain endothelial cells, astrocytes, and neurons derived from human induced pluripotent stem cells. Journal of Neurochemistry. 140 (6), 874-888 (2017).
- Jamieson, J. J., Gerecht, S. Chipping Away at Blood-Brain-Barrier Modeling. Cell stem cell. 24 (6), 831-832 (2019).
- Faal, T., et al. Induction of Mesoderm and Neural Crest-Derived Pericytes from Human Pluripotent Stem Cells to Study Blood-Brain Barrier Interactions. Stem Cell Reports. 12 (3), 451-460 (2019).
- Lippmann, E. S., et al. Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 30 (8), 783 (2012).
- Qian, T., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Science Advances. 3 (11), 1701679 (2017).
- Neal, E. H., et al. A Simplified, Fully Defined Differentiation Scheme for Producing Blood-Brain Barrier Endothelial Cells from Human iPSCs. Stem Cell Reports. 12 (6), 1380-1388 (2019).
- Wevers, N. R., et al. A perfused human blood-brain barrier on-a-chip for high-throughput assessment of barrier function and antibody transport. Fluids and Barriers of the CNS. 15 (1), 23 (2018).
- Huh, D., et al. Microfabrication of human organs-on-chips. Nature Protocols. 8 (11), 2135 (2013).
- Huh, D., Matthews, B. D., Mammoto, A., Montoya-Zavala, M., Hsin, H. Y., Ingber, D. E. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
