Kan-beyin bariyeri (BBB) sıkı beyin homeostazı düzenleyen bir çok hücreli nörovasküler birimdir. İnsan iPSC’leri ve çip üzerine organ teknolojilerini birleştirerek, hastalık modellemesi ve CNS ilaç penetrite tahminleri için uygun kişiselleştirilmiş bir BBB çipi ürettik. BBB çipinin üretimi ve işletimi için ayrıntılı bir protokol açıklanmıştır.
Kan beyin bariyeri (BBB) nörovasküler birimler tarafından oluşur (NUS) bu kalkan merkezi sinir sistemi (CNS) hassas beyin fonksiyonlarını bozabilir kanda bulunan bir dizi faktörden. Bu nedenle, BBB CNS terapötik teslim için önemli bir engeldir. Kanıt birikmesi BBB başlangıç ve nörolojik hastalıkların ilerlemesinde önemli bir rol oynadığını göstermektedir. Bu nedenle, CNS hedefli ilaçların penetrasyon tahmin yanı sıra sağlık ve hastalık BBB rolünü açıklığa kavuşturabilir bir BBB modeli için büyük bir ihtiyaç vardır.
Yakın zamanda, insanlar için tamamen kişiselleştirilmiş bir BBB çipi üretmek için çip üzerine organ ve indüklenen pluripotent kök hücre (iPSC) teknolojilerini birleştirdik. Bu yeni platform insan BBB genelinde ilaç ve molekül taşıma tahmin için uygun hücresel, moleküler ve fizyolojik özellikleri görüntüler. Ayrıca, hastaya özel BBB çipleri kullanarak, nörolojik hastalık modelleri oluşturduk ve kişiselleştirilmiş prediktif tıp uygulamaları için potansiyel gösterdi. Burada iPSC kaynaklı BBB yongalarının nasıl üretiliş gösterilmiş olduğunu gösteren ayrıntılı bir protokol, iPSC kaynaklı beyin mikrovasküler endotel hücrelerinin (iBT’ler) farklılaşmasıyla başlayan ve nöral atalar içeren karışık sinir kültürleriyle sonuçlanan, farklılaştırılmış nöronlar ve astrositler. Ayrıca, hücreleri organ çipine tohumlama ve BBB yongalarının kontrollü laminar akışı altında birliğe dönüştürme prosedürü de açıklanmıştır. Son olarak, ilaç ve molekül geçirgenliğinin değerlendirilmesi için parasellüler geçirgenlik tahlilleri ve çip içindeki hücre tiplerinin bileşimini belirlemek için immünositokimyasal yöntemler de dahil olmak üzere BBB çip analizlerinin ayrıntılı açıklamaları sağlanmaktadır.
BBB, CNS’yi dolaşan kandan ayıran son derece seçici bir bariyerdir. Aynı zamanda beyin homeostaz1 korumak için gerekli besin ve diğer metabolitlerin akını sağlarken potansiyel olarak yıkıcı maddeler, faktörler ve kksobiyotikler kritik beyin fonksiyonları korur1. BBB, perisitlerin, astrosit endfeet’in ve nöronal süreçlerin beyin mikrovasküler endotel hücrelerine (BMEC) doğrudan temas ettiği çok hücreli bir NVU’dur. Bu etkileşimler BMECs sıkı ve bağlı kavşaklar2,3tarafından desteklenen özel bariyer özellikleri oluşturmak için izin verir. Bu bariyerin oluşumu moleküllerin parasellüler geçişini sınırlar, ancak molekülleri cns’ye veya kageri taşımak için polarize taşıyıcılar içerir1. Bu benzersiz bariyer özellikleri nedeniyle, BBB beyne biyofarmasötik lerin teslimi için önemli bir engel oluşturmaktadır, ve fda onaylı küçük moleküllerin az% 5 CNS ulaşabilirsiniz tahmin edilmektedir4.
Hayvan modelleri yaygın BBB penetrance ve BBBgelişiminde yer moleküler mekanizmalar 5 çalışma için kullanılmıştır. Hayvan modelleri sadakatle in vivo ortamda karmaşık çok hücreli temsil ederken, ifade ve BBB taşıyıcıların aktivitesi farklılıkları yanı sıra türler arasında substrat özgüllüğü genellikle insanlar için hayvan verilerinin doğru ekstrapolasyon engel6. Bu nedenle, insan tabanlı modeller insan BBB çalışma ve CNS hedef tasarlanmış ilaçların geliştirilmesinde kullanılmak üzere önemlidir. Bu ihtiyaç, ilaç geliştirme alanında biyolojik, insana özgü ilaçların artan hakimiyeti ile daha da belirgin hale gelir. Kanıt birikmesi, tehlikeye bbb ciddi CNS bozuklukları bir dizi ile ilişkili olduğunu göstermektedir, beyin tümörleri ve nörolojik hastalıklar da dahil olmak üzere7,8,9. Bu hastalıkları sadakatle yansıtan insan modelleri hem 1) ilaç gelişimi için hedeflenebilir yeni yollar belirlemek ve 2) CNS penetrans tahmin, böylece klinik öncesi çalışmalarda zaman ve kaynakları azaltmak ve muhtemelen klinik çalışmalarda başarısızlık oranını azaltarak potansiyeline sahip.
In vitro modelleri yaygın BMECs ve NVU diğer hücreler arasındaki etkileşimleri incelemek ve prospektif BBB geçirgen ilaçlar için ekranları yürütmek için uygulanmıştır10. İnsan BBB’nin temel yönlerini yeniden oluşturmak için, in vitro modeller fizyolojik olarak ilgili özellikleri (örn. düşük parasellüler geçirgenlik ve fizyolojik olarak ilgili transendotelelektrik direnci [TEER] endotel monotabakası boyunca göstermelidir. Buna ek olarak, bir in vitro sistemin moleküler profili temsili fonksiyonel taşıma sistemlerinin ifadesini içermelidir. Tipik olarak, in vitro modeller bbb özelliklerini geliştirmek için diğer NVU hücrelerinin kombinasyonları ile yarı geçirimli bir membran üzerinde birlikte kültürlenen endotel hücrelerinden oluşur11. Bu yaklaşım bariyer işlevselliği ve molekül geçirgenliğinin basit ve nispeten hızlı bir şekilde değerlendirilmesini sağlar. Bu tür hücre bazlı BBB modelleri, cerrahi eksizyonlardan veya ölümsüzleştirilmiş BMEC hatlarından izole edilmiş hücreler de dahil olmak üzere hayvan veya insan hücre kaynakları ile kurulabilir.
Son zamanlarda, protokoller BMECs içine insan pluripotent hücreleri ayırt etmek için in vitro insan BBB modelleri için cazip bir kaynak olarak tanıtıldı12,13. İndüklenen pluripotent kök hücre (iPSC)kaynaklı BMECs (iBMECs) yüksek ölçeklenebilir, insan BBB önemli morfolojik ve fonksiyonel özellikleri göstermek, ve hastanın genetik taşır. Kültürde, iBMEC’ler sıkı bağlantı işaretlerini ifade eden ve vivo benzeri sıkı bağlantı komplekslerini görüntüleyen bir monolayer oluşturur. Bu hücreler ayrıca BBB glikoz taşıyıcısı, glikoz taşıyıcısı 1 (GLUT1) dahil olmak üzere BBB belirteçlerini ifade eder. Daha da önemlisi, ve insan BMECs için diğer alternatif hücre kaynaklarının aksine, iBMECs bu vivo ölçülen kadar yüksek değerlere sahip bariyer özellikleri elde14, bazolateral eksen boyunca polarize, ve fonksiyonel efflux pompalar ifade. Ayrıca, çeşitli konulardan gelen iPSC’lerin kullanımı 1) BBB’nin yönlerini kişiselleştirilmiş bir tıp tarzında test etme fırsatını memnuniyetle karşılar ve 2) NVU’nun ek hücre tipleri oluşturmak için esnek bir kaynak sağlar. Kişiselleştirilmiş BBB yongaları oluşturmak için izojenik bir hücre kaynağından bu hücreleri üreten de ilaç yanıtları, klinik çalışmalarda gözlenen tedaviye direnç veya uzlaşmalı yanıt için önemli bir neden dir bireysel farklılıkların anlaşılmasına yardımcı olacaktır.
iBMEC’lerin bir çanakta veya yarı geçirimli transwell eklentisinde monolayers olarak kullanılması BBB modellemeiçin güçlü bir yaklaşımı temsil eder. Bu sistemler sağlam, tekrarlanabilir ve uygun maliyetli olma eğilimindedir. Buna ek olarak, TEER ve geçirgenlik gibi fonksiyonel analizlerin gerçekleşmesi nispeten kolaydır. Ancak, iki boyutlu (2D) sistemler in vivo dokunun 3Boyutlu doğasını özetleyemedi ve kan ve kan hücrelerinin dolaşımı tarafından sağlanan fizyolojik kesme stres kuvvetlerinden yoksundur. Bu, bu modellerde vasküler endotel yeteneğini geliştirmek ve içsel BBB özellikleri ve fonksiyonları korumak için sınırlar.
Canlı hücreler tarafından sıralanmış mikro mühendislik sistemleri, organ-on-chips adı verilen bir kavram içinde çeşitli organ işlevlerini modellemek için uygulanmıştır. İnvivo benzeri çok hücreli mimari, doku-doku arayüzleri, fizikokimyasal mikroortamlar ve vasküler perfüzyonu yeniden oluşturarak, bu mikromühendislik platformları doku ve organ işlevselliği mümkün olmayan düzeylerde geleneksel 2D kültür sistemleri. Ayrıca in vivo doku ve organ bağlamında canlı hücrelere benzer biyokimyasal, genetik ve metabolik profillerin yüksek çözünürlüklü, gerçek zamanlı görüntüleme ve analizini sağlarlar. Ancak, organ-on-chip belirli bir sorun, tasarım, imalat ve bu mikromühendislik yongaları uygulama genellikle biyolojik odaklı akademik laboratuvarlarda eksik özel mühendislik uzmanlık gerektirir.
Biz son zamanlarda kişiselleştirilmiş bir BBB çip modeli oluşturmak için iPSC ve organ-on-chip teknolojileri kombine ettik15,16. Açıklanan teknolojik zorlukların üstesinden gelmek için, ticari olarak kullanılabilen Chip-S1, çiplerin bakımını basit ve sağlam bir şekilde otomatikleştirmek için tasarlanmış bir araç olan kültür modülüyle birlikte kullanılmaktadır (Öykünme A.Ş.). BBB çipi nöral ve endotel hücreleri arasındaki etkileşimleri yeniden oluşturur ve entegre altın elektrotlar17ile özel yapım organ yongaları ile ölçülen fizyolojik olarak ilgili TEER değerleri elde eder. Ayrıca, BBB çip düşük parasellüler geçirgenlik görüntüler, organ düzeyinde inflamatuar ipuçları yanıt, aktif efflux pompalar ifade, ve çözünür biyobelirteçleri ve biyofarmasötiklerin öngörülü taşıma sergiler. Özellikle, BBB yongaları birkaç kişiden oluşturulan sağlıklı bireyler ve nörolojik hastalıkları olan hastalar arasında beklenen fonksiyonel farklılıklar yakalar15.
Aşağıda açıklanan protokol, dinamik akış koşullarında insan iPSC tabanlı BBB yongalarının üretimi için güvenilir, verimli ve tekrarlanabilir bir yöntemi açıklamaktadır. Doğrudan BBB çipinde veya numune alma atıklarından yapilebilen tahlil ve uç nokta analizlerinin türünde rehberlik sağlanır. Böylece protokol, biyolojik ve fonksiyonel özelliklerin ve tepkilerin insanla ilgili bir modelde değerlendirilmesi için uygulanabilecek teknik lerin spektrumlarını göstermektedir.
burada iPSC tabanlı BBB çipin kısa bir açıklaması verilmiştir. İnsan iPSCs başlangıçta farklılaşmış ve nöral progenitors serbest yüzen agregalar olarak doku kültürü şişeleri yayılır, EZ-küreler denir. Chip-S116üst kanal,18,19, hücrelerin nöral ata hücreleri (iNPCs), iAstrocytes ve iNeurons karışık bir kültür içine 7 gün içinde ayırt olarak, çipin “beyin tarafı” oluşturan ayrıştırılmış EZ-küreler ile tohumlu olduğunu. İnsan iPSC’leri de doku kültürü plakalarında iBMEC’lere ayrılır. Çipin alt kanalı iBM’lerle tohumlanır ve endotel tüpü oluşturmak için gelişirken “kan tarafını” oluştururlar (Şekil 1). Üst ve alt kanalları ayıran gözenekli hücre dışı matriks (ECM) kaplı membran, kanallar ve 2 arasındaki hücre-hücre etkileşimlerinin oluşmasına izin verir) kullanıcının geleneksel Bir ışık mikroskobu kullanarak her iki kanalda da geçirgenlik tahlilleri ve görüntü hücrelerini çalıştırmasına olanak tanır.
NVU’daki organ-on-chip teknolojisi ve iPSC kaynaklı hücrelerin birleşimi, insan BBB’nin doğru bir şekilde modellemesi için umut vaat ediyor. Burada, son zamanlarda yayınlanan iPSC tabanlı BBB çip16basit ve sağlam uygulama için ayrıntılı bir protokol sağlar. Tohumlama paradigmasının genel bakışı ve zamanlaması Şekil 3’tegösterilmiştir. BBB modellemesi için uygun bariyer fonksiyonlarını elde etmek ve sürdürmek, homojen bir iBMEC monolayer ol…
The authors have nothing to disclose.
Dr. Soshana Svendsen’e eleştirel kurgu için teşekkür ederiz. Bu çalışma İsrail Bilim Vakfı hibe 1621/18, Bilim ve Teknoloji Bakanlığı (MOST), İsrail 3-15647, Kaliforniya Rejeneratif Tıp hibe ID DISC1-08800, Sherman Aile Vakfı, NIH-NINDS hibe 1UG3NS105703 ve ALS Derneği hibe 18-SI-389 tarafından desteklenmiştir. AH, Wallenberg Vakfı tarafından finanse edilmiştir (hibe numarası 2015.0178).
Accutase | EMD Millipore | SCR005 | Dissociation solution |
B27 | Gibco | 12587010 | |
Bfgf | Peprotech | 100-18B | |
Chip-S1 | Emulate Inc | Chip-S1 | Organ-Chip |
Collagen IV | Sigma | C5533 | |
DAPI | Invitrogen | D3571 | |
Dextran-FITC | Sigma | 46944 | |
DMEM: F12 | Thermo Fisher Scientific | 31330038 | |
Donkey serum | Sigma | D9663 | |
Emulate Reagent 1 (ER-1) | Emulate Inc | ER-1 | |
Emulate Reagent 2 (ER-2) | Emulate Inc | ER-2 | |
Fibronectin | Sigma | F1141 | |
Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) | Dako | Z0334 | |
GLUT-1 | Invitrogen | MA5-11315 | |
Glutamax | Life Technologies | 35050038 | Glutamine supplement |
hBDNF | Peprotech | 450-02 | |
KOSR | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | |
Laminin | Sigma | L2020 | |
Matrigel | Corning | 354234 | Basement membrane matrix |
mTeSR1 | StemCell Technologies, Inc. | 85851 | |
NEAA | Biological industries | 01-340-1B | |
Nestin | Millipore | MAB353 | |
NutriStem | Biological industries | 05-100-1A | Alternate media |
PECAM-1 | Thermo Fisher Scientific | 10333 | |
Platelet-poor plasma-derived bovine serum (PPP) | Biomedical Technologies | J64483AB | |
Retinoic acid (RA) | Sigma | R2625 | |
S100β | Abcam | ab6602 | |
Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit | Millipore | SCGP00525 | |
Triton X-100 | Sigma | X100 | |
ZO-1 Monoclonal Antibody | Invitrogen | 33-9100 | |
βIII-tubulin (Tuj1α) | Sigma | T8660 | |
β-mercaptoethanol | Life Technologies | 31350010 |