एक मानव आईपीएससी आधारित रक्त मस्तिष्क बाधा चिप की पीढ़ी
Summary
रक्त-मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) एक बहुकोशिकीय न्यूरोवैस्कुलर यूनिट है जो मस्तिष्क होमोस्टोसिस को कसकर विनियमित करती है। मानव आईपीएससी और ऑर्गन-ऑन-चिप प्रौद्योगिकियों के संयोजन से, हमने एक व्यक्तिगत बीबीबी चिप उत्पन्न की है, जो रोग मॉडलिंग और सीएनएस दवा पेनेट्रेबिलिटी भविष्यवाणियों के लिए उपयुक्त है। बीबीबी चिप के उत्पादन और संचालन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल वर्णित है।
Abstract
रक्त मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) न्यूरोवैस्कुलर इकाइयों (एनवीयू) द्वारा बनाई जाती है जो रक्त में पाए जाने वाले कारकों की एक श्रृंखला से केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) को ढालती है जो नाजुक मस्तिष्क कार्य को बाधित कर सकती है। जैसे, बीबीबी सीएनएस को चिकित्सीय चिकित्सा के वितरण में एक बड़ी बाधा है। साक्ष्य जमा करने से पता चलता है कि बीबीबी न्यूरोलॉजिकल रोगों की शुरुआत और प्रगति में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। इस प्रकार, एक बीबीबी मॉडल की जबरदस्त आवश्यकता है जो सीएनएस-लक्षित दवाओं के प्रवेश की भविष्यवाणी कर सकता है और साथ ही स्वास्थ्य और रोग में बीबीबी की भूमिका को स्पष्ट कर सकता है।
हमने हाल ही में अंग-ऑन-चिप और प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSC) प्रौद्योगिकियों को संयुक्त किया है ताकि मनुष्यों के लिए पूरी तरह से व्यक्तिगत बीबीबी चिप उत्पन्न की जा सके। यह उपन्यास मंच सेलुलर, आणविक और शारीरिक गुणों को प्रदर्शित करता है जो मानव बीबीबी में दवा और अणु परिवहन की भविष्यवाणी के लिए उपयुक्त हैं। इसके अलावा, रोगी-विशिष्ट बीबीबी चिप्स का उपयोग करके, हमने न्यूरोलॉजिकल रोग के मॉडल उत्पन्न किए हैं और व्यक्तिगत भविष्य कहनेवाला दवा अनुप्रयोगों की क्षमता का प्रदर्शन किया है। यहां प्रदान किया गया एक विस्तृत प्रोटोकॉल है जो आईपीएससी-व्युत्पन्न बीबीबी चिप्स उत्पन्न करने का प्रदर्शन करता है, जिसकी शुरुआत आईपीएससी-व्युत्पन्न मस्तिष्क माइक्रोवेस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं (iBMECs) के भेदभाव से होती है और जिसके परिणामस्वरूप तंत्रिका जनक होते हैं, विभेदित न्यूरॉन्स, और एस्ट्रोसाइट्स। इसके अलावा वर्णित अंग चिप में कोशिकाओं को सीडिंग और नियंत्रित लैमिनार प्रवाह के तहत बीबीबी चिप्स की संस्कृति के लिए एक प्रक्रिया है । अंत में, बीबीबी चिप विश्लेषणों का विस्तृत विवरण प्रदान किया जाता है, जिसमें चिप के भीतर कोशिका प्रकारों की संरचना का निर्धारण करने के लिए दवा और अणु पारगम्यता के साथ-साथ इम्यूनोसाइटो रासायनिक तरीकों का आकलन करने के लिए पैरासेलुलर पारगम्यता परख शामिल हैं ।
Introduction
बीबीबी एक अत्यधिक चयनात्मक बाधा है जो परिसंचारी रक्त से सीएनएस को अलग करती है। यह संभावित विघटनकारी पदार्थों, कारकों और ज़ेनोबायोटिक्स से महत्वपूर्ण मस्तिष्क कार्यों की रक्षा करता है, जबकि मस्तिष्क होमोस्टेसिस1को बनाए रखने के लिए आवश्यक पोषक तत्वों और अन्य मेटाबोलाइट्स की आमद की अनुमति देता है। बीबीबी एक बहुकोशिकीय एनवीयू है जिसमें पेरिसाइट्स, एस्ट्रोसाइट एंडफीट और न्यूरोनल प्रक्रियाएं सीधे मस्तिष्क माइक्रोवैस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं (बीएमईसी) से संपर्क करती हैं। ये बातचीत बीएमईईसी को विशेष बाधा गुण बनाने की अनुमति देती है जो तंग और अनुयायियोंजंक्शनों 2,3द्वारा समर्थित हैं । इस बाधा का गठन अणुओं के पैरासेलुलर मार्ग को सीमित करता है, लेकिन इसमें ध्रुवीकृत ट्रांसपोर्टर होते हैं जो सक्रिय रूप से अणुओं को सीएनएस में ले जाते हैं या रक्त1में वापस आते हैं। इन अद्वितीय बाधा गुणों के कारण, बीबीबी मस्तिष्क में बायोफार्मास्युटिकल्स के वितरण में एक बड़ी बाधा का गठन करता है, और यह अनुमान लगाया गया है कि एफडीए-अनुमोदित छोटे अणुओं में से 5% से भी कम सीएनएस4तक पहुंच सकते हैं।
बीबीबी तपस्या और बीबीबी विकास5में शामिल आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए पशु मॉडलों का व्यापक रूप से उपयोग किया गया है । जबकि पशु मॉडल ईमानदारी से वीवो पर्यावरण में जटिल बहुकोशिकीय का प्रतिनिधित्व करते हैं, बीबीबी ट्रांसपोर्टरों की अभिव्यक्ति और गतिविधि में अंतर के साथ-साथ प्रजातियों में विशिष्टता को प्रमाणित करता है, जो अक्सर मनुष्यों के लिए पशु डेटा के सटीक बहिष्करण को रोकते हैं6। इस प्रकार, मानव आधारित मॉडल मानव बीबीबी का अध्ययन करने और सीएनएस को लक्षित करने के लिए डिज़ाइन की गई दवाओं के विकास में उपयोग के लिए महत्वपूर्ण हैं। यह जरूरत दवा विकास के क्षेत्र में जैविक, मानव विशिष्ट दवाओं के बढ़ते प्रभुत्व के साथ और भी स्पष्ट हो जाता है । साक्ष्य जमा करने से पता चलता है कि एक समझौता बीबीबी ब्रेन ट्यूमर और न्यूरोलॉजिकल रोगों7,8,9सहित कई गंभीर सीएनएस विकारों से जुड़ा हुआ है । मानव मॉडल ईमानदारी से इन रोगों को दर्शाती है दोनों 1 करने की क्षमता है) उपन्यास रास्ते है कि दवा के विकास के लिए लक्षित किया जा सकता है और 2) सीएनएस तपस्या की भविष्यवाणी, इस प्रकार पूर्व नैदानिक अध्ययन में समय और संसाधनों को कम करने और संभवतः नैदानिक परीक्षणों में विफलता दर कम ।
इन विट्रो मॉडलों को व्यापक रूप से BMECs और एनवीयू की अन्य कोशिकाओं के बीच बातचीत का अध्ययन करने और संभावित BBB-permeable दवाओं10के लिए स्क्रीन आचरण करने के लिए लागू किया गया है । मानव बीबीबी के प्रमुख पहलुओं को फिर से बनाने के लिए, इन विट्रो मॉडलों को एंडोथेलियल मोनोलेयर में शारीरिक रूप से प्रासंगिक गुणों (यानी, कम पैरासेलुलर पारगम्यता और शारीरिक रूप से प्रासंगिक ट्रांसेंडोथेलियल इलेक्ट्रिकल रेजिस्टेंस [टीईईआर] प्रदर्शित करना चाहिए। इसके अलावा, इन विट्रो प्रणाली के आणविक प्रोफ़ाइल में प्रतिनिधि कार्यात्मक परिवहन प्रणालियों की अभिव्यक्ति शामिल होनी चाहिए। आमतौर पर, इन विट्रो मॉडल एंडोथेलियल कोशिकाओं से बने होते हैं जो बीबीबी गुणोंकोबढ़ाने के लिए अन्य एनवीयू कोशिकाओं के संयोजन के साथ एक अर्धनिर्मित झिल्ली पर सह-संस्कारी होते हैं। यह दृष्टिकोण बाधा कार्यक्षमता और अणु स्थायित्व के सरल और अपेक्षाकृत तेजी से मूल्यांकन की अनुमति देता है। इस तरह के सेल आधारित बीबीबी मॉडल पशु या मानव कोशिका स्रोतों के साथ स्थापित किया जा सकता है, जिसमें सर्जिकल उत्तेजनाओं या अमर बीएमईसी लाइनों से अलग कोशिकाएं शामिल हैं।
हाल ही में, बीएमईसी में मानव pluripotent कोशिकाओं में अंतर करने के प्रोटोकॉल इन विट्रो मानव बीबीबी मॉडल12,13के लिए एक आकर्षक स्रोत के रूप में पेश किए गए थे । प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSC)-व्युत्पन्न BMECs (iBMECs) अत्यधिक स्केलेबल हैं, मानव बीबीबी की महत्वपूर्ण रूपात्मक और कार्यात्मक विशेषताओं को प्रदर्शित करते हैं, और रोगी की आनुवंशिकी ले जाते हैं। संस्कृति में, iBMECs एक मोनोलेयर बनाते हैं जो तंग जंक्शन मार्कर को व्यक्त करता है और वीवो-जैसे तंग जंक्शन परिसरों में प्रदर्शित करता है। ये सेल बीबीबी ग्लूकोज ट्रांसपोर्टर, ग्लूकोज ट्रांसपोर्टर 1 (GLUT1) सहित बीबीबी मार्कर भी व्यक्त करते हैं । महत्वपूर्ण बात, और मानव बीएमईसी के लिए अन्य वैकल्पिक सेल स्रोतों के विपरीत, iBMECs वीवो14में मापा गया मूल्यों के साथ बाधा गुण प्राप्त करता है, बासोलेटरल धुरी के साथ ध्रुवीकरण करता है, और कार्यात्मक एफलक्स पंपों को व्यक्त करता है। इसके अलावा, विभिन्न विषयों से आईपीएससी का उपयोग दोनों 1) एक व्यक्तिगत दवा तरीके से बीबीबी के पहलुओं का परीक्षण करने के अवसर का स्वागत करता है और 2) एनवीयू के अतिरिक्त सेल प्रकार पैदा करने के लिए एक लचीला स्रोत प्रदान करता है। व्यक्तिगत बीबीबी चिप्स बनाने के लिए एक आइसोजेनिक सेल स्रोत से इन कोशिकाओं को उत्पन्न करना भी दवा प्रतिक्रियाओं में अंतर व्यक्तिगत मतभेदों को समझने में सहायता करेगा, जो नैदानिक अध्ययनों में देखे गए उपचार के प्रतिरोध या समझौता प्रतिक्रिया का एक प्रमुख कारण है।
एक डिश में मोनोलेयर के रूप में या अर्ध पारगम्य ट्रांसवेल डालने पर iBMECs का उपयोग बीबीबी मॉडलिंग के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है। ये प्रणालियां मजबूत, प्रजनन योग्य और लागत प्रभावी होती हैं। इसके अलावा, TEER और परगम्यता जैसे कार्यात्मक विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए अपेक्षाकृत सरल हैं। हालांकि, दो आयामी (2डी) सिस्टम वीवो ऊतक की 3 डी प्रकृति को फिर से तैयार करने में विफल रहते हैं, और उनके पास रक्त और रक्त कोशिकाओं को प्रसारित करके प्रदान की गई शारीरिक कतरनी तनाव बलों की कमी है। यह आंतरिक बीबीबी गुणों और कार्यों को विकसित करने और बनाए रखने के लिए इन मॉडलों में संवहनी एंडोथेलियम की क्षमता को सीमित करता है।
जीवित कोशिकाओं द्वारा लाइन में खड़ा माइक्रोइंजीनियरसिस्टम अंग-ऑन-चिप्स नामक अवधारणा में विभिन्न अंग कार्यक्षमताओं को मॉडल करने के लिए लागू किया गया है। वीवो-जैसे बहुकोशिकीय वास्तुकला, ऊतक-ऊतक इंटरफेस, भौतिकरासायनिक माइक्रोवातावरण, और संवहनी परफ्यूजन में पुन: निर्माण करके, ये माइक्रोइंजीनियरप्लेटफॉर्म ऊतक और अंग कार्यक्षमता के स्तर को उत्पन्न करते हैं जो संभव नहीं है पारंपरिक 2डी संस्कृति प्रणालियां। वे वीवो ऊतक और अंग संदर्भ में जीवित कोशिकाओं के समान उच्च संकल्प, वास्तविक समय इमेजिंग और जैव रासायनिक, आनुवंशिक और मेटाबोलिक प्रोफाइल के विश्लेषण को भी सक्षम करते हैं। हालांकि, अंग पर चिप की एक विशेष चुनौती यह है कि डिजाइन, निर्माण, और इन माइक्रोइंजीनियर चिप्स के आवेदन विशेष इंजीनियरिंग विशेषज्ञता है कि आम तौर पर जैविक रूप से उंमुख अकादमिक प्रयोगशालाओं में कमी है की आवश्यकता है ।
हमने हाल ही में आईपीएससी और ऑर्गन-ऑन-चिप प्रौद्योगिकियों को एक व्यक्तिगत बीबीबी चिप मॉडल15,16उत्पन्न करने के लिए संयुक्त किया है । वर्णित तकनीकी चुनौतियों को दूर करने के लिए, वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध चिप-S1 का उपयोग संस्कृति मॉड्यूल के साथ किया जाता है, जो चिप्स के रखरखाव को सरल और मजबूत तरीके से स्वचालित करने के लिए डिज़ाइन किया गया एक उपकरण (इंक का अनुकरण) करता है। बीबीबी चिप तंत्रिका और एंडोथेलियल कोशिकाओं के बीच बातचीत को फिर से बनाता है और शारीरिक रूप से प्रासंगिक TEER मूल्यों को प्राप्त करता है, जिसे एकीकृत सोने के इलेक्ट्रोड17के साथ कस्टम मेड ऑर्गन चिप्स द्वारा मापा जाता है। इसके अतिरिक्त, बीबीबी चिप कम पैरासेलुलर पारगम्यता प्रदर्शित करता है, अंग स्तर पर भड़काऊ संकेतों का जवाब देता है, सक्रिय प्रभावलों पंपों को व्यक्त करता है, और घुलनशील बायोमार्कर और बायोफार्मास्युटिकल्स के भविष्य कहनेवाला परिवहन को प्रदर्शित करता है। विशेष रूप से, कई व्यक्तियों से उत्पन्न बीबीबी चिप्स स्वस्थ व्यक्तियों और न्यूरोलॉजिकल रोगों के रोगियों के बीच अपेक्षित कार्यात्मक मतभेदों को कैप्चर करता है15।
नीचे दिए गए प्रोटोकॉल में गतिशील प्रवाह की स्थितियों के तहत मानव आईपीएससी आधारित बीबीबी चिप्स की पीढ़ी के लिए एक विश्वसनीय, कुशल और प्रजनन योग्य विधि का वर्णन किया गया है। मार्गदर्शन परख ों और एंडपॉइंट विश्लेषण ों के प्रकार पर प्रदान किया जाता है जो सीधे बीबीबी चिप में या नमूना प्रवाह से किया जा सकता है। इस प्रकार, प्रोटोकॉल तकनीकों के स्पेक्ट्रम को दर्शाता है जिसे मानव-प्रासंगिक मॉडल में जैविक और कार्यात्मक गुणों और प्रतिक्रियाओं के मूल्यांकन के लिए लागू किया जा सकता है।
यहां आईपीएससी स्थित बीबीबी चिप का संक्षिप्त विवरण दिया गया है। मानव आईपीएससी शुरू में अंतर और तंत्रिका जनक ों के मुक्त फ्लोटिंग समुचने के रूप में ऊतक संस्कृति फ्लास्क में प्रचारित कर रहे हैं, ईज़ी क्षेत्रों कहा जाता है । चिप-S116,18,19 के शीर्ष चैनल को अलग-अलग ईज़ी-क्षेत्रों से वरीयता प्राप्त है जो चिप के “मस्तिष्क पक्ष” बनाते हैं, क्योंकि कोशिकाएं 7 दिनों में तंत्रिका जनक कोशिकाओं (आईएनपीसी), iAstrocytes और iAstros की मिश्रित संस्कृति में अंतर करती हैं। मानव आईपीएससी भी ऊतक संस्कृति प्लेटों में iBMECs में अंतर कर रहे हैं । चिप के नीचे चैनल iBMECs के साथ वरीयता प्राप्त करने के लिए “रक्त की ओर” के रूप में वे एक एंडोथेलियल ट्यूब(चित्रा 1)बनाने के लिए विकसित है । असुरक्षित बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) – लेपित झिल्ली जो ऊपर और नीचे चैनलों को अलग करती है 1) चैनलों और 2 के बीच सेल-टू-सेल इंटरैक्शन के गठन की अनुमति देती है) उपयोगकर्ता को पारंपरिक प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग करके या तो चैनल में पर्मायिबिलिटी परख और छवि कोशिकाओं को चलाने की अनुमति देती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
एनवीयू में ऑर्गन-ऑन-चिप तकनीक और आईपीएससी-व्युत्पन्न कोशिकाओं का संयोजन मानव बीबीबी की सटीक मॉडलिंग के लिए वादा करता है। यहां, हम हाल ही में प्रकाशित iPSC आधारित BBB चिप16के सरल और मजबूत आवेदन के लि?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम डॉ सोशना स्वेंडसेन को क्रिटिकल एडिटिंग के लिए धन्यवाद देना चाहेंगे । इस काम को इजराइल साइंस फाउंडेशन ग्रांट 1621/18, मिनिस्ट्री ऑफ साइंस एंड टेक्नोलॉजी (मोस्ट), इजराइल 3-15647, कैलिफोर्निया इंस्टीट्यूट फॉर रिजेनरेटिव मेडिसिन ग्रांट आईडी डिस्क1-08800, शेरमेन फैमिली फाउंडेशन, एनआईएच-निंडीएस ग्रांट 1UG3NS105703 और एएलएस ग्रांट एसोसिएशन 18-एसआई-389 ने सपोर्ट किया। एएच को वॉलनबर्ग फाउंडेशन (ग्रांट नंबर 2015.0178) द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
Materials
| Accutase | EMD Millipore | SCR005 | Dissociation solution |
| B27 | Gibco | 12587010 | |
| Bfgf | Peprotech | 100-18B | |
| Chip-S1 | Emulate Inc | Chip-S1 | Organ-Chip |
| Collagen IV | Sigma | C5533 | |
| DAPI | Invitrogen | D3571 | |
| Dextran-FITC | Sigma | 46944 | |
| DMEM: F12 | Thermo Fisher Scientific | 31330038 | |
| Donkey serum | Sigma | D9663 | |
| Emulate Reagent 1 (ER-1) | Emulate Inc | ER-1 | |
| Emulate Reagent 2 (ER-2) | Emulate Inc | ER-2 | |
| Fibronectin | Sigma | F1141 | |
| Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) | Dako | Z0334 | |
| GLUT-1 | Invitrogen | MA5-11315 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050038 | Glutamine supplement |
| hBDNF | Peprotech | 450-02 | |
| KOSR | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | Basement membrane matrix |
| mTeSR1 | StemCell Technologies, Inc. | 85851 | |
| NEAA | Biological industries | 01-340-1B | |
| Nestin | Millipore | MAB353 | |
| NutriStem | Biological industries | 05-100-1A | Alternate media |
| PECAM-1 | Thermo Fisher Scientific | 10333 | |
| Platelet-poor plasma-derived bovine serum (PPP) | Biomedical Technologies | J64483AB | |
| Retinoic acid (RA) | Sigma | R2625 | |
| S100β | Abcam | ab6602 | |
| Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit | Millipore | SCGP00525 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| ZO-1 Monoclonal Antibody | Invitrogen | 33-9100 | |
| βIII-tubulin (Tuj1α) | Sigma | T8660 | |
| β-mercaptoethanol | Life Technologies | 31350010 |
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