Summary
Blod - hjärnbarriären (BBB) är en multicellulär neurovaskulär enhet som i tät en tid reglerar hjärnans homeostas. Genom att kombinera humana iPSCs och organ-on-chip-teknik har vi genererat ett personligt BBB-chip, lämpligt för sjukdomsmodellering och CNS-läkemedelspenetrability förutsägelser. Ett detaljerat protokoll beskrivs för generering och drift av BBB-chippet.
Abstract
Blodhjärnbarriären (BBB) bildas av neurovaskulära enheter (NVUs) som skyddar det centrala nervsystemet (CNS) från en rad faktorer som finns i blodet som kan störa känslig hjärnfunktion. BBB är därför ett stort hinder för leverans av therapeutics till CNS. Ackumulerande bevis tyder på att BBB spelar en nyckelroll i uppkomsten och utvecklingen av neurologiska sjukdomar. Således finns det ett enormt behov av en BBB modell som kan förutsäga penetration av CNS-riktade läkemedel samt belysa BBB: s roll i hälsa och sjukdom.
Vi har nyligen kombinerat organ-on-chip och inducerad pluripotent stamcellsteknik (iPSC) för att generera ett BBB-chip helt personligt för människor. Denna nya plattform visar cellulära, molekylära och fysiologiska egenskaper som är lämpliga för förutsägelse av läkemedels- och molekyltransporter över den mänskliga BBB. Dessutom, med hjälp av patientspecifika BBB-chips, har vi genererat modeller av neurologisksjukdom och visat potentialen för personliga prediktiva läkemedel applikationer. Förutsatt här är ett detaljerat protokoll som visar hur man genererar iPSC-härledda BBB-chips, som börjar med differentiering av iPSC-härledda hjärnan mikrovaskulära endotelceller (iBMECs) och resulterar i blandade neurala kulturer som innehåller neurala progenitorer, differentierade nervceller och astrocyter. Också beskrivs är ett förfarande för sådd celler i organchip et och odling av BBB-flisunder kontrollerade laminarflöde. Slutligen ges detaljerade beskrivningar av BBB-spånanalyser, inklusive paracellulära permeabilitetsanalyser för bedömning av läkemedels- och molekylpermeabilitet samt immunocytokemiska metoder för att bestämma sammansättningen av celltyper inom chippet.
Introduction
BBB är en mycket selektiv barriär som skiljer CNS från det cirkulerande blodet. Det skyddar kritiska hjärnfunktioner från potentiellt störande ämnen, faktorer och xenobiotika samtidigt som tillströmningen av näringsämnen och andra metaboliter som krävs för att upprätthålla hjärnan homeostas1. BBB är en multicellulära NVU där pericyter, astrocyter endfeet och neuronala processer direkt kontakt hjärnan mikrovaskulära endotelceller (BMECs). Dessa interaktioner gör det möjligt för BMECs att bilda specialiserade barriäregenskaper som stöds av snäva och vidhäftningar korsningar2,3. Bildandet av denna barriär begränsar den paracellulära passagen av molekyler, men den innehåller polariserade transportörer för att aktivt transportera molekyler till CNS eller tillbaka in i blodet1. På grund av dessa unika barriäregenskaper utgör BBB ett stort hinder för leverans av biofarmaceutiska läkemedel i hjärnan, och det uppskattas att mindre än 5% av FDA-godkända små molekyler kan nå CNS4.
Djurmodeller har använts i stor utsträckning för att studera BBB penetrance och de molekylära mekanismer som deltar i BBB utveckling5. Medan djurmodeller troget representerar den komplexa multicellulära in vivo-miljön, utesluter skillnader i uttryck och aktivitet av BBB-transportörer samt substratspecificitet mellan arter ofta korrekt extrapolering av djurdata till människor6. Således är människobaserade modeller avgörande för att studera den mänskliga BBB och för användning i utvecklingen av läkemedel som syftar till att rikta CNS. Detta behov blir ännu tydligare med den ökande dominansen av biologiska, människospecifika läkemedel på läkemedelsutvecklingsområdet. Ackumulerande bevis tyder på att en komprometterad BBB är associerad med ett antal allvarliga CNS störningar, inklusive hjärntumörer och neurologiska sjukdomar7,8,9. Mänskliga modeller återspeglar troget dessa sjukdomar har potential att både 1) identifiera nya vägar som kan riktas mot läkemedelsutveckling och 2) förutsäga CNS penetrance, vilket minskar tid och resurser i prekliniska studier och eventuellt minska felfrekvensen i kliniska prövningar.
In vitro-modeller har genomförts i stor utsträckning för att studera interaktioner mellan BMECs och andra celler i NVU och genomföra skärmar för potentiella BBB-genomsläppliga läkemedel10. För att återskapa viktiga aspekter av den mänskliga BBB måste in vitro-modeller visa fysiologiskt relevanta egenskaper (dvs. låg paracellulära permeabilitet och fysiologiskt relevant transendotelelektriskresistens [TEER] över endotelmonolayer). Dessutom måste den molekylära profilen för ett in vitro-system innehålla uttryck för representativa funktionella transportsystem. Typiskt, in vitro modeller består av endotelceller som är samodlade på ett semipermeable membran med kombinationer av andra NVU celler för att förbättra BBB egenskaper11. Detta tillvägagångssätt möjliggör enkel och relativt snabb bedömning av barriärfunktionalitet och molekylpermeabilitet. Sådana cellbaserade BBB-modeller kan upprättas med djur- eller mänskliga cellkällor, inklusive celler som isolerats från kirurgiska excisions eller förevigade BMEC-linjer.
Nyligen infördes protokoll för att differentiera mänskliga pluripotenta celler i BMECs som en attraktiv källa för in vitro mänskliga BBB modeller12,13. Inducerad pluripotent stamcells (iPSC)-härledda BMECs (iBMECs) är mycket skalbara, visar avgörande morfologiska och funktionella egenskaper hos den mänskliga BBB, och bär genetik en patient. I kulturen bildar iBMECs ett monolayer som uttrycker snäva kopplingsmarkörer och visar in vivo-liknande snäva kopplingskomplex. Dessa celler uttrycker också BBB-markörer, inklusive BBB glukostransportör, glukostransportör 1 (GLUT1). Viktigt, och till skillnad från andra alternativa cellkällor för mänskliga BMECs, iBMECs förvärva barriäregenskaper med värden så högt som de mätt in vivo14, polarisera längs basolateral axeln, och uttrycka funktionella efflux pumpar. Dessutom välkomnar användningen av iSP:er från olika ämnen båda 1) möjligheten att testa aspekter av BBB på ett personligt medicinsätt och 2) en flexibel källa för att generera ytterligare celltyper av NVU. Generera dessa celler från en isogenic cell källa för att skapa personliga BBB-chips skulle också bidra till att förstå mellan individuella skillnader i läkemedelssvar, vilket är en viktig orsak till resistens eller äventyras svar på behandling som observerats i kliniska studier.
Användning av iBMECs som monolayers i en maträtt eller på en halv permeable transwell infoga representerar en kraftfull metod för BBB modellering. Dessa system tenderar att vara robusta, reproducerbara och kostnadseffektiva. Dessutom är funktionella analyser som TEER och permeabilitet relativt enkla att utföra. Emellertid, tvådimensionella (2D) system misslyckas med att sammanfatta 3D-karaktären av in vivo vävnad, och de saknar fysiologiska skjuvning stresskrafter som cirkulerar blod och blodkroppar. Detta begränsar kärlens förmåga att utveckla och underhålla inneboende BBB-egenskaper och funktioner.
Mikrokonstruerade system kantade av levande celler har implementerats för att modellera olika organfunktioner i ett koncept som kallas organ-on-chips. Genom att återskapa in vivo-liknande multicellulär arkitektur, vävnadsvävnadsgränssnitt, fysicokemiska mikromiljöer och vaskulär perfusion, genererar dessa mikrokonstruerade plattformar nivåer av vävnads- och organfunktionalitet som inte är möjlig med konventionella 2D-kultursystem. De möjliggör också högupplöst, realtidsavbildning och analys av biokemiska, genetiska och metaboliska profiler som liknar levande celler i in vivovävnad och organsammanhang. Men en särskild utmaning av organ-on-chip är att design, tillverkning och tillämpning av dessa mikrokonstruerade chips kräver specialiserad teknisk expertis som vanligtvis saknas i biologiskt orienterade akademiska laboratorier.
Vi har nyligen kombinerat iPSC och organ-on-chip-teknik för att generera en personlig BBB chip modell15,16. För att övervinna de tekniska utmaningar som beskrivs används det kommersiellt tillgängliga Chip-S1 tillsammans med kulturmodulen, ett instrument som är utformat för att automatisera underhållet av chipsen på ett enkelt och robust sätt (Emulate Inc.). BBB-chippet återskapar interaktioner mellan neurala och endotelceller och uppnår fysiologiskt relevanta TEER-värden, som mäts av skräddarsydda organchips med integrerade guldelektroder17. Dessutom visar BBB-chipet låg paracellulära permeabilitet, svarar på inflammatoriska signaler på organnivå, uttrycker aktiva effluxpumpar och uppvisar prediktiva transporter av lösliga biomarkörer och biofarmaceutiska läkemedel. Noterbart är att BBB-chips som genereras från flera individer fångar de förväntade funktionella skillnaderna mellan friska individer och patienter med neurologiska sjukdomar15.
I protokollet nedan beskrivs en tillförlitlig, effektiv och reproducerbar metod för generering av mänskliga iPSC-baserade BBB-chips under dynamiska flödesförhållanden. Vägledning ges om vilken typ av analyser och slutpunktsanalyser som kan utföras direkt i BBB-chippet eller från provtagningsspillvatten. Således visar protokollet spektrumet av tekniker som kan tillämpas för att utvärdera biologiska och funktionella egenskaper och svar i en människa-relevant modell.
Här finns en kort beskrivning av det iPSC-baserade BBB-chippet. Mänskliga iPSCs differentieras ursprungligen och förökas i vävnadsodlingsflaskor som fritt flytande aggregat av neurala progenitorer, kallade EZ-sfärer. Den övre kanalen i Chip-S116,18,19 är sådd med separerade EZ-sfärer som bildar "hjärnan sidan" av chip, som celler skiljer över 7 dagar i en blandad kultur av neurala stamceller (iNPCs), iAstrocyter och iNeurons. Mänskliga iPSCs är också differentierade i vävnadsodlingplattor i iBMECs. Den nedre kanalen av chipet är seedade med iBMECs att bilda "blodsidan" som de utvecklas för att bilda en endotelrör(figur 1). Den porösa extracellulära matrisen (ECM)-belagda membran som separerar de övre och nedre kanalerna 1) tillåter bildandet av cell-till-cell interaktioner mellan kanaler och 2) gör det möjligt för användaren att köra permeabilitet analyser och bildceller i båda kanalerna med hjälp av ett konventionellt ljusmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Generering av iPSC-härledda neurala stamceller (iNPCs)
- Producera EZ-sfärer från iPSC kolonier som beskrivs nedan och som tidigarepublicerats 20,21,22.
- Kultur iPSC kolonier till sammanflödet på källaren membran matrix-belagda 6 brunn plattor (0,5 mg/tallrik) i mTESR1 eller andra kommersiella medier (se Materialtabell).
- Ta bort iPSC medium och byt ut med 2 ml EZ-sfärmedium [ESM; DMEM:F12 7:3 kompletterad med 100 ng/ml grundläggande fibroblast tillväxtfaktor (bFGF), 100 ng/mL epidermal tillväxtfaktor, 5 μg/mL heparin, och 2% B27 tillägg].
- Skrapa botten av varje konfluenta väl med baksidan av en steril 1000 μL pipett spets eller cell skrapa.
- Samla alla celler och placera i en extremt låg fastsättning T25-kolv för att möjliggöra spontan bildning av fritt flytande sfärer. Inkubera över natten vid 37 °C.
- Mata sfärerna var 2–3:e dag när mediet blir gult genom att ersätta hälften av mediet med färska ESM. Detta gör det möjligt för sfärer att förbli i konditionerat medium, vilket är mycket viktigt för deras tillväxt och underhåll.
- Luta kolven på ett rörställ och låt sfärerna bosätta sig med gravitationen i 1–2 min ner till kolvens hörn.
- När bosatte sig, aspirera hälften av supernatant med en 5 ml eller 10 ml serologiska pipett och ersätta med färska, förvärmda ESM.
- Passage EZ-sfärer varje vecka genom att hugga sfärer till 200 μm diametrar som tidigare beskrivits23,20,21. EZ-sfärer kan upprätthållas i upp till 25 passager och är idealiska när de används mellan passager 8-25.
- Förbered en cellfjädring av iNPCs:
- För att inducera neural differentiering, separera EZ-sfär i enstaka celler.
- Samla sfärer 3–4 dagar efter huggning från en T75-kolv och överför till en konisk 15 ml, låt den stå i 2 min eller tills alla sfärer har slagits i botten.
- Ta långsamt bort ESM med en 5 ml pipett e utan att störa de fasta sfärerna. Tillsätt 1 ml dissociationslösning (se Materialbord)och inkubera i 10 min vid 37 °C.
- Snurra dissociationslösningen och sfärerna efter 5 minuters inkubation för att säkerställa att alla fasta sfärer behandlas.
- Ta långsamt bort dissociationslösningen. Lägg till 1 ml neural differentieringsmedium [NDM; DMEM: F12 med 2% B27 minus vitamin A, 1% N2 tillägg, och mänskliga hjärnan-härledda neurotrofisk faktor (hBDNF, 20 ng/mL)].
- Triturate sfärerna i enstaka celler genom pipettning med hjälp av en 1 mL pipett följt av 200 μL pipett, tills alla sfärer har separerat. Undvik bubblabildning under triturationsproceduren.
- Räkna separerade celler med hjälp av en hemocytometer och späda celler till en slutlig densitet på 1 x 106 celler/ml. Det är möjligt att ändra densiteten beroende på ansökan.
OBS: Högre densiteter (upp till 6 x 106 celler/ml) rekommenderas för kortsiktiga kulturer på upp till 3 dagar, och lägre densiteter rekommenderas för långsiktiga tillämpningar på upp till 3 veckor.
OBS: Cellerna är nu redo att utsäde i den övre kanalen av chipet för att bilda "hjärnan sidan".
2. Differentiering av iSP-kort till iBMECs
- Passage iPSCs från en enda konfluentbrunn av en 6 brunn tallrik på en 1:6 förhållande i en 6 brunn källare membran matrix-belagda plattan. Låt cellerna följa för 24 h. Ändra iPSC medium dagligen.
- Räkna celler dagligen med hjälp av en hemocytometer.
- När celler når en densitet på 1,5–3,0 x 105 celler/brunn, ersätt iPSC-medium med 3 ml okonditionerat medium utan bFGF [DMEM:F12 1:1, med 10% knockout serumersättning (KOSR), 1% icke-essentiella aminosyror (NEAA), 0,5% glutamintillägg (Table of Materials)och 100 μM β-mercaptoetanol]. Byt ut medium dagligen i 6 dagar24.
- Dag 6, byt ut medium med endotelcell (EG) medium [humant endotelserumfritt medium (hESFM) kompletterat med 1% trombocytfattigplasma-härlett bovinserum, 20 ng/mL bFGF och 10 μM all-trans retinosyra (RA)]. Lämna medium i 2 dagar.
- Ta bort EG medium och tillsätt 1 ml dissociationlösning per brunn. Inkubera vid 37 °C i 35 min.
OBS: Även om detta anses vara en lång inkubationstid i dissociationslösningen som används här, kan iBMECs uthärda denna behandling med celllivskraft som är högre än 90%. - Lossa cellerna från brunnen genom att försiktigt pipetting cellen suspension och samla alla celler i en 15 ml konisk tjusning.
OBS: Undvik hårda rörledningar. Om cellerna inte lossnar lätt, inkubera i ytterligare 5 min. - Tillsätt 1 volym EG-medium i 15 ml konisk för att inaktivera Accutase, centrifugera vid 200 x g i 5 min, ta bort medium och byt ut med 1 ml EG-medium (utan bFGF och RA).
- Räkna celler med hjälp av en hemocytometer och justera celldensiteten till 14–20 x 106 celler/ml.
OBS: Cellerna är nu redo att sås in i den nedre kanalen av chipet för att bilda "blodsidan".
3. Mikrotillverkning av orgelchipet
- Använd ett organ chip för BBB chip modellen och dess produktion som gjorts tidigare16,18,19. Det höga kanalorganet (se Materialbord)tillverkas av en mycket flexibel polydimetylsiloxan (PDMS) elastomer som innehåller två överlagrade och parallella mikroskalskanaler åtskilda av ett flexibelt porösmembran. De övre och nedre mikrokanalstorlekarna är 1 mm x 1 mm respektive 1,0 mm x 0,2 mm. De två kanalerna skiljs åt av ett 50 μm tjockt PDMS-gjort flexibelt porösa membran, innehållande porerna med en diameter på 7 μm med 40 μm avstånd. Ytan på det porösa membranet som separerar kanalerna är 0,171 cm2.
4. Flisberedning
- Organchips levereras färdigförpackade inom chipbäraren, vilket eliminerar behovet av att störa eller förvränga spånjusteringen under hantering. Dessutom ansluter chipbäraren säkert till en bärbar modul ("Pod") som fungerar som gränssnittet mellan kulturmodulen och chipet.
- Spraya förpackningen av flisarna med 70% etanol och föra in i biosäkerhetsskåpet (BSC).
- Öppna förpackningen och lägg ut orgelchipet i en steril Petriskål. Hantera chiphållaren endast vid sidorna för att undvika direktkontakt med chippet.
- Se till att fliken på operatören är vänd åt höger(bild 2) och när du använder flera marker, justera dem alla i samma orientering.
- Märk varje chip på fliken bäre (fullständig spånförberedelse och arbetsflöde visas i bild 3).
5. Ytaktivering och ECM-beläggning
- Beredning av ytaktiveringslösning
- Emulera reagens 1 (ER-1), som finns i en injektionsflaska som innehåller 5 mg, är ljuskänslig. Förbered färsk ER-1-lösning omedelbart före användning. ER-1 integritet är avgörande för framgångsrik beredning av marker.
- Stäng av lampan i BSC vid hantering av ER-1.
OBS: ER-1 är ett öga irriterande och måste hanteras i BSC med rätt handskar och ögonskydd. - Låt ER-1- och ER-2-reagenserna jämvikta till rumstemperatur (RT) före användning.
- Skydda lösningen mot ljus genom att linda ett tomt sterilt 15 ml koniskt rör med folie.
- Tryck kort på ER-1-flaskan för att lösa pulvret längst ner.
- Lägg till 1 ml ER-2-buffert i flaskan och överför omedelbart innehållet till botten av det 15 ml inslagna koniska röret. Rör inte för att blanda. Färgen på den lösning som överförs till det koniska röret kommer att vara röd.
- Upprepa steg 5.1.6 3x. På den sista omgången, täck er-1-flaskan och invertera för att samla eventuellt återstående pulver från locket och överför sedan lösningen till det koniska röret. Detta kommer att ge den totala volymen till 4 ml ER-1-lösning.
- Tillsätt 6 ml ER-2-lösning till 4 ml ER-1-lösningen i konisk rör på 15 ml till en slutlig koncentration på 0,5 mg/ml. ER-1 bör lösas upp helt inom ER-2-lösningen.
- Aktivering av yta
- Använda en P200 pipett och en steril 200 μL filtrerad pipettspets, ta upp 200 μL AV ER-1 blandning.
- Placera pipetten i botteninloppet och tryck 20 μL ER-1-blandning genom bottenkanalen tills blandningen börjar flöda ut ur bottenkanaluttaget.
- Tillsätt ca 50 μl ER-1 blandning och placera den i den övre kanalen inloppet. Tryck blandningen genom den övre kanalen tills den börjar flöda ut ur det övre kanaluttaget.
- Ta bort all överflödig ER-1 blandning från ytan av chipet genom mild strävan. Se till att ER-1-blandningen endast avlägsnas från spånytan och inte från kanalerna.
- Kontrollera att kanalerna är fria från luftbubblor före aktivering av ultraviolett (UV). Om luftbubblor upptäcks, ta bort bubblor genom att tvätta kanalen med ER-1 blandning.
- Placera den öppna skålen som innehåller chipsen i UV-ljuslådan (tillhandahålls av Emulate Inc.).
- Ställ in strömbrytaren på baksidan av UV-ljusrutan på inställningen "Konsekvent". Slå på strömmen och initiera UV-aktivering. Lämna flisarna under UV-ljus i 20 min.
Obs: Undvik exponering av personal för UV-ljus. - Ta bort ER-1-blandningen från båda kanalerna.
- Tvätta varje kanal med 200 μL ER-2-lösning.
- Ta bort ER-2 från båda kanalerna.
- Tvätta varje kanal med 200 μl steril kall Dulbeccos fosfatbuffrad koks (DPBS).
- Lämna kalla DPBS inuti kanalerna tills du fortsätter till nästa steg.
- Extracellulär matris (ECM) beredning och beläggning
- Förbered ECM-lösningen genom att kombinera de enskilda ECM-komponenterna med kall DPBS, vatten eller annat lösningsmedel till de slutliga arbetskoncentrationerna. ECM-lösningen bör förberedas färsk varje gång den används.
- Täck både de övre och nedre kanalerna på chippet med ECM, med sammansättning som bestäms av celltypen som ska sås. ECM-blandningen måste bibehållas på is tills den används.
- Använd laminin (50 μg/ml) för att belägga "hjärnsidan", och kollagen IV och fibronectin blandat vid ett 4:1-förhållande (320:80 μg/ml) för att belägga "blodsidan" enligt beskrivningen i avsnitt 5.6.
- Beredning av ECM alikvoter
- Späd 1 mg/ml laminin i kall DPBS till en slutlig koncentration på 50 μg/ml. Aliquot och förvara på -20 °C fram till användning.
- Lös kollagen IV i 0,1% ättiksyra till en koncentration av 1 mg/ml. Inkubera lösningen vid 2–8 °C över natten eller vid RT för 1–3 h eller tills den är helt upplöst.
- Förbered en blandning av kollagen IV:fibronectin (320 μl kollagen IV, 80 μL fibronectin, 600 μL steril dubbeldestillerad H2O). Blandningen kan förvaras vid -20 °C.
- Beläggning av flisarna med ECM
- Aspirera helt i den kalla DPBS från båda kanalerna. Ställ in en P200 pipett för att ta upp 100 μL kollagen IV:fibronectin lösning.
- Introducera lösningen genom bottenkanalinloppet tills ett litet droppformulär bildas på uttaget. Lämna en liten droppe på inloppet efter att ha tagit bort pipettspetsen.
- Introducera lamininlösningen genom det övre kanalinloppet tills ett litet droppformulär bildas på utloppet. Lämna en liten droppe på inloppet efter att ha tagit bort pipettspetsen.
- Titta noga på kanalerna för att säkerställa att inga bubblor finns. Om bubblor finns, tvätta kanalen med lämplig ECM-lösning tills alla bubblor tas bort.
- Upprepa steg 5.5.1–5.5.4 för varje chip.
- Tillsätt 1,5 ml DPBS i locket på ett koniskt rör på 15 ml. Placera DPBS-locket i 150 mm kulturskålen med chipsen för att ge extra fukt och försegla skålen med parafilm. För bästa resultat, inkubera flisarna vid 4 °C över natten.
OBS: Om så önskas kan celler sås samma dag som chip aktivering och ECM beläggning, men natten inkubations tid är att föredra. Spånor kan vara redo för sådd 4 h efter tillsats av ECM och inkubering spån vid 37 °C.
6. Sådd "hjärnan sidan" kanal och differentiera EZ sfärer i blandade neurala kulturer
- Ta skålen som innehåller de beredda chipsen till BSC. Tvätta försiktigt båda kanalerna med 200 μL NDM.
- Undvik kontakt med portarna, noggrant aspirera överflödiga media droppar från ytan av chipet. Agitera försiktigt cellsuspension innan varje chip sås sett till en homogen cellsuspension
- Sådd iNPC:erna i den övre kanalen för att generera "hjärnsidan"
- Seed cellerna (1 x 106 celler/ml) i den övre kanalen av chipet. Lägg till en P200-spets som innehåller 30–100 μl cellers fjädring till det övre kanalinloppet och släpp försiktigt spetsen från pipetten. Ta en tom P200 pipett, tryck ned kolven, sätt in i det övre kanaluttaget och dra försiktigt in de enskilda cellernas fjädring genom chipet.
- Täck skålen och överför till mikroskopet för att kontrollera såddtätheten och homogen fördelning av celler inom den övre kanalen. Ta försiktigt bort pipettspetsen från spåninloppet och utloppsportarna.
- Sådddensiteten bör visas som 20 % täckning. Om sådddensiteten är högre eller lägre än förväntat eller ojämn, returnera rinnorna till BSC, tvätta kanal 2x med 200 μL färskt medium och upprepa steg 6.3.1.
- Efter att ha bekräftat rätt celldensitet, placera omedelbart spånorna i inkubatorn i 2 h vid 37 °C efter att ha sett varje sats. Tvätta bort de celler som inte fäster med färsk NDM.
- Håll cellerna under statiska förhållanden vid 37 °C med en daglig NDM-ersättning för minst 48 timmar innan flöde påbörjas. iBMECs kan sås efter iNPC har anslutits eller en efterföljande dag efter iNPC-sådd.
7. Sådd iBMECs i den nedre kanalen för att generera "blodsidan"
- Ta skålen som innehåller de beredda chipsen till BSC. Tvätta försiktigt bottenkanalen med 200 μL EG-medium.
- Undvika kontakt med hamnarna, noggrant aspirera droppar av överskott EG medium från ytan av chipet, se till att lämna medium i båda kanalerna. Agitera försiktigt cellsuspension innan varje chip sås sett till en homogen cellsuspension.
- Med hjälp av en P200 pipett, dra upp 30–100 μL av iBMEC-cellsuspensionen (14–20 x 106 celler/ml) och placera spetsen i bottenkanalintaget. Koppla försiktigt bort spetsen från pipetten och lämna den cellinnehållande spetsen i inloppsporten.
- Tryck ned kolven på en P200-pipett med en tom spets, sätt in i det nedre kanaluttaget och dra försiktigt in den enda cellfjädringen genom den nedre kanalen genom att långsamt släppa pipettkolven.
- Sug upp överskott cellsuspension från ytan av chipet. Undvik direktkontakt med inlopps- och utloppsportar för att säkerställa att ingen cellfjädring sugs ut ur kanalerna.
- Täck chippet och överför det till mikroskopet för att observera såddtäthet. Den nedre kanalen ska fyllas utan observerbara mellanrum mellan celler när den observeras vid 4x eller 10x under mikroskop(figur 4).
- Om sådddensiteten är under 90 % täckning eller är ojämnt fördelad, justera celltätheten därefter och upprepa steg 7.2–7.6 tills rätt densitet uppnås inom kanalen. Efter att ha bekräftat rätt celldensitet (figur 4), fröceller i de återstående marker. För att fästa cellerna på det porösa membranet, som ligger på toppen av den nedre kanalen, invertera varje chip och vila i en chipvagga.
- Placera en liten reservoar (15 ml koniskt rörlock som innehåller sterild pbs) inuti 150 mm skålen för att ge fukt för cellerna. Inkubera spån vid 37 °C i cirka 3 timmar, eller tills cellerna i den nedre kanalen har fästs. När iBMECs har anslutit (~ 3 h efter seedning), vänd tillbaka markerna till en upprätt position så att cellfästet till den nedre delen av den nedre kanalen.
8. Initiering av flödet
- Flow initieras vanligtvis 48 h efter sådd av iBMECs. Denna gång krävs för att iBMECs att fästa ordentligt på chipet.
- För att bibehålla laminarflödet genom chipet är det viktigt att avgasa och jämvikta mediets temperatur. Medium måste förvärmas i ett vattenbad på 37 °C för 1 h.
- Upp till 50 ml värmt medium kan avgasas genom inkubation under ett vakuumdrivet filtreringssystem i 15 min.
- Priming av bärbara moduler
- Sanera utsidan av den bärbara modulförpackningen och brickorna med 70 % etanol, torka och överför till BSC. Öppna förpackningen och placera modulerna i facket. Orientera dem med reservoarerna mot baksidan av facket.
- Pipette 3 ml förjämlade, varma medier till varje inloppsbehållare. Lägg till EG:s kulturmedium i inloppsbehållaren på den nedre kanalen och NDM till den övre kanalinloppsbehållaren på den övre kanalen(bild 5).
- Pipett 300 μl förjämstad, varmt medium till varje utloppsbehållare, direkt över varje utloppsport(figur 5).
- Placera upp till sex bärbara moduler på varje fack. Ta brickorna till inkubatorn och skjut helt in i kulturmodulen med fackets handtag vänd utåt.
- Välj och kör "Prime"-cykeln på kulturmodulen. Stäng inkubatorns dörr och låt kulturmodulen prime de bärbara modulerna (tar ~1 min). Priming-cykeln slutförs när statusfältet lyder "Klar". Ta bort facket från kulturmodulen och ta det till BSC.
- Kontrollera att de bärbara modulerna har primats genom att inspektera undersidan av varje bärbar modul i BSC. Leta efter förekomsten av små droppar på alla fyra hamnar.
- Om någon bärbar modul inte visar droppar, kör kör den primära cykeln på dessa moduler. Om något medium droppat på facket (detta kan inträffa oftare av utloppsportarna), rengör fack med 70 % etanol.
- Anslutning av chips till bärbara moduler, reglering och inledande av flöde
- Tvätta försiktigt båda kanalerna i varje chip med varmt, jämviktcellspecifikt odlingsmedium för att ta bort eventuella bubblor i kanalen och placera små droppar av media (enligt mediet i kanalen) på toppen av varje inlopp och utloppsport.
- Sätt in spån med bärare i de bärbara modulerna och placera upp till sex på varje fack. Sätt i brickor i kulturmodulen. Programmera lämpliga organ chip kultur förhållanden (flöde och stretch) på kulturmodulen.
- Programmerade förhållanden börjar så snart "Reglera" cykeln är klar.
OBS: Flödena för varje kanal kan styras oberoende av varandra och kan ställas in på hastigheter som varierar från 0–1 000 μL/h. BBB-chippet är vanligtvis odlat på 30 μL/h. När flytande medier som EG-medier eller ESM vid 30 μL/h respektive 1000 μL/h är kjuvkrafterna 0,01 dyn/cm2 respektive 0,33 dyn/cm2. - Kör "Reglera" cykel, som tar ca 2 h, varefter kulturmodulen kommer att börja flödet vid förinställda orgel chip kulturförhållanden.
9. Bedömning av paracellulär permeabilitet i blodet till hjärna
- Förbered NDM kompletterat med 10 μg/mL dextran-FITC (4 kDa). Denna lösning kommer att användas som ingång för "blodsidan" kanal.
- Fyll de nedre kanalbehållarna i de bärbara modulerna med NDM kompletterad med dextran-FITC. Fyll de övre kanalmagasinen med NDM utan spårämne.
- Perfuse både, de övre och nedre kanalerna med en flödeshastighet på 30 μL/h för minst 4 h tills tillräckligt med media ackumuleras för bedömning av fluorescens i en plattläsare (vanligtvis 100 μL).
- Samla in medieprover från in- och utmatningsmagasinen i de övre och nedre kanalerna. Skydda proverna från ljus.
- Seriellt späd adrärt ndm kompletterat med 10 μg/ml dextran-FITC 1:1 med NDM utan spårämne för att generera en kalibreringskurva på 10–12 punkter.
- Ta 100 μL av varje prov, inklusive kalibreringskurvan, i en svart 96 brunnsplatta och läs fluorescens med hjälp av en plattläsare (485 nm excitation, 530 nm utsläpp).
- Använd de uppmätta värdena för att beräknaP-appvärden enligt följande:
- Ta dagliga mätningar för att bedöma barriäregenskaperna och bekräfta att BBB-chippet fortfarande fungerar.
10. Immunocytokemi
- Ta chips till en kemisk rökhuva. Med hjälp av en P200 pipett, fixa celler genom att perfusing båda kanalerna med 200 μL av 4% paraformaldehyd (PFA) i DPBS och inkubera i 10 min på RT.
- Efter fixeringen perfuse varje kanal med 200 μL DPBS och inkubera i 5 min. Upprepa DPBS tvätt 2x.
- Blockera och permeabilisera celler på chipet genom att perfusing primära blockeringslösning (PBS, kompletterad med 5% normal åsna serum och 0,1% Triton X-100). Inkubera på RT för 1 h.
- Späd primära antikroppar i primär blockeringslösning och inkubera över natten vid 4 °C. BMECs markörer är GLUT-1 (1:100 utspädning), ZO-1 (1:300), PECAM-1 (1:250; CD31) och VE-cadherin (1:200). Neurala markörer är βIII-tubulin (1:1000; Tuj1α), S100β (1:500), nestin (1:1000) och GFAP (1:1000).
- Tvätta chipsen 3x med kall DPBS.
- Späd sekundära antikroppar i sekundär blockeringslösning (DPBS med 5% normalt åsna serum utan Triton-X).
- Genomsyra den sekundära antikroppslösningen genom båda kanalerna. Vanligtvis späds fluorescerande sekundära antikroppar 1:1000. Inkubera för 1 h på RT skyddad från ljus.
- Tvätta chipsen 3x med DPBS.
- Stain cellkärnor genom perfusing chip med 100 μL DAPI-lösning. Inkubera på RT i 5 min.
- Tvätta chipsen 3x med DPBS.
- Chipet är klart för bildbehandling med antingen upprätt eller ett inverterat fluorescerande mikroskop. PDMS-genomskinligheten tillåter avbildning i det intakta organchippet. Förstoringsglas över 10x kan kräva långdistansmål med långa arbetsavstånd på grund av organets tjocklek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 6A,B,C representerar en BBB chip seedade med EZ-sfärer på "hjärnan sidan" övre kanal och iBMECs på "blod sidan"" nedre kanalen. IBMECs varseedade först och tilläts fästa över natten, varefter EZ-sfärerna var seedade. Chips odlades sedan under statiska förhållanden med daglig media ersättning i sju dagar. BBB-chippet fastställdes sedan med 4% PFA på RT i 10 min och tvättades 3x med DPBS. Immunocytochemistry utfördes på BBB-chippet med 1) nestin som en markör för neurala stamceller, 2) S100β eller GFAP som markörer för astrocyter, och 3) βIII-tubulin som en markör för nervceller. GLUT-1 och Pecam-1 användes som en markör för BMECs. Imaging utfördes på 20x med hjälp av ett konfokalmikroskop och bilder bearbetades med Fiji för ImageJ programvara.
Figur 6D representerar en paracellulär permeabilitetsanalys som utfördes på organchips befolkade med iBMECs och EZ-sfärer, enbart iBMECs (utan EZ-sfärer) eller ez-sfärer ensam (utan iBMECs). Efter en "Reglera" cykel, en 4 kDa Dextran-FITC spårämne lades till behållaren på "blodsidan" till en slutlig koncentration av 10 μg/ml, och chips perfunderades vid 30 μL / h över natten. Därefter samlades media in från inlopps- och utloppsreservoarer i både de övre och nedre kanalerna. 100 μL av varje prov samlades in och undersöktes för fluorescens med hjälp av en plattläsare.
Viktigt, en 1:1 kalibreringskurva användes för att omvandla fluorescensvärden till koncentrationsvärden för Dextran FITC. Värden användes sedan för att beräkna permeabilitet(P-app). Dessa resultat visar att iBMECs bildar funktionella barriäregenskaper, som ytterligare skärps när iBMECs är samodlade med EZ-sfärer. Chips odlade med EZ-sfärer bara, misslyckas med att bilda en barriär. Ett liknande tillvägagångssätt kan användas för att undersöka transporten av någon molekyl över BBB-chippet, beroende på en tillgänglig mätmetod (t.ex. fluorescens, ELISA eller masspektrofotometri).
Bild 1: Schematisk av det iPSC-baserade BBB-chippet. Före sådd på chipet differentieras iPSCs i odlingsplattor i i) EZ-sfärer (neurala stamceller, iNPCs), som odlas i suspension som sfärer, och till (ii) hjärnan mikrovaskulära endotelceller (iBMECs). EZ-sfärer separeras i enstaka celler, seedade på den övre kanalen av organchipet, där de ytterligare skiljer sig åt i blandade neurala kulturer för att bilda "hjärnsidan". iBMECs är seedade i den nedre kanalen av organchipet för att bilda ett blodkärl-liknande struktur på "blodsidan". Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 2: Schematisk av den övre vyn av chipet i chipbäraren, med märkta portar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 3: Flödesschema för den iPSC-baserade BBB-chipförberedelsen och arbetsflödet. Fördifferentiering av både neurala och endotelceller från iPSCs krävs innan arbetsflödet inleds. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 4: Sådd av iBMECs i den nedre kanalen. Brightfield bilder av iBMECs seedade i den nedre kanalen(A)omedelbart efter sådd eller (B) 24 h efter sådd, efter celler har fäst. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 5: Schematisk av det anslutna chipet och den bärbara modulen med märkta inlopps- och utloppsmediabehållare. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 6: Representativa resultat. Immunocytochemistry på iPSC-baserade BBB chip 7 dagar efter sådd. EZ-sfärer differentierade till en blandad neural cell population i den övre "hjärnan sidan" kanal, inklusive (A) S100β + (gröna) astrocyter, Nestin + (röd) neurala stamceller samt (B) GFAP + (röd) astrocyter och βIII-tubin + (röd) nervceller. Skalstänger = 200 μm(C)iBMECs seedade i den nedre "blodsidan" kanal uttryckt GLUT-1 och (grön) PECAM-1 (CD31, röd). Skalstång = 200 μm. (D)Utvärdering av BBB-chippermeabilitet utfördes genom att dextran-FITC (4 kDa) lades till i behållaren på den nedre kanalen. Resultaten visar att orgelchips som såddes med iBMECs och EZ-sfärer visar en snäv barriär jämfört med organchips som setts med enbart iBMECs (*p < 0,05). Organchips som setts med EZ-sfärer ensam visar inga barriäregenskaper (***p < 0,001; enkelriktad ANOVA med Tukeys flera jämförelser test). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kombinationen av organ-on-chip-teknik och iPSC-härledda celler i NVU håller löfte om korrekt modellering av den mänskliga BBB. Här ger vi ett detaljerat protokoll för enkel och robust tillämpning av den nyligen publicerade iPSC-baserade BBB chip16. En översikt och tidpunkt för sådd paradigm visas i figur 3. För att erhålla och underhålla barriärfunktioner som är lämpliga för BBB-modellering är det avgörande att generera ett homogent iBMEC-monoskikt och behålla dess integritet. Det första steget mot generering av en funktionell monolayer inkluderar kemisk aktivering av den icke-polära PDMS ytan som möjliggör fastsättning av ECM proteiner. Ytaktiveringsreagenser bryts ned snabbt vid reconstitution, vilket så småningom kan resultera i suboptimal fastsättning av celler. Det är därför viktigt att hålla reagenser färska och skyddade från ljus under hela processen.
Under UV-aktivering (avsnitt 5.2) måste reagenser fördelas jämnt inom varje kanal för att uppnå konsekvent ECM-beläggning och homogen cellfastsättning. ECM-kompositioner och koncentrationer som finns i detta protokoll optimerades till de specifika typerna av celler(dvs., iBMECs och EZ-sfärhärledda neurala stamceller). Det är möjligt att ändra cellsammansättningen men kan kräva olika ECM-villkor, vilket kräver optimering. Efter ECM beläggning, är det viktigt att utsäde iBMECs ordentligt. Hög cellseedningsdensitet (>14 x 106 celler/ml) är avgörande för att erhålla en komplett monolayer. Om det inte uppnår full cellinfluens rekommenderas att ytterligare öka cellsuspensionens densitet upp till 20 x 106 celler/ml under sådd.
Laminar flöde föreslogs tidigare att förbättra iBMEC mognad15 och är oumbärlig för att uppfylla de fördelar som tillhandahålls av den mikrofluidiska plattformen. Mikrobubblor som flyter genom kanalerna på chippet kan dock fysiskt stressa och lossa inhemska celler, vilket kan leda till förstörelse av BBB-chipintegriteten. För att undvika mikrobubblabildning under laminflöde är det viktigt att jämvikta mediet innan perfusion initieras. Jämndagkräver förvärmande och avgasning av mediet före användning.
Genereringen av personliga chips möjliggörs med både mänskliga iPSC-härledda iBMECs och iNPCs. Medan differentieringen av iBMECs är kort och ganska enkel24,22, differentiering av iPSCs i neurala celler21,25 är mer utmanande. Emellertid, de neurala celler som finns i "hjärnan sidan" av chipet kan ersättas av någon neural celltyp, såsom primära neurala celler eller iPSC-härledda motoriska nervceller16. På samma sätt som "bona fide" endotelceller, iBMECs visa plasticitet i genuttryck som svar på olika neurala co-kulturer. Denna flexibilitet kan således leda till framtida utveckling av olika nfr på chippet. Ytterligare flexibilitet i systemet kan erhållas genom att justera cellsåddtid och ordning. iBMECs kan sås före eller efter neurala celler, vilket gör det möjligt att utsäde iBMECs omedelbart efter sådd och fastsättning av neurala celler, eller efter EZ-sfärer har differentierats till mer mogna neurala kulturer i chipmiljön. Detta är av särskild betydelse, med tanke på den omogna karaktären av iPSC-härledda neurala celler. Med tanke på att EZ-sfärer är tidiga neurala förfäder, längre differentiering perioder kan också resultera i en ökad andel astrocyter och nervceller.
En komponent som saknas i protokollet är perivascular pericyter, som ger en avgörande komponent i den fysiologiska NVU. Senaste framsteg i iPSCs differentiering i pericyte-liknande celler26,27 kommer att tillåta införandet av denna ytterligare celltyp, vilket ger en förbättrad kopia av BBB samtidigt som dess personliga natur.
IBMECs har tidigare visat sig visa olika egenskaper som är avgörande för BBB-modellering inklusive uttryck för cellulära markörer, inrättandet av TEER och funktionell aktivitet av efflux pumpar28,24,5. Molekylära analyser har dock visat att dessa celler också uttrycker flera epitelmarkörer15. Framsteg i iBMEC generation visar förbättrad funktion och endotel markör uttryck har nyligen beskrivits29,30. Efter paradigm presenteras här, dessa potentiellt förbättrade celler kan lätt införlivas i BBB chip modell för framtida applikationer. Den flexibla men robusta plattform som beskrivs här kan underlätta både sjukdomsmodellering och utveckling och bedömning av nya CNS-läkemedel.
Även om detta protokoll bygger på en specifik kommersiellt tillgänglig produkt, erbjuder ytterligare kommersiella företag olika mikrofysiologiska plattformar, vilket kan erbjuda alternativa fördelar31. Dessutom finns protokoll för "intern" tillverkning av mikrofluidic Organ chips också32 och kan erbjuda mer modularitet inklusive integration av TEER elektroder17, som saknas från den plattform som används här.
Organ-on-chips infördes som ett alternativt tillvägagångssätt för att förbättra den fysiologiska sammanhang nuvarande cellkulturer33. Tillämpningen av denna teknik kräver dock specialiserade ingenjörskunskaper, som ofta saknas i biologiskt orienterade laboratorier. En kommersiellt tillgänglig chipplattform, såsom den som används här, ger mindre modularitet och ökad robusthet och reproducerbarhet, som kan tillämpas av ett bredare utbud av användare. Vidare är appliceringen av laminatflöde på ett mikrofluidiskt chip beroende av applicering av spruta eller peristaltiska pumpar, vilket inför en annan komplexitetsnivå. Detta hinder är nu lättare att övervinna med tillämpningen av kulturmodulen, vilket underlättar samtidig perfusion av flera marker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Cedars-Sinai äger ett minoritetsbestånd intresse i Emulate, företaget som producerar studiens mikrofluidic Organ chips. En officer i Cedars-Sinai tjänstgör också på Emulate styrelse. Emugeret gav inget ekonomiskt stöd till denna forskning. Cedars-Sinai och Emulate har patent in i samband med detta arbete.
Acknowledgments
Vi vill tacka dr Soshana Svendsen för kritisk redigering. Detta arbete stöddes av Israel Science Foundation bidrag 1621/18, ministeriet för vetenskap och teknik (MOST), Israel 3-15647, California Institute for Regenerative Medicine bevilja ID DISC1-08800, Sherman Family Foundation, NIH-NINDS bevilja 1UG3NS105703, och ALS Association bevilja 18-SI-389. AH finansierades av Wallenberg Foundation (bidragsnummer 2015.0178).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accutase | EMD Millipore | SCR005 | Dissociation solution |
| B27 | Gibco | 12587010 | |
| Bfgf | Peprotech | 100-18B | |
| Chip-S1 | Emulate Inc | Chip-S1 | Organ-Chip |
| Collagen IV | Sigma | C5533 | |
| DAPI | Invitrogen | D3571 | |
| Dextran-FITC | Sigma | 46944 | |
| DMEM: F12 | Thermo Fisher Scientific | 31330038 | |
| Donkey serum | Sigma | D9663 | |
| Emulate Reagent 1 (ER-1) | Emulate Inc | ER-1 | |
| Emulate Reagent 2 (ER-2) | Emulate Inc | ER-2 | |
| Fibronectin | Sigma | F1141 | |
| Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) | Dako | Z0334 | |
| GLUT-1 | Invitrogen | MA5-11315 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050038 | Glutamine supplement |
| hBDNF | Peprotech | 450-02 | |
| KOSR | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | Basement membrane matrix |
| mTeSR1 | StemCell Technologies, Inc. | 85851 | |
| NEAA | Biological industries | 01-340-1B | |
| Nestin | Millipore | MAB353 | |
| NutriStem | Biological industries | 05-100-1A | Alternate media |
| PECAM-1 | Thermo Fisher Scientific | 10333 | |
| Platelet-poor plasma-derived bovine serum (PPP) | Biomedical Technologies | J64483AB | |
| Retinoic acid (RA) | Sigma | R2625 | |
| S100β | Abcam | ab6602 | |
| Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit | Millipore | SCGP00525 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| ZO-1 Monoclonal Antibody | Invitrogen | 33-9100 | |
| βIII-tubulin (Tuj1α) | Sigma | T8660 | |
| β-mercaptoethanol | Life Technologies | 31350010 |
References
- Pardridge, W. M. Blood-brain barrier endogenous transporters as therapeutic targets: a new model for small molecule CNS drug discovery. Expert Opinion on Therapeutic Targets. 19 (8), 1059-1072 (2015).
- Gastfriend, B. D., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Modeling the blood-brain barrier: beyond the endothelial cells. Current Opinion in Biomedical Engineering. 5, 6-12 (2018).
- Jamieson, J. J., Linville, R. M., Ding, Y. Y., Gerecht, S., Searson, P. C. Role of iPSC-derived pericytes on barrier function of iPSC-derived brain microvascular endothelial cells in 2D and 3D. Fluids and Barriers of the CNS. 16 (1), 15 (2019).
- El-Habashy, S. E., et al. Novel treatment strategies for brain tumors and metastases. Pharmaceutical Patent Analyst. 3 (3), 279-296 (2014).
- Lim, R. G., et al. Huntington's disease iPSC-derived brain microvascular endothelial cells reveal WNT-mediated angiogenic and blood-brain barrier deficits. Cell Reports. 19 (7), 1365-1377 (2017).
- Dumitrescu, A. M., Liao, X. H., Weiss, R. E., Millen, K., Refetoff, S. Tissue-specific thyroid hormone deprivation and excess in monocarboxylate transporter (mct) 8-deficient mice. Endocrinology. 147 (9), 4036-4043 (2006).
- Spencer, J. I., Bell, J. S., DeLuca, G. C. Vascular pathology in multiple sclerosis: reframing pathogenesis around the blood-brain barrier. Journal of Neurology and Neurosurgical Psychiatry. 89 (1), 42-52 (2018).
- Yamazaki, Y., Kanekiyo, T. Blood-brain barrier dysfunction and the pathogenesis of Alzheimer's disease. International Journal of Molecular Sciences. 18 (9), 1965 (2017).
- Ben-Zvi, A., et al. Mfsd2a is critical for the formation and function of the blood-brain barrier. Nature. 509 (7501), 507 (2014).
- Heng, M. Y., Detloff, P. J., Albin, R. L. Rodent genetic models of Huntington disease. Neurobiology of Disease. 32 (1), 1-9 (2008).
- Ho, R., et al. ALS disrupts spinal motor neuron maturation and aging pathways within gene co-expression networks. Nature Neuroscience. 19 (9), 1256 (2016).
- Griep, L. M., et al. BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomedical Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).
- Prabhakarpandian, B., et al. Synthetic tumor networks for screening drug delivery systems. Journal of controlled release. 201, 49-55 (2015).
- Delsing, L., et al. Barrier properties and transcriptome expression in human iPSC-derived models of the blood-brain barrier. Stem Cells. 36 (12), 1816-1827 (2018).
- Park, T. E., et al. Hypoxia-enhanced Blood-Brain Barrier Chip recapitulates human barrier function and shuttling of drugs and antibodies. Nature Communications. 10 (1), 2621 (2019).
- Vatine, G. D., et al. Human iPSC-Derived Blood-Brain Barrier Chips Enable Disease Modeling and Personalized Medicine Applications. Cell Stem Cell. 24 (6), 995-1005 (2019).
- Henry, O. Y. F., Villenave, R., Cronce, M. J., Leineweber, W. D., Benz, M. A., Ingber, D. E. Organs-on-chips with integrated electrodes for trans-epithelial electrical resistance (TEER) measurements of human epithelial barrier function. Lab on a Chip. 17 (13), 2264-2271 (2017).
- Sances, S., et al. Human iPSC-derived endothelial cells and microengineered organ chip enhance neuronal development. Stem Cell Reports. 10 (4), 1222-1236 (2018).
- Workman, M. J., et al. Enhanced utilization of induced pluripotent stem cell–derived human intestinal organoids using microengineered chips. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 669-677 (2018).
- Ebert, A. D., et al. EZ spheres: a stable and expandable culture system for the generation of pre-rosette multipotent stem cells from human ESCs and iPSCs. Stem Cell Research. 10 (3), 417-427 (2013).
- Shelley, B. C., Gowing, G., Svendsen, C. N. A cGMP-applicable expansion method for aggregates of human neural stem and progenitor cells derived from pluripotent stem cells or fetal brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (88), e51219 (2014).
- Vatine, G. D., et al. Modeling psychomotor retardation using iPSCs from MCT8-deficient patients indicates a prominent role for the blood-brain barrier. Cell Stem Cell. 20 (6), 831-843 (2017).
- Svendsen, C. N., et al. A new method for the rapid and long term growth of human neural precursor cells. Journal of Neuroscience Methods. 85 (2), 141-152 (1998).
- Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources. Scientific Reports. 4, 4160 (2014).
- Canfield, S. G., et al. An isogenic blood-brain barrier model comprising brain endothelial cells, astrocytes, and neurons derived from human induced pluripotent stem cells. Journal of Neurochemistry. 140 (6), 874-888 (2017).
- Jamieson, J. J., Gerecht, S. Chipping Away at Blood-Brain-Barrier Modeling. Cell stem cell. 24 (6), 831-832 (2019).
- Faal, T., et al. Induction of Mesoderm and Neural Crest-Derived Pericytes from Human Pluripotent Stem Cells to Study Blood-Brain Barrier Interactions. Stem Cell Reports. 12 (3), 451-460 (2019).
- Lippmann, E. S., et al. Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 30 (8), 783 (2012).
- Qian, T., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Science Advances. 3 (11), 1701679 (2017).
- Neal, E. H., et al. A Simplified, Fully Defined Differentiation Scheme for Producing Blood-Brain Barrier Endothelial Cells from Human iPSCs. Stem Cell Reports. 12 (6), 1380-1388 (2019).
- Wevers, N. R., et al. A perfused human blood-brain barrier on-a-chip for high-throughput assessment of barrier function and antibody transport. Fluids and Barriers of the CNS. 15 (1), 23 (2018).
- Huh, D., et al.
- Huh, D., Matthews, B. D., Mammoto, A., Montoya-Zavala, M., Hsin, H. Y., Ingber, D. E. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
