Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Substructure Analyzer: En brukervennlig arbeidsflyt for rask utforskning og nøyaktig analyse av cellulære organer i fluorescensmikroskopibilder

Published: July 15, 2020 doi: 10.3791/60990
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 2, 1
1Université de Lorraine, CNRS, IMoPA F54000 Nancy France, 2Institut Pasteur, BioImage Analysis Unit, CNRS UMR 3691, Paris, France.

Summary

Vi presenterer en fritt tilgjengelig arbeidsflyt bygget for rask utforskning og nøyaktig analyse av cellulære organer i bestemte cellerom i fluorescensmikroskopibilder. Denne brukervennlige arbeidsflyten er utformet på åpen kildekode-programvare isete og bruker også ImageJ-funksjonalitet. Rørledningen er rimelig uten kunnskap i bildeanalyse.

Abstract

Det siste tiåret har vært preget av gjennombrudd i fluorescensmikroskopiteknikker illustrert av forbedring av romlig oppløsning, men også i live-celleavbildning og høygjennomstrømningsmikroskopiteknikker. Dette førte til en konstant økning i mengden og kompleksiteten til mikroskopidataene for et enkelt eksperiment. Fordi manuell analyse av mikroskopidata er svært tidkrevende, subjektiv og forbyr kvantitative analyser, blir automatisering av bioimageanalyse nesten uunngåelig. Vi bygget en informatikkarbeidsflyt kalt Substructure Analyzer for å automatisere signalanalysen i bioimages fra fluorescerende mikroskopi. Denne arbeidsflyten er utviklet på den brukervennlige åpen kildekode-plattformen Icy og fullføres av funksjoner fra ImageJ. Det inkluderer forhåndsbehandling av bilder for å forbedre signalet til støyforhold, den individuelle segmenteringen av celler (deteksjon av cellegrenser) og deteksjon / kvantifisering av cellelegemer beriket i bestemte cellerom. Den største fordelen med denne arbeidsflyten er å foreslå komplekse bio-imaging funksjonalitet til brukere uten bildeanalyse kompetanse gjennom et brukervennlig grensesnitt. Videre er det svært modulært og tilpasset flere problemer fra karakterisering av kjernefysisk / cytoplasmatisk translokasjon til komparativ analyse av forskjellige cellelegemer i forskjellige cellulære understrukturer. Funksjonaliteten til denne arbeidsflyten illustreres gjennom studiet av Cajal (kveilet) Organer under oksidative stressforhold (OS). Data fra fluorescensmikroskopi viser at deres integritet i menneskelige celler påvirkes noen timer etter induksjon av OS. Denne effekten er preget av en reduksjon av coilinkjerning i karakteristiske Cajal Bodies, forbundet med en nukleoplasmisk omfordeling av coilin til et økt antall mindre foci. Coilins sentrale rolle i utvekslingen mellom CB-komponenter og den omkringliggende nukleoplasma tyder på at OS indusert omfordeling av coilin kan påvirke sammensetningen og funksjonaliteten til Cajal Bodies.

Introduction

Lett mikroskopi og, mer spesielt, fluorescensmikroskopi er robuste og allsidige teknikker som vanligvis brukes i biologiske vitenskaper. De gir tilgang til nøyaktig lokalisering av ulike biomolekyler som proteiner eller RNA gjennom deres spesifikke fluorescerende merking. Det siste tiåret har vært preget av raske fremskritt innen mikroskopi og bildeteknologi som det fremgår av Nobelprisen i kjemi i 2014 som tildeler Eric Betzig, Stefan W. Hell og William E. Moerner for utviklingen av super-løst fluorescensmikroskopi (SRFM)1. SFRM omgår diffraksjonsgrensen for tradisjonell optisk mikroskopi for å bringe den inn i nanodimensionen. Forbedring i teknikker som live-imaging eller høy gjennomstrømning screening tilnærminger øker også mengden og kompleksiteten av dataene til å behandle for hvert eksperiment. Mesteparten av tiden står forskerne overfor høye heterogene populasjoner av celler og ønsker å analysere fenotyper på encellet nivå.

I utgangspunktet ble analyser som foci telling utført av øyet, som foretrekkes av noen forskere siden det gir full visuell kontroll over telleprosessen. Manuell analyse av slike data er imidlertid for tidkrevende, fører til variasjon mellom observatører, og gir ikke tilgang til mer komplekse funksjoner slik at dataassisterte tilnærminger blir mye brukt og nesten uunngåelig2. Bioimage informatikk metoder øker effektiviteten av dataanalyse betydelig og er fri for uunngåelig operatør subjektivitet og potensielle skjevhet av manuell telling analyse. Den økte etterspørselen på dette feltet og forbedring av datakraft førte til utvikling av et stort antall bildeanalyseplattformer. Noen av dem er fritt tilgjengelig og gir tilgang til ulike verktøy for å utføre analyse med personlige datamaskiner. En klassifisering av åpne tilgangsverktøy har nylig blitt etablert3 og presenterer Icy4 som en kraftig programvare som kombinerer brukervennlighet og funksjonalitet. Videre har Icy fordelen av å kommunisere med ImageJ.

For brukere uten bildeanalyseekspertise er de viktigste hindringene å velge riktig verktøy i henhold til de problematiske og riktig innstilte parametrene som ofte ikke er godt forstått. Videre er oppsettstidene ofte lange. Isete foreslår et brukervennlig pek-og-klikk-grensesnitt kalt "Protokoller" for å utvikle arbeidsflyt ved å kombinere noen plugins som finnes i en uttømmende samling4. Den fleksible modulære utformingen og pek-og-klikk-grensesnittet gjør det mulig å sette opp en analyse for ikke-programmerere. Her presenterer vi en arbeidsflyt kalt Substructure Analyzer, utviklet i Isens grensesnitt, hvis funksjon er å analysere fluorescerende signaler i bestemte cellulære rom og måle forskjellige funksjoner som lysstyrke, foci nummer, foci størrelse og romlig distribusjon. Denne arbeidsflyten løser flere problemer, for eksempel kvantifisering av signaloverføring, analyse av transfiserte celler som uttrykker en fluorescerende reporter, eller analyse av foci fra forskjellige cellulære understrukturer i individuelle celler. Det tillater samtidig behandling av flere bilder, og utdataresultater eksporteres til et tabulatord som kan åpnes i vanlige regnearkprogrammer.

Rørledningen Understrukturanalysator presenteres i figur 1. Først er alle bildene i en spesifisert mappe forhåndsbehandlet for å forbedre signalet til støyforholdet. Dette trinnet øker effektiviteten av følgende trinn og reduserer driftstiden. Deretter identifiseres og segmenteres interesseområdene( ROIer), som tilsvarer bildeområdene der det fluorescerende signalet skal oppdages, og segmenteres. Til slutt analyseres det fluorescerende signalet, og resultatene eksporteres til et tabulatord.

Objektsegmentering (påvisning av grenser) er det mest utfordrende trinnet i bildeanalyse, og effektiviteten bestemmer nøyaktigheten av de resulterende cellemålingene. De første objektene som er identifisert i et bilde (kalt primære objekter) er ofte kjerner fra DNA-farget bilder (DAPI eller Hoechst flekker), selv om primære objekter også kan være hele celler, perler, flekker, svulster, eller hva farget objekter. I de fleste biologiske bilder berører celler eller kjerner hverandre eller overlapper hverandre, noe som fører til at de enkle og raske algoritmene mislykkes. Til dags dato kan ingen universell algoritme utføre perfekt segmentering av alle objekter, hovedsakelig fordi deres egenskaper (størrelse, form eller tekstur) modulerer effektiviteten av segmentering5. Segmenteringsverktøyene som vanligvis distribueres med mikroskopiprogramvare (for eksempel MetaMorph Imaging Software av Molecular Devices6, eller NIS-Elements Advances Research-programvaren av Nikon7) er vanligvis basert på standardteknikker som korrelasjonsmatching, terskel eller morfologiske operasjoner. Selv om de er effektive i grunnleggende systemer, presenterer disse overgeneraliserte metodene raskt begrensninger når de brukes i mer utfordrende og spesifikke sammenhenger. Faktisk er segmentering svært følsom for eksperimentelle parametere som celletype, celletetthet eller biomarkører, og krever ofte gjentatt justering for et stort datasett. Arbeidsflyten for substructureanalysator integrerer både enkle og mer sofistikerte algoritmer for å foreslå ulike alternativer tilpasset bildekompleksitet og brukerbehov. Det foreslår spesielt den markørbaserte vannskillealgoritmen8 for svært grupperte objekter. Effektiviteten til denne segmenteringsmetoden er avhengig av valg av individuelle markører på hvert objekt. Disse markørene velges manuelt mesteparten av tiden for å få riktige parametere for full segmentering, noe som er svært tidkrevende når brukerne står overfor et høyt antall objekter. Substructure Analyzer foreslår en automatisk påvisning av disse markørene, noe som gir en svært effektiv segmenteringsprosess. Segmentering er, mesteparten av tiden, det begrensende trinnet for bildeanalyse og kan betydelig endre behandlingstiden avhengig av oppløsningen av bildet, antall objekter per bilde og nivået av klynger av objekter. Vanlige datasamlebånd krever noen sekunder til 5 minutter per bilde på en standard stasjonær datamaskin. Analyse av mer komplekse bilder kan kreve en kraftigere datamaskin og litt grunnleggende kunnskap i bildeanalyse.

Fleksibiliteten og funksjonaliteten til denne arbeidsflyten illustreres med ulike eksempler i de representative resultatene. Fordelene med denne arbeidsflyten vises spesielt gjennom studiet av kjernefysiske understrukturer under oksidative stressforhold (OS). OS tilsvarer en ubalanse i redoks homeostase i favør av oksidanter og er forbundet med høye nivåer av reaktive oksygenarter (ROS). Siden ROS fungerer som signalmolekyler, påvirker endringer i konsentrasjon og subcellulær lokalisering positivt eller negativt et mylder av veier og nettverk som regulerer fysiologiske funksjoner, inkludert signaltransduksjon, reparasjonsmekanismer, genuttrykk, celledød og spredning9,10. OS er dermed direkte involvert i ulike patologier (nevrodegenerative og kardiovaskulære sykdommer, kreft, diabetes, etc.), men også cellulær aldring. Derfor, dechiffrere konsekvensene av OS på den menneskelige cellens organisasjon og funksjon utgjør et avgjørende skritt i forståelsen av rollene til OS i utbruddet og utviklingen av menneskelige patologier. Det er fastslått at OS regulerer genuttrykk ved å modulere transkripsjon gjennom flere transkripsjonsfaktorer (p53, Nrf2, FOXO3A)11, men også ved å påvirke reguleringen av flere sam- og post-transkripsjonelle prosesser som alternativ spleising (AS) av pre-RNAs12,13,14. Alternativ spleising av primære koding og ikke-koding transkripsjoner er en viktig mekanisme som øker koding kapasiteten av genomene ved å produsere transkripsjon isoformer. AS utføres av et stort ribonucleoprotein kompleks kalt skjøteosom, som inneholder nesten 300 proteiner og 5 U-rike små kjernefysiske RNAs (UsnRNAs)15. Spleikaenhet og AS er tett kontrollert i celler, og noen trinn i den skjøteosommodningen forekommer i membranfrie kjernefysiske rom kalt Cajal Bodies. Disse kjernefysiske understrukturene er preget av den dynamiske naturen til deres struktur og deres sammensetning, som hovedsakelig utføres av multivalente interaksjoner mellom deres RNA og proteinkomponenter med coilinproteinet. Analyse av tusenvis av celler med arbeidsflyten for substructure analyzer tillot karakterisering av aldri beskrevne effekter av OS på Cajal Bodies. Faktisk, innhentet data tyder på at OS endrer kjernen av Cajal Bodies, indusere en nukleoplasmisk omfordeling av coilin protein i mange mindre kjernefysiske foci. En slik endring av strukturen i Cajal Bodies kan påvirke modningen av skjøteosomet og delta i AS-modulasjon av OS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

MERK: Brukervennlige opplæringsprogrammer er tilgjengelige på Icys nettsted http://icy.bioimageanalysis.org.

1. Last ned isete og substructure analyzer protokollen

  1. Last ned isete fra Icy-nettstedet (http://icy.bioimageanalysis.org/download) og last ned Substructure Analyzer-protokollen: http://icy.bioimageanalysis.org/protocols?sort=latest.
    MERK: Hvis du bruker et 64-biters operativsystem, må du passe på å bruke 64-bitersversjonen av Java. Denne versjonen gjør det mulig å øke minnet tildelt isete (Preferanser | Generelt | Maks minne).

2. Åpne protokollen

  1. Åpne Isete og klikk på Verktøy på Bånd-menyen.
  2. Klikk på Protokoller for å åpne Protokoller Editor-grensesnittet.
  3. Klikk på Last inn og åpne protokollen Substructure Analyzer. Protokollinnlasting kan ta noen sekunder. Kontroller at åpningen av protokollen er fullført før du bruker den.
    MERK: Arbeidsflyten består av 13 generelle blokker som presenteres i figur 2a. Hver blokk fungerer som en rørledning som består av flere bokser som utfører bestemte delaktiviteter.

3. Samhandle med arbeidsflyten på isete

MERK: Hver blokk eller boks er nummerert og har en bestemt rangering i arbeidsflyten (Figur 2b). Ved å klikke på dette nummeret tilordnes den nærmeste mulige posisjonen til den første til den valgte blokken/boksen, og plasseringen av de andre blokkene/boksene organiseres på nytt. Respekter riktig rekkefølge av blokkene når du forbereder arbeidsflyten. Punktdetektorblokken trenger for eksempel forhåndsdefinerte ROIer slik at segmenteringsblokker må kjøres før punktdetektorblokker. Ikke endre plasseringen av boksene. Ikke bruk "." i bildets navn.

  1. Ved å klikke øverst til venstre på ikonet, skjule, utvide, forstørre, begrense eller fjerne blokken (Figur 2b).
  2. Hver rørledning i arbeidsflyten er preget av et nettverk av bokser som er koblet til via inndata og utdata (Figur 2b). Hvis du vil opprette en tilkobling, klikker du på Utdata og vedlikeholder til markøren oppnår en inndata. Tilkoblinger kan fjernes ved å klikke på Utdata-koden.

4. Sammenslåing av kanalene i et bilde

  1. Bruk blokkflettingskanaler til å generere sammenslåtte bilder. Gi om nødvendig navn til filene slik at sekvenser som skal slås sammen, har samme navnprefiks etterfulgt av et distinkt skilletegn. Sekvenser av enkeltkanaler fra et bilde A heter for eksempel: ImageA_red, ImageA_blue.
    MERK: For skilletegnet må du ikke bruke tegn som allerede finnes i bildets navn.
  2. Opprett én ny mappe per kanal i samme mappe for å slå sammen. Hvis du for eksempel vil slå sammen røde, grønne og blå kanaler, oppretter du 3 mapper og lagrer de tilsvarende sekvensene i disse mappene.
  3. Bruk bare blokkflettingskanaler, fjern de andre blokkene og lagre protokollen som flettekanaler.
    1. Få tilgang til boksene for å angi parametere. For hver kanal fyller du boksene Kanalnummer X (boks 1, 5 eller 9), Mappekanalnummer X (boks 2, 6 eller 10), Separatorkanalnummer X (boks 3, 7 eller 11) og Colormap-kanal nb X (henholdsvis boks 4, 8 og 12).
      MERK: Disse boksene grupperes horisontalt etter fire, hver linje som tilsvarer samme kanal. I hver linje er en skjerm også tilgjengelig (bokser 23, 24 eller 25) for å visualisere sekvensen til den tilsvarende kanalen direkte.
      1. I boksen Kanalnummer Xvelger du hvilken kanal som skal trekkes ut (i klassiske RGB-bilder, 0=Rød, 1=Grønn, 2=Blå). Brukeren får raskt tilgang til de forskjellige kanalene i et bilde i Inspector-vinduet for isete, i kategorien Sekvens. Skriv verdien for den minste kanalen i den øvre linjen og den høyeste i bunnlinjen.
      2. Skriv \Navnet på mappen som inneholder bilder av kanal X, i boksen Mappekanalnummer X.
      3. Skriv skilletegnet som brukes for bildets navn (idet forrige eksemplet: "_red", "_green" og "_blue").
      4. I boksen Colormap-kanal nb Xangir du med et tall som colormap-modell som skal brukes til å visualisere den tilsvarende kanalen i Isen. De tilgjengelige fargekartene er synlige i kategorien Sekvens i inspektørvinduet.
      5. I boksen Format for sammenslåtte bilder (boks 28) skriver du utvidelsen for å lagre sammenslåtte bilder: TIF, GIF, JPG, BMP eller PNG.
        MERK: For å slå sammen bare to kanaler, må du ikke fylle de fire boksene som tilsvarer den tredje kanalen.
    2. Øverst til venstre i blokkeret Slå sammen kanaler klikker du på koblingen direkte til høyre for Mappe. Dobbeltklikk på mappen som inneholder sekvenser av den første kanalen som er definert i boksen Mappekanalnummer 1 (boks 2) i dialogboksen Åpne, som vises. Deretter klikker du på Åpne.
    3. Kjør protokollen ved å klikke på den svarte pilen øverst til venstre i blokkeringen av flettekanaler (se del 7 for mer informasjon). Sammenslåtte bilder lagres i en flettemappe i samme katalog som mappene til enkeltkanaler.

5. Segmentering av regionene av interesse

MERK: Substructure Analyzer integrerer både enkle og mer sofistikerte algoritmer for å foreslå ulike alternativer tilpasset bildekompleksitet og brukerbehov.

  1. Velg den tilpassede blokken.
    1. Hvis objekter ikke berører hverandre, eller brukeren ikke trenger å skille grupperte objekter individuelt, bruker du blokksegmenteringen A: Objekter som ikke er grupperte.
    2. Når objekter ikke berører hverandre, men noen av dem er nære, bruker du blokksegmenteringen B: Dårlig grupperte objekter.
    3. For objekter med et høyt klyngenivå og en konveks figur, bruker du blokksegmentering C: Grupperte objekter med konvekse figurer.
    4. Hvis objekter viser et høyt klyngenivå og har uregelmessige figurer, bruker du blokksegmenteringS D: Grupperte objekter med uregelmessige figurer.
    5. Bruk blokksegmentering E: Klynget cytoplasma til å segmentere berøring av cytoplasmer individuelt ved hjelp av segmenterte kjerner som markører. Denne blokken trenger i viktig grad segmenterte kjerner for å behandle.
      MERK: Blokker tilpasset for primær objektsegmenteringsprosess uavhengig, slik at flere blokker kan brukes i samme kjøring for å sammenligne effektiviteten for en bestemt understruktur eller for å segmentere ulike typer understrukturer. Hvis klyngenivået er heterogent innenfor samme sett med bilder, behandler du små og svært grupperte objekter separat i de tilpassede blokkene.
  2. Koble utdataene (Fil) for blokken Velg mappe til mappeinndataene for den valgte segmenteringsblokken.
  3. Angi parametere for den valgte segmenteringsblokken.
    1. Segmentering A: Objekter som ikke er grupperte og segmentering C: Grupperte objekter med konvekse figurer
      1. I boksen Kanalsignal (boks 1) setter du kanalen for objektene til segment.
      2. Som et alternativ, i boksen Gaussian filter (boks 2), øke X og Y sigma verdier hvis signalet inne objekter er heterogene. Gaussian-filteret jevner ut teksturer for å oppnå mer ensartede regioner og øker hastigheten og effektiviteten til kjernesegmentering. Jo mindre objektene er, jo lavere er sigma-verdien. Unngå høye sigma verdier. Sett standardverdiene til 0.
      3. I boksen HK-Midler (boks 3) angir du parameteren Intensitetsklasser og omtrentlige minimums- og maksimumsstørrelser (i piksler) av objekter som skal oppdages.
        MERK: For intensitetsklasser klassifiserer en verdi på 2 piksler i 2 klasser: bakgrunn og forgrunn. Det er dermed tilpasset når kontrasten mellom objektene og bakgrunnen er høy. Hvis forgrunnsobjekter har forskjellige intensiteter, eller hvis kontrasten med bakgrunnen er lav, øker du antall klasser. Standardinnstillingen er 2. Objektstørrelse kan raskt evalueres ved å tegne en avkastning manuelt rundt objektet av interesse. Størrelsen på avkastningen (Innvendig i piksler) vises direkte på bildet når du peker den med markøren eller kan nås i vinduet avkastningsstatistikk (åpne det fra søkefeltet). Optimale parametere oppdager hvert forgrunnsobjekt i én enkelt avkastning. De kan defineres manuelt i Isete (Gjenkjenning og sporing | HK-Midler).
      4. I boksen Active Contours (boks 4) optimaliserer du gjenkjenningen av objektkantlinjer. Uttømmende dokumentasjon for denne plugin er tilgjengelig på nettet: http://icy.bioimageanalysis.org/plugin/Active_Contours. Riktige parametere kan også defineres manuelt i Isete (Gjenkjenning og sporing | Aktive konturer).
      5. Under prosessen opprettes en mappe automatisk for å lagre bilder av segmenterte objekter. I boksen Tekst (boks 6) navngir du denne mappen (for : Segmenterte kjerner). Hvis du vil angi formatet for lagring av bilder av segmenterte objekter (Tiff, Gif, Jpeg, BMP, PNG), fyller du boksformatet for bilder av segmenterte objekter. Mappen opprettes i mappen som inneholder sammenslåtte bilder.
      6. Kjør arbeidsflyten (hvis du vil ha mer informasjon, kan du se del 7).
    2. Segmentering B: Dårlig grupperte objekter
      1. Følg de samme trinnene som i 5.3.1 for å angi parametere for bokser Kanalsignal, HK-Midler, Active Contours, Utvidelse for å lagre segmenterte objekter og Tekst (Bokser rangeringer er ikke det samme som i trinn 5.3.1).
      2. I boksen Ring IJ plugin (boks 4) angir du rullende parameter for å kontrollere undertrundertappen i bakgrunnen. Sett denne parameteren til minst størrelsen på det største objektet som ikke er en del av bakgrunnen. Å redusere denne verdien øker fjerning av bakgrunnen, men kan også indusere tap av forgrunnssignal.
      3. I boksen Adaptiv histogramme (boks 6) forbedrer du kontrastene mellom forgrunnsobjektene og bakgrunnen. Å øke skråningen gir mer kontrasterte sekvenser.
      4. Kjør arbeidsflyten (hvis du vil ha mer informasjon, kan du se del 7).
    3. Segmentering D: Grupperte objekter med uregelmessige figurer
      MERK: Tre forskjellige metoder for segmentering gjelder for hvert bilde: for det første,HK-betyr klyngerkombinert medAktiv Konturer-metodebrukes. Deretterklassisk vannskillealgoritme(ved hjelp av avstandskartet Euklidian) brukes på tidligere feilsegmenterte objekter. Til slutt, enmarkørbasert vannskillealgoritmebrukes. Bare HK-midler og markørbaserte vannskillemetoder trenger brukermedvirkning. For begge metodene kan de samme parameterne brukes for alle bilder (helautomatisk versjon) eller endres for hvert bilde (halvautomatisk versjon). Hvis brukeren ikke er opplært i disse segmenteringsmetodene, anbefales den halvautomatiske behandlingen på det sterkeste. Under behandlingen av denne blokken er manuell inngripen nødvendig. Når en segmenteringsmetode er fullført, må brukeren manuelt fjerne feilsegmenterte objekter før begynnelsen av neste segmenteringsmetode. Segmenterte objekter lagres og vurderes ikke i neste trinn. Denne blokken må kobles til blokkenDialogboksen Grupperte/heterogene figurer som primærobjekter segmenteringsdialogboksfor å fungere riktig.
      1. Last ned ImageJ-samlingen MorphoLibJ på https://github.com/ijpb/MorphoLibJ/releases. MorphoLibJ 1.4.0-versjonen brukes i denne protokollen. Plasser filen MorphoLibJ_-1.4.0.jar i mappen isete / ij / plugins. Du finner mer informasjon om innholdet i denne samlingen på https://imagej.net/MorphoLibJ.
      2. Følg de samme trinnene som i trinn 5.3.1 for å angi parametere for bokser Kanalsignal, Gaussian filter, Active Contours, Extension for å lagre segmenterte objekter og Tekst. Bokser rangeringer er ikke det samme som i trinn 5.3.1.
      3. Angi parametere for boksen Adaptiv histogrammering (se trinn 5.3.2.3).
      4. Hvis du vil aktivere Trekk fra bakgrunn, skriver du ja i Bruk trekk fra bakgrunn? Ellers skriver du Nei. Hvis programtillegget er aktivert, angir du den rullende parameteren (se trinn 5.3.2), i boksen Trekk fra bakgrunnsparameter (boks 7).
      5. Automatisering av HK-midler: Hvis du vil bruke de samme parameterne for alle bilder (helautomatisk behandling), angir du Nb av klasser (boks 11), Minimumsstørrelsen (boks 12) og Maksimal størrelse (boks13) (se trinn 5.3.1). Disse parameterne må angis for å velge maksimalt forgrunnspiksler og optimalisere individualiseringen av forgrunnsobjekter. For den halvautomatiske behandlingsversjonen er det ikke nødvendig med inngripen.
      6. Automatisering av markøruttrekk: For den helautomatiske versjonen utvider du boksen Intern markøruttrekk (boks 27) og angir verdien for parameteren "dynamisk" i linje 13 i skriptet. For den halvautomatiske behandlingsversjonen er det ikke nødvendig med inngripen.
        MERK: Markører trekkes ut ved å bruke en utvidet minima-transformasjon på et inndatabilde som styres av en "dynamisk" parameter. I den markørbaserte vannskillealgoritmen simuleres flom fra disse markørene for å utføre objektsegmentering. For vellykket segmentering av forgrunnsobjekter, bør en enkelt markør per forgrunnsobjekt trekkes ut. Innstillingen av den "dynamiske" parameteren for optimal markøruttrekk avhenger hovedsakelig av oppløsningen på bildene. Dermed, hvis du ikke er kjent med denne parameteren, bruk den halvautomatiske versjonen.
      7. Kjør arbeidsflyten (hvis du vil ha mer informasjon, kan du se del 7).
      8. I begynnelsen av behandlingen åpnes hk-middelparametere og markerbasert vannskille suksessivt åpent. Hvis du vil bruke de samme parameterne for alle bilder (helautomatisk versjon), klikker du på JA. Ellers klikker du på NEI. En informasjonsboks åpnes og ber om å "Bestemme optimale ROM med HK-Means plugin og lukk bildet". Klikk på OK og bruk HK-Means plugin manuelt (Deteksjon og sporing| Hk-Midler) på bildet, som automatisk åpnes. Velg alternativet Eksporter ROIer i plugin-boksen FOR HK-Midler. Bruk de beste parameterne for å få ROIer som inneholder maksimalt forgrunnspiksler og for å optimalisere individualiseringen av forgrunnsobjekter. Når optimale ROM-er blir funnet, lukker du bildet direkte.
      9. På slutten av den første segmenteringsmetoden åpnes en informasjonsboks og ber om å "Fjerne uønskede ROIer og lukke bildet". Disse ROIene tilsvarer kantlinjene til de segmenterte objektene. Velg OK, og fjern ROIer for feilsegmenterte objekter i bildet, som automatisk åpnes. En avkastning kan enkelt fjernes ved å plassere markøren på kanten og bruke "Slett" -knappen på tastaturet. Lukk. Gjenta den samme prosedyren etter fullføring av det andre segmenteringstrinnet.
      10. På dette stadiet, hvis JA-knappen ble valgt for full automatisering av den markørbaserte vannskillealgoritmen, vil de tidligere angitte parameterne bli brukt på alle bilder.
      11. Hvis NO-knappen ble valgt, åpnes en informasjonsboks og ber om å "Bestemme og justere interne markører". Klikk på OK og innenfor ImageJ-grensesnittet til Icy, gå til Plugins | MorphoLibJ | Minima og Maxima| Utvidet min & Maks. Velg Utvidet Minima iDrift.
      12. Velg Forhåndsvisning for å forhåndsvise det automatisk åpnede bildet resultatet av transformasjonen. Flytt dynamikken til optimale markører observeres. Markører er grupper av piksler med en verdi på 255 (Ikke nødvendigvis hvite piksler). Optimale parametere fører til én markør per objekt. Fokuser på de gjenværende objektene som ikke er godt segmentert med de to tidligere segmenteringsmetodene.
      13. Om nødvendig, forbedre markørene ved å bruke flere morfologiske operasjoner som "Åpning" eller "Lukke" (Plugins | MorphoLibJ | Morfologiske filtre). Når du får det endelige bildet av markører, hold det åpent og lukk alle de andre bildene som slutter med bildet som opprinnelig ble brukt som en inngang for Extended Minima-operasjonen. Klikk på Nei hvis en ImageJ-boks ber om å lagre endringer på dette bildet.
      14. I boksen Nb av bilder med Informasjonsboks (boks 14) bestemmer du hvor mange bilder med informasjonsbokser som skal vises.
    4. Segmentering E: Klynget cytoplasma
      MERK: Denne blokken bruker tidligere segmenterte kjerner som individuelle markører for å initiere cytoplasmasegmentering. Kontroller at blokken av kjernesegmentering har behandlet før du bruker den.
      1. I boksen Channel cytoplasma (boks 1), sett kanalen til cytoplasmatisk signal.
      2. I boksen Utvidelse segmentert kjerner (boks 2), skrive formatet som brukes til å lagre bilder av segmenterte kjerner (tif, jpeg, bmp, png). Standardformatet er tif.
      3. Skriv \Navnet på mappen som inneholder segmenterte kjerner, i boksen Tekst (boks3).
      4. I boksen Format av bilder av segmenterte cytoplasmer (boks 4) angir du formatet som skal brukes til å lagre segmenterte objekter bilder (Tiff, Gif, Jpeg, BMP, PNG).
      5. Under prosessen opprettes en mappe automatisk for å lagre bilder av segmenterte cytoplasmer. I boksen Tekst (boks 5) gir du denne mappen navnet (for del: Segmenterte cytoplasmer) i boksen Tekst (boks 5). Mappen opprettes i mappen som inneholder sammenslåtte bilder.
      6. Følg de samme trinnene som i trinn 5.3.1 for å angi parametere for bokser Gaussian filter og Active Contours (Vær forsiktig, boksrangeringer er ikke det samme som i trinn 5.3.1).
      7. Kjør arbeidsflyten (hvis du vil ha mer informasjon, kan du se del 7).

6. Fluorescerende signaldeteksjon og analyse

  1. Velg den tilpassede blokken.
    1. I blokken Fluorescence Analysis A: 1 Channel, utføre deteksjon og analyse av foci i en kanal inne i en type segmentert objekt: påvisning av coilin foci (rød kanal) i kjernen.
    2. I blokken Fluorescens Analyse B: 2 Kanaler i samme rom, utføre deteksjon og analyse av foci i to kanaler inne i en type segmentert objekt: påvisning av coilin (rød kanal) og 53BP1 (grønn kanal) foci i kjernen.
    3. I blokken Fluorescence Analysis C: 2 Kanaler i to rom,utføre deteksjon og analyse av foci i en eller to kanaler, spesielt inne i kjernene og deres tilsvarende cytoplasma: påvisning av Coilin foci (rød kanal) både innenfor kjernen og dens tilsvarende cytoplasma eller påvisning av Coilin foci (rød kanal) i kjernen og G3BP foci (grønn kanal) innenfor tilsvarende cytoplasma.
    4. I blokken Fluorescence Analysis D: Global Translocationberegner du prosentandelen av signal fra én kanal i to mobilrom (a og b). For eksempel, i en cytoplasma / kjerne translokasjonsanalyse, eksporterer beregnede prosentandeler av kjernefysiske og cytoplasmatiske signaler for hvert bilde i det endelige "Resultater" -regnearket. Formelen som brukes til å beregne kjernefysisk signalprosent, vises nedenfor. Denne blokken kan brukes til et hvilket som helst subcellulært rom:
      Equation 1
    5. I blokken Fluorescence Analysis E: Individuell celleoverføringberegner du prosentandelen av signal fra en kanal i to cellulære rom for hver celle. Denne blokken er spesielt optimalisert for nucleus / cytoplasma translokasjonsanalyse på encellet nivå.
      MERK: Fordi blokken Fluorescensanalyse E: Individuell celletranslokasjon utfører analyse på encellenivå, er det nødvendig med effektiv segmentering av kjerne og cytoplasma.
  2. Koble output0 (Fil) av blokken Velg mappe (blokk 1) til mappeinndata (hvite piler i svarte sirkler) av den valgte blokken.
  3. Angi parameterne for den valgte blokken.
    1. Fluorescensanalyse A: 1 kanal, fluorescensanalyse B: 2 kanaler i samme rom og fluorescensanalyse C: 2 kanaler i to rom
      1. Skriv navnet på mappen som inneholder bilder av segmenterte objekter foran en omvendt skråstrek i boksen Postboksbilder. (For eksempel: \Segmenterte kjerner).
      2. I boksen Format av bilder av segmenterte objekter (boks 2) skriver du formatet som brukes til å lagre bilder av segmenterte objekter (tif, jpeg, bmp, png). Standardformatet er tif.
      3. Skriv Ja i boksen Kill Borders? Ellers skriver du Nei. Installasjonen av MorphoLibJ-samlingen av ImageJ er nødvendig for å bruke denne funksjonen (se trinn 5.3.3).
      4. I boksen(es) Kanalflekker signal, angi kanalen der flekker må oppdages. I klassiske RGB-bilder, 0=Rød, 1=Grønn og 2=Blå.
      5. I boksene Navnet på lokalisert molekyl, skriv navnet på molekylet lokalisering i flekkene. Antall felt som skal angis, avhenger av antall molekyler.
      6. I boksen(e) Wavelet Spot Detector Blockangir du punktregistreringsparametere for hver kanal. Angi skalaen(e) (referert til punktstørrelse), og følsomheten til gjenkjenningen (en mindre følsomhet reduserer antall oppdagede flekker, standardverdien er 100 og minimumsverdien som 0). Uttømmende dokumentasjon av denne plugin er tilgjengelig online: http://icy.bioimageanalysis.org/plugin/Spot_Detector. Parametere kan også defineres manuelt i Isete (Gjenkjenning og sporing | Punktdetektor).
      7. Som et alternativ, i boksen Filtrer avkastning etter størrelse, filtrer de segmenterte objektene der flekker oppdages ved å angi et størrelsesintervall (i piksler). Dette trinnet er spesielt nyttig for å fjerne objekter under eller oversegmentert. Hvis du vil estimere størrelsen på objekter manuelt, kan du se trinn 5.3.1. Standardparametere inkluderer ikke filtrering av ROIer etter størrelse. Blokk 2 Kanaler i to rom inneholder to bokser: Filterkjerner etter størrelse (boks 19) og Filter cytoplasma etter størrelse (boks 46).
      8. Du kan eventuelt filtrere de oppdagede flekkene i boksen Filtrer flekkeretter størrelse i henhold til størrelsen (i piksler) for å fjerne uønskede artefakter. For å manuelt estimere spotstørrelse, klikk på Gjenkjenning og sporing og åpne Spot detektor plugin. Velg Eksporter til avkastning i Utdataalternativer. Vær forsiktig med at standardparametere ikke inkluderer filtrering av flekker etter størrelse, og at filtrerte flekker ikke tas i betraktning for analysen. Antall felt du vil angi, avhenger av antall kanaler.
      9. Du kan eventuelt bruke et ekstra filter i boksen Filterpunkter(kontrast, homogenitet, omkrets, rundhet) på de oppdagede flekkene. Vær forsiktig med at standardparametere ikke inkluderer punktfiltrering, og at filtrerte flekker ikke tas i betraktning for analysen. Antall felt du vil angi, avhenger av antall kanaler.
      10. Du kan eventuelt angi en terskel for området (i piksler) av analyserte flekker i boksene Punktstørrelsesterskel. Antall tellede plasser nedenfor og over denne terskelen eksporteres i det endelige resultatregnearket. Antall bokser som skal informeres, avhenger av antall kanaler.
      11. Kjør arbeidsflyten (hvis du vil ha mer informasjon, kan du se del 7). Data eksporteres i Results et Resultatregneark som er lagret i mappen som inneholder sammenslåtte bilder.
    2. Fluorescensanalyse D: Global translokasjon og fluorescensanalyse E: Individuell celletranslokasjon:
      1. Skriv \Navnet på mappen som inneholder bilder av segmenterte objekter, i boksene Mappebilder (esker 1 og 2). I blokken Fluorescence Analysis D: Global Translocationidentifiseres de to typene avkastning som avkastning og avkastning b. For blokken Fluorescens Analyse E: Individuell celleoverføring, i Mappebilder segmenterte kjerner og mappebilder segmenterte cytoplasmer bokser, skriv navnet på mappen som inneholder segmenterte kjerner og cytoplasmer, henholdsvis.
      2. I boksen Kanalsignal (boks 3) skriver du inn kanalen på signalet.
      3. I boksen Format av bilder av segmenterte objekter (boks 4) skriver du formatet som brukes til å lagre bilder av segmenterte objekter (tif, jpeg, bmp, png). Standardformatet er tif. Alternativet Kill Borders er også tilgjengelig for å fjerne kantlinjeobjekter (se trinn 6.3.1).
      4. Du kan eventuelt filtrere de segmenterte objektene i boksene Filtrer avkastningetter størrelse ved å angi et størrelsesintervall (i piksler). Dette trinnet kan være nyttig å fjerne objekter under eller oversegmentert. Hvis du vil estimere objektstørrelsen manuelt, kan du se trinn 5.3.1. Det er to felt å angi, ett per kanal. Standardparametere inkluderer ikke ROI-filtrering etter størrelse.
      5. Kjør arbeidsflyten (hvis du vil ha mer informasjon, kan du se del 7). Eksportere data i et regneark Resultater som er lagret i mappen som inneholder sammenslåtte bilder.

7. Kjør protokollen

  1. Hvis du vil behandle én blokk i en løpetur, fjerner du tilkoblingen mellom den valgte blokken og blokken Velg mappe. Plasser ønsket blokk på 1st rang. Øverst til venstre i den ønskede blokken klikker du på koblingen direkte til høyre for mappen. Dobbeltklikk mappen som inneholder de sammenslåtte bildene, i dialogboksen Åpne, som vises. Deretter klikker du på Åpne. Klikk på Kjør for å starte arbeidsflyten. Behandlingen kan stoppes ved å Stop klikke på Stopp-knappen.
  2. Hvis du vil behandle ulike blokker i en løpetur, må du beholde tilkoblinger av valgte blokker med blokken Velg mappe (blokk 1). Kontroller at rangeringen tillater god behandling av arbeidsflyten. Hvis en bestemt blokk for eksempel trenger segmenterte objekter for å behandle, må du kontrollere at segmenteringsblokken behandler før. Før du kjører arbeidsflyten, må du fjerne ubrukte blokker og lagre den nye protokollen med et annet navn.
  3. Klikk på Kjør for å starte arbeidsflyten. Når dialogboksen åpen vises, dobbeltklikker du på mappen som inneholder de sammenslåtte bildene. Deretter klikker du på Åpne. Arbeidsflyten kjører automatisk. Stopp om nødvendig behandlingen ved å Stop klikke på Stopp-knappen.
  4. På slutten av behandlingen kontrollerer du at meldingen Arbeidsflyten som ble utført, dukket opp nederst til høyre, og at alle blokkene flagges med et grønt tegn (Figur 2b). Hvis ikke, angir blokken og innsiden av boksen som presenterer feiltegnet elementet for å korrigere (Figur 2b).
    Merk: Når arbeidsflyten er utført, kan ikke et nytt løp startes direkte, og for å behandle arbeidsflyten på nytt, bør minst én blokk flagges med skiltet "klar til å behandle". Hvis du vil endre statusen for en blokk, kan du enten slette og opprette en kobling mellom to bokser i denne blokken, eller bare lukke og åpne protokollen på nytt. Hvis det oppstår en feil under behandlingen, kan et nytt løp startes direkte. Under et nytt løp behandles alle blokkene i rørledningen, selv om noen av dem flagges med det grønne tegnet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Alle de beskrevne analysene er utført på en standard bærbar PC (64-biters firekjerners prosessor ved 2,80 GHz med 16 GB ram (random access Memory) som arbeider med 64-bitersversjonen av Java. Random-access-minne er en viktig parameter å vurdere, avhengig av mengden og oppløsningen på bilder som skal analyseres. Bruk av 32-bitersversjonen av Java begrenser minnet til omtrent 1300 MB, noe som kan være uegnet for big data-analyse, mens 64-bitersversjonen gjør det mulig å øke minnet som er tildelt isete. Figur 3 rapporterer tiden som trengs for segmentering for ulike typer bilder og ulike oppløsninger. Den bekrefter at høy oppløsning i vesentlig grad øker tiden for primærobjektsegmentering.

Dataene som presenteres i de neste avsnittene viser at arbeidsflyten for substrukatoranalysator kan brukes til å løse de fleste vanlige problematiske som oppstår i cellulær og molekylærbiologi (celletelling, focitelling og analyse, translokasjonsanalyse).

Måling i mange celler av den nøyaktige andelen molekyler konsentrert i et gitt rom eller endring av lokalisering på tvers av subcellulære domener kan være en svært tungvint og feilutsatt oppgave, spesielt når den utføres manuelt. Figur 4 illustrerer arbeidsflytens evne til raskt og presist å kvantifisere den godt beskrevne kjernefysiske translokasjonen av transkripsjonsfaktoren NFκB som svar på TNFα-stimulering. Bilder som brukes til analysen ble nådig utarbeidet av Ilya Ravkin (http://www.ravkin.net/SBS/Image-Library.htm) og er offentlig tilgjengelig på Broad Bioimage Benchmark Collection16. Dette settet inneholder bilder av MCF7- og A549-cellelinjer behandlet med økende konsentrasjoner av TNFα. Analysen er utført på mer enn 40 000 celler og 96 bilder (48 bilder for hver kanal) fra MCF7-cellelinjen (Figur 4a). Hele analysen (fra import av bilder til datalagring) tok 26 minutter. Hvert bilde tilsvarer en bestemt TNFα-konsentrasjon. De kjernefysiske/cytoplasmatiske proporsjonene av NFκB var homogene på tvers av alle celler for et gitt bilde. Av denne grunn, for hvert bilde, verdiene av alle kjernefysiske eller cytoplasmatiske piksler ble oppsummert for å beregne kjernefysiske og cytoplasmatiske proporsjoner av NFκB, og individualisering av berøring kjerner / cytoplasma under segmenteringen var ikke nødvendig. DAPI-bilder ble behandlet i segmentering C: Grupperte objekter med konvekse figurer blokk til segmentkjerner og den grønne kanalen ble brukt til å avgrense cytoplasmene med segmentering E: Klynget cytoplasma blokk (Figur 4b). Fluorescensanalyse D: Global translokasjonsblokk ble brukt til å eksportere summen av kjernefysiske og cytoplasmatiske pikselverdier. De oppnådde dataene er representert i en doseresponskurve (figur 4c) og illustrerer økningen av NFκB kjernefysisk proporsjon etter stimulering med økende konsentrasjoner av TNFα.

Arbeidsflyten analyserer ikke bare det globale intensitetssignalet i forskjellige submobile rom, men kan også brukes til å oppdage foci og trekke ut spesifikk informasjon om funksjonene deres. Figur 5a illustrerer påvisning av P-legemer i individuelle celler ved å lokalisere forsterkeren av mRNA-avfelling 4 (EDC4) protein. Segmentering A: Ikke grupperte objekter blokk ble brukt til å segmentere kjerner som presenterer et lavt nivå av klynger, Segmentering E: Clustered cytoplasma blokk for å avgrense cytoplasma og Fluorescence Analysis C: 2 kanaler i to rom for å oppdage EDC4 foci. Segmenterte objekter identifiseres (Segmentert nuclei_0, Segmentert cytoplasms_0), og flere opplysninger samles inn i det tilsvarende regnearket (Segmentert kjerneinformasjon og segmentert cytoplasmer-informasjon) som EDC4-intensiteten eller antall/størrelse på påviste organer i hver avkastning (figur 5b). Før de analyseres, kan oppdagede organer filtreres inn i henhold til deres område, noe som kan være nyttig å utelukke objekter under oppløsningskraften til mikroskopet. For å estimere størrelsen på bevarte objekter, kan det innføres en ekstra områdeterskel. Områder av alle de oppdagede legemene rapporteres i dedikerte regneark (Segmentert nuclei_Distribution foci størrelse, Segmentert cytoplasms_Distribution foci størrelse). I dette eksemplet fremhever vi analysen av to celler (Segmentert nuclei_0 and_1 og segmentert cytoplasm_0 and_1), hvor cytoplasmatiske EDC4-foci oppdages. Merk at selv om signalet fra EDC4-proteinet oppdages i både kjernefysiske og cytoplasmatiske rom, tilsvarer bare de cytoplasmatiske fociene P-legemer. Atomsignalet skyldes sannsynligvis tverrreaktiviteten til antistoffet som brukes til å utføre immunfluorescenseksperimenter. Størrelsen i piksler av hvert av foci er gitt.

Så, som effekten av oksidativt stress (OS) på Cajal Bodies var fortsatt ukjent, vi tok nytte av allsidigheten av arbeidsflyten for å studere det i løpet av tiden kinetikk (2 til 20 timer etter OS induksjon med 500 μM H2O2) (Figur 6). Cajal Bodies er dynamiske strukturer som kjerner og oppløses i nukleoplasma under kontroll av spesifikke parametere som transkripsjonshastigheten eller cellesyklusprogresjonen. Cajal Bodies ble visualisert ved å lokalisere sin viktigste strukturelle og funksjonelle komponent, coilin protein. Informasjon om antall og størrelsen på Cajal-organer ble samlet inn ved å studere 2300 enkeltceller fra høyoppløselige bilder (3840X3072) som inneholder 3 kanaler: DAPI (blå), 53BP1 (grønn) og coilin (rød) (Figur 6a). Full behandling tok mindre enn 1 t. Fordi kjerner presentert konveks form og noen av dem ble gruppert, blokken Segmentering C: Grupperte objekter med konvekse figurer ble valgt til å utføre segmenteringen. Som OS er kjent for å indusere DNA dobbel-strand pauser (DDSBs), p53-bindende protein 1 (53BP1), kjent for å være en viktig effektor av DNA skade signalveier, ble brukt som en markør for å diskriminere mellom stressede og ikke-stressede celler. Faktisk, i fravær av DNA-skader, er 53BP1 homogent fordelt i nukleoplasma, mens etter DNA-skader konsentrerer den seg om DDSB, som danner lett skilles foci i mikroskopi. Tallet og størrelsen på både 53BP1 og coilin kjernefysiske foci i hver celle ble analysert ved hjelp av blokken Fluorescens Analyse B: 2 Kanaler i samme rom. For det første bidro analysen av 53BP1-data til å bestemme for hvert tidspunkt for kinetikkene den beste terskelen for å klassifisere celler i henhold til stressstatus. Blant hele kinetikken induserer OS en betydelig økning av 53BP1-focinummeret med en 11 ganger økning ved 2, 4 og 8 timer etter induksjon av OS (Figur S1). Denne effekten er mindre uttalt ved 6 timer (6,5 ganger) på grunn av et høyere startnivå av DSB i ikke-stressede celler. Selv etter 20 timer gjenstår en vedvarende økning (nesten 6 ganger). Disse dataene gjenspeiler effektiviteten av behandlingen for å indusere operativsystemet og etablere 53BP1 som en effektiv stressmarkør for både tidlige og sene observasjoner i mikroskopi. På den annen side ble en liten andel av stressede celler med lavt nivå av DDSB observert på hvert tidspunkt av kinetikken, noe som tyder på at cellene ikke er homogent stresset, noe som håndhever viktigheten av å bruke en stressmarkør i stresseksperimenter. Basert på ROC-analysen ble det valgt en samlet terskel på 17 53BP1-foci for å diskriminere mellom stressede og ustressede celler gjennom kinetikken (figur S1).

Deretter ble antall og størrelse på kjernefysisk foci av coilin analysert i henhold til cellens stressstatus. En signifikant økning i antall foci ble observert 2, 4 og 6 timer etter stressinduksjon (figur 6b). Den mest vedvarende effekten observeres ved 2 timer, antall celler som har mer enn 10 foci øker fra 0% i de ustressede cellene til 75% i de stressede cellene. Videre hadde mer enn 25% av stressede celler av det tidspunktet mer enn 20 coilin foci. Denne effekten reduseres gradvis til 8 timer. Ved 20 h observeres en liten økning av den første og tredje kvartilene, men data viser også at 84% og 80% av cellene presenterer mindre enn 8 foci i ikke-stressede og stressede celler, henholdsvis. Disse dataene viser at OS også har sene effekter på parametere som kontrollerer kjernen av Cajal Bodies, som kan være forskjellig fra tidlige effekter. Interessant, nøye analyse av funksjonene i coilin kjernefysiske foci viste at den observerte økningen av antall coilin foci forbinder med en reduksjon i deres størrelse (Figur 6c). For eksempel, 2 timer etter OS induksjon, øker andelen coilin foci med et område under 0,2 μm2 fra 26% til 64%. Denne effekten minker til 8 timer, men i motsetning til Cajal Bodies' tall, observeres ingen signifikant endring ved 20 timer. Dette kan gjenspeile at tidlig og sen nukleoplasmisk omfordeling av Cajal Bodies er forskjellige hendelser.

Til sammen tyder disse dataene sterkt på at OS endrer kjernekraften til Cajal Bodies, og induserer en nukleoplasmisk omfordeling til mange mindre kjernefysiske foci. Siden kjernedannelse av Cajal Bodies er drevet av deres protein og RNA komponenter, dette tyder på at OS effekten kan endre sammensetningen av Cajal Bodies. Innenfor Cajal Bodies samhandler coilin-proteinet med flere forskjellige proteinpartnere som komponenter i SMN-komplekset og Sm-proteinene. Disse interaksjonene involverte ofte fosfordomener av coilin, og man kan forestille seg at en endring av strukturen i Cajal Bodies kan knyttes til endringer i fosforyleringsstatusen til coilin. Videre viste nyere arbeider at Cajal Bodies ikke er tilfeldig lokalisert i kjernen, og kan påvirke genuttrykk gjennom proksimal tilknytning til spesifikke genloci17. Gitt alle disse fakta, ville det ikke være overraskende hvis en effekt på Cajal organer funksjonalitet ville følge endringer i deres struktur. Ut fra disse resultatene kan vi også spørre om slike Cajal Bodies' ombygging er en passiv konsekvens av OS eller deltar i responsen ved å samhandle med spesifikke genloci, for eksempel.

For å teste om en endring i coilin-uttrykket kunne endre lokaliseringen og endre kjernen av Cajal Bodies, overuttrykte vi et eksogent GFP-coilin fusjonsprotein. Kjerner ble ikke gruppert, så segmentering ble utført med blokken Segmentering A: Ikke grupperte objekter. Deretter, for å nøyaktig kvantifisere antall og størrelse på coilin foci (rødt signal, kanal 1) i henhold til nivået av GFP-coilin (grønt signal, kanal 2) overuttrykk, blokken Fluorescens Analyse B: 2 Kanaler i samme rom ble brukt. Nivået av GFP-coilin ble reflektert av gjennomsnittlig intensitet av GFP-signalet i individuell kjerne (figur 7a). I celler med middels eller høyt nivå av GFP-coilin overuttrykk (GFP intensitet høyere enn 10), øker antall Cajal Bodies per kjerne betydelig med noen kjerner som viser opptil 21 foci (Figur 7b). Vi la også merke til at lysstyrken (gjennomsnittlig intensitet) av Cajal Bodies øker betydelig parallelt med overuttrykksnivået som fører til intensitetsmetning. Slike mettede regioner kan dermed maskere tilstedeværelsen av mindre og svakere foci. I celler som overutsyrer et middels eller høyt nivå av GFP-coilin, øker størrelsen på Cajal Bodies også betydelig, medianverdiene stiger fra 1 til 2 μm2 (Figur 7c). Videre, mer enn 25% av cellene med en høy GFP-coilin uttrykk nivå stede foci med et område større enn 2,5 μm2,mens det aldri overstiger 0,8 μm2 i ikke-transfiserte celler. Til slutt fører GFP-Coilin overuttrykk til en betydelig økning i både antall og størrelse på Cajal Bodies. Siden OS øker antall Cajal Bodies, men reduserer størrelsen, kan disse dataene gjenspeile at OS-effekten på strukturen til Cajal Bodies er mest sannsynlig indusert av en endring av deres sammensetning i stedet for av en effekt på den cellulære mengden coilin.

Figure 1
Figur 1: Rørledningen Understrukturanalysator
Arbeidsflyten er utviklet i Isete, en åpen samfunnsplattform for bioimageinformatikk, og utfører automatisk analyse av flere fluorescensmikroskopibilder. For det første lastes flerkanalsbilder automatisk i protokollen og forhåndsbehandles for å forbedre, om nødvendig, signalet til støyforholdet og for å fjerne bildeartefakter. Deretter isolerer bildesegmentering områder av interesse (ROIer) fra bakgrunnen. Flere metoder for segmentering er tilgjengelige avhengig av nivået av klynger og arten av objektene av interesse. Segmenterte objekter lagres med en bestemt beskrivelse (for eksempel Bilde name_Nucleus_1) i en bestemt mappe og kan brukes/brukes på nytt for etterfølgende analyse. Fluorescerende signaler som flekker analyseres deretter i ROIene, og flere funksjoner (plassering, størrelse, form, intensitet, tekstur, spotnummer og størrelse) eksporteres deretter til et automatisk opprettet regneark. Alle de målte funksjonene, som antall oppdagede flekker, rapporteres til beskrivelsen av den tilsvarende avkastningen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Grafisk grensesnitt for den isete arbeidsflyten
(a) Arbeidsflyten består av 13 generelle blokker, som kan grupperes i henhold til deres generelle funksjon: Velg mappe (blokk 1) tillate tilgang til bilder; Merge Channels (blokk 2) brukes til å slå sammen forskjellige kanaler med bilder. Blokker 3 til 8 er dedikert til objektsegmentering, hver og en tilpasses for en bestemt kontekst: Segmentering A: Ikke grupperte objekter, Segmentering B: Dårlig grupperte objekter, Segmentering C: Grupperte objekter med konvekse figurer, Segmentering D: Grupperte objekter med uregelmessige figurer (blokk 7, fungerer i forbindelse med blokk 6), Segmentering E: Klyngede cytoplasma . Blokker 9 til 11 brukes til å telle/analysere foci i subcellulære rom: Fluorescens Analyse A: 1 Kanal, Fluorescens Analyse B: 2 Kanaler i samme rom og Fluorescens Analyse C: 2 Kanaler i to rom. Blokkene 12 og 13 er tilpasset for analyse av translokasjonshendelser: Fluorescensanalyse D: Global translokasjon og fluorescensanalyse E: Individuell celleoverføring. (b) Global presentasjon av en blokkarkitektur. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Tid som trengs for segmentering som en funksjon av bildeoppløsning og objektklyngenivå
(a) Grafisk illustrasjon av tiden som trengs for å utføre segmentering avhengig av bildeoppløsning og klyngenivå. To forskjellige segmenteringsblokker er testet: Segmentering A (for objekter som ikke er gruppert) og segmentering D (for grupperte objekter med uregelmessige figurer). Behandlingstidspunktet (i sekunder per bilde) tegnes som en funksjon for bildeoppløsning (antall piksler). (b) Eksempel på bilder analysert med enten Segmentering A eller Segmentering D-blokk. DAPI-farging og segmenterte kjerner er indikert. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Arbeidsflytanalyse av en NFκB kjernefysisk translokasjonsanalyse som svar på TNFα-stimulering
(a) Eksempel på bilder av humane MCF7-celler (human bryst adenokarsinom cellelinje) behandlet med TNFα fra BBBC014 bildesett (Broad Bioimage Benchmark Collection)12. Lokalisering av transkripsjonsfaktoren NFκB er undersøkt i celler behandlet med 12 økende konsentrasjoner av TNFα (fra 0 til 10-7g/ml). For hver konsentrasjon ble 4 replikere gjort. DAPI-bilder (blå kanal) ble behandlet i segmentering C: Grupperte objekter med konvekse figurer blokk til segmentkjerner, og deretter NFκB farging med FITC (grønn kanal) ble brukt til å avgrense cytoplasmaene med segmentering E: Clustered cytoplasma blokk. Fluorescensanalyse D: Global translokasjonsblokk ble brukt til å eksportere summen av kjernefysiske og cytoplasmatiske pikselverdier. (b) Segmenterte kjerner (grå) og cytoplasmer (hvit) brukes til å bestemme den totale intensiteten av NFκB fluorescerende signal i hvert rom. (c) Doseresponskurven hentet fra dataanalyse illustrerer økningen av NFκB kjernefysisk proporsjon etter hvert som TNFα-konsentrasjonen øker. Bilder er i et 8-biters BMP-format, og bildestørrelsen er 1360 x 1024 piksler. For hver konsentrasjon beregnes standardavviket mellom de 4 replikene og illustreres som feilfelt. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: Kvantifisering av EDC4-foci (P-organer) i cytoplasma i individuelle celler
(a) Co-farging med DAPI (blå kanal) og Phalloidin (rød kanal) tillater segmentering og identifisering av cellekjerner og F-actin, henholdsvis. EDC4 protein (grønn kanal) brukes som en markør for påvisning av P-organer kjent for å være utelukkende cytoplasmatiske. Skalalinje, 10 μm. (b) Foci telles, og flere funksjoner (her eksporteres deres område i piksler) til Resultatregnearket strukturert i flere ark. To ark er dedikert til analyse av kjerner og to til analyse av cytoplasmer. Hver rå bygger inn informasjonen om en bestemt avkastning. I Nucleus/Cytoplasma Information sheet eksporteres egenskapene til segmenterte objekter (ROI ID, størrelse og gjennomsnittlig intensitet), etterfulgt av antall oppdagede foci i hver avkastning. Om nødvendig kan en størrelsesterskel (100 piksler i dette eksemplet) legges til, og antall foci under og over denne terskelen rapporteres i de to siste kolonnene. I Nucleus/Cytoplasm_Distribution av foci størrelse ark, er området (i piksler) av alle de oppdagede foci rapportert i rå av tilsvarende avkastning. I dette eksemplet fremhever vi analysen av to celler (Segmentert cytoplasm_0 and_1), hvor cytoplasmatiske EDC4-foci er påvist. Størrelsen i piksler av hvert av foci er også gitt. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: Kinetikk av coilin og 53BP1 nukleoplasmisk fordeling etter oksidativt stress
Analysen av antall og størrelse på foci var basert på mer enn 110 individuelle celler for hver tid punkt fra 3 uavhengige kinetikk. (a) Immunofluorescens påvisning av coilin og 53BP1 foci i HeLa S3 celler gjennom behandling kinetikk med 500 μM H2O2. 53BP1 konsentrerer seg om DNA Double-Strand Break-anlegg og brukes til å vurdere effektiviteten av behandlingen på hver celle. Coilin er beriket i Cajal Bodies. Cellene ble fikset 2, 4, 6, 8 og 20 timer etter oksidativ stressinduksjon og kofarget med anti-coilin (rød kanal) og anti-53BP1 (grønn kanal) antistoffer. Vekt bar, 10 μm. (b) Antall coilin kjernefysiske foci etter oksidativt stress. Resultatene vises som boksplott, der det sentrale merket er medianen, de nedre og øvre kantene av boksen er 25th og 75th persentiler. I celler behandlet med H2O2oppdages en signifikant økning i antall coilin foci og er maksimal etter 2 og 4 timers behandling. Wilcoxon - Mann Whitney testanalyse viser en signifikant forskjell mellom ubehandlede og H2O2 behandlede celler (*, p<0,05; **, p<0,01; ***, p<0.001). (c) Andelen celler i funksjon av coilin foci området (μm2). De fleste foci har et mindre areal på 2 t og 4 t tidspunkter i forhold til kontrollen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7: Studie av Cajal Bodies kjernedannelse i celler som overutsykler et GFP-coilin fusjonsprotein
(a) HeLa S3 celler ble forbigående transfisert i biologiske triplikater med 500 ng av en plasmid uttrykker en GFP-Coilin fusjon protein ved hjelp av en standard prosedyre etter produsentens anbefalinger. Etter 48 timer ble cellene fikset og farget med et antistoff mot coilin. DAPI (blå kanal) tillater å segmentere kjerner. For disse analysene ble mer enn 100 celler analysert. GFP-signalet reflekterer lokalisering av ektopisk koilin-GFP-protein (grønn kanal), mens coilinsignalet (rød kanal) tilsvarer både endogene og eksogene proteinlokalisering. For hver kjerne gjenspeiler den gjennomsnittlige intensiteten til GFP-signalet nivået av coilin-uttrykk. Ifølge denne parameteren har funksjonene i Coilin foci blitt analysert ved hjelp av blokken Fluorescensanalyse B: 2 Kanaler i samme rom. Vektlinje, 10 μm. (b) Forholdet mellom antall coilin foci og gjennomsnittlig GFP-intensitet per kjerne. Resultatene vises som boksplott, der det sentrale merket er medianen, den nedre og øvre kanten av boksen er 25th og 75th persentiler. Wilcoxon - Mann Whitney testanalyse viser en betydelig økning av antall foci for en GFP intensitet > 10 (*, p<0,05; **, p<0.01; ***, p<0.001). (c) Forholdet mellom coilin foci og gjennomsnittlig GFP intensitet per kjerne. Resultatene vises som boksplott, der det sentrale merket er medianen, den nedre og øvre kanten av boksen er 25th og 75th persentiler. Wilcoxon - Mann Whitney testanalyse viser en betydelig økning av området coilin foci for en GFP intensitet > 10 (*, p<0,05; **, p<0.01; ***, p<0.001). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur S1: Kinetikk av 53BP1 nukleoplasmisk fordeling etter oksidativt stress
(a) Kvantifisering av 53BP1 kjernefysiske foci i ubehandlede eller H2O2 behandlede celler etter forskjellige inkubasjonstider. Resultatene vises som boksplott, der det sentrale merket er medianen, den nedre og øvre kanten av boksen er 25th og 75th persentiler. Wilcoxon - Mann Whitney testanalyse viser en signifikant forskjell mellom ubehandlede og H2O2 behandlede celler (*, p<0,05; **, p<0,01; ***, p<0.001). (b) For hvert tidspunkt for kinetikken er det etablert en ROC (Receiver Operating Characteristic)-kurve for å bestemme den beste terskelen for å diskriminere mellom stressede og ustressede celler. Parametrene for hver test rapporteres i tabellen (Følsomhet, spesifisitet, TP: sann positiv, TN: true negative, FP: false positive, FN: false negative). Fra disse dataene var en global terskel på 17 53BP1-foci fast bestemt på å diskriminere stresset fra ikke-stressede celler gjennom kinetikken. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Et økende antall gratis programvareverktøy er tilgjengelige for analyse av fluorescenscellebilder. Brukere må riktig velge tilstrekkelig programvare i henhold til kompleksiteten av deres problematiske, til deres kunnskap i bildebehandling, og til den tiden de ønsker å bruke i sin analyse. Isete, CellProfiler eller ImageJ/Fiji er kraftige verktøy som kombinerer både brukervennlighet og funksjonalitet3. Isete er et frittstående verktøy som presenterer et klart grafisk brukergrensesnitt (GUI), og spesielt dets "Protokoller" pek og klikk grensesnitt der arbeidsflyter enkelt kan utformes eller manipuleres4. Funksjonaliteten til denne programvaren er forbedret ved å støtte og utnytte ImageJ plug-ins, og mye dokumentasjon er tilgjengelig takket være sitt store fellesskap av brukere. Vi brukte denne sterke kombinasjonen av brukervennlighet og funksjonalitet i isete programvaren til å utvikle substructure analyzer arbeidsflyten. Hovedmålet er å foreslå en automatisert løsning for å utføre en full analyse av cellefluorescerende signal fra flere bilder. Analysen omfatter bildeforbehandling, objektsegmentering og fluorescerende signalanalyse.

Flere protokoller deles takknemlig på det iskalde nettstedet og foreslår å bruke isete funksjoner for å oppdage og analysere fluorescerende signaler som cellulære foci. Noen av disse protokollene behandler imidlertid bare ett bilde per kjøring, ikke eksporter resultatene i en bestemt fil eller analyserer én enkelt kanal. Andre inneholder ikke foreløpig segmentering for å bestemme områder av interesse (ROIer) eller foreslå enkle algoritmer som "HK-midler" som ikke er egnet for segmentering av svært grupperte objekter. Substructure Analyzer automatiserer alle trinnene i bildeanalysen fra bildeforbehandling til segmentering av objekter og deteksjon/analyse av fluorescerende signaler. Protokollen foreslår også enkle eller mer komplekse metoder for objektsegmentering og eksport av dataene (navnene på de segmenterte objektene, focianalyse) realiseres i optimaliserte utganger tilpasset det problematiske. CellProfiler foreslår også kraftige rørledninger som består av moduler som innkapsler funksjonalitet18,19. De tilgjengelige rørledningene er godt tilpasset spesifikke problemer. Isete arbeidsflyter er et nettverk av forskjellige bokser, hver av dem utfører en bestemt oppgave. Gjennom "Protokoller"-grensesnittet er bokser som komponerer nettverket intuitive og enkle å manipulere. Substructure Analyzer er tilpasset flere sammenhenger som enkel sammenslåing av kanaler, kvantifisering av fluorescerende signaler distribusjon mellom to subcellulære rom, analyse av foci i en eller flere kanaler fra en eller to cellulære rom i enkelte celler. Flere skjermer gjør det mulig å visualisere de mellomliggende resultatene under hver kjøring for å kontrollere behandlingen. Videre presenterer Isete ikonlinjer som grupperer metodene etter emne, og hvilke funksjoner som finnes i arbeidsflyten, kan manipuleres separat for å teste bestemte parametere manuelt på enkelte bilder før du bruker dem på et helt bildesett.

Som i bioimage analysefeltet, er det mest kritiske trinnet i denne protokollen objektsegmentering. Protokollen foreslår segmentering av primære objekter, som er det meste av tidscellekjernene, og inneholder også en annen blokk som oppgave er å segmentere en annen type objekter i cellen. Kjernesegmentering kan være vanskelig når objektene er svært gruppert slik at de berører eller overlapper sammen. Ulike alternativer for segmentering av primære objekter finnes i protokollen, i henhold til formen på objektene og nivået av klynger selv om det til dag ikke lykkes noen universell algoritme i hele segmenteringen av svært grupperte objekter. Segmenteringsprosessen er hovedsakelig begrenset ved fastsettelse av riktige parametere som kan segmentere en del av objektene, men føre til under- eller oversegmentering av en annen del. Brukeren må utføre forskjellige kjøringer med forskjellige parametere for å få en endelig riktig segmentering, spesielt for grupperte objekter som presenterer heterogene og ikke-konvekse figurer.

Denne protokollen er for det meste begrenset av segmenteringstrinnet, noe som kan være svært tidkrevende og trenger kraftig datamaskinkonfigurasjon for de mest komplekse tilfellene. Mer spesifikt, jo mer tallrike eller komplekse bildene er (grupperte objekter for å segmentere, et høyt antall piksler i bildene), jo mer random-access minne (RAM) brukeren vil kreve. Globalt, for enhver problematisk, brukeren må kjøre protokollen på en 64 bits Java Runtime Environment (fritt tilgjengelig på Java-nettstedet) og å bruke en 64 bits operativsystem (OS) for å øke tilgjengelig minne som brukes av Icy (minnet er begrenset til 1300 MB for 32 bits JRE). På grunn av skriptet fungerer ikke protokollen riktig på en Mac-datamaskin. Videre øker antall parametere med kompleksiteten i problemet og vil kreve mer kunnskap i bildeanalyse. Når det gjelder funksjonalitetskriteriene, har denne protokollen ennå ikke blitt tilpasset for analyse av stablede bilder (tidsstabler, z-stabler) selv om Icy effektivt utfører analyse på denne typen data.

Fremtidige oppdateringer vil bli realisert spesielt for å forbedre segmenteringen av komplekse grupperte objekter. Ytterligere blokker vil bli utviklet for å tilpasse segmenteringen til grupperte cellulære strukturer med uregelmessige ikke-konvekse former. Vi vil også tilpasse arbeidsflyten for analyse av tid og z-stabler (for live bildebehandling og 3D-data).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

G.H. ble støttet av en utdannet stipendiat fra Ministère Délégué à la Recherche et aux Technologies. L.H. ble støttet av en utdannet stipendiat fra Institut de Cancérologie de Lorraine (ICL), mens Q.T. ble støttet av et offentlig stipend overvåket av det franske nasjonale forskningsbyrået (ANR) som en del av det andre "Investissements d'Avenir" -programmet FIGHT-HF (referanse: ANR-15-RHU4570004). Dette arbeidet ble finansiert av CNRS og Université de Lorraine (UMR 7365).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16% Formaldehyde solution (w/v) methanol free Thermo Fisher Scientific 28908 to fix the cells
Alexa Fluor 488 of goat anti-rabbit Thermo Fisher Scientific A-11008 fluorescent secondary antibody
Alexa Fluor 555 of goat anti-mouse Thermo Fisher Scientific A-21425 fluorescent secondary antibody
Alexa Fluor 555 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A34055 fluorescent secondary antibody
Bovine serum albumin standard (BSA) euromedex 04-100-812-E
DMEM Sigma-Aldrich D5796-500ml cell culture medium
Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI Sigma-Aldrich DUO82040-5ML mounting medium
Human: HeLa S3 cells IGBMC, Strasbourg, France cell line used to perform the experiments
Hydrogen peroxide solution 30% (H2O2) Sigma-Aldrich H1009-100ml used as a stressing agent
Lipofectamine 2000 Reagent Thermo Fisher Scientific 11668-019 transfection reagent
Mouse monoclonal anti-coilin abcam ab11822 Coilin-specific antibody
Nikon Optiphot-2 fluorescence microscope Nikon epifluoresecence microscope
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Thermo Fisher Scientific 31985062 transfection medium
PBS pH 7.4 (10x) gibco 70011-036 to wash the cells
Rabbit polyclonal anti-53BP1 Thermo Fisher Scientific PA1-16565 53BP1-specific antibody
Rabbit polyclonal anti-EDC4 Sigma-Aldrich SAB4200114 EDC4-specific antibody
Triton X-100 Roth 6683 to permeabilize the cells

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Möckl, L., Lamb, D. C., Bräuchle, C. Super-resolved fluorescence microscopy: Nobel Prize in Chemistry 2014 for Eric Betzig, Stefan Hell, and William E. Moerner. Angewandte Chemie. 53 (51), 13972-13977 (2014).
  2. Meijering, E., Carpenter, A. E., Peng, H., Hamprecht, F. A., Olivo-Marin, J. -C. Imagining the future of bioimage analysis. Nature Biotechnology. 34 (12), 1250-1255 (2016).
  3. Wiesmann, V., Franz, D., Held, C., Münzenmayer, C., Palmisano, R., Wittenberg, T. Review of free software tools for image analysis of fluorescence cell micrographs. Journal of Microscopy. 257 (1), 39-53 (2015).
  4. de Chaumont, F., et al. Icy: an open bioimage informatics platform for extended reproducible research. Nature Methods. 9 (7), 690-696 (2012).
  5. Girish, V., Vijayalakshmi, A. Affordable image analysis using NIH Image/ImageJ. Indian J Cancer. 41 (1), 47 (2004).
  6. Zaitoun, N. M., Aqel, M. J. Survey on image segmentation techniques. Procedia Computer Science. 65, 797-806 (2015).
  7. Molecular Devices. MetaMorph Microscopy Automation and Image Analysis Software. , Available from: https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/acquisition-and-analysis-software/metamorph-microscopy (2018).
  8. Nikon. NIS-Elements Imaging Software. , Available from: https://www.nikon.com/products/microscope-solutions/lineup/img_soft/nis-element (2014).
  9. Meyer, F., Beucher, S. Morphological segmentation. Journal of Visual Communication and Image Representation. 1 (1), 21-46 (1990).
  10. Schieber, M., Chandel, N. S. ROS Function in Redox Signaling and Oxidative Stress. Current Biology. 24 (10), 453-462 (2014).
  11. D'Autréaux, B., Toledano, M. B. ROS as signalling molecules: mechanisms that generate specificity in ROS homeostasis. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 8 (10), 813-824 (2007).
  12. Davalli, P., Mitic, T., Caporali, A., Lauriola, A., D'Arca, D. ROS, Cell Senescence, and Novel Molecular Mechanisms in Aging and Age-Related Diseases. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2016, 3565127 (2016).
  13. Disher, K., Skandalis, A. Evidence of the modulation of mRNA splicing fidelity in humans by oxidative stress and p53. Genome. 50 (10), 946-953 (2007).
  14. Takeo, K., et al. Oxidative stress-induced alternative splicing of transformer 2β (SFRS10) and CD44 pre-mRNAs in gastric epithelial cells. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 297 (2), 330-338 (2009).
  15. Seo, J., et al. Oxidative Stress Triggers Body-Wide Skipping of Multiple Exons of the Spinal Muscular Atrophy Gene. PLOS ONE. 11 (4), 0154390 (2016).
  16. Will, C. L., Luhrmann, R. Spliceosome Structure and Function. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (7), 003707 (2011).
  17. Ljosa, V., Sokolnicki, K. L., Carpenter, A. E. Annotated high-throughput microscopy image sets for validation. Nature Methods. 9 (7), 637-637 (2012).
  18. Wang, Q., et al. Cajal bodies are linked to genome conformation. Nature Communications. 7, (2016).
  19. Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7, 100 (2006).
  20. McQuin, C., et al. CellProfiler 3.0: Next-generation image processing for biology. PLoS Biology. 16 (7), 2005970 (2018).

Tags

Bioengineering Utgave 161 Fluorescensmikroskopi Bio-bildeanalyse Cellesegmentering Foci-telling Cellulære organer Oksidativt stress Automatisering Translokasjonsanalyse Substructure Analyzer Isete Bilde J
Substructure Analyzer: En brukervennlig arbeidsflyt for rask utforskning og nøyaktig analyse av cellulære organer i fluorescensmikroskopibilder
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Heckler, G., Aigueperse, C., Hettal, … More

Heckler, G., Aigueperse, C., Hettal, L., Thuillier, Q., de Chaumont, F., Dallongeville, S., Behm-Ansmant, I. Substructure Analyzer: A User-Friendly Workflow for Rapid Exploration and Accurate Analysis of Cellular Bodies in Fluorescence Microscopy Images. J. Vis. Exp. (161), e60990, doi:10.3791/60990 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter