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Bioengineering

सबस्ट्रक्चर एनालाइजर: फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी इमेजेज में सेलुलर निकायों के रैपिड एक्सप्लोरेशन और सटीक विश्लेषण के लिए उपयोगकर्ता के अनुकूल वर्कफ्लो

Published: July 15, 2020 doi: 10.3791/60990
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 2, 1
1Université de Lorraine, CNRS, IMoPA F54000 Nancy France, 2Institut Pasteur, BioImage Analysis Unit, CNRS UMR 3691, Paris, France.

Summary

हम फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी छवियों में विशिष्ट सेल डिब्बों में सेलुलर निकायों की तेजी से अन्वेषण और सटीक विश्लेषण के लिए बनाया गया एक स्वतंत्र रूप से उपलब्ध कार्यप्रवाह प्रस्तुत करते हैं। यह उपयोगकर्ता के अनुकूल वर्कफ़्लो ओपन-सोर्स सॉफ्टवेयर बर्फीले पर डिज़ाइन किया गया है और इमेजजे कार्यक्षमताओं का भी उपयोग करता है। पाइपलाइन छवि विश्लेषण में ज्ञान के बिना सस्ती है।

Abstract

पिछले दशक में स्थानिक संकल्प सुधार द्वारा सचित्र फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी तकनीकों में सफलताओं की विशेषता है, लेकिन यह भी लाइव सेल इमेजिंग और उच्च थ्रूपुट माइक्रोस्कोपी तकनीकों में । इसके कारण एक ही प्रयोग के लिए माइक्रोस्कोपी डेटा की मात्रा और जटिलता में लगातार वृद्धि हुई। क्योंकि माइक्रोस्कोपी डेटा का मैनुअल विश्लेषण बहुत समय लगता है, व्यक्तिपरक है, और मात्रात्मक विश्लेषण को प्रतिबंधित करता है, बायोइमेज विश्लेषण का स्वचालन लगभग अपरिहार्य होता जा रहा है। हमने फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी से बायोइमेज में सिग्नल विश्लेषण को पूरी तरह से स्वचालित करने के लिए उपसंरचना विश्लेषक नामक एक सूचना का कार्यप्रवाह बनाया। यह वर्कफ़्लो उपयोगकर्ता के अनुकूल ओपन-सोर्स प्लेटफॉर्म बर्फीले पर विकसित किया गया है और इमेजजे से कार्यक्षमताओं द्वारा पूरा किया जाता है। इसमें सिग्नल टू शोर अनुपात में सुधार करने के लिए छवियों का पूर्व-प्रसंस्करण, कोशिकाओं का व्यक्तिगत विभाजन (कोशिका सीमाओं का पता लगाना) और विशिष्ट कोशिका डिब्बों में समृद्ध कोशिका निकायों का पता लगाना/परिमाणीकरण शामिल है । इस वर्कफ़्लो का मुख्य लाभ उपयोगकर्ता के अनुकूल इंटरफ़ेस के माध्यम से छवि विश्लेषण विशेषज्ञता के बिना उपयोगकर्ताओं के लिए जटिल बायो-इमेजिंग कार्यक्षमताओं का प्रस्ताव करना है। इसके अलावा, यह अत्यधिक मॉड्यूलर है और विभिन्न सेलुलर उप-संरचनाओं में विभिन्न सेल निकायों के तुलनात्मक विश्लेषण के लिए परमाणु/साइटोप्लाज्मिक स्थानांतरण के लक्षण वर्णन से कई मुद्दों के अनुकूल है । इस वर्कफ़्लो की कार्यक्षमता ऑक्सीडेटिव तनाव (ओएस) स्थितियों के तहत कैजल (कुंडलित) निकायों के अध्ययन के माध्यम से सचित्र है। फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के आंकड़े बताते हैं कि ओएस के शामिल होने के कुछ घंटे बाद मानव कोशिकाओं में उनकी अखंडता प्रभावित होती है । इस प्रभाव को छोटे फोसी की बढ़ी हुई संख्या में कॉइलिन के न्यूक्लियेशन को विशेषता कैजल निकायों में कम करने की विशेषता है। सीबी घटकों और आसपास के न्यूक्लियोप्लाज्म के बीच आदान-प्रदान में कॉइलिन की केंद्रीय भूमिका से पता चलता है कि ओएस प्रेरित कॉइलिन का पुनर्वितरण संरचना और कैजल निकायों की कार्यक्षमता को प्रभावित कर सकता है।

Introduction

प्रकाश माइक्रोस्कोपी और, विशेष रूप से, फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी मजबूत और बहुमुखी तकनीक आमतौर पर जैविक विज्ञान में उपयोग किया जाता है। वे अपने विशिष्ट फ्लोरोसेंट लेबलिंग के माध्यम से प्रोटीन या आरएनए जैसे विभिन्न जैव अणुओं के सटीक स्थानीयकरण तक पहुंच देते हैं। पिछले दशक में माइक्रोस्कोपी और इमेजिंग प्रौद्योगिकियों में तेजी से प्रगति की विशेषता है, जैसा कि रसायन विज्ञान में २०१४ नोबेल पुरस्कार से सबूत है एरिक Betzig, स्टीफन डब्ल्यू नरक और विलियम ई. Moerner सुपर हल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी (SRFM)1के विकास के लिए । एसएफआरएम इसे नैनोडामेंसेशन में लाने के लिए पारंपरिक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी की विवर्तन सीमा को बाईपास करता है। लाइव इमेजिंग या उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग दृष्टिकोण जैसी तकनीकों में सुधार भी प्रत्येक प्रयोग के लिए इलाज के लिए डेटा की मात्रा और जटिलता को बढ़ाता है। अधिकांश समय, शोधकर्ताओं को कोशिकाओं की उच्च विषम आबादी का सामना करना पड़ता है और एकल कोशिका स्तर पर फेनोटाइप का विश्लेषण करना चाहते हैं।

शुरू में, फोसी काउंटिंग जैसे विश्लेषण आंख द्वारा किए गए थे, जिसे कुछ शोधकर्ताओं द्वारा पसंद किया जाता है क्योंकि यह मतगणना प्रक्रिया पर पूर्ण दृश्य नियंत्रण प्रदान करता है। हालांकि, इस तरह के डेटा का मैनुअल विश्लेषण बहुत समय लगता है, पर्यवेक्षकों के बीच परिवर्तनशीलता की ओर जाता है, और अधिक जटिल सुविधाओं तक पहुंच नहीं देता है ताकि कंप्यूटर-सहायता प्राप्त दृष्टिकोण व्यापक रूप से उपयोग किए जा रहे हैं और लगभग अपरिहार्य2। बायोइमेज सूचना के तरीके डेटा विश्लेषण की दक्षता में काफी वृद्धि करते हैं और अपरिहार्य ऑपरेटर व्यक्तिपरकता और मैनुअल गिनती विश्लेषण के संभावित पूर्वाग्रह से मुक्त हैं। इस क्षेत्र में बढ़ी हुई मांग और कंप्यूटर पावर के सुधार के कारण बड़ी संख्या में छवि विश्लेषण प्लेटफार्मों का विकास हुआ। उनमें से कुछ स्वतंत्र रूप से उपलब्ध हैं और व्यक्तिगत कंप्यूटर के साथ विश्लेषण करने के लिए विभिन्न उपकरणों तक पहुंच देते हैं। खुले पहुंच उपकरणों का वर्गीकरण हाल ही में3 स्थापित किया गया है और एक शक्तिशाली प्रयोज्य और कार्यक्षमता के संयोजन सॉफ्टवेयर के रूप में बर्फीले4 प्रस्तुत करता है । इसके अलावा, बर्फीले ImageJ के साथ संवाद स्थापित करने का लाभ है।

छवि विश्लेषण विशेषज्ञता के बिना उपयोगकर्ताओं के लिए, मुख्य बाधाएं समस्याग्रस्त के अनुसार उपयुक्त उपकरण का चयन करना और सही ढंग से उन मापदंडों को ट्यून करना है जिन्हें अक्सर अच्छी तरह से समझा नहीं जाता है। इसके अलावा, सेटअप समय अक्सर लंबा होता है। बर्फीले एक व्यापक संग्रह4के भीतर पाया कुछ प्लगइन्स के संयोजन से कार्यप्रवाह विकसित करने के लिए "प्रोटोकॉल" नाम एक उपयोगकर्ता के अनुकूल बिंदु और क्लिक इंटरफेस का प्रस्ताव है । लचीला मॉड्यूलर डिजाइन और पॉइंट-एंड-क्लिक इंटरफेस गैर-प्रोग्रामर के लिए एक विश्लेषण व्यवहार्य स्थापित करते हैं। यहां हम बर्फीले इंटरफ़ेस में विकसित सबस्ट्रक्चर एनालाइजरनामक एक कार्यप्रवाह प्रस्तुत करते हैं, जिसका कार्य विशिष्ट सेलुलर डिब्बों में फ्लोरोसेंट संकेतों का विश्लेषण करना और चमक, फोसी नंबर, फोसी आकार और स्थानिक वितरण के रूप में विभिन्न विशेषताओं को मापना है। यह कार्यप्रवाह सिग्नल स्थानांतरण की मात्राकरण, फ्लोरोसेंट रिपोर्टर व्यक्त करने वाली संक्रमित कोशिकाओं का विश्लेषण, या व्यक्तिगत कोशिकाओं में विभिन्न सेलुलर उपसंरचनाओं से फोसी का विश्लेषण जैसे कई मुद्दों को संबोधित करता है। यह कई छवियों के एक साथ प्रसंस्करण की अनुमति देता है, और आउटपुट परिणाम एक टैब-डीलिमिटेड वर्कशीट को निर्यात किए जाते हैं जिन्हें आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले स्प्रेडशीट कार्यक्रमों में खोला जा सकता है।

सबस्ट्रक्चर एनालाइजर पाइपलाइन को चित्र 1में प्रस्तुत किया गया है । सबसे पहले, एक निर्दिष्ट फ़ोल्डर में निहित सभी छवियों को शोर अनुपात के लिए उनके संकेत में सुधार करने के लिए पूर्व संसाधित किया जाता है। यह कदम निम्नलिखित चरणों की दक्षता को बढ़ाता है और चलने का समय कम हो जाता है। फिर, छवि क्षेत्रों के अनुरूप ब्याज के क्षेत्र (आरओआई), जहां फ्लोरोसेंट सिग्नल का पता लगाया जाना चाहिए, की पहचान की जाती है और खंडित किया जाता है। अंत में, फ्लोरोसेंट सिग्नल का विश्लेषण किया जाता है, और परिणामों को टैब-डीलिम्ड वर्कशीट में निर्यात किया जाता है।

ऑब्जेक्ट सेगमेंटेशन (सीमाओं का पता लगाना) छवि विश्लेषण में सबसे चुनौतीपूर्ण कदम है, और इसकी दक्षता परिणामस्वरूप सेल माप की सटीकता निर्धारित करती है। एक छवि (जिसे प्राथमिक वस्तुओं कहा जाता है) में पहचानी गई पहली वस्तुएं अक्सर डीएनए-सना हुआ छवियों (DAPI या Hoechst धुंधला) से नाभिक होती हैं, हालांकि प्राथमिक वस्तुएं पूरी कोशिकाएं, मोती, धब्बे, ट्यूमर, या जो भी दाग वाली वस्तुएं हो सकती हैं। अधिकांश जैविक छवियों में, कोशिकाएं या नाभिक एक दूसरे को छूते हैं या सरल और तेज एल्गोरिदम को विफल करने के कारण ओवरलैप करते हैं। आज तक, कोई भी सार्वभौमिक एल्गोरिदम सभी वस्तुओं का सही विभाजन नहीं कर सकता है, ज्यादातर इसलिए कि उनकी विशेषताएं (आकार, आकार या बनावट) विभाजन5की दक्षता को संशोधित करती हैं। आमतौर पर माइक्रोस्कोपी सॉफ्टवेयर (जैसे आणविक उपकरणोंद्वाराकायापलट इमेजिंग सॉफ्टवेयर, या निकॉन7द्वारा एनआईएस-एलिमेंट्स एडवांस रिसर्च सॉफ्टवेयर) के साथ वितरित खंडीकरण उपकरण आम तौर पर सहसंबंध मिलान, थ्रेसहोल्ड या रूपात्मक संचालन जैसी मानक तकनीकों पर आधारित होते हैं। हालांकि बुनियादी प्रणालियों में कुशल, इन अतिजनरक्षित तरीकों को अधिक चुनौतीपूर्ण और विशिष्ट संदर्भों में उपयोग किए जाने पर सीमाएं तेजी से मौजूद होती हैं। दरअसल, विभाजन सेल प्रकार, सेल घनत्व, या बायोमार्कर जैसे प्रयोगात्मक मापदंडों के प्रति अत्यधिक संवेदनशील है, और अक्सर एक बड़े डेटा सेट के लिए बार-बार समायोजन की आवश्यकता होती है। सबस्ट्रक्चर एनालाइजर वर्कफ्लो छवि जटिलता और उपयोगकर्ता की जरूरतों के अनुकूल विभिन्न विकल्पों का प्रस्ताव करने के लिए सरल और अधिक परिष्कृत एल्गोरिदम दोनों को एकीकृत करता है। यह विशेष रूप से अत्यधिक संकुल वस्तुओं के लिए मार्कर आधारित वाटरशेड एल्गोरिदम8 का प्रस्ताव करता है। इस विभाजन विधि की दक्षता प्रत्येक वस्तु पर व्यक्तिगत मार्कर के चयन पर निर्भर करती है। इन मार्कर को पूर्ण विभाजन के लिए सही मापदंडों को प्राप्त करने के लिए मैन्युअल रूप से चुना जाता है, जो उपयोगकर्ताओं को उच्च संख्या में वस्तुओं का सामना करने पर अत्यधिक समय लगता है। सबस्ट्रक्चर एनालाइजर इन मार्कर का स्वत: पता लगाने का प्रस्ताव करता है, जो एक अत्यधिक कुशल विभाजन प्रक्रिया प्रदान करता है। विभाजन, अधिकांश समय, छवि विश्लेषण का सीमित कदम है और छवि के संकल्प, प्रति छवि वस्तुओं की संख्या और वस्तुओं के क्लस्टरिंग के स्तर के आधार पर प्रसंस्करण समय को काफी संशोधित कर सकता है। विशिष्ट पाइपलाइनों को मानक डेस्कटॉप कंप्यूटर पर प्रति छवि कुछ सेकंड से 5 मिनट की आवश्यकता होती है। अधिक जटिल छवियों के विश्लेषण के लिए छवि विश्लेषण में अधिक शक्तिशाली कंप्यूटर और कुछ बुनियादी ज्ञान की आवश्यकता हो सकती है।

इस कार्यप्रवाह के लचीलेपन और कार्यक्षमता को प्रतिनिधि परिणामों में विभिन्न उदाहरणों के साथ चित्रित किया गया है। इस कार्यप्रवाह के फायदे विशेष रूप से ऑक्सीडेटिव तनाव (ओएस) स्थितियों के तहत परमाणु उपसंरचनाओं के अध्ययन के माध्यम से प्रदर्शित किए जाते हैं। ओएस ऑक्सीडेंट के पक्ष में रेडॉक्स होमोसेस्टेसिस के असंतुलन से मेल खाता है और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) के उच्च स्तर से जुड़ा हुआ है। चूंकि आरओएस अणुओं को संकेत देने के रूप में कार्य करते हैं, इसलिए उनकी एकाग्रता और उपकोशिकीय स्थानीयकरण में परिवर्तन सकारात्मक या नकारात्मक रूप से असंख्य रास्तों और नेटवर्कों को प्रभावित करते हैं जो शारीरिक कार्यों को विनियमित करते हैं, जिनमें सिग्नल ट्रांसडक्शन, मरम्मत तंत्र, जीन अभिव्यक्ति, सेल मृत्यु और प्रसार9,,10शामिल हैं। ओएस इस प्रकार सीधे विभिन्न विकृतियों (न्यूरोडीजेनेरेटिव और हृदय रोगों, कैंसर, मधुमेह, आदि) में शामिल है, लेकिन यह भी सेलुलर उम्र बढ़ने। इसलिए, मानव सेल के संगठन और समारोह पर ओएस के परिणामों को समझने से मानव विकृतियों की शुरुआत और विकास में ओएस की भूमिकाओं की समझ में एक महत्वपूर्ण कदम बनता है। यह स्थापित किया गया है कि ओएस कई ट्रांसक्रिप्शन कारकों (पी 53, एनआरएफ 2, फॉक्सओ 3 ए)11के माध्यम से प्रतिलेखन को मॉडुलकर करके जीन अभिव्यक्ति को नियंत्रित करता है, लेकिन पूर्व-आरएनए12, 13, 14,13,14जैसे वैकल्पिक स्प्लिसिंग (एएस) जैसी कई सह-और बाद की ट्रांसक्रिप्शनल प्रक्रियाओं के नियमन को प्रभावित करके भी। प्राथमिक कोडिंग और गैर-कोडिंग ट्रांसक्रिप्ट का वैकल्पिक स्प्लिसिंग एक आवश्यक तंत्र है जो ट्रांसक्रिप्ट आइसोफॉर्म का उत्पादन करके जीनोम की एन्कोडिंग क्षमता को बढ़ाता है। जैसा कि एक विशाल राइबोन्यूक्लिकोप्रोटीन कॉम्प्लेक्स द्वारा किया जाता है जिसे स्प्लिकोसोम कहा जाता है, जिसमें लगभग 300 प्रोटीन और 5 यू-रिच छोटे परमाणु आरएनए (UsnRNAs)15होते हैं। स्प्लियोसोम असेंबली और एएस को कोशिकाओं में कसकर नियंत्रित किया जाता है और स्प्लियोसोम परिपक्वता के कुछ कदम झिल्ली-कम परमाणु डिब्बों के भीतर होते हैं जिसकाजल निकाय नाम है। इन परमाणु उपसंरचनाओं को उनकी संरचना और उनकी संरचना की गतिशील प्रकृति की विशेषता है, जो मुख्य रूप से कॉइन प्रोटीन के साथ उनके आरएनए और प्रोटीन घटकों की बहुसंभासीय बातचीत द्वारा आयोजित की जाती हैं। सबस्ट्रक्चर एनालाइजर वर्कफ्लो के साथ हजारों कोशिकाओं के विश्लेषण ने कैजल निकायों पर ओएस के कभी वर्णित प्रभावों के लक्षण वर्णन की अनुमति दी। दरअसल, प्राप्त आंकड़ों से पता चलता है कि ओएस कैजल निकायों के नाभिक को संशोधित करता है, जो कॉइलिन प्रोटीन के न्यूक्लियोप्लाज्मिक पुनर्वितरण को कई छोटे परमाणु फोसी में प्रेरित करता है। कैजल निकायों की संरचना में इस तरह के परिवर्तन से स्प्लिकोसोम की परिपक्वता प्रभावित हो सकती है और ओएस द्वारा एएस मॉड्यूलेशन में भाग ले सकते हैं।

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Protocol

नोट: उपयोगकर्ता के अनुकूल ट्यूटोरियल बर्फीले की वेबसाइट http://icy.bioimageanalysis.orgपर उपलब्ध हैं ।

1. बर्फीले और सबस्ट्रक्चर एनालाइजर प्रोटोकॉल डाउनलोड करें

  1. बर्फीली वेबसाइट(http://icy.bioimageanalysis.org/download) से बर्फीले डाउनलोड करें और सबस्ट्रक्चर एनालाइजर प्रोटोकॉल डाउनलोड करें: http://icy.bioimageanalysis.org/protocols?sort=latest।.
    नोट: यदि 64-बिट ओएस का उपयोग कर रहे हैं, तो जावा के 64-बिट संस्करण का उपयोग करना सुनिश्चित करें। यह संस्करण बर्फीले (वरीयताओं) को आवंटित स्मृति को बढ़ाने की अनुमतिदेता है । जनरल । अधिकतम मेमोरी)।

2. प्रोटोकॉल खोलना

  1. बर्फीले खोलें और रिबन मेनू में टूल्स पर क्लिक करें।
  2. प्रोटोकॉल एडिटर इंटरफेस खोलने के लिए प्रोटोकॉल पर क्लिक करें।
  3. लोड पर क्लिक करें और प्रोटोकॉल सबस्ट्रक्चर एनालाइजर खोलें। प्रोटोकॉल लोड होने में कुछ सेकंड लग सकते हैं। सुनिश्चित करें कि प्रोटोकॉल का उपयोग करने से पहले इसका उद्घाटन पूरा हो गया है।
    नोट: वर्कफ्लो 13 सामान्य ब्लॉकों से बना है जो चित्र 2एमें प्रस्तुत किए गए हैं । प्रत्येक ब्लॉक विशिष्ट उपकार्य प्रदर्शन करने वाले कई बक्से से बना पाइपलाइन के रूप में काम करता है।

3. बर्फीले पर कार्यप्रवाह के साथ बातचीत

नोट: प्रत्येक ब्लॉक या बॉक्स गिने जाता है और कार्यप्रवाह(चित्रा 2b)के भीतर एक विशिष्ट रैंक है। इस नंबर पर क्लिक करके, पहले के निकटतम संभव स्थिति चयनित ब्लॉक/बॉक्स को सौंपा जाता है तो अन्य ब्लॉकों/बक्से की स्थिति को फिर से संगठित किया जाता है । वर्कफ़्लो तैयार करते समय ब्लॉकों के सही क्रम का सम्मान करें। उदाहरण के लिए, स्पॉट डिटेक्टर ब्लॉक को पूर्व-परिभाषित आरओआई की आवश्यकता होती है ताकि विभाजन ब्लॉकों को स्पॉट डिटेक्टर ब्लॉक से पहले चलाना पड़े। बक्से की स्थिति को संशोधित न करें। छवि के नाम में "" का उपयोग न करें।

  1. ऊपरी बाएं कोने आइकन पर क्लिक करके, पतन, विस्तार, विस्तार, संकीर्ण, या ब्लॉक(चित्रा 2b)को हटा दें ।
  2. वर्कफ़्लो की प्रत्येक पाइपलाइन को उनके इनपुट औरआउटपुट (चित्रा 2b)के माध्यम से जुड़े बक्से के नेटवर्क की विशेषता है। कनेक्शन बनाने के लिए, आउटपुट पर क्लिक करें और तब तक बनाए रखें जब तक कि कर्सर इनपुट प्राप्त न कर ले। आउटपुट टैग पर क्लिक करके कनेक्शन निकाले जा सकते हैं।

4. एक छवि के चैनलों का विलय

  1. विलय छवियों को उत्पन्न करने के लिए ब्लॉक मर्ज चैनलों का उपयोग करें। यदि आवश्यक हो, तो फ़ाइलों का नाम बदलें ताकि विलय किए जाने वाले दृश्यों में एक ही नाम का उपसर्ग हो जिसके बाद एक अलग विभाजक हो। उदाहरण के लिए, इमेज ए के अलग-अलग चैनलों के दृश्यों का नाम दिया गया है: ImageA_red, ImageA_blue।
    नोट: विभाजक के लिए, छवि के नाम में पहले से मौजूद पात्रों का उपयोग न करें।
  2. एक ही फ़ोल्डर में, विलय करने के लिए प्रति चैनल एक नया फ़ोल्डर बनाएं। उदाहरण के लिए, लाल, हरे और नीले चैनलों को मर्ज करने के लिए, 3 फ़ोल्डर बनाएं, और इन फ़ोल्डरों में संबंधित दृश्यों को स्टोर करें।
  3. केवल ब्लॉक मर्ज चैनलोंका उपयोग करें, अन्य ब्लॉकों को हटा दें, और प्रोटोकॉल को मर्ज चैनल के रूप में सहेजें।
    1. मापदंडों को निर्धारित करने के लिए बक्से तक पहुंचें। प्रत्येक चैनल के लिए, बॉक्स चैनल नंबर एक्स (बक्से 1, 5 या 9), फ़ोल्डर चैनल नंबर एक्स (बक्से 2, 6 या 10), सेपरेटर चैनल नंबर एक्स (बक्से 3, 7 या 11) और Colormap चैनल nb X (बक्से 4, 8 और 12) क्रमशः भरें ।
      नोट: इन बक्से क्षैतिज चार, प्रत्येक लाइन एक ही चैनल के अनुरूप द्वारा समूहित कर रहे हैं । प्रत्येक पंक्ति में, एक डिस्प्ले भी उपलब्ध है (बक्से 23, 24, या 25) सीधे संबंधित चैनल के अनुक्रम की कल्पना करने के लिए।
      1. बॉक्स चैनल नंबर एक्समें, चुनें कि कौन सा चैनल निकालने के लिए (शास्त्रीय आरजीबी छवियों में, 0 = लाल, 1 = ग्रीन, 2 = नीला)। उपयोगकर्ता जल्दी से बर्फीले की इंस्पेक्टर विंडो के भीतर एक छवि के विभिन्न चैनलों तक पहुंचता है, अनुक्रम टैब में। ऊपरी पंक्ति में सबसे छोटे चैनल का मूल्य और नीचे की पंक्ति में सबसे अधिक लिखें।
      2. बॉक्स फ़ोल्डर चैनल नंबर एक्समें, चैनल एक्स की छवियों वाले फ़ोल्डर का नाम लिखें।
      3. बॉक्स सेपरेटर चैनल नंबर एक्समें, छवि के नाम के लिए उपयोग किए जाने वाले विभाजक को लिखें (पिछले उदाहरण में: "_red", "_green" और "_blue")।
      4. बॉक्स कलरमैप चैनल एनबी एक्समें, बर्फीले में इसी चैनल की कल्पना करने के लिए उपयोग करने के लिए एक नंबर के साथ इंगित करता है जो कलरमैप मॉडल का उपयोग करता है। उपलब्ध कलरमैप इंस्पेक्टर विंडो के सीक्वेंस टैब में दिखाई दे रहे हैं।
      5. विलय छवियों (बॉक्स 28) के बॉक्स प्रारूप में, विलय छवियों को बचाने के लिए विस्तार लिखें: .tif, .gif, .jpg, .bmp या .png.
        नोट: केवल 2 चैनलों को मर्ज करने के लिए, तीसरे चैनल के अनुरूप चार बक्से न भरें।
    2. मर्ज चैनल ब्लॉक के ऊपरी बाएं कोने पर, लिंक पर सीधे फ़ोल्डरके दाईं ओर क्लिक करें। खुले संवाद बॉक्स में जो दिखाई देता है, बॉक्स फ़ोल्डर चैनल नंबर 1 (बॉक्स 2) में परिभाषित किए गए पहले चैनल के दृश्यों वाले फ़ोल्डर पर डबल-क्लिक करें। फिर, ओपनपर क्लिक करें ।
    3. मर्ज चैनल ब्लॉक के ऊपरी बाएं कोने में काले तीर पर क्लिक करके प्रोटोकॉल चलाएं (अधिक जानकारी के लिए भाग 7 देखें)। मर्ज किए गए चित्रों को अलग-अलग चैनलों के फ़ोल्डर के समान निर्देशिका में मर्ज फ़ोल्डर में सहेजा जाता है।

5. ब्याज के क्षेत्रों का विभाजन

नोट: सबस्ट्रक्चर एनालाइजर छवि जटिलता और उपयोगकर्ता की जरूरतों के अनुकूल विभिन्न विकल्पों का प्रस्ताव करने के लिए सरल और अधिक परिष्कृत एल्गोरिदम दोनों को एकीकृत करता है।

  1. अनुकूलित ब्लॉक का चयन करें।
    1. यदि वस्तुएं एक दूसरे को नहीं छूती हैं, या उपयोगकर्ता को व्यक्तिगत रूप से संकुल वस्तुओं में अंतर करने की आवश्यकता नहीं है, तो ब्लॉक सेगमेंटेशन ए: गैर संकुल वस्तुओंका उपयोग करें।
    2. जब वस्तुएं एक दूसरे को नहीं छूती हैं, लेकिन उनमें से कुछ करीब हैं, तो ब्लॉक सेगमेंटेशन बी: खराब संकुल वस्तुओंका उपयोग करें।
    3. उच्च क्लस्टरिंग स्तर और उत्तल आकार वाली वस्तुओं के लिए, ब्लॉक सेगमेंटेशन सी का उपयोग करें: उत्तल आकार के साथ क्लस्टर वस्तुओं।
    4. यदि वस्तुएं उच्च क्लस्टरिंग स्तर प्रस्तुत करती हैं और अनियमित आकार होती हैं, तो ब्लॉक सेगमेंटेशन डी का उपयोग करें: अनियमित आकार के साथ क्लस्टर वस्तुओं।
    5. ब्लॉक सेगमेंटेशन ई का उपयोग करें: मार्कर के रूप में खंडित नाभिक का उपयोग करके व्यक्तिगत रूप से साइटोप्लाज्म को छूने वाले साइटोप्लाज्म को सेगमेंट करने के लिए क्लस्टरेड साइटोप्लाज्म। इस ब्लॉक को प्रक्रिया के लिए अनिवार्य रूप से खंडित नाभिक की आवश्यकता है।
      नोट: प्राथमिक ऑब्जेक्ट सेगमेंटेशन प्रक्रिया के लिए स्वतंत्र रूप से अनुकूलित ब्लॉक ताकि कई ब्लॉकों का उपयोग एक विशेष उपसंरचना के लिए अपनी दक्षता की तुलना करने या विभिन्न प्रकार के उपसंरचनाओं को खंडित करने के लिए एक ही रन में किया जा सके। यदि क्लस्टरिंग स्तर छवियों के एक ही सेट के भीतर विषम है, तो अनुकूलित ब्लॉकों में अलग से छोटी और अत्यधिक संकुल वस्तुओं की प्रक्रिया करें।
  2. ब्लॉक सेलेक्ट फोल्डर के आउटपुट0 (फाइल) को चुने हुए सेगमेंटेशन ब्लॉक के फोल्डर इनपुट से लिंक करें।
  3. चुने हुए विभाजन ब्लॉक के पैरामीटर सेट करें।
    1. विभाजन ए: गैर संकुल वस्तुओं और विभाजन सी: उत्तल आकार के साथ संकुल वस्तुओं
      1. बॉक्स चैनल सिग्नल (बॉक्स 1) में, ऑब्जेक्ट्स के चैनल को सेगमेंट में सेट करें।
      2. एक विकल्प के रूप में, बॉक्स गॉसियन फिल्टर (बॉक्स 2) में, एक्स और वाई सिग्मा मूल्यों को बढ़ाएं यदि वस्तुओं के अंदर संकेत विषम है। गॉसियन फ़िल्टर अधिक समान क्षेत्रों को प्राप्त करने के लिए बनावट को स्मूद करता है और नाभिक विभाजन की गति और दक्षता को बढ़ाता है। वस्तुओं को जितना छोटा होगा, सिग्मा मूल्य जितना कम होगा। उच्च सिग्मा मूल्यों से बचें। 0 के लिए डिफ़ॉल्ट मान निर्धारित करें।
      3. बॉक्स एचके-मीन्स (बॉक्स 3) में, तीव्रता वर्ग पैरामीटर और वस्तुओं के अनुमानित न्यूनतम और अधिकतम आकार (पिक्सल में) का पता लगाने के लिए सेट करें।
        नोट: तीव्रता कक्षाओं के लिए, 2 का मूल्य 2 वर्गों में पिक्सल को वर्गीकृत करता है: पृष्ठभूमि और अग्रभूमि। इस प्रकार यह अनुकूलित किया जाता है जब वस्तुओं और पृष्ठभूमि के बीच विपरीत अधिक होता है। यदि अग्रभूमि वस्तुओं में अलग-अलग तीव्रता होती है या यदि पृष्ठभूमि के साथ विपरीत कम है, तो कक्षाओं की संख्या बढ़ाएं। डिफ़ॉल्ट सेटिंग 2 है। ऑब्जेक्ट आकार को ब्याज की वस्तु के चारों ओर मैन्युअल रूप से आरओआई खींचकर जल्दी से मूल्यांकन किया जा सकता है। आरओआई (पिक्सल में इंटीरियर) का आकार सीधे छवि पर दिखाई देता है जब इसे कर्सर के साथ इंगित किया जाता है या आरओआई सांख्यिकी खिड़की में पहुंचा जा सकता है (इसे खोज बार से खोलें)। इष्टतम पैरामीटर एक ही आरओआई में प्रत्येक अग्रभूमि वस्तु का पता लगातेहैं। उन्हें बर्फीले(डिटेक्शन एंड ट्रैकिंग) में मैन्युअल रूप से परिभाषित किया जा सकता है । HK-का मतलब है)।
      4. बॉक्स सक्रिय आकृति (बॉक्स 4) में, वस्तु सीमाओं का पता लगाने का अनुकूलन करें। इस प्लगइन के लिए संपूर्ण दस्तावेज ऑनलाइन उपलब्ध है: http://icy.bioimageanalysis.org/plugin/Active_Contours। सही मापदंडों को भी मैन्युअल रूप से बर्फीले(डिटेक्शन एंड ट्रैकिंग) में परिभाषित किया जा सकता है । सक्रिय रूपरेखा)।
      5. प्रक्रिया के दौरान, खंडित वस्तुओं की छवियों को सहेजने के लिए एक फ़ोल्डर स्वचालित रूप से बनाया जाता है। बॉक्स टेक्स्ट (बॉक्स 6) में, इस फ़ोल्डर (पूर्व: खंडित नाभिक) का नाम दें। खंडित वस्तुओं (टिफ, जीआईएफ, जेपीईजी, बीएमपी, पीएनजी) की छवियों को सहेजने के लिए प्रारूप निर्धारित करने के लिए, खंडित वस्तुओं की छवियों के बॉक्स प्रारूप को भरें। फ़ोल्डर को फ़ोल्डर में बनाया गया है जिसमें मर्ज किए गए चित्र हैं।
      6. वर्कफ़्लो चलाएं (विवरण के लिए, भाग 7 देखें)।
    2. विभाजन बी: खराब संकुल वस्तुओं
      1. बक्से चैनल सिग्नल, एचके-मीन्स,सक्रिय आकृति, खंडित वस्तुओं और पाठ को बचाने के लिए विस्तार के मापदंड निर्धारित करने के लिए 5.3.1 में समान चरणोंका पालन करें (बॉक्स रैंक चरण 5.3.1 के समान नहीं हैं)।
      2. बॉक्स कॉल आईजे प्लगइन (बॉक्स 4) में, पृष्ठभूमि घटाव को नियंत्रित करने के लिए रोलिंग पैरामीटर सेट करें। इस पैरामीटर को कम से कम सबसे बड़ी वस्तु के आकार में सेट करें जो पृष्ठभूमि का हिस्सा नहीं है। इस मूल्य को कम करने से पृष्ठभूमि हटाने में वृद्धि होती है लेकिन अग्रभूमि संकेत के नुकसान को भी प्रेरित कर सकता है।
      3. बॉक्स अनुकूली हिस्टोग्राम समकरण (बॉक्स 6) में, अग्रभूमि वस्तुओं और पृष्ठभूमि के बीच विरोधाभासों में सुधार करें। ढलान बढ़ाने से अधिक विषम दृश्यों को मिलता है।
      4. वर्कफ़्लो चलाएं (विवरण के लिए, भाग 7 देखें)।
    3. विभाजन डी: अनियमित आकार के साथ संकुल वस्तुओं
      नोट: विभाजन के तीन अलग-अलग तरीके प्रत्येक छवि पर लागू होते हैं: सबसे पहले,HK-का मतलब क्लस्टरिंगके साथ संयुक्तसक्रिय रूपरेखा विधिलागू किया जाता है। फिर,शास्त्रीय वाटरशेड एल्गोरिदम(यूक्लिडियन डिस्टेंस मैप का उपयोग करके) पहले गलत-खंडित वस्तुओं पर लागू किया जाता है। अंत में, एकमार्कर आधारित वाटरशेड एल्गोरिदमप्रयोग किया जाता है। केवल एच-साधन और मार्कर-आधारित वाटरशेड विधियों को उपयोगकर्ता हस्तक्षेप की आवश्यकता है। दोनों तरीकों के लिए, एक ही पैरामीटर सभी छवियों (पूरी तरह से स्वचालित संस्करण) के लिए लागू किया जा सकता है या प्रत्येक छवि (अर्ध-स्वचालित संस्करण) के लिए बदला जा सकता है। यदि उपयोगकर्ता को इन विभाजन विधियों में प्रशिक्षित नहीं किया जाता है, तो अर्ध-स्वचालित प्रसंस्करण की अत्यधिक सिफारिश की जाती है। इस ब्लॉक के प्रसंस्करण के दौरान, मैनुअल हस्तक्षेप की आवश्यकता होती है। जब कोई विभाजन विधि समाप्त हो जाती है, तो उपयोगकर्ता को अगले विभाजन विधि की शुरुआत से पहले गलत-खंडित वस्तुओं को मैन्युअल रूप से हटाना होगा। सफलतापूर्वक खंडित वस्तुओं को सहेजा जाता है और अगले चरण (ओं) में नहीं माना जाता है। इस ब्लॉक को ब्लॉक से जोड़ना होगासंकुल/विषम आकार प्राथमिक वस्तुओं विभाजन संवाद बॉक्ससही ढंग से काम करना।
      1. https://github.com/ijpb/MorphoLibJ/releasesपर ImageJ संग्रह MorphoLibJ डाउनलोड करें । इस प्रोटोकॉल में मोर्फोलिबजे 1.4.0 संस्करण का उपयोग किया जाता है। फाइल को MorphoLibJ_-1.4.0.जार को फोल्डर बर्फीले/ij/प्लगइन्स में रखें । इस संग्रह की सामग्री के बारे में अधिक जानकारी https://imagej.net/MorphoLibJ पर उपलब्ध है।
      2. बॉक्स चैनल सिग्नल, गॉसियन फिल्टर, सक्रिय आकृति, खंडित वस्तुओं और पाठको बचाने के लिए विस्तार के मापदंड निर्धारित करने के लिए चरण 5.3.1 में समान चरणों का पालन करें । बक्से रैंकों कदम 5.3.1 में के रूप में ही नहीं कर रहे हैं।
      3. बॉक्स अनुकूली हिस्टोग्राम समकरण के पैरामीटर सेट करें (चरण 5.3.2.3 देखें)।
      4. घटाना पृष्ठभूमिको सक्रिय करने के लिए, लागू घटाना पृष्ठभूमि में हां लिखें? (बॉक्स 5) । अन्यथा, नलिखें। यदि प्लगइन सक्रिय है, तो बॉक्स घटाना पृष्ठभूमि पैरामीटर (बॉक्स 7) में रोलिंग पैरामीटर (चरण 5.3.2 देखें) सेट करें।
      5. HK-साधनों का स्वचालितीकरण: सभी छवियों (पूरी तरह से स्वचालित प्रसंस्करण) के लिए एक ही पैरामीटर लागू करने के लिए, कक्षाओं के एनबी (बॉक्स 11), न्यूनतम आकार (बॉक्स 12), और अधिकतम आकार (box13) (चरण 5.3.1 देखें) सेट करें। इन मापदंडों को अधिकतम अग्रभूमि पिक्सेल का चयन करने और अग्रभूमि वस्तुओं के व्यक्तिगतकरण को अनुकूलित करने के लिए सेट किया जाना चाहिए। अर्ध-स्वचालित प्रसंस्करण संस्करण के लिए, किसी हस्तक्षेप की आवश्यकता नहीं है।
      6. मार्कर निष्कर्षण का स्वचालितीकरण: पूरी तरह से स्वचालित संस्करण के लिए, बॉक्स आंतरिक मार्कर निष्कर्षण (बॉक्स 27) का विस्तार करें और स्क्रिप्ट के लाइन 13 में "गतिशील" पैरामीटर का मूल्य निर्धारित करें। अर्ध-स्वचालित प्रसंस्करण संस्करण के लिए, किसी हस्तक्षेप की आवश्यकता नहीं है।
        नोट: मार्कर एक "गतिशील" पैरामीटर द्वारा नियंत्रित इनपुट छवि पर एक विस्तारित मिनीमा परिवर्तन लागू करके निकाले जाते हैं। मार्कर-आधारित वाटरशेड एल्गोरिदम में, इन मार्कर से बाढ़ ऑब्जेक्ट सेगमेंटेशन करने के लिए नकली है। अग्रभूमि वस्तुओं के सफल विभाजन के लिए, अग्रभूमि वस्तु के प्रति एक एकल मार्कर निकाला जाना चाहिए। इष्टतम मार्कर निष्कर्षण के लिए "गतिशील" पैरामीटर की स्थापना ज्यादातर छवियों के संकल्प पर निर्भर करती है। इस प्रकार, यदि इस पैरामीटर से परिचित नहीं है, तो अर्ध-स्वचालित संस्करण का उपयोग करें।
      7. वर्कफ़्लो चलाएं (विवरण के लिए, भाग 7 देखें)।
      8. प्रसंस्करण की शुरुआत में, संवाद बॉक्स एचके-मतलब पैरामीटर और मार्कर-आधारित वाटरशेड क्रमिक रूप से खुलते हैं। सभी छवियों (पूरी तरह से स्वचालित संस्करण) के लिए एक ही मापदंडों को लागू करने के लिए, हांपर क्लिक करें । अन्यथा, NOपर क्लिक करें । एक सूचना बॉक्स खुलता है, "HK-का मतलब प्लगइन और बंद छवि के साथ इष्टतम आरओआई निर्धारित करने के लिए पूछ रहा है"। ठीक है पर क्लिक करें और मैन्युअल रूप से HK-साधन प्लगइन(डिटेक्शन एंड ट्रैकिंग)लागू करें। HK-का मतलब है) छवि पर, जो स्वचालित रूप से खुलता है। एचके-मीन्स प्लगइन बॉक्स में एक्सपोर्ट आरओआई ऑप्शन चुनें। अधिकतम अग्रभूमि पिक्सेल वाले आरओआई रखने और अग्रभूमि वस्तुओं के व्यक्तिगतकरण को अनुकूलित करने के लिए सबसे अच्छे मापदंडों को लागू करें। जब इष्टतम आरओआई पाए जाते हैं, तो सीधे छवि को बंद करें।
      9. पहली विभाजन विधि के अंत में, एक सूचना बॉक्स खुलता है और "अवांछित आरओआई और क्लोज इमेज को हटाने" के लिए कहता है। ये आरओआई खंडित वस्तुओं की सीमाओं के अनुरूप हैं। ठीक चुनें और छवि में गलत-खंडित वस्तुओं के ROIs को हटा दें, जो स्वचालित रूप से खुलता है। एक आरओआई को अपनी सीमा पर कर्सर रखकर और कीबोर्ड के "डिलीट" बटन का उपयोग करके आसानी से हटाया जा सकता है। छवि को बंद करें। दूसरे विभाजन चरण के पूरा होने के बाद एक ही प्रक्रिया दोहराएं।
      10. इस स्तर पर, यदि यस बटन को मार्कर-आधारित वाटरशेड एल्गोरिदम के पूर्ण-स्वचालितीकरण के लिए चुना गया था, तो पहले सेट पैरामीटर सभी छवियों पर लागू किए जाएंगे।
      11. यदि कोई बटन नहीं चुना गया था, तो एक सूचना बॉक्स खुलता है, "आंतरिक मार्कर निर्धारित करने और समायोजित करने" के लिए कहता है। ठीक है और बर्फीले के ImageJ इंटरफेस के भीतर पर क्लिक करें, प्लगइन्स के लिए जाओ । मोर्फोलिबजे । मिनीमा और मैक्सिमा। विस्तारित न्यूनतम और अधिकतम। ऑपरेशन में, विस्तारित मिनीमाका चयन करें।
      12. परिवर्तन के परिणामस्वरूप स्वचालित रूप से खोली गई छवि पर प्री-विजुअली करने के लिए पूर्वावलोकन चुनें। जब तक इष्टतम मार्कर नहीं देखे जाते तब तक गतिशील को स्थानांतरित करें। मार्कर 255 (जरूरी नहीं कि सफेद पिक्सल) के मूल्य वाले पिक्सल के समूह हैं। इष्टतम पैरामीटर प्रति ऑब्जेक्ट एक मार्कर का नेतृत्व करते हैं। शेष वस्तुओं पर ध्यान केंद्रित करें जो पिछले दो विभाजन विधियों के साथ अच्छी तरह से खंडित नहीं हुए हैं।
      13. यदि आवश्यक हो, तो "ओपनिंग" या "क्लोजिंग"(प्लगइन्स) जैसे अतिरिक्त रूपात्मक संचालन लागू करके मार्कर में सुधार करें। मोर्फोलिबजे । रूपात्मक फिल्टर)। मार्कर की अंतिम छवि प्राप्त करते समय, इसे खुला रखें और विस्तारित मिनीमा ऑपरेशन के लिए इनपुट के रूप में उपयोग की जाने वाली छवि के साथ समाप्त होने वाली अन्य सभी छवियों को बंद करें। यदि कोई इमेजजे बॉक्स इस छवि पर परिवर्तनों को बचाने के लिए कहता है तो नहीं पर क्लिक करें।
      14. सूचना बॉक्स (बॉक्स 14) के साथ छवियों के बॉक्स एनबी में, यह निर्धारित करें कि सूचना बॉक्स के साथ कितनी छवियां दिखाई नी चाहिए।
    4. विभाजन ई: संकुल साइटोप्लाज्म
      नोट: यह ब्लॉक साइटोप्लाज्म विभाजन शुरू करने के लिए पहले से खंडित नाभिक को व्यक्तिगत मार्कर के रूप में उपयोग करता है। सुनिश्चित करें कि नाभिक विभाजन के ब्लॉक का उपयोग करने से पहले संसाधित किया गया है।
      1. बॉक्स चैनल साइटोप्लाज्म (बॉक्स 1) में, साइटोप्लाज्मिक सिग्नल का चैनल सेट करें।
      2. बॉक्स एक्सटेंशन सेगमेंट्ड न्यूक्लियी (बॉक्स 2) में, खंडित नाभिक (टिफ, जेपीईजी, बीएमपी, पीएनजी) की छवियों को सहेजने के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रारूप को लिखें। डिफॉल्ट फॉर्मेट टिफ है।
      3. बॉक्स टेक्स्ट (बॉक्स3) में, खंडित नाभिक वाले फ़ोल्डर का नाम लिखें।
      4. खंडित साइटोप्लाज्म्स (बॉक्स 4) की छवियों के बॉक्स प्रारूप में, खंडित वस्तुओं छवियों (झगड़ा, जीआईएफ, जेपीईजी, बीएमपी, पीएनजी) को सहेजने के लिए उपयोग करने के लिए प्रारूप निर्धारित करें।
      5. प्रक्रिया के दौरान, खंडित साइटोप्लाज्म की छवियों को सहेजने के लिए एक फ़ोल्डर स्वचालित रूप से बनाया जाता है। बॉक्स टेक्स्ट (बॉक्स 5) में, इस फ़ोल्डर (पूर्व: खंडित साइटोप्लाज्म) का नाम दें। फ़ोल्डर को फ़ोल्डर में बनाया गया है जिसमें मर्ज किए गए चित्र हैं।
      6. बॉक्स गॉसियन फ़िल्टर और सक्रिय आकृति के मापदंडों को निर्धारित करने के लिए चरण 5.3.1 के समान चरणों का पालन करें (सावधान रहें, बॉक्स रैंक चरण 5.3.1 के समान नहीं हैं)।
      7. वर्कफ़्लो चलाएं (विवरण के लिए, भाग 7 देखें)।

6. फ्लोरोसेंट सिग्नल डिटेक्शन एंड एनालिसिस

  1. अनुकूलित ब्लॉक का चयन करें।
    1. ब्लॉक फ्लोरेसेंस एनालिसिस ए में: 1 चैनल,एक प्रकार की खंडित वस्तु के अंदर एक चैनल में फोसी का पता लगाने और विश्लेषण करें: नाभिक के भीतर कॉइन फोसी (लाल चैनल) का पता लगाना।
    2. ब्लॉक फ्लोरेसेंस एनालिसिस बी में: एक ही डिब्बे में 2 चैनल,एक प्रकार की खंडित वस्तु के अंदर दो चैनलों में फोसी का पता लगाने और विश्लेषण करते हैं: न्यूक्लियस के भीतर कॉइलिन (रेड चैनल) और 53बीपी1 (ग्रीन चैनल) फोसी का पता लगाना।
    3. ब्लॉक फ्लोरेसेंस एनालिसिस सी में: दो डिब्बों में 2 चैनल,एक या दो चैनलों में फोसी का पता लगाने और विश्लेषण करते हैं, विशेष रूप से नाभिक और उनके संबंधित साइटोप्लाज्म के अंदर: न्यूक्लियस के भीतर कॉइन फोसी (लाल चैनल) का पता लगाना और इसके इसी साइटोप्लाज्म या न्यूक्लियस के भीतर कॉइन फोसी (लाल चैनल) का पता लगाना (ग्रीन चैनल) इसी सिरास्म के भीतर।
    4. ब्लॉक फ्लोरेसेंस एनालिसिस डी में: ग्लोबल ट्रांसलोकेशन,दो सेलुलर डिब्बों (ए और बी) में एक चैनल से सिग्नल के प्रतिशत की गणना करें। उदाहरण के लिए, एक साइटोप्लाज्म/नाभिक स्थानांतरण परख में, अंतिम "परिणाम" स्प्रेडशीट में प्रत्येक छवि के लिए परमाणु और साइटोप्लाज्मिक संकेतों के निर्यात की गणना प्रतिशत । परमाणु संकेत प्रतिशत की गणना करने के लिए उपयोग किया जाने वाला फार्मूला नीचे दिखाया गया है। इस ब्लॉक का उपयोग किसी भी उपकोशिकीय डिब्बे के लिए किया जा सकता है:
      Equation 1
    5. ब्लॉक फ्लोरेसेंस एनालिसिस ई में: अलग-अलग सेल ट्रांसलोकेशन,प्रत्येक सेल के लिए दो सेलुलर डिब्बों में एक चैनल से सिग्नल के प्रतिशत की गणना करें। यह ब्लॉक एकल कोशिका स्तर पर नाभिक/साइटोप्लाज्म स्थानांतरण परख के लिए विशेष रूप से अनुकूलित है।
      नोट: क्योंकि ब्लॉक फ्लोरेसेंस विश्लेषण ई: व्यक्तिगत सेल ट्रांसलोकेशन एकल-सेल स्तर पर विश्लेषण करता है, नाभिक और साइटोप्लाज्म के कुशल विभाजन की आवश्यकता होती है।
  2. ब्लॉक सेलेक्ट फोल्डर (ब्लॉक 1) के आउटपुट0 (फाइल) को चुने हुए ब्लॉक के फ़ोल्डर इनपुट (काले घेरे में सफेद तीर) से लिंक करें।
  3. चुने हुए ब्लॉक के मापदंडों को निर्धारित करें।
    1. फ्लोरेसेंस एनालिसिस ए: 1 चैनल, फ्लोरेसेंस एनालिसिस बी: एक ही डिब्बे में 2 चैनल और फ्लोरेसेंस एनालिसिस सी: दो डिब्बों में 2 चैनल
      1. बॉक्स फ़ोल्डर छवियों में आरओआई,एक बैकस्लैश से पहले खंडित वस्तुओं की छवियों वाले फ़ोल्डर का नाम लिखें। (उदाहरण के लिए: खंडित नाभिक)।
      2. खंडित वस्तुओं (बॉक्स 2) की छवियों के बॉक्स प्रारूप में, खंडित वस्तुओं (टिफ, जेपीईजी, बीएमपी, पीएनजी) की छवियों को बचाने के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रारूप को लिखें। डिफॉल्ट फॉर्मेट टिफ है।
      3. बॉक्स में सीमाओं को मार डालो?, सीमा वस्तुओं को हटाने के लिए हां लिखें । अन्यथा, नहींलिखें। इमेजजे के मोर्फोलिबजे संग्रह की स्थापना इस फ़ंक्शन का उपयोग करने के लिए आवश्यक है (चरण 5.3.3 देखें)।
      4. बॉक्स (es) चैनल स्पॉट संकेतमें, चैनल जहां स्पॉट का पता लगाया जाना है सेट । शास्त्रीय आरजीबी छवियों में, 0 = लाल, 1 = ग्रीन, और 2 = ब्लू।
      5. बक्से में स्थानीय अणु का नाम,स्थानों में स्थानीयकरण अणु का नाम लिखें। प्रवेश करने के लिए खेतों की संख्या अणुओं की संख्या पर निर्भर करती है।
      6. बॉक्स (es) वेवलेट स्पॉट डिटेक्टर ब्लॉकमें, प्रत्येक चैनल के लिए स्पॉट डिटेक्शन पैरामीटर सेट करें। स्केल (एस) (स्पॉट आकार को संदर्भित) सेट करें, और पता लगाने की संवेदनशीलता (एक छोटी संवेदनशीलता पता लगाए गए स्थानों की संख्या को कम कर देती है, डिफ़ॉल्ट मूल्य 100 और न्यूनतम मूल्य 0 जा रहा है)। इस प्लगइन का संपूर्ण दस्तावेज ऑनलाइन उपलब्ध है: http://icy.bioimageanalysis.org/plugin/Spot_Detector। मापदंडों को भी मैन्युअल रूप से बर्फीले(डिटेक्शन एंड ट्रैकिंग) में परिभाषित किया जा सकता है । स्पॉट डिटेक्टर)।
      7. एक विकल्प के रूप में, आकार के अनुसार बॉक्स फ़िल्टर आरओआईमें, खंडित वस्तुओं को फ़िल्टर करें जहां आकार का अंतराल (पिक्सेल में) सेट करके स्पॉट का पता लगाया जाता है। यह चरण विशेष रूप से अंडर या ओवर-सेगमेंट वस्तुओं को हटाने के लिए उपयोगी है। वस्तुओं के आकार का मैन्युअल रूप से अनुमान लगाने के लिए, चरण 5.3.1 देखें। डिफ़ॉल्ट मापदंडों में आकार के अनुसार आरओआई की फ़िल्टरिंग शामिल नहीं है। दो डिब्बों में ब्लॉक 2 चैनलों में दो बक्से होते हैं: आकार द्वारा फ़िल्टर नाभिक (बॉक्स 19) और आकार द्वारा फ़िल्टर साइटोप्लाज्म (बॉक्स 46)।
      8. वैकल्पिक रूप से, आकार के अनुसार बॉक्स फ़िल्टर स्पॉटमें, अवांछित कलाकृतियों को हटाने के लिए अपने आकार (पिक्सल में) के अनुसार पता लगाया गया स्पॉट फ़िल्टर करें। स्पॉट साइज का मैन्युअल रूप से अनुमान लगाने के लिए, डिटेक्शन और ट्रैकिंग पर क्लिक करें और स्पॉट डिटेक्टर प्लगइन खोलें। आउटपुट विकल्पों में, आरओआई को निर्यातका चयन करें। सावधान रहें कि डिफ़ॉल्ट मापदंडों में आकार के अनुसार स्पॉट की फ़िल्टरिंग शामिल नहीं है, और विश्लेषण के लिए फ़िल्टर किए गए स्पॉट को ध्यान में नहीं रखा जाता है। प्रवेश करने के लिए फ़ील्ड की संख्या चैनलों की संख्या पर निर्भर करती है।
      9. वैकल्पिक रूप से, बॉक्स फ़िल्टर स्पॉटमें, पता लगाने वाले स्थानों पर एक अतिरिक्त फ़िल्टर (कंट्रास्ट, एकरूपता, परिधि, गोलाई) लागू करें। सावधान रहें कि डिफ़ॉल्ट मापदंडों में स्पॉट फ़िल्टरिंग शामिल नहीं है और विश्लेषण के लिए फ़िल्टर किए गए स्पॉट को ध्यान में नहीं रखा जाता है। प्रवेश करने के लिए फ़ील्ड की संख्या चैनलों की संख्या पर निर्भर करती है।
      10. वैकल्पिक रूप से, बक्से स्पॉट आकार सीमामें, विश्लेषण किए गए स्थानों के क्षेत्र (पिक्सल में) के लिए एक सीमा निर्धारित करें। इस सीमा के नीचे और ऊपर गिने गए स्थानों की संख्या अंतिम परिणाम स्प्रेडशीट में निर्यात की जाती है। सूचित किए जाने वाले बक्सों की संख्या चैनलों की संख्या पर निर्भर करती है।
      11. वर्कफ़्लो चलाएं (विवरण के लिए, भाग 7 देखें)। डेटा को विलय किए गए छवियों वाले फ़ोल्डर में सहेजे गए परिणाम स्प्रेडशीट में निर्यात किया जाता है।
    2. फ्लोरेसेंस एनालिसिस डी: ग्लोबल ट्रांसलोकेशन एंड फ्लोरेसेंस एनालिसिस ई: इंडिविजुअल सेल ट्रांसलोकेशन:
      1. बक्से फ़ोल्डर छवियों (बक्से 1 और 2) में, खंडित वस्तुओं की छवियों वाले फ़ोल्डर का नाम लिखें। ब्लॉक फ्लोरेसेंस एनालिसिस डी में: ग्लोबल ट्रांसलोकेशन,दो प्रकार के आरओआई की पहचान आरओआई ए और आरओआई बी के रूप में की जाती है। ब्लॉक फ्लोरेसेंस एनालिसिस ई के लिए: फ़ोल्डर छवियों में अलग-अलग सेल ट्रांसलोकेशन,खंडित नाभिक और फ़ोल्डर छवियों में साइटोप्लाज्म बॉक्स खंडित हैं, क्रमशः खंडित नाभिक और साइटोप्लाज्म युक्त फ़ोल्डर का नाम लिखें।
      2. बॉक्स चैनल सिग्नल (बॉक्स 3) में, सिग्नल के चैनल में प्रवेश करें।
      3. खंडित वस्तुओं (बॉक्स 4) की छवियों के बॉक्स प्रारूप में, खंडित वस्तुओं (टिफ, जेपीईजी, बीएमपी, पीएनजी) की छवियों को बचाने के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रारूप को लिखें। डिफॉल्ट फॉर्मेट टिफ है। सीमा वस्तुओं को हटाने के लिए किल बॉर्डर्स विकल्प भी उपलब्ध है (चरण 6.3.1 देखें)।
      4. वैकल्पिक रूप से, बॉक्स में आकार के अनुसार आरओआई फ़िल्टरकरें, आकार का अंतराल (पिक्सेल में) सेट करके खंडित वस्तुओं को फ़िल्टर करें। यह कदम अंडर या ओवर-सेगमेंट की वस्तुओं को हटाने के लिए उपयोगी हो सकता है। ऑब्जेक्ट आकार का मैन्युअल रूप से अनुमान लगाने के लिए, चरण 5.3.1 देखें। प्रवेश करने के लिए दो फ़ील्ड हैं, एक प्रति चैनल। डिफ़ॉल्ट मापदंडों में आकार के अनुसार आरओआई फ़िल्टरिंग शामिल नहीं है।
      5. वर्कफ़्लो चलाएं (विवरण के लिए, भाग 7 देखें)। विलय किए गए छवियों वाले फ़ोल्डर में सहेजे गए स्प्रेडशीट परिणामों में निर्यात डेटा।

7. प्रोटोकॉल चलाएं

  1. एक भाग में एक ब्लॉक को संसाधित करने के लिए, चयनित ब्लॉक और ब्लॉक सेलेक्ट फ़ोल्डरके बीच कनेक्शन निकालें। वांटेड ब्लॉक को1वीं रैंक पर रखें। वांटेड ब्लॉक के ऊपरी बाएं कोने पर, लिंक पर सीधे फ़ोल्डरके दाईं ओर क्लिक करें। खुले संवाद बॉक्स में जो दिखाई देता है, विलय छवियों वाले फ़ोल्डर पर डबल क्लिक करें। फिर, ओपनपर क्लिक करें । वर्कफ़्लो शुरू करने के लिए रन पर क्लिक करें। स्टॉप बटन पर क्लिक करके प्रोसेसिंग को रोका जा सकता है।
  2. एक रन में विभिन्न ब्लॉकों को संसाधित करने के लिए, ब्लॉक सेलेक्ट फ़ोल्डर (ब्लॉक 1) के साथ चुने गए ब्लॉकों के कनेक्शन रखें। सुनिश्चित करें कि उनकी रैंक कार्यप्रवाह के अच्छे प्रसंस्करण की अनुमति देती है। उदाहरण के लिए, यदि किसी विशिष्ट ब्लॉक को प्रक्रिया करने के लिए खंडित वस्तुओं की आवश्यकता होती है, तो सुनिश्चित करें कि विभाजन ब्लॉक प्रक्रियाओं से पहले। वर्कफ़्लो चलाने से पहले, अप्रयुक्त ब्लॉक निकालें और दूसरे नाम के साथ नए प्रोटोकॉल को सहेजें।
  3. वर्कफ़्लो शुरू करने के लिए रन पर क्लिक करें। जब खुला संवाद बॉक्स दिखाई देता है, तो मर्ज किए गए छवियों वाले फ़ोल्डर पर डबल-क्लिक करें। फिर, ओपनपर क्लिक करें । वर्कफ्लो अपने आप चलता है। यदि आवश्यक हो, तो स्टॉप बटन पर क्लिक करके प्रसंस्करण बंद करें।
  4. प्रसंस्करण के अंत में, जांच करें कि संदेश कार्यप्रवाह सफलतापूर्वक निचले दाहिने हाथ के कोने में दिखाई दिया और सभी ब्लॉकों को हरे रंग के हस्ताक्षर(चित्रा 2b)के साथ झंडी दिखाकर रवाना किया जाता है। यदि नहीं, तो त्रुटि हस्ताक्षर पेश करने वाला ब्लॉक और अंदर का बॉक्स तत्व को सही करने का संकेतदेता है (चित्रा 2b)।
    नोट: कार्यप्रवाह को सफलतापूर्वक निष्पादित करने के बाद, एक नया रन सीधे शुरू नहीं किया जा सकता है, और कार्यप्रवाह को फिर से संसाधित करने के लिए, कम से कम एक ब्लॉक को "प्रक्रिया के लिए तैयार" हस्ताक्षर के साथ फ़्लैग किया जाना चाहिए। ब्लॉक की स्थिति को बदलने के लिए, या तो इस ब्लॉक के अंदर दो बक्से के बीच एक लिंक हटाएं और फिर से बनाएं या प्रोटोकॉल को बंद करें और फिर से खोलें। यदि प्रसंस्करण के दौरान कोई त्रुटि होती है, तो सीधे एक नया रन शुरू किया जा सकता है। एक नए रन के दौरान, पाइपलाइन के सभी ब्लॉकों पर कार्रवाई की जाती है, भले ही उनमें से कुछ को हरे रंग के हस्ताक्षर के साथ हरी झंडी दिखाई जाती है।

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Representative Results

सभी वर्णित विश्लेषण एक मानक लैपटॉप (64-बिट, क्वाड-कोर प्रोसेसर 2.80 गीगाहर्ट्ज पर 16 जीबी रैंडम-एक्सेस मेमोरी (रैम)) पर किया गया है जो जावा के 64-बिट संस्करण के साथ काम कर रहा है। रैंडम-एक्सेस मेमोरी विश्लेषण करने के लिए छवियों की राशि और संकल्प के आधार पर विचार करने के लिए एक महत्वपूर्ण पैरामीटर है। जावा के 32-बिट संस्करण का उपयोग करने से मेमोरी को लगभग 1300 एमबी तक सीमित कर दिया जाता है, जो बड़े डेटा विश्लेषण के लिए अनुपयुक्त हो सकता है, जबकि 64-बिट संस्करण बर्फीले को आवंटित मेमोरी को बढ़ाने की अनुमति देता है। चित्र 3 विभिन्न प्रकार की छवियों और विभिन्न संकल्पों के लिए विभाजन के लिए आवश्यक समय की रिपोर्ट करता है। यह पुष्टि करता है कि उच्च संकल्प प्राथमिक वस्तु विभाजन के समय में काफी वृद्धि करता है।

अगले पैराग्राफ में प्रस्तुत आंकड़ों से पता चलता है कि उपसंरचना विश्लेषक कार्यप्रवाह का उपयोग सेलुलर और आणविक जीव विज्ञान (सेल काउंटिंग, फोसी काउंटिंग और विश्लेषण, स्थानांतरण विश्लेषण) में सामने आई अधिकांश सामान्य समस्याओं को हल करने के लिए किया जा सकता है।

किसी दिए गए डिब्बे के भीतर केंद्रित अणुओं के सटीक अनुपात की कई कोशिकाओं में मापन या उपकोशिकीय डोमेन में स्थानीयकरण का परिवर्तन एक बहुत ही बोझिल और त्रुटि-प्रवण कार्य हो सकता है, खासकर जब इसे मैन्युअल रूप से किया जाता है। चित्रा 4 TNFα उत्तेजना के जवाब में ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर NFοB के अच्छी तरह से वर्णित परमाणु स्थानांतरण को तेजी से और ठीक से निर्धारित करने के लिए कार्यप्रवाह की क्षमता को दर्शाता है। विश्लेषण के लिए उपयोग की जाने वाली छवियों को इलिया रावकिन(http://www.ravkin.net/SBS/Image-Library.htm)द्वारा शालीनता से संकलित किया गया था और यह व्यापक बायोइमेज बेंचमार्क संग्रह16में सार्वजनिक रूप से उपलब्ध हैं । इस सेट में TNFα की बढ़ती सांद्रता के साथ इलाज MCF7 और A549 सेल लाइनों की छवियां शामिल हैं। विश्लेषण MCF7 सेल लाइन (चित्रा 4a) से 40,000 से अधिक कोशिकाओं और 96 छवियों (प्रत्येक चैनल के लिए48 छवियों)पर किया गया है। पूरे विश्लेषण (छवियों के आयात से डेटा बचत के लिए) 26 मिनट लग गए । प्रत्येक छवि एक विशिष्ट TNFα एकाग्रता से मेल खाती है। NFοB के परमाणु/साइटोप्लाज्मिक अनुपात एक दिए गए छवि के लिए सभी कोशिकाओं में सजातीय थे । इस कारण से, प्रत्येक छवि के लिए, सभी परमाणु या साइटोप्लाज्मिक पिक्सेल के मूल्यों को NFB के परमाणु और साइटोप्लाज्मिक अनुपात की गणना करने के लिए अभिव्यक्त किया गया था, और उनके विभाजन के दौरान नाभिक/साइटोप्लाज्म को छूने के व्यक्तिगतकरण की आवश्यकता नहीं थी। डेपी छवियों को सेगमेंटेशन सी में संसाधित किया गया था: उत्तल आकार ब्लॉक के साथ क्लस्टर ऑब्जेक्ट्स को नाभिक को खंडित करने के लिए और हरे चैनल का उपयोग सेगमेंटेशन ई: क्लस्टरेड साइटोप्लाज्म ब्लॉक(चित्रा 4b)के साथ साइटोप्लाज्म को चित्रित करने के लिए किया गया था। फ्लोरेसेंस एनालिसिस डी: ग्लोबल ट्रांसलोकेशन ब्लॉक का इस्तेमाल न्यूक्लियर और साइटोप्लाज्मिक पिक्सल वैल्यूज के योग को एक्सपोर्ट करने के लिए किया गया था । प्राप्त डेटा को खुराक-प्रतिक्रिया वक्र(चित्रा 4c)में दर्शाया जाता है और टीएनएफएα की बढ़ती सांद्रता के साथ उत्तेजना के बाद एनएफएबी परमाणु अनुपात की वृद्धि को दर्शाता है।

वर्कफ्लो न केवल विभिन्न उप-सेलुलर डिब्बों में वैश्विक तीव्रता संकेत का विश्लेषण करता है बल्कि इसका उपयोग फोसी का पता लगाने और उनकी विशेषताओं के बारे में विशिष्ट जानकारी निकालने के लिए भी किया जा सकता है। चित्रा 5a एमआरएनए डिकैपिंग 4 (ईडीसी4) प्रोटीन के बढ़ाने वाले को स्थानीयकरण करके व्यक्तिगत कोशिकाओं में पी-निकायों का पता लगाने को दर्शाता है। सेगमेंटेशन ए: नॉन क्लस्टर्ड ऑब्जेक्ट्स ब्लॉक का उपयोग नाभिक को खंडित करने के लिए किया गया था जो क्लस्टरिंग का निम्न स्तर प्रस्तुत करता है, सेगमेंटेशन ई: क्लस्टरेड साइटोप्लाज्म ब्लॉक साइटोप्लाज्म और फ्लोरेसेंस एनालिसिस सी को चित्रित करने के लिए: ईडीसी 4 फोसी का पता लगाने के लिए दो डिब्बों में 2 चैनल। खंडित वस्तुओं की पहचान की जाती है (खंडित nuclei_0, खंडित cytoplasms_0), और कई जानकारी संबंधित वर्कशीट (खंडित नाभिक सूचना और खंडित साइटोप्लाज्म जानकारी) जैसे EDC4 मतलब तीव्रता या प्रत्येक आरओआई(चित्रा 5b)में पता लगाया निकायों की संख्या/आकार में एकत्र की जाती है । विश्लेषण किए जाने से पहले, पता लगाए गए निकायों को उनके क्षेत्र के अनुसार प्रारंभिक रूप से फ़िल्टर किया जा सकता है, जो माइक्रोस्कोप की संकल्प शक्ति के नीचे की वस्तुओं को बाहर करने के लिए उपयोगी हो सकता है। संरक्षित वस्तुओं के आकार का अनुमान लगाने के लिए, एक अतिरिक्त क्षेत्र सीमा शुरू की जा सकती है। सभी पता लगाया निकायों के क्षेत्रों समर्पित वर्कशीट (खंडित nuclei_Distribution foci आकार, खंडित cytoplasms_Distribution foci आकार) में सूचित कर रहे हैं । इस उदाहरण में, हम दो कोशिकाओं (खंडित nuclei_0 and_1 और खंडित cytoplasm_0 and_1) के विश्लेषण को उजागर करते हैं, जहां साइटोप्लाज्मिक ईडीसी 4 फोसी का पता लगाया जाता है। ध्यान दें कि भले ही परमाणु और साइटोप्लाज्मिक दोनों डिब्बों में EDC4 प्रोटीन के संकेत का पता चला है, केवल साइटोप्लाज्मिक फोसी पी-बॉडी के अनुरूप है। परमाणु संकेत सबसे अधिक संभावना एंटीबॉडी की क्रॉस-रिएक्टिविटी से इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रयोगों को करने के लिए इस्तेमाल किया परिणाम । हर फोसी के पिक्सल में साइज दिया गया है।

फिर, चूंकि कैजल बॉडीज पर ऑक्सीडेटिव स्ट्रेस (ओएस) का प्रभाव अभी भी अज्ञात था, इसलिए हमने कार्यप्रवाह की बहुमुखी प्रतिभा का लाभ उठाते हुए समय के दौरान इसका अध्ययन किया (500 माइक्रोन एच 2 ओ 2 )(चित्र 6)के साथ ओएस इंडक्शन के 2 से20घंटे बाद।2 कैजल बॉडीज ट्रांसक्रिप्शन रेट या सेल साइकल प्रोग्रेशन जैसे विशिष्ट मापदंडों के नियंत्रण में न्यूक्लियोप्लाज्म के भीतर नाभिक और भंग करने वाली गतिशील संरचनाएं हैं। कैजल निकायों को उनके मुख्य संरचनात्मक और कार्यात्मक घटक, कॉइलिन प्रोटीन को स्थानीयकृत करके कल्पना की गई थी। 3 चैनलों: DAPI (नीला), 53BP1 (हरा) और कॉइलिन (लाल)(चित्रा 6a)युक्त उच्च संकल्प छवियों (3840X3072) से २३०० व्यक्तिगत कोशिकाओं का अध्ययन करके Cajal निकायों की संख्या और आकार के बारे में जानकारी एकत्र की गई । पूर्ण प्रसंस्करण में 1 घंटे से भी कम समय लगा। क्योंकि नाभिक प्रस्तुत उत्तल आकार और उनमें से कुछ संकुल थे, ब्लॉक विभाजन सी: उत्तल आकार के साथ संकुल वस्तुओं विभाजन प्रदर्शन करने के लिए चुना गया था । के रूप में ओएस डीएनए डबल स्ट्रैंड टूटता है (DDSBs), p53 बाध्यकारी प्रोटीन 1 (53BP1), डीएनए क्षति संकेत रास्ते के एक आवश्यक प्रभावक के रूप में जाना जाता है प्रेरित करने के लिए जाना जाता है, एक मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया गया था तनावग्रस्त और गैर जोर दिया कोशिकाओं के बीच भेदभाव । दरअसल, डीएनए क्षति के अभाव में, 53BP1 को न्यूक्लियोप्लाज्म के भीतर सजातीय रूप से वितरित किया जाता है, जबकि डीएनए क्षति के बाद, यह डीडीएसबी पर केंद्रित है, जो माइक्रोस्कोपी में आसानी से अलग करने योग्य फोसी बनाते हैं। प्रत्येक कोशिका में 53बीपी1 और कॉइलिन न्यूक्लियर फोसी दोनों की संख्या और आकार का विश्लेषण ब्लॉक फ्लोरेसेंस एनालिसिस बी: 2 चैनल्स इन एक ही डिब्बे मेंकरके किया गया था । सबसे पहले, 53BP1 डेटा के विश्लेषण के लिए काइनेटिक्स के प्रत्येक समय बिंदु के लिए निर्धारित करने के लिए सबसे अच्छा सीमा उनके तनाव की स्थिति के अनुसार कोशिकाओं को वर्गीकृत करने में मदद की । पूरे काइनेटिक्स में, ओएस ओएस(चित्रा एस1) के प्रेरण के बाद 11 गुना वृद्धि के साथ 53बीपी1 फोसी संख्या में 2, 4 और 8 घंटे की उल्लेखनीय वृद्धि लाती है। गैर-तनावग्रस्त कोशिकाओं में डीएसबी के उच्च प्रारंभिक स्तर के कारण यह प्रभाव 6 एच (6.5 गुना) पर कम स्पष्ट होता है। यहां तक कि 20 घंटे के बाद, एक निरंतर वृद्धि बनी हुई है (लगभग 6 गुना)। ये डेटा ओएस को प्रेरित करने और माइक्रोस्कोपी में प्रारंभिक और देर से टिप्पणियों के लिए एक कुशल तनाव-मार्कर के रूप में 53BP1 स्थापित करने के लिए उपचार की दक्षता को दर्शाते हैं। दूसरी ओर, काइनेटिक्स के प्रत्येक समय बिंदु पर डीडीएसबी के निम्न स्तर के साथ तनावग्रस्त कोशिकाओं का एक छोटा सा अनुपात देखा गया, जिससे यह सुझाव दिया गया कि कोशिकाओं को सजातीय रूप से जोर नहीं दिया जाता है, तनाव प्रयोगों में तनाव मार्कर का उपयोग करने के महत्व को लागू करना । आरओसी विश्लेषण के आधार पर, 17 53BP1 फोसी की एक समग्र सीमा का चयन काइनेटिक्स(चित्रा S1)में तनावग्रस्त और तनावग्रस्त कोशिकाओं के बीच भेदभाव करने के लिए किया गया था।

फिर सेल की स्ट्रेस स्टेटस के हिसाब से कॉइलिन के न्यूक्लियर फोसी की संख्या और साइज का विश्लेषण किया गया । तनाव प्रेरण(चित्रा 6b)के बाद फोसी की संख्या में उल्लेखनीय वृद्धि 2, 4 और 6 घंटे देखी गई। सबसे निरंतर प्रभाव 2 घंटे में मनाया जाता है, 10 से अधिक फोसी वाली कोशिकाओं की संख्या तनावग्रस्त कोशिकाओं में 0% से बढ़कर 75% हो जाती है। इसके अलावा, उस समय बिंदु की तनावग्रस्त कोशिकाओं में से 25% से अधिक 20 कॉइन फोसी थे। यह प्रभाव उत्तरोत्तर 8 घंटे तक कम हो जाता है। 20 घंटे में, पहली और तीसरी क्वार्टाइल्स की एक छोटी सी वृद्धि देखी जाती है, लेकिन डेटा यह भी दर्शाता है कि 84% और 80% कोशिकाएं क्रमशः गैर-तनावग्रस्त और तनावग्रस्त कोशिकाओं में 8 फोसी से कम मौजूद हैं। इन आंकड़ों से पता चलता है कि ओएस का कैजल निकायों के नाभिक को नियंत्रित करने वाले मापदंडों पर भी देर से प्रभाव पड़ता है, जो शुरुआती प्रभावों से अलग हो सकता है। दिलचस्प बात यह है कि कॉइलिन न्यूक्लियर फोसी की विशेषताओं के सावधानीपूर्वक विश्लेषण से पता चला है कि उनके आकार(चित्रा 6c)में कमी के साथ कॉइन फोसी एसोसिएट्स की संख्या में वृद्धि हुई है। उदाहरण के लिए, ओएस इंडक्शन के बाद 2 एच, 0.2 माइक्रोन2 से नीचे के क्षेत्र के साथ कॉइलिन फोसी का अनुपात 26% से बढ़कर 64% हो जाता है। यह प्रभाव 8 घंटे तक कम हो जाता है, लेकिन, सीजल निकायों की संख्या के विपरीत, 20 घंटे में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन नहीं देखा जाता है। यह प्रतिबिंबित हो सकता है कि सीजल निकायों के प्रारंभिक और देर से न्यूक्लियोप्लाज्मिक पुनर्वितरण अलग-अलग घटनाएं हैं।

कुल मिलाकर इन आंकड़ों का दृढ़ता से सुझाव है कि ओएस कैजल निकायों की नाभिक शक्ति को बदलता है, जो कई छोटे परमाणु फोसी में न्यूक्लियोप्लाज्मिक पुनर्वितरण को प्रेरित करता है। चूंकि कैजल निकायों का नाभिक उनके प्रोटीन और आरएनए घटकों से प्रेरित है, इसलिए इससे पता चलता है कि ओएस प्रभाव कैजल निकायों की संरचना को बदल सकता है। कैजल निकायों के भीतर, कॉइलिन प्रोटीन एसएमएन कॉम्प्लेक्स और एसएम प्रोटीन के घटकों जैसे कई अलग-अलग प्रोटीन भागीदारों के साथ बातचीत करता है। इन बातचीत में अक्सर कॉइलिन के फॉस्फोडोमेन शामिल होते थे, और कोई कल्पना कर सकता है कि कैजल निकायों की संरचना का एक संशोधन कॉइलिन की फॉस्फोरिलेशन स्थिति में परिवर्तन से जोड़ा जा सकता है। इसके अलावा, हाल के कार्यों से पता चला है कि कैजल निकायों को नाभिक के भीतर बेतरतीब ढंग से स्थानीयकृत नहीं किया जाता है, और विशिष्ट जीन लोकी17के साथ समीपस्थ संबंध के माध्यम से जीन अभिव्यक्ति को प्रभावित कर सकते हैं। इन सभी तथ्यों को देखते हुए, यह आश्चर्य की बात नहीं होगी अगर सीजल निकायों की कार्यक्षमता पर एक प्रभाव उनकी संरचना में परिवर्तन के साथ होगा । इन परिणामों से, हम यह भी पूछ सकते हैं कि क्या इस तरह के कैजल बॉडीज की रिमॉडलिंग ओएस का एक निष्क्रिय परिणाम है या उदाहरण के लिए विशिष्ट जीन लोकी के साथ बातचीत करके प्रतिक्रिया में भाग लेता है।

यह परीक्षण करने के लिए कि क्या कॉइलिन अभिव्यक्ति में परिवर्तन इसके स्थानीयकरण को बदल सकता है और कैजल निकायों के नाभिक को बदल सकता है, हमने एक बहिर्जात जीएफपी-कॉइन फ्यूजन प्रोटीन को अधिक व्यक्त किया। नाभिक संकुल नहीं थे, इसलिए विभाजन ब्लॉक विभाजन ए: गैर संकुल वस्तुओंके साथ किया गया था। फिर, जीएफपी-कॉइलिन (ग्रीन सिग्नल, चैनल 2) ओवरएक्सप्रेशन के स्तर के अनुसार कॉइलिन फोसी (रेड सिग्नल, चैनल 1) की संख्या और आकार को ठीक से निर्धारित करने के लिए, ब्लॉक फ्लोरेसेंस एनालिसिस बी: एक ही डिब्बे में 2 चैनल का उपयोग किया गया था। जीएफपी-कॉइलिन का स्तर व्यक्तिगत नाभिक(चित्र 7 ए)में जीएफपी सिग्नल की औसत तीव्रता से परिलक्षित होता था। जीएफपी-कॉइलिन ओवरएक्सप्रेशन (जीएफपी की तीव्रता 10 से अधिक) के मध्यम या उच्च स्तर वाली कोशिकाओं में, प्रति नाभिक के साथ कैजल निकायों की संख्या में काफी वृद्धि होती है, जिसमें कुछ नाभिक 21 फोसी(चित्रा 7b)तक प्रदर्शित होते हैं। हमने यह भी देखा कि कैजल निकायों की चमक (औसत तीव्रता) अतिव्यक्तता स्तर के समानांतर में काफी बढ़ जाती है जिससे तीव्रता संतृप्ति होती है। इस तरह के संतृप्त क्षेत्र इस प्रकार छोटे और बेहोश फोसी की उपस्थिति को मुखौटा कर सकते हैं। जीएफपी-कॉइलिन के मध्यम या उच्च स्तर की कोशिकाओं में, कैजल निकायों का आकार भी काफी बढ़ जाता है, औसत मूल्य 1 से 2 माइक्रोन2 (चित्रा 7c)तक बढ़ जाते हैं। इसके अलावा, उच्च जीएफपी-कॉइलिन अभिव्यक्ति स्तर वाली 25% से अधिक कोशिकाएं 2.5 माइक्रोन2से बड़े क्षेत्र के साथ मौजूद हैं, जबकि यह गैर-संक्रमित कोशिकाओं में 0.8 माइक्रोन2 से अधिक नहीं है। अंत में, जीएफपी-कॉइलिन ओवरएक्सप्रेशन से कैजल निकायों की संख्या और आकार दोनों में उल्लेखनीय वृद्धि होती है। चूंकि ओएस कैजल निकायों की संख्या बढ़ाता है लेकिन उनके आकार को कम करता है, ये डेटा प्रतिबिंबित कर सकता है कि कैजल निकायों की संरचना पर ओएस प्रभाव संभवतः कॉइलिन की सेलुलर मात्रा पर प्रभाव के बजाय उनकी संरचना के परिवर्तन से प्रेरित है।

Figure 1
चित्रा 1: उपसंरचना एनालाइजर पाइपलाइन
वर्कफ़्लो बर्फीले में विकसित किया गया है, जो बायोइमेज इन्फॉर्मेटिक्स के लिए एक खुला सामुदायिक मंच है, और कई फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी छवियों का स्वचालित विश्लेषण करता है। सबसे पहले, मल्टी-चैनल छवियों को स्वचालित रूप से प्रोटोकॉल के भीतर लोड किया जाता है और यदि आवश्यक हो, तो शोर अनुपात के संकेत और इमेजिंग कलाकृतियों को हटाने के लिए सुधार करने के लिए पूर्व-संसाधित किया जाता है। फिर, छवि विभाजन पृष्ठभूमि से ब्याज (आरओआई) के क्षेत्रों को अलग करता है। विभाजन के कई तरीके क्लस्टरिंग के स्तर और ब्याज की वस्तुओं की प्रकृति के आधार पर उपलब्ध हैं। खंडित वस्तुओं को किसी विशिष्ट फ़ोल्डर में एक विशिष्ट वर्णनकर्ता (उदाहरण के लिए, छवि name_Nucleus_1) के साथ सहेजा जाता है और बाद के विश्लेषण के लिए उपयोग/पुन: उपयोग किया जा सकता है। धब्बे जैसे फ्लोरोसेंट संकेतों का विश्लेषण आरओआई के भीतर किया जाता है और कई विशेषताओं (स्थान, आकार, आकार, तीव्रता, बनावट, स्पॉट नंबर और आकार) को स्वचालित रूप से निर्मित स्प्रेडशीट में निर्यात किया जाता है। सभी मापा सुविधाओं, पता लगाया स्थानों की संख्या की तरह, इसी आरओआई के वर्णनकर्ता को सूचित कर रहे हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: बर्फीले कार्यप्रवाह का ग्राफिकल इंटरफेस
(क)वर्कफ़्लो 13 सामान्य ब्लॉकों से बना है, जिसे उनके सामान्य कार्य के अनुसार समूहित किया जा सकता है: फ़ोल्डर चुनें (ब्लॉक 1) छवियों तक पहुंच की अनुमति दें; मर्ज चैनल (ब्लॉक 2) का उपयोग छवियों के विभिन्न चैनलों को मर्ज करने के लिए किया जाता है। ब्लॉक 3 से 8 ऑब्जेक्ट सेगमेंटेशन को समर्पित हैं, प्रत्येक को एक विशिष्ट संदर्भ के लिए अनुकूलित किया जा रहा है: विभाजन ए: गैर संकुल वस्तुएं, विभाजन बी: खराब क्लस्टर ऑब्जेक्ट्स, सेगमेंटेशन सी: उत्तल आकार के साथ क्लस्टर ऑब्जेक्ट्स, सेगमेंटेशन डी: अनियमित आकार के साथ क्लस्टर ऑब्जेक्ट्स (ब्लॉक 7, ब्लॉक 6 के सहयोग से काम करता है), विभाजन ई: क्लस्टर्ड साइटोप्लाम्स। ब्लॉक 9 से 11 का उपयोग उपकोशिकीय डिब्बों के भीतर फोसी का विश्लेषण करने/विश्लेषण करने के लिए किया जाता है: फ्लोरेसेंस विश्लेषण ए: 1 चैनल, फ्लोरेसेंस एनालिसिस बी: एक ही डिब्बे में 2 चैनल और फ्लोरेसेंस एनालिसिस सी: दो डिब्बों में 2 चैनल। ब्लॉक 12 और 13 स्थानांतरण घटनाओं के विश्लेषण के लिए अनुकूलित कर रहे हैं: फ्लोरेसेंस विश्लेषण डी: ग्लोबल ट्रांसलोकेशन और फ्लोरेसेंस विश्लेषण ई: व्यक्तिगत सेल स्थानांतरण। (ख)ए ब्लॉक आर्किटेक्चर की वैश्विक प्रस्तुति। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3: छवि संकल्प और ऑब्जेक्ट क्लस्टरिंग स्तर के एक समारोह के रूप में विभाजन के लिए आवश्यक समय
(क)इमेज रिजॉल्यूशन और क्लस्टरिंग लेवल के आधार पर सेगमेंटेशन करने के लिए जरूरी समय का ग्राफिकल चित्रण । दो अलग-अलग सेगमेंटेशन ब्लॉकों का परीक्षण किया गया है: विभाजन ए (गैर-संकुल वस्तुओं के लिए) और विभाजन डी (अनियमित आकृतियों वाली संकुल वस्तुओं के लिए)। प्रसंस्करण का समय (प्रति छवि सेकंड में) छवि रिज़ॉल्यूशन (पिक्सेल की संख्या) के फ़ंक्शन के रूप में प्लॉट किया जाता है। (ख)या तो विभाजन ए या विभाजन डी ब्लॉक के साथ विश्लेषण छवियों का उदाहरण । दापी धुंधला और खंडित नाभिक संकेत दिया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: TNFα उत्तेजना के जवाब में एक NFοB परमाणु स्थानांतरण परख का कार्यप्रवाह विश्लेषण
(aक) BBBC014 इमेज सेट (ब्रॉड बायोइमेज बेंचमार्क कलेक्शन)12से टीएनएफपी के साथ इलाज किए गए मानव एमसीएफ7 कोशिकाओं (मानव स्तन एडेनोकार्सिनोमा सेल लाइन) की छवियों का उदाहरण । ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर NFοB के स्थानीयकरण का अध्ययन टीएनएफपीके 12 बढ़ती सांद्रता (0 से 10-7ग्राम/एमएल) के साथ इलाज कोशिकाओं में किया गया है। प्रत्येक एकाग्रता के लिए, 4 प्रतिकृति किया गया। डेपी छवियों (ब्लू चैनल) को सेगमेंटेशन सी में संसाधित किया गया था: उत्तल आकार ब्लॉक के साथ क्लस्टर ऑब्जेक्ट्स ब्लॉक को नाभिक को खंडित करने के लिए, और फिर एफटीसी (ग्रीन चैनल) के साथ एनएफबी धुंधला का उपयोग सेगमेंटेशन ई: क्लस्टरेड साइटोप्लाज्म ब्लॉक के साथ साइटोप्लाज्म्स को चित्रित करने के लिए किया गया था। फ्लोरेसेंस एनालिसिस डी: ग्लोबल ट्रांसलोकेशन ब्लॉक का इस्तेमाल न्यूक्लियर और साइटोप्लाज्मिक पिक्सल वैल्यूज के योग को एक्सपोर्ट करने के लिए किया गया था । (ख)खंडित नाभिक (ग्रे) और साइटोप्लाज्म (सफेद) का उपयोग प्रत्येक डिब्बे में एनएफएबी फ्लोरोसेंट सिग्नल की कुल तीव्रता निर्धारित करने के लिए किया जाता है। (ग)डेटा विश्लेषण से प्राप्त खुराक-प्रतिक्रिया वक्र NFοB परमाणु अनुपात की वृद्धि को दर्शाता है क्योंकि TNFα एकाग्रता बढ़ जाती है । छवियां 8-बिट बीएमपी प्रारूप में हैं, और छवि का आकार 1360 x 1024 पिक्सल है। प्रत्येक एकाग्रता के लिए, 4 प्रतिकृति के बीच मानक विचलन की गणना की जाती है और त्रुटि सलाखों के रूप में सचित्र होती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्र 5: व्यक्तिगत कोशिकाओं में साइटोप्लाज्म के भीतर EDC4 फोसी (पी-निकाय) का मात्राकरण
(क)डीएपीआई (ब्लू चैनल) और फल्लोइडिन (रेड चैनल) के साथ सह-धुंधला होने से सेल न्यूक्लियी और एफ-ऐक्टिन के विभाजन और पहचान की अनुमति है । EDC4 प्रोटीन (ग्रीन चैनल) का उपयोग पी-निकायों का पता लगाने के लिए एक मार्कर के रूप में किया जाता है जिसे विशेष रूप से साइटोप्लाज्मिक माना जाता है। स्केल बार, 10 माइक्रोन(ख) फोसी की गणना की जाती है, और कई विशेषताएं (यहां पिक्सल में उनका क्षेत्र) कई शीट में संरचित परिणाम स्प्रेडशीट को निर्यात किया जाता है।b दो चादरें नाभिक के विश्लेषण के लिए समर्पित हैं और दो साइटोप्लाज्म के विश्लेषण के लिए। प्रत्येक कच्चे एक विशिष्ट आरओआई की जानकारी एम्बेड करता है। नाभिक/साइटोप्लाज्म सूचना पत्रक में, खंडित वस्तुओं की विशेषताओं (आरओआई आईडी, आकार और मतलब तीव्रता) का निर्यात किया जाता है, जिसके बाद प्रत्येक आरओआई के भीतर पता लगाया गया फोसी की संख्या होती है। यदि आवश्यक हो, तो एक आकार सीमा (इस उदाहरण में 100 पिक्सल) जोड़ा जा सकता है, और इस सीमा के नीचे और ऊपर फोसी की संख्या दो अंतिम स्तंभों में सूचित की जाती है। फोसी साइज शीट्स के न्यूक्लियस/Cytoplasm_Distribution में, सभी पता लगाया फोसी के क्षेत्र (पिक्सल में) इसी रॉय के कच्चे में सूचित किया जाता है । इस उदाहरण में, हम दो कोशिकाओं (खंडित cytoplasm_0 and_1) के विश्लेषण को उजागर करते हैं, जहां साइटोप्लाज्मिक ईडीसी 4 फोसी का पता लगाया गया है। हर फोसी के पिक्सल में साइज भी दिया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: ऑक्सीडेटिव तनाव के बाद कॉइलिन और 53BP1 न्यूक्लियोप्लाज्मिक वितरण के काइनेटिक्स
फोसी की संख्या और आकार का विश्लेषण 3 स्वतंत्र काइनेटिक्स से प्रत्येक बार बिंदु के लिए 110 से अधिक व्यक्तिगत कोशिकाओं पर आधारित था। (क) हेला एस 3 कोशिकाओं में कॉइलिन और 53बीपी1 फोसी का इम्यूनोफ्लोरेसेंस डिटेक्शन 500 माइक्रोनएम एच2ओ2के साथ उपचार गतिज के दौरान । 53BP1 डीएनए डबल-स्ट्रैंड ब्रेक साइटों पर केंद्रित है और प्रत्येक कोशिका पर उपचार की दक्षता का आकलन करने के लिए उपयोग किया जाता है। कॉइन काजल निकायों में समृद्ध है। कोशिकाओं को ऑक्सीडेटिव तनाव प्रेरण और एंटी-कॉइलिन (रेड चैनल) और एंटी-53बीपी1 (ग्रीन चैनल) एंटीबॉडी के साथ सह-दाग के बाद 2, 4, 6, 8, और 20 घंटे तय किए गए थे । स्केल बार, 10 माइक्रोन (ख)ऑक्सीडेटिव तनाव के बाद कॉइलिन न्यूक्लियर फोसी की संख्या। परिणाम बॉक्स प्लॉट के रूप में दिखाए जाते हैं, जहां केंद्रीय निशान औसत है, बॉक्स के निचले और ऊपरी किनारों25 वें और 75वें शतमक हैं। एच 2ओ2के साथ इलाज कोशिकाओं में, कॉइलिन फोसी की संख्या में उल्लेखनीय वृद्धि का पता चला है और उपचार के 2 और 4 घंटे के बाद अधिकतम है। विलकॉक्सन-मान व्हिटनी परीक्षण विश्लेषण अनुपचारित और एच2ओ2 उपचारित कोशिकाओं (*, पीएंडटी;0.05; **, पीएंड एलटी;0.01; ***, पीएंड एलटी;0.001) के बीच एक महत्वपूर्ण अंतर को दर्शाता है। (ग)कॉइलिन फोसी क्षेत्र (μm2)के कार्य में कोशिकाओं का अनुपात । अधिकांश फोसी नियंत्रण की तुलना में 2 घंटे और 4 घंटे के समय बिंदुओं पर एक छोटा क्षेत्र है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7: GFP-कॉइलिन फ्यूजन प्रोटीन को अधिक व्यक्त करने वाली कोशिकाओं में कैजल बॉडीज के नाभिक का अध्ययन
(क)हेला एस 3 कोशिकाओं को निर्माता की सिफारिशों का पालन करते हुए एक मानक प्रक्रिया का उपयोग करते हुए जीएफपी-कॉइन फ्यूजन प्रोटीन व्यक्त करते हुए प्लाज्मिड के 500 एनजी के साथ जैविक ट्रिप्लिकेट में क्षणिक रूप से संक्रमित किया गया था। 48 घंटे के बाद, कोशिकाओं को ठीक किया गया और कॉइलिन के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ दाग दिया गया। DAPI (ब्लू चैनल) नाभिक खंड के लिए परमिट। इन विश्लेषणों के लिए 100 से अधिक कोशिकाओं का विश्लेषण किया गया। जीएफपी सिग्नल एक्टोपिक कॉइलिन-जीएफपी प्रोटीन (ग्रीन चैनल) स्थानीयकरण को दर्शाता है, जबकि कॉइलिन सिग्नल (रेड चैनल) अंतर्जात और बहिर्जात प्रोटीन स्थानीयकरण दोनों से मेल खाता है। प्रत्येक नाभिक के लिए, जीएफपी संकेत की औसत तीव्रता कॉइलिन अभिव्यक्ति के स्तर को दर्शाती है। इस पैरामीटर के अनुसार, ब्लॉक फ्लोरेसेंस एनालिसिस बी: 2 चैनल्सइन एक ही डिब्बे का उपयोग करके कॉइन फोसी की विशेषताओं का विश्लेषण किया गया है। स्केल बार, 10 माइक्रोन(ख)कुंडली फोसी की संख्या और मतलब जीएफपी तीव्रता प्रति नाभिक के बीच संबंध। परिणाम बॉक्स प्लॉट के रूप में दिखाए जाते हैं, जहां केंद्रीय निशान औसत है, बॉक्स का निचला और ऊपरी किनारा 25वें और 75वें शतमक हैं। विलकॉक्सन - मान व्हिटनी परीक्षण विश्लेषण जीएफपी तीव्रता के लिए फोसी की संख्या में उल्लेखनीय वृद्धि को दर्शाता है >10 (*, पीएंडटी;0.05; **, पीएंडटी;0.01; ***, पीएंडटी;0.001)। (ग)कुंडलिन फोसी के क्षेत्र और मतलब जीएफपी तीव्रता प्रति नाभिक के बीच संबंध । परिणाम बॉक्स प्लॉट के रूप में दिखाए जाते हैं, जहां केंद्रीय निशान औसत है, बॉक्स का निचला और ऊपरी किनारा 25वें और 75वें शतमक हैं। विलकॉक्सन - मान व्हिटनी परीक्षण विश्लेषण जीएफपी तीव्रता के लिए कॉइलिन फोसी के क्षेत्र में उल्लेखनीय वृद्धि को दर्शाता है और 10 (*, पीएंडटी;0.05; पीएंडटी;0.01; ***, पीएंडटी;0.001)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्रा S1: ऑक्सीडेटिव तनाव के बाद 53BP1 न्यूक्लियोप्लाज्मिक वितरण के काइनेटिक्स
(क)विभिन्न इनक्यूबेशन समय के बाद अनुपचारित या एच 2 ओ2उपचारित कोशिकाओं में 53BP1 परमाणु फोसी का परिमाणीकरण ।2 परिणाम बॉक्स प्लॉट के रूप में दिखाए जाते हैं, जहां केंद्रीय निशान औसत है, बॉक्स का निचला और ऊपरी किनारा 25वें और 75वें शतमक हैं। विलकॉक्सन-मान व्हिटनी परीक्षण विश्लेषण अनुपचारित और एच2ओ2 उपचारित कोशिकाओं (*, पीएंडटी;0.05; **, पीएंड एलटी;0.01; ***, पीएंड एलटी;0.001) के बीच एक महत्वपूर्ण अंतर को दर्शाता है। (ख)गतिज के प्रत्येक समय बिंदु के लिए, तनावग्रस्त और तनावग्रस्त कोशिकाओं के बीच भेदभाव करने के लिए सबसे अच्छी सीमा निर्धारित करने के लिए एक आरओसी (रिसीवर ऑपरेटिंग विशेषता) वक्र स्थापित किया गया है । प्रत्येक परीक्षण के मापदंडों तालिका में रिपोर्ट कर रहे हैं (संवेदनशीलता, विशिष्टता, टीपी: सच सकारात्मक, टीएन: सच नकारात्मक, एफपी: झूठी सकारात्मक, एफएन: झूठी नकारात्मक)। इन आंकड़ों से, 17 53BP1 foci की एक वैश्विक दहलीज काइनेटिक्स के माध्यम से गैर-तनावग्रस्त कोशिकाओं से तनावपूर्ण भेदभाव करने के लिए निर्धारित किया गया था । इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

फ्लोरेसेंस सेल छवियों के विश्लेषण के लिए मुफ्त सॉफ्टवेयर उपकरणों की बढ़ती संख्या उपलब्ध है। उपयोगकर्ताओं को सही ढंग से अपने समस्याग्रस्त की जटिलता के अनुसार पर्याप्त सॉफ्टवेयर का चयन करना चाहिए, छवि प्रसंस्करण में अपने ज्ञान के लिए, और समय वे अपने विश्लेषण में खर्च करना चाहते हैं । बर्फीले, सेलप्रोफिलर, या इमेजजे/फिजी उपयोगिता और कार्यक्षमता दोनों के संयोजन शक्तिशाली उपकरण हैं3। बर्फीला एक स्टैंड-अलोन टूल है जो एक स्पष्ट ग्राफिकल यूजर इंटरफेस (जीयूआई) प्रस्तुत करता है, और विशेष रूप से इसका "प्रोटोकॉल" बिंदु और क्लिक इंटरफ़ेस जिसके माध्यम से वर्कफ्लो को आसानी से डिजाइन या हेरफेर किया जा सकता है4। इमेजजे प्लग-इन का समर्थन और उपयोग करके इस सॉफ़्टवेयर की कार्यक्षमता को बढ़ाया जाता है, और उपयोगकर्ताओं के अपने बड़े समुदाय के लिए बहुत सारे दस्तावेज उपलब्ध हैं। हमने सबस्ट्रक्चर एनालाइजर वर्कफ्लो विकसित करने के लिए बर्फीले सॉफ्टवेयर की उपयोगिता और कार्यक्षमता के इस मजबूत संयोजन का उपयोग किया। इसका मुख्य उद्देश्य कई छवियों से सेल फ्लोरोसेंट सिग्नल का पूर्ण विश्लेषण करने के लिए एक स्वचालित समाधान का प्रस्ताव करना है। विश्लेषण में छवि पूर्व प्रसंस्करण, ऑब्जेक्ट सेगमेंटेशन और फ्लोरोसेंट सिग्नल विश्लेषण शामिल हैं।

कई प्रोटोकॉल बर्फीली वेबसाइट पर कृतज्ञता से साझा किए जाते हैं और सेलुलर फोसी जैसे फ्लोरोसेंट संकेतों का पता लगाने और विश्लेषण करने के लिए बर्फीली कार्यक्षमताओं का उपयोग करने का प्रस्ताव करते हैं। हालांकि, इनमें से कुछ प्रोटोकॉल केवल प्रति रन एक छवि को संसाधित करते हैं, परिणामों को किसी विशिष्ट फ़ाइल में निर्यात नहीं करते हैं या किसी एक चैनल का विश्लेषण नहीं करते हैं। अन्य में ब्याज के क्षेत्रों (आरओआई) को निर्धारित करने के लिए प्रारंभिक विभाजन नहीं होता है या "एच-कायण" जैसे सरल एल्गोरिदम का प्रस्ताव नहीं होता है जो अत्यधिक संकुल वस्तुओं के विभाजन के लिए अनुकूल नहीं हैं। सबस्ट्रक्चर एनालाइजर छवि पूर्व प्रसंस्करण से वस्तुओं के विभाजन और फ्लोरोसेंट संकेतों का पता लगाने/विश्लेषण से छवि विश्लेषण के सभी चरणों को स्वचालित करता है । प्रोटोकॉल में ऑब्जेक्ट सेगमेंटेशन और डेटा के निर्यात के लिए सरल या अधिक जटिल तरीकों का भी प्रस्ताव किया गया है (खंडित वस्तुओं के नाम, फोसी विश्लेषण) समस्याग्रस्त के अनुकूल अनुकूलित आउटपुट में महसूस किया जाता है। सेलप्रोफिलर में मॉड्यूल से बनी शक्तिशाली पाइपलाइनों का भी प्रस्ताव है जो कार्यक्षमताओं को समाहित करते हैं18,19. उपलब्ध पाइपलाइनों को विशिष्ट समस्याओं के लिए अच्छी तरह से अनुकूलित किया गया है । बर्फीले कार्यप्रवाह विभिन्न बक्से का एक नेटवर्क हैं, उनमें से प्रत्येक एक विशिष्ट कार्य करते हैं। "प्रोटोकॉल" इंटरफ़ेस के माध्यम से, नेटवर्क की रचना करने वाले बक्से सहज और हेरफेर करने में आसान हैं। सबस्ट्रक्चर एनालाइजर को कई संदर्भों जैसे चैनलों के सरल विलय, दो उपकोशिकीय डिब्बों के बीच फ्लोरोसेंट संकेतों के वितरण की मात्रा, व्यक्तिगत कोशिकाओं में एक या दो सेलुलर डिब्बों से एक या कई चैनलों में फोसी का विश्लेषण के लिए अनुकूलित किया जाता है। प्रसंस्करण को नियंत्रित करने के लिए प्रत्येक रन के दौरान कई डिस्प्ले मध्यवर्ती परिणामों की कल्पना करने की अनुमति देते हैं। इसके अलावा, बर्फीले आइकन बार प्रस्तुत करता है जो विषय के अनुसार विधियों को समूहित करते हैं और जिनसे कार्यप्रवाह में पाई जाने वाली कार्यक्षमताओं को पूरी छवि सेट पर उपयोग करने से पहले कुछ छवियों पर विशिष्ट मापदंडों का मैन्युअल रूप से परीक्षण करने के लिए अलग से हेरफेर किया जा सकता है।

बायोइमेज विश्लेषण क्षेत्र की तरह, इस प्रोटोकॉल का सबसे महत्वपूर्ण कदम ऑब्जेक्ट सेगमेंटेशन है। प्रोटोकॉल प्राथमिक वस्तुओं के विभाजन का प्रस्ताव करता है, जो अधिकांश समय कोशिका नाभिक हैं, और इसमें एक अन्य ब्लॉक भी शामिल है जो कोशिका के भीतर दूसरे प्रकार की वस्तुओं को खंडित करना है। नाभिक विभाजन मुश्किल हो सकता है जब वस्तुओं अत्यधिक संकुल इतना है कि वे स्पर्श या एक साथ ओवरलैप कर रहे हैं । प्राथमिक वस्तुओं के विभाजन के लिए विभिन्न विकल्प प्रोटोकॉल में निहित हैं, वस्तुओं के आकार और क्लस्टरिंग के स्तर के अनुसार, भले ही अत्यधिक संकुल वस्तुओं के पूर्ण विभाजन में कोई सार्वभौमिक एल्गोरिदम सफलता की तारीख है। विभाजन प्रक्रिया मुख्य रूप से सही मापदंडों के निर्धारण से सीमित है जो वस्तुओं के एक हिस्से को सफलतापूर्वक खंडित कर सकती है लेकिन किसी अन्य हिस्से के कम या अधिक विभाजन का कारण बन सकती है। उपयोगकर्ता को अंतिम सही विभाजन प्राप्त करने के लिए विभिन्न मापदंडों के साथ अलग-अलग रन करने होंगे, विशेष रूप से विषम और गैर-उत्तल आकार पेश करने वाली क्लस्टर वस्तुओं के लिए।

यह प्रोटोकॉल ज्यादातर विभाजन चरण द्वारा सीमित है, जो अत्यधिक समय लेने वाला हो सकता है और सबसे जटिल मामलों के लिए शक्तिशाली कंप्यूटर विन्यास की आवश्यकता होती है। अधिक विशेष रूप से, छवियां जितनी अधिक असंख्य या जटिल हैं (सेगमेंट में क्लस्टर ऑब्जेक्ट्स, छवियों में पिक्सेल की एक उच्च संख्या), उपयोगकर्ता को अधिक यादृच्छिक-पहुंच मेमोरी (रैम) की आवश्यकता होगी। विश्व स्तर पर, किसी भी समस्याग्रस्त के लिए, उपयोगकर्ता को 64 बिट्स जावा रनटाइम पर्यावरण (जावा वेबसाइट पर स्वतंत्र रूप से उपलब्ध) पर प्रोटोकॉल चलाने और बर्फीले द्वारा उपयोग की जाने वाली उपलब्ध मेमोरी को बढ़ाने के लिए 64 बिट्स ऑपरेटिंग सिस्टम (ओएस) का उपयोग करने की आवश्यकता होगी (मेमोरी 32 बिट्स जेआरई के लिए 1300 एमबी तक सीमित है)। स्क्रिप्ट की वजह से, प्रोटोकॉल मैक कंप्यूटर पर सही ढंग से काम नहीं करता है। इसके अलावा, समस्या की जटिलता के साथ मापदंडों की संख्या बढ़ जाती है और छवि विश्लेषण में अधिक ज्ञान की आवश्यकता होगी। कार्यक्षमता मानदंडों के संबंध में, इस प्रोटोकॉल को अभी तक खड़ी छवियों (समय के ढेर, जेड-स्टैक) के विश्लेषण के लिए अनुकूलित नहीं किया गया है, भले ही बर्फीले कुशलता से इस प्रकार के डेटा पर विश्लेषण करते हों।

भविष्य के अपडेट विशेष रूप से जटिल संकुल वस्तुओं के विभाजन में सुधार करने के लिए महसूस किए जाएंगे। अनियमित गैर-उत्तल आकारों के साथ संकुल सेलुलर संरचनाओं के विभाजन को अनुकूलित करने के लिए अतिरिक्त ब्लॉक विकसित किए जाएंगे। हम समय और जेड-स्टैक (लाइव इमेजिंग और 3डी डेटा के लिए) के विश्लेषण के लिए वर्कफ़्लो को भी अनुकूलित करेंगे।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

जीएच को मिनेस्टेरे डेलेगुए ए ला रेचेचे एट ऑक्स टेक्नोलॉजीज से स्नातक फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था। एलएच को इंस्टीटयूट डी कैन्सेरोलोजी डी लोरेन (आईसीएल) से स्नातक फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था, जबकि क्यूटी को फ्रांसीसी राष्ट्रीय अनुसंधान एजेंसी (एएनआर) द्वारा दूसरे "इन्वेस्टिसमेंट्स डी एवेनियर" कार्यक्रम फाइट-एचएफ (संदर्भ: ANR-15-RHU4570004) के हिस्से के रूप में एक सार्वजनिक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। इस काम को सीएनआरएस और यूनीवर्सिट डी लोरेन (UMR 7365) द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16% Formaldehyde solution (w/v) methanol free Thermo Fisher Scientific 28908 to fix the cells
Alexa Fluor 488 of goat anti-rabbit Thermo Fisher Scientific A-11008 fluorescent secondary antibody
Alexa Fluor 555 of goat anti-mouse Thermo Fisher Scientific A-21425 fluorescent secondary antibody
Alexa Fluor 555 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A34055 fluorescent secondary antibody
Bovine serum albumin standard (BSA) euromedex 04-100-812-E
DMEM Sigma-Aldrich D5796-500ml cell culture medium
Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI Sigma-Aldrich DUO82040-5ML mounting medium
Human: HeLa S3 cells IGBMC, Strasbourg, France cell line used to perform the experiments
Hydrogen peroxide solution 30% (H2O2) Sigma-Aldrich H1009-100ml used as a stressing agent
Lipofectamine 2000 Reagent Thermo Fisher Scientific 11668-019 transfection reagent
Mouse monoclonal anti-coilin abcam ab11822 Coilin-specific antibody
Nikon Optiphot-2 fluorescence microscope Nikon epifluoresecence microscope
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Thermo Fisher Scientific 31985062 transfection medium
PBS pH 7.4 (10x) gibco 70011-036 to wash the cells
Rabbit polyclonal anti-53BP1 Thermo Fisher Scientific PA1-16565 53BP1-specific antibody
Rabbit polyclonal anti-EDC4 Sigma-Aldrich SAB4200114 EDC4-specific antibody
Triton X-100 Roth 6683 to permeabilize the cells

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References

  1. Möckl, L., Lamb, D. C., Bräuchle, C. Super-resolved fluorescence microscopy: Nobel Prize in Chemistry 2014 for Eric Betzig, Stefan Hell, and William E. Moerner. Angewandte Chemie. 53 (51), 13972-13977 (2014).
  2. Meijering, E., Carpenter, A. E., Peng, H., Hamprecht, F. A., Olivo-Marin, J. -C. Imagining the future of bioimage analysis. Nature Biotechnology. 34 (12), 1250-1255 (2016).
  3. Wiesmann, V., Franz, D., Held, C., Münzenmayer, C., Palmisano, R., Wittenberg, T. Review of free software tools for image analysis of fluorescence cell micrographs. Journal of Microscopy. 257 (1), 39-53 (2015).
  4. de Chaumont, F., et al. Icy: an open bioimage informatics platform for extended reproducible research. Nature Methods. 9 (7), 690-696 (2012).
  5. Girish, V., Vijayalakshmi, A. Affordable image analysis using NIH Image/ImageJ. Indian J Cancer. 41 (1), 47 (2004).
  6. Zaitoun, N. M., Aqel, M. J. Survey on image segmentation techniques. Procedia Computer Science. 65, 797-806 (2015).
  7. Molecular Devices. MetaMorph Microscopy Automation and Image Analysis Software. , Available from: https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/acquisition-and-analysis-software/metamorph-microscopy (2018).
  8. Nikon. NIS-Elements Imaging Software. , Available from: https://www.nikon.com/products/microscope-solutions/lineup/img_soft/nis-element (2014).
  9. Meyer, F., Beucher, S. Morphological segmentation. Journal of Visual Communication and Image Representation. 1 (1), 21-46 (1990).
  10. Schieber, M., Chandel, N. S. ROS Function in Redox Signaling and Oxidative Stress. Current Biology. 24 (10), 453-462 (2014).
  11. D'Autréaux, B., Toledano, M. B. ROS as signalling molecules: mechanisms that generate specificity in ROS homeostasis. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 8 (10), 813-824 (2007).
  12. Davalli, P., Mitic, T., Caporali, A., Lauriola, A., D'Arca, D. ROS, Cell Senescence, and Novel Molecular Mechanisms in Aging and Age-Related Diseases. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2016, 3565127 (2016).
  13. Disher, K., Skandalis, A. Evidence of the modulation of mRNA splicing fidelity in humans by oxidative stress and p53. Genome. 50 (10), 946-953 (2007).
  14. Takeo, K., et al. Oxidative stress-induced alternative splicing of transformer 2β (SFRS10) and CD44 pre-mRNAs in gastric epithelial cells. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 297 (2), 330-338 (2009).
  15. Seo, J., et al. Oxidative Stress Triggers Body-Wide Skipping of Multiple Exons of the Spinal Muscular Atrophy Gene. PLOS ONE. 11 (4), 0154390 (2016).
  16. Will, C. L., Luhrmann, R. Spliceosome Structure and Function. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (7), 003707 (2011).
  17. Ljosa, V., Sokolnicki, K. L., Carpenter, A. E. Annotated high-throughput microscopy image sets for validation. Nature Methods. 9 (7), 637-637 (2012).
  18. Wang, Q., et al. Cajal bodies are linked to genome conformation. Nature Communications. 7, (2016).
  19. Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7, 100 (2006).
  20. McQuin, C., et al. CellProfiler 3.0: Next-generation image processing for biology. PLoS Biology. 16 (7), 2005970 (2018).

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Heckler, G., Aigueperse, C., Hettal, … More

Heckler, G., Aigueperse, C., Hettal, L., Thuillier, Q., de Chaumont, F., Dallongeville, S., Behm-Ansmant, I. Substructure Analyzer: A User-Friendly Workflow for Rapid Exploration and Accurate Analysis of Cellular Bodies in Fluorescence Microscopy Images. J. Vis. Exp. (161), e60990, doi:10.3791/60990 (2020).

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