Substructure Analyzer: En brugervenlig workflow for hurtig udforskning og nøjagtig analyse af cellulære organer i fluorescens mikroskopi Billeder

Summary

Vi præsenterer en frit tilgængelig arbejdsgang bygget til hurtig udforskning og præcis analyse af cellulære organer i specifikke celle rum i fluorescens mikroskopi billeder. Denne brugervenlige arbejdsgang er designet på open source-software iskolde og bruger også ImageJ funktionaliteter. Rørledningen er overkommelig uden viden i billedanalyse.

Abstract

Det seneste årti har været præget af gennembrud inden for fluorescensmikroskopiteknikker illustreret ved forbedring af rumlig opløsning, men også i levende cellebilleddannelse og mikroskopiteknikker med høj gennemløb. Dette førte til en konstant stigning i mængden og kompleksiteten af mikroskopidataene for et enkelt eksperiment. Da manuel analyse af mikroskopidata er meget tidskrævende, subjektiv og forbyder kvantitative analyser, er automatisering af bioimageanalyse næsten uundgåelig. Vi byggede en informatik workflow kaldet Substructure Analyzer til fuldt ud at automatisere signalanalyse i bioimages fra fluorescerende mikroskopi. Denne arbejdsgang er udviklet på den brugervenlige open source-platform Icy og er afsluttet af funktionaliteter fra ImageJ. Det omfatter forbehandling af billeder for at forbedre signal-støjforholdet, den individuelle segmentering af celler (påvisning af cellegrænser) og detektion/kvantificering af cellekroppe beriget i specifikke cellerum. Den største fordel ved denne arbejdsgang er at foreslå komplekse biobilledbehandlingsfunktioner til brugere uden ekspertise inden for billedanalyse via en brugervenlig grænseflade. Desuden er det meget modulopbygget og tilpasset til flere spørgsmål fra karakterisering af nukleare / cytoplasmatiske translokation til den sammenlignende analyse af forskellige celleorganer i forskellige cellulære substrukturer. Funktionaliteten af denne arbejdsgang er illustreret gennem studiet af Cajal (oprullet) Organer under oxidative stress (OS) betingelser. Data fra fluorescensmikroskopi viser, at deres integritet i humane celler påvirkes få timer efter induktionen af OS. Denne effekt er karakteriseret ved et fald i coilin nucleation i karakteristiske Cajal Organer, forbundet med en nucleoplasmic omfordeling af coilin i et øget antal mindre foci. Coilins centrale rolle i udvekslingen mellem CB-komponenter og den omgivende kerneoplasme tyder på, at os-induceret omfordeling af coilin kan påvirke Cajal-organernes sammensætning og funktionalitet.

Introduction

Lysmikroskopi og især fluorescensmikroskopi er robuste og alsidige teknikker, der almindeligvis anvendes i biologiske videnskaber. De giver adgang til den præcise lokalisering af forskellige biomolekyler som proteiner eller RNA gennem deres specifikke fluorescerende mærkning. Det sidste årti har været præget af hurtige fremskridt inden for mikroskopi og billeddannelse teknologier som det fremgår af 2014 Nobelprisen i kemi tildeling Eric Betzig, Stefan W. Helvede og William E. Moerner for udvikling af super-løst fluorescens mikroskopi (SRFM)¹. SFRM omgår diffraktionsgrænsen for traditionel optisk mikroskopi for at bringe den ind i nanodimensionen. Forbedring af teknikker som live-imaging eller høj gennemløb screening tilgange øger også mængden og kompleksiteten af de data til behandling for hvert eksperiment. Det meste af tiden, forskere står over for høje heterogene populationer af celler og ønsker at analysere fænotyper på encelleniveau.

I første omgang blev analyser som foci-optælling udført af øjet, hvilket foretrækkes af nogle forskere, da det giver fuld visuel kontrol over optællingsprocessen. Manuel analyse af sådanne data er imidlertid for tidskrævende, fører til variation mellem observatører og giver ikke adgang til mere komplekse funktioner, således at computerassisterede tilgange bliver udbredt og næsten uundgåelige². Bioimageinformatikmetoder øger dataanalysens effektivitet betydeligt og er fri for den uundgåelige erhvervsdrivendes subjektivitet og potentielle bias i den manuelle optællingsanalyse. Den øgede efterspørgsel på dette område og forbedringen af computerkraften førte til udviklingen af et stort antal billedanalyseplatforme. Nogle af dem er frit tilgængelige og giver adgang til forskellige værktøjer til at udføre analyser med personlige computere. En klassificering af open access-værktøjer er for nylig blevet etableret³ og præsenterer Icy⁴ som en kraftfuld software, der kombinerer brugervenlighed og funktionalitet. Desuden icy har den fordel at kommunikere med ImageJ.

For brugere uden ekspertise inden for billedanalyse er de vigtigste hindringer at vælge det rigtige værktøj i henhold til de problematiske og korrekt justere parametre, der ofte ikke er godt forstået. Desuden er opsætningstiderne ofte lange. Icy foreslår en brugervenlig peg-og-klik-grænseflade med navnet "Protokoller" for at udvikle arbejdsgange ved at kombinere nogle plugins fundet i en udtømmende samling⁴. Det fleksible modulære design og peg-og-klik-grænsefladen gør det muligt at oprette en analyse for ikke-programmører. Her præsenterer vi en arbejdsgang kaldet Substructure Analyzer, udviklet i Icy's interface, hvis funktion er at analysere fluorescerende signaler i specifikke cellulære rum og måle forskellige funktioner som lysstyrke, foci nummer, foci størrelse, og rumlig fordeling. Denne arbejdsgang omhandler flere spørgsmål såsom kvantificering af signaltranslokation, analyse af transficerede celler, der udtrykker en fluorescerende reporter, eller analyse af foci fra forskellige cellulære understrukturer i de enkelte celler. Det giver mulighed for samtidig behandling af flere billeder, og outputresultater eksporteres til et faneafgrænset regneark, der kan åbnes i almindeligt anvendte regnearksprogrammer.

Pipelinen Substructure Analyzer er præsenteret i figur 1. For det første er alle billederne i en bestemt mappe forbehandlet for at forbedre deres signal til støjforhold. Dette trin øger effektiviteten af følgende trin og reducerer køretiden. Derefter identificeres og segmenteres de interesseområder, der svarer til de billedområder, hvor lysstofsignalet skal detekteres. Endelig analyseres fluorescerende signalet, og resultaterne eksporteres til et faneafgrænset regneark.

Objektsegmentering (detektion af grænser) er det mest udfordrende trin i billedanalyse, og dets effektivitet bestemmer nøjagtigheden af de resulterende cellemålinger. De første objekter identificeret i et billede (kaldet primære objekter) er ofte kerner fra DNA-farvede billeder (DAPI eller Hoechst farvning), selv om primære objekter også kan være hele celler, perler, pletter, tumorer, eller hvad farvede objekter. I de fleste biologiske billeder, celler eller kerner røre hinanden eller overlapper forårsager enkle og hurtige algoritmer til at mislykkes. Til dato kan ingen universel algoritme udføre perfekt segmentering af alle objekter, mest fordi deres egenskaber (størrelse, form eller tekstur) modulerer effektiviteten af segmentering⁵. De segmenteringsværktøjer, der almindeligvis distribueres med mikroskopisoftware (f.eks. MetaMorph Imaging Software by Molecular Devices⁶eller NIS-Elements Advances Research-softwaren fra Nikon^7),er generelt baseret på standardteknikker som korrelationsmatchning, tærskelværdi eller morfologiske operationer. Selv om de er effektive i grundlæggende systemer, udgør disse overgeneraliserede metoder hurtigt begrænsninger, når de anvendes i mere udfordrende og specifikke sammenhænge. Segmentering er meget følsom over for eksperimentelle parametre som celletype, celletæthed eller biomarkører og kræver ofte gentagen justering for et stort datasæt. Arbejdsgangen For Understrukturanalyse integrerer både enkle og mere avancerede algoritmer for at foreslå forskellige alternativer, der er tilpasset billedkompleksiteten og brugernes behov. Den foreslår især den markørbaserede vandskelalgoritme⁸ for stærkt grupperede objekter. Effektiviteten af denne segmenteringsmetode afhænger af valget af individuelle markører på hvert objekt. Disse markører vælges manuelt det meste af tiden for at få korrekte parametre for fuld segmentering, hvilket er meget tidskrævende, når brugerne står over for et stort antal objekter. Substructure Analyzer foreslår en automatisk påvisning af disse markører, hvilket giver en yderst effektiv segmenteringsproces. Segmentering er det meste af tiden det begrænsende trin i billedanalysen og kan ændre behandlingstiden betydeligt afhængigt af billedets opløsning, antallet af objekter pr. billede og niveauet for gruppering af objekter. Typiske rørledninger kræver et par sekunder til 5 minutter pr. billede på en almindelig stationær computer. Analyse af mere komplekse billeder kan kræve en mere kraftfuld computer og nogle grundlæggende viden i billedanalyse.

Fleksibiliteten og funktionaliteten af denne arbejdsproces illustreres med forskellige eksempler i de repræsentative resultater. Fordelene ved denne arbejdsgang vises især gennem undersøgelse af nukleare understrukturer under oxidative stressforhold .). OS svarer til en ubalance i redox homøostase til fordel for oxidanter og er forbundet med høje niveauer af reaktive ilt arter (ROS). Da ROS fungerer som signalmolekyler, påvirker ændringer i deres koncentration og subcellulære lokalisering positivt eller negativt et utal af veje og netværk, der regulerer fysiologiske funktioner, herunder signaltransduktion, reparationsmekanismer, genekspression, celledød og spredning^9,10. OS er således direkte involveret i forskellige patologier (neurodegenerative og hjerte-kar-sygdomme, kræft, diabetes, osv.), men også cellulære aldring. Derfor udgør dechifrering af os's konsekvenser for den menneskelige celles organisation og funktion et afgørende skridt i forståelsen af OS's roller i starten og udviklingen af menneskelige patologier. Det er blevet fastslået, at OS regulerer genekspression ved at modulere transskription gennem flere transskriptionsfaktorer (p53, Nrf2, FOXO3A)¹¹, men også ved at påvirke reguleringen af flere co- og post-transskriptionelle processer såsom alternativ splejsning (AS) af præ-RNAs^12,13,14. Alternativ splejsning af primær kodning og ikke-kodning udskrifter er en væsentlig mekanisme, der øger kodning kapacitet af genomer ved at producere udskrift isoforms. AS udføres af en enorm ribonucleoprotein kompleks kaldet splejseosom, der indeholder næsten 300 proteiner og 5 U-rige små nukleare RNAs (UsnRNAs)¹⁵. Splejsning og AS er stramt kontrolleret i celler og nogle trin i splejsning forekommer inden for membran-mindre nukleare rum ved navn Cajal Organer. Disse nukleare understrukturer er karakteriseret ved den dynamiske karakter af deres struktur og deres sammensætning, som hovedsagelig udføres af multivalente interaktioner mellem deres RNA og proteinkomponenter med coilinproteinet. Analyse af tusindvis af celler med substruktur analyzer workflow tilladt karakterisering af aldrig beskrevet virkningerne af OS på Cajal Organer. Faktisk, opnåede data tyder på, at OS ændrer nukleation af Cajal Organer, inducere en nukleoplasmatisk omfordeling af coilin protein i mange mindre nukleare foci. En sådan ændring af cajalorganernes struktur kan påvirke modningen af splejsning og deltage i AS-modulering af OS.

Protocol

BEMÆRK: Brugervenlige tutorials er tilgængelige på Icy's hjemmeside http://icy.bioimageanalysis.org.

1. Download iskolde og substructure Analyzer protokol

1. Download Iskolde fra det iskolde websted (http://icy.bioimageanalysis.org/download) og download substrukturanalyseprotokollen: http://icy.bioimageanalysis.org/protocols?sort=latest.
   BEMÆRK: Hvis du bruger et 64-bit OPERATIVSYSTEM, skal du sørge for at bruge 64-bit versionen af Java. Denne version gør det muligt at øge den hukommelse, der er allokeret til Icy (Indstillinger | Almindelige bestemmelser | Maks.

2. Åbning af protokollen

1. Åbn Iskolde og klik på Værktøjer i menuen Bånd.
2. Klik på Protokoller for at åbne grænsefladen Protocols Editor.
3. Klik på Indlæs, og åbn protokollen Substructure Analyzer. Protokolindlæsning kan tage et par sekunder. Sørg for, at åbningen af protokollen er fuldført, før den tages i brug.
   BEMÆRK: Arbejdsprocessen består af 13 generelle blokke i figur 2a. Hver blok fungerer som en pipeline, der består af flere kasser, der udfører bestemte underopgaver.

3. Interaktion med arbejdsprocessen om icy

BEMÆRK: Hver blok eller boks er nummereret og har en bestemt placering i arbejdsgangen (Figur 2b). Ved at klikke på dette nummer, er den nærmeste mulige position til den første tildelt den valgte blok / boks derefter placeringen af de andre blokke / kasser er re-organiseret. Respekter blokkennes rigtige rækkefølge, når arbejdsprocessen forberedes. For eksempel skal spotdetektorblokere foruddefinerede ROI'er, så segmenteringsblokke skal køre, før SpotDetektor blokerer. Felternes placering må ikke ændres. Brug ikke "." i billedets navn.

1. Ved at klikke på ikonet øverste venstre hjørne skal du skjule, udvide, forstørre, indsnævre eller fjerne blokken (Figur 2b).
2. Hver pipeline af arbejdsprocessen er kendetegnet ved et netværk af kasser tilsluttet via deres input og output (Figur 2b). Hvis du vil oprette en forbindelse, skal du klikke på Output og vedligeholde, indtil markøren opnår et input. Forbindelser kan fjernes ved at klikke på outputkoden.

4. Sammenlægning af kanalerne i et billede

1. Brug blokfletningskanaler til at generere flettede billeder. Omdøb om nødvendigt filerne, så sekvenser, der skal flettes, har samme navns præfiks efterfulgt af en særskilt separator. Sekvenser af individuelle kanaler fra et billede A navngives f.eks.: ImageA_red, ImageA_blue.
   BEMÆRK: Brug ikke tegn, der allerede findes i billedets navn, til separatoren.
2. Opret en ny mappe pr. kanal i samme mappe for at flette. Hvis du vil flette røde, grønne og blå kanaler, skal du f.eks.
3. Brug kun blokfletningskanalerne, fjern de andre blokke, og gem protokollen som Flet kanaler.
   1. Få adgang til boksene for at angive parametre. For hver kanal skal du udfylde felterne Kanalnummer X (boks 1, 5 eller 9), Mappekanalnummer X (rubrik 2, 6 eller 10), Separator-kanalnummer X (rubrik 3, 7 eller 11) og Colormap-kanal nb X (rubrik 4, 8 og 12).
      BEMÆRK: Disse bokse er vandret grupperet med fire, hver linje, der svarer til den samme kanal. På hver linje er der også en visning (boks 23, 24 eller 25) til direkte visualisere rækkefølgen af den tilsvarende kanal.
      1. I feltet Kanalnummer Xskal du vælge, hvilken kanal der skal udtrækkes (i klassiske RGB-billeder, 0=Rød, 1=Grøn, 2=Blå). Brugeren får hurtigt adgang til de forskellige kanaler i et billede i vinduet Inspektør i Icy under fanen Sekvens.
      2. Skriv mappen \Navn på den mappe , der indeholder billeder af kanal X , i feltet Mappekanalnummer X.
      3. Skriv den separator , der bruges til billedets navn i feltet Separatorkanalnummer X(i det forrige eksempel: "_red", "_green" og "_blue").
      4. I feltet Colormap channel nb Xskal du angive med et tal, hvilken farvemapmodel der skal bruges til at visualisere den tilsvarende kanal i Icy. De tilgængelige farvetilknytninger er synlige under fanen Sekvens i vinduet Inspektør.
      5. Skriv udvidelsen i boksen Formatér af flettede billeder (boks 28) for at gemme flettede billeder: .tif, .gif, .jpg, .bmp eller .png.
         BEMÆRK: Hvis du kun vil flette 2 kanaler, må du ikke udfylde de fire bokse, der svarer til den tredje kanal.
   2. Klik på linket direkte til højre for mappei øverste venstre hjørne af bloken Flet kanaler. Dobbeltklik på den mappe, der indeholder sekvenser af den første kanal, der er defineret i feltet Mappekanal nummer 1 (boks 2), i dialogboksen Åbn, som vises. Klik derefter på Åbn.
   3. Kør protokollen ved at klikke på den sorte pil i øverste venstre hjørne af fletkanaler blok (se del 7 for flere detaljer). Flettede billeder gemmes i en fletmappe i samme mappe som mapperne i de enkelte kanaler.

5. Segmentering af interesseregioner

BEMÆRK: Substructure Analyzer integrerer både enkle og mere avancerede algoritmer til at foreslå forskellige alternativer tilpasset billedets kompleksitet og brugernes behov.

1. Vælg den tilpassede blok.
   1. Hvis objekter ikke berører hinanden, eller brugeren ikke behøver at skelne grupperede objekter individuelt, skal du bruge blokken Segmentering A: Ikke-grupperede objekter.
   2. Når objekter ikke rører hinanden, men nogle af dem er tæt på, skal du bruge bloksegmentering B: Objekter, der ikke er grupperet dårligt.
   3. For objekter med et højt klyngeniveau og en konveks figur skal du bruge bloksegmentering C: Grupperede objekter med konvekse figurer.
   4. Hvis objekter udgør et højt klyngeniveau og har uregelmæssige former, skal du bruge bloksegmentering D: Grupperede objekter med uregelmæssige former.
   5. Brug blokken Segmentering E: Grupperet cytoplasma til at segmentere rørende cytoplasmer individuelt ved hjælp af segmenterede kerner som markører. Denne blok har absolut brug for segmenterede kerner til at behandle.
      BEMÆRK: Blokke, der er tilpasset den primære objektsegmenteringsproces uafhængigt, således at flere blokke kan anvendes i samme løb til at sammenligne deres effektivitet for en bestemt understruktur eller til at segmentere forskellige typer understrukturer. Hvis klyngeniveauet er heterogent inden for det samme sæt billeder, skal du behandle små og stærkt grupperede objekter separat i de tilpassede blokke.
2. Sammenkæd output0 (Fil) af blokken Vælg mappe med mappeinputtet for den valgte segmenteringsblok.
3. Angiv parametre for den valgte segmenteringsblok.
   1. Segmentering A: Ikke-grupperede objekter og Segmentering C: Grupperede objekter med konvekse figurer
      1. Angiv objekternes kanal i bokskanalsignal (boks 1) til segmentet.
      2. Som en mulighed, i boksen Gaussisk filter (boks 2), øge X og Y sigma værdier, hvis signalet inde objekter er heterogen. Den Gaussiske filter udglatter teksturer for at opnå mere ensartede regioner og øger hastigheden og effektiviteten af kernesegmentering. Jo mindre objekter, jo lavere sigma værdi er. Undgå høje sigma værdier. Angiv standardværdier til 0.
      3. I feltet HK-Means (boks 3) skal du angive parameteren Intensitetsklasser og den omtrentlige minimum- og maksimumstørrelse (i pixel) for objekter, der skal registreres.
         BEMÆRK: For intensitetsklasser klassificerer en værdi på 2 pixel i 2 klasser: baggrund og forgrund. Den tilpasses således, når kontrasten mellem objekterne og baggrunden er høj. Hvis forgrundsobjekter har forskellige intensiteter, eller hvis kontrasten til baggrunden er lav, skal du øge antallet af klasser. Standardindstillingen er 2. Objektstørrelsen kan hurtigt evalueres ved at tegne et investeringsafkast manuelt omkring det objekt, der er interessant. Størrelsen af investeringsafkastet (Interiør i pixel) vises direkte på billedet, når du peger det med markøren eller kan tilgås i investeringsafkastet statistik vindue (åbne den fra søgelinjen). Optimale parametre registrerer hvert forgrundsobjekt i et enkelt investeringsafkast. De kan defineres manuelt i Iskolde (Detektion og sporing | HK-Midler).
      4. I feltet Aktive konturer (boks 4) skal du optimere registreringen af objektkanter. Udtømmende dokumentation for dette plugin er tilgængelig online: http://icy.bioimageanalysis.org/plugin/Active_Contours. Korrekte parametre kan også defineres manuelt i Iskolde(Detektion og sporing | Aktive konturer).
      5. Under processen oprettes der automatisk en mappe for at gemme billeder af segmenterede objekter. I feltet Tekst (boks 6) skal du navngive denne mappe (f.eks. segmenterede kerner). Hvis du vil angive formatet til lagring af billeder af segmenterede objekter (Tiff, Gif, Jpeg, BMP, PNG), skal du udfylde boksformatet for billeder af segmenterede objekter. Mappen oprettes i den mappe, der indeholder flettede billeder.
      6. Kør arbejdsprocessen (se del 7 for yderligere oplysninger).
   2. Segmentering B: Objekter, der ikke er grupperet
      1. Følg de samme trin som i 5.3.1 for at indstille parametre for bokse Kanalsignal, HK-Means, Active Contours, Udvidelse for at gemme segmenterede objekter og Tekst (Bokse er ikke de samme som i trin 5.3.1).
      2. I feltet Call IJ-plugin (boks 4) skal du indstille parameteren Rolling til at styre baggrundsundertrugning. Indstil denne parameter til mindst størrelsen på det største objekt, der ikke er en del af baggrunden. Hvis du formindsker denne værdi, øges fjernelsen af baggrunden, men det kan også medføre tab af forgrundssignal.
      3. I boksen Adaptiv histogram udligning (boks 6), forbedre kontrasterne mellem forgrundsobjekter og baggrunden. Forøgelse af hældningen giver mere kontrasterede sekvenser.
      4. Kør arbejdsprocessen (se del 7 for yderligere oplysninger).
   3. Segmentering D: Grupperede objekter med uregelmæssige figurer
      BEMÆRK: Tre forskellige segmenteringsmetoder gælder for hvert billede: for det første,HK-betyder klyngedannelsekombineret medMetoden Aktive kontureranvendes. Derefterklassisk vandskel algoritme(ved hjælp af det euklidiske afstandskort) anvendes på tidligere forkert segmenterede objekter. Endelig er der enmarkør-baseret vandskel algoritmeanvendes. Kun HK-midler og markør-baserede vandskel metoder har brug for brugerindgriben. For begge metoder kan de samme parametre anvendes for alle billeder (fuldautomatisk version) eller ændres for hvert billede (halvautomatisk version). Hvis brugeren ikke er uddannet i disse segmenteringsmetoder, anbefales den halvautomatiske behandling på det kraftigste. Under behandlingen af denne blok er manuel indgriben nødvendig. Når en segmenteringsmetode er færdig, skal brugeren manuelt fjerne forkert segmenterede objekter før begyndelsen af den næste segmenteringsmetode. Segmenterede objekter gemmes og tages ikke i betragtning i næste trin. Denne blok skal forbindes med blokkenDialogboksen Segmentering af grupperede/heterogene figurer af primære objekterfor at fungere korrekt.
      1. Download ImageJ-samlingen MorphoLibJ på https://github.com/ijpb/MorphoLibJ/releases. Den MorphoLibJ 1.4.0 version bruges i denne protokol. Placer filen MorphoLibJ_-1.4.0.jar i mappen iskolde / ij / plugins. Du kan finde flere oplysninger om indholdet af denne samling på https://imagej.net/MorphoLibJ.
      2. Følg de samme trin som i trin 5.3.1 for at angive parametre for bokse Kanalsignal, Gaussisk filter, Aktive konturer, Udvidelse for at gemme segmenterede objekter og Tekst. Bokserækkerne er ikke de samme som i trin 5.3.1.
      3. Angiv parametre for boksen Adaptiv histogramme (se trin 5.3.2.3).
      4. Hvis du vil aktivere Subtraher baggrund, skal du skrive ja i Anvend Subtraher baggrund? Ellers, skriv nej. Hvis plugin'et er aktiveret, skal du angive den rullende parameter (se trin 5.3.2) i feltet Subtraher baggrundsparameter (boks 7).
      5. Automatisering af HK-midler: Hvis du vil anvende de samme parametre for alle billeder (fuldautomatisk behandling), skal du indstille Nb for klasser (boks 11), minimumstørrelse (boks 12) og maksimumstørrelsen (boks13) (se trin 5.3.1). Disse parametre skal indstilles til at vælge maksimalt forgrundspixel og optimere individualiseringen af forgrundsobjekter. For den halvautomatiske behandlingsversion er der ikke behov for indgriben.
      6. Automatisering af markørekstraktioner: For den fuldautomatiske version skal boksen Intern Markøre udtræk (boks 27) og indstille værdien af den "dynamiske" parameter i linje 13 i scriptet. For den halvautomatiske behandlingsversion er der ikke behov for indgriben.
         BEMÆRK: Markører udtrækkes ved at anvende en udvidet minima-transformation på et inputbillede, der styres af en "dynamisk" parameter. I den markørbaserede vandskelalgoritme simuleres oversvømmelse fra disse markører for at udføre objektsegmentering. For at opnå en vellykket segmentering af forgrundsobjekter skal der udtrækkes en enkelt markør pr. forgrundsobjekt. Indstillingen af den "dynamiske" parameter for optimal markører ekstraktion afhænger for det meste af opløsningen af billeder. Hvis du ikke er bekendt med denne parameter, skal du bruge den halvautomatiske version.
      7. Kør arbejdsprocessen (se del 7 for yderligere oplysninger).
      8. I begyndelsen af behandlingen åbnes dialogbokse HK-means-parametre og marker-baserede vandskel successivt. Hvis du vil anvende de samme parametre for alle billeder (fuldautomatisk version), skal du klikke på JA. Ellers skal du klikke på NEJ. Der åbnes en informationsboks, hvor du bliver bedt om at "Bestemme optimale ROI'er med HK-Means-plugin og lukke billedet". Klik på OK og manuelt anvende HK-Means plugin(Opdagelse og Sporing| HK-Midler) på billedet, som automatisk åbnes. Vælg indstillingen Eksporter ROI i feltet HK-Means-plugin. Anvend de bedste parametre for at have ROI'er, der indeholder et maksimum af forgrundspixel, og for at optimere individualiseringen af forgrundsobjekter. Når der findes optimale RO'er, skal du lukke billedet direkte.
      9. I slutningen af den første segmenteringsmetode åbnes en informationsboks og beder om at "Fjerne uønskede ROI'er og lukke billedet". Disse ROI'er svarer til de segmenterede objekters kanter. Vælg OK, og fjern PPI for objekter, der er segmenteret forkert, i billedet, som automatisk åbnes. Et investeringsafkast kan nemt fjernes ved at placere markøren på kanten og bruge "Slet"-knappen på tastaturet. Luk billedet. Gentag den samme procedure, når det andet segmenteringstrin er fuldført.
      10. Hvis JA-knappen blev valgt til fuld automatisering af den markørbaserede vandskelalgoritme, anvendes de tidligere indstillede parametre på alle billeder.
      11. Hvis knappen NEJ er markeret, åbnes en oplysningsboks, hvor du bliver bedt om at "Bestemme og justere interne mærker". Klik på OK og inden for ImageJ interface icy, gå til Plugins | MorphoLibJ | Minima og Maxima| Udvidet Min og Maks. Vælg Udvidet Minimai Drift .
      12. Vælg Eksempel for at visualisere resultatet af transformeringen på det automatisk åbnede billede. Bevæg dynamikken, indtil der er observeret optimale markører. Mærker er grupper af pixel med en værdi på 255 (Ikke nødvendigvis hvide pixel). Optimale parametre fører til én markør pr. objekt. Fokuser på de resterende objekter, der ikke er blevet godt segmenteret med de to tidligere segmenteringsmetoder.
      13. Hvis det er nødvendigt, forbedre markører ved at anvende yderligere morfologiske operationer som "Åbning" eller "Lukning" (Plugins | MorphoLibJ | Morfologiske filtre). Når du får det endelige billede af markører, skal du holde det åbent og lukke alle de andre billeder, der slutter med det billede, der oprindeligt blev brugt som input til handlingen Extended Minima. Klik på Nej, hvis et BilledeJ-felt beder om at gemme ændringer på dette billede.
      14. I rubrik Nb af billeder med Informationsboks (boks 14) skal du bestemme, hvor mange billeder med informationsbokse der skal vises.
   4. Segmentering E: Grupperet cytoplasma
      BEMÆRK: Denne blok bruger tidligere segmenterede kerner som individuelle markører til at indlede cytoplasma segmentering. Sørg for, at blok af kerner segmentering har behandlet, før du bruger det.
      1. I boksen Kanalcytoplasma (boks 1) skal du indstille kanalen af det cytoplasmatiske signal.
      2. Skriv det format, der bruges til at gemme billeder af segmenterede kerner (tif, jpeg, bmp, png), i boksen Udvidelsessegmentet segmenteret kerner (boks 2). Standardformatet er tif.
      3. Skriv mappen \Navn, der indeholder segmenterede kerner, i feltet Tekst (boks3).
      4. I boksen Formatér af billeder af segmenterede cytoplasmer (boks 4) skal du indstille det format, der skal bruges til at gemme segmenterede objekter billeder (Tiff, Gif, Jpeg, BMP, PNG).
      5. Under processen oprettes der automatisk en mappe for at gemme billeder af segmenterede cytoplasmer. I feltet Tekst (boks 5) skal du navngive denne mappe (f.eks. segmenterede cytoplasmer). Mappen oprettes i den mappe, der indeholder flettede billeder.
      6. Følg de samme trin som i trin 5.3.1 for at indstille parametre for kasser Gaussisk filter og Aktive konturer (Vær forsigtig, boks rækker er ikke det samme som i trin 5.3.1).
      7. Kør arbejdsprocessen (se del 7 for yderligere oplysninger).

6. Fluorescerende signaldetektion og analyse

1. Vælg den tilpassede blok.
   1. I blokken Fluorescens Analyse A: 1 Kanal, udføre detektion og analyse af foci i en kanal inde i en type segmenteret objekt: påvisning af coilin foci (rød kanal) i kernen.
   2. I blokken Fluorescens Analyse B: 2 Kanaler i samme rum, udføre detektion og analyse af foci i to kanaler inde i en type segmenteret objekt: påvisning af coilin (rød kanal) og 53BP1 (grøn kanal) foci i kernen.
   3. I blokken Fluorescens Analyse C: 2 Kanaler i to rum, udføre detektion og analyse af foci i en eller to kanaler, specielt inde i kernerne og deres tilsvarende cytoplasma: påvisning af Coilin foci (rød kanal) både inden for kernen og dens tilsvarende cytoplasma eller påvisning af Coilin foci (rød kanal) i kernen og G3BP foci (grøn kanal) inden for den tilsvarende cytoplasma.
   4. I blokken Fluorescens Analyse D: Global Translokation, beregne procentdelen af signal fra en kanal i to cellulære rum (a og b). I en cytoplasma/kernetranslokationsanalyse eksporteres f.eks. Den formel, der anvendes til at beregne den nukleare signalprocent, er vist nedenfor. Denne blok kan bruges til alle undercellede rum:
      
   5. I blokken Fluorescens Analyse E: Individuel celle translokation, beregne procentdelen af signal fra en kanal i to cellulære rum for hver celle. Denne blok er specielt optimeret til kerne/cytoplasma translokationsanalyse på enkeltcelleniveau.
      BEMÆRK: Da blokken Fluorescensanalyse E: Individuel celletranslokation udfører analyse på enkeltcelleniveau, er der behov for effektiv segmentering af kerne og cytoplasma.
2. Sammenkæd output0 (Fil) i blokken Vælg mappe (blok 1) til mappeinput (hvide pile i sorte cirkler) i den valgte blok.
3. Angiv parametrene for den valgte blok.
   1. Fluorescensanalyse A: 1 Kanal, fluorescensanalyse B: 2 Kanaler i samme rum og fluorescensanalyse C: 2 Kanaler i to rum
      1. Skriv navnet på den mappe, der indeholder billeder af segmenterede objekter, der indledes med en omvendt skråstreg, i feltet Mappebilleder. (F.eks.: \Segmenterede kerner).
      2. Skriv det format, der bruges til at gemme billeder af segmenterede objekter (tif, jpeg, bmp, png), i boksen Formatér billeder af segmenterede objekter (boks 2). Standardformatet er tif.
      3. Skriv Ja i feltet Kill Borders? Ellers skal du skrive Nej. Installationen af MorphoLibJ-samlingen af ImageJ er nødvendig for at bruge denne funktion (se trin 5.3.3).
      4. I feltet (r) Kanal pletter signal, indstille den kanal, hvor pletter skal detekteres. I klassiske RGB-billeder, 0=Rød, 1=Grøn og 2=Blå.
      5. I kasserne Navn lokaliseret molekyle, skrive navnet på molekylet lokalisere ind i pletter. Antallet af felter, der skal indtastes, afhænger af antallet af molekyler.
      6. Angiv punktdetektionsparametre for hver kanal i feltet(e) Wavelet Spot Detector Block. Angiv skalaen(-erne) (der henvises til staffagestørrelse) og detektionens følsomhed (en mindre følsomhed reducerer antallet af fundne pletter, standardværdien er 100, og minimumværdien er 0). Udtømmende dokumentation af dette plugin er tilgængelig online: http://icy.bioimageanalysis.org/plugin/Spot_Detector. Parametre kan også defineres manuelt i Iskolde(Detektion og sporing | Spotdetektor).
      7. Som en indstilling skal du filtrere de segmenterede objekter i feltet Filter-investeringsafkast efter størrelseved at angive et størrelsesinterval (i pixel). Dette trin er især nyttigt til at fjerne objekter under eller oversegmenter. Hvis du manuelt vil estimere objekternes størrelse, skal du se trin 5.3.1. Standardparametre omfatter ikke filtrering af lok bmi efter størrelse. Blok 2 Kanalerne i to rum indeholder to kasser: Filterkerner efter størrelse (boks 19) og Filtercytoplasma efter størrelse (rubrik 46).
      8. Du kan også vælge, at filtrere de fundne pletter efter størrelse i boksen Filterpletter efter størrelsefor at fjerne uønskede artefakter. Hvis du manuelt vil estimere spotstørrelse, skal du klikke på Registrering og sporing og åbne spotdetektorpluginen. Vælg Eksporter til investeringsafkast i Outputindstillinger . Pas på, at standardparametre ikke omfatter filtrering af pletter efter størrelse, og at der ikke tages hensyn til filtrerede pletter ved analysen. Antallet af felter, der skal angives, afhænger af antallet af kanaler.
      9. Eventuelt anvender et ekstra filter (kontrast, homogenitet, omkreds, rundhed) på de fundne pletter i boksen Filterpunkter. Pas på, at standardparametrene ikke omfatter punktfiltrering, og at der ikke tages hensyn til filtrerede pletter ved analysen. Antallet af felter, der skal angives, afhænger af antallet af kanaler.
      10. Du kan også vælge, at der i boksene spotstørrelsestærsklenangives en tærskel for området (i pixel) for analyserede pletter. Antallet af optalte punkter under og over denne tærskel eksporteres i det endelige regneark Resultater. Antallet af bokse, der skal informeres, afhænger af antallet af kanaler.
      11. Kør arbejdsprocessen (se del 7 for yderligere oplysninger). Data eksporteres i et regneark med resultater, der er gemt i den mappe, der indeholder flettede billeder.
   2. Fluorescensanalyse D: Global translokation og fluorescensanalyse E: Individuel celletranslokation:
      1. Skriv mappen \Navn, der indeholder billeder af segmenterede objekter, i felterne Mappebilleder (boks 1 og 2). I blokken Fluorescence Analyse D: Global Translokation, de to typer af ROI er identificeret som ROI a og ROI b. For blokken Fluorescence Analyse E: Individuelle Cell Translocation, i Mappe billeder segmenteret kerner og mappe billeder segmenteret cytoplasmer bokse, skrive navnet på den mappe, der indeholder segmenteret kerner og cytoplasmer, henholdsvis.
      2. Indtast signalets kanal i boksen Kanalsignal (boks 3).
      3. Skriv det format, der bruges til at gemme billeder af segmenterede objekter (tif, jpeg, bmp, png), i boksen Formatér billeder af segmenterede objekter (boks 4). Standardformatet er tif. Indstillingen Kill Borders er også tilgængelig til fjernelse af kantobjekter (se trin 6.3.1).
      4. Du kan også filtrere de segmenterede objekter efter størrelse i boksene Filter-investeringsafkast efter størrelseved at angive et interval af størrelse (i pixel). Dette trin kan være nyttigt til at fjerne objekter, der er under eller oversegmenteret. Hvis du manuelt vil estimere objektstørrelsen, skal du se trin 5.3.1. Der er to felter, der skal indtastes, et pr. kanal. Standardparametre omfatter ikke roi-filtrering efter størrelse.
      5. Kør arbejdsprocessen (se del 7 for yderligere oplysninger). Eksporter data i et regneark Resultater, der er gemt i den mappe, der indeholder flettede billeder.

7. Kør protokollen

1. Hvis du vil behandle én blok i en kørsel, skal du fjerne forbindelsen mellem den valgte blok og blokken Vælg mappe. Placer den ønskede blok på 1^street rang. I øverste venstre hjørne af den ønskede blok skal du klikke på linket direkte til højre for mappen. Dobbeltklik på den mappe, der indeholder de flettede billeder, i dialogboksen Åbn, som vises. Klik derefter på Åbn. Klik på Kør for at starte arbejdsprocessen. Behandlingen kan stoppes ved at klikke på stopknappen.
2. Hvis du vil behandle forskellige blokke i en kørsel, skal du bevare forbindelser af valgte blokke med blokken Vælg mappe (blok 1). Sørg for, at deres rang giver mulighed for en god behandling af arbejdsprocessen. Hvis en bestemt blok f.eks. Før du kører arbejdsprocessen, skal du fjerne ubrugte blokke og gemme den nye protokol med et andet navn.
3. Klik på Kør for at starte arbejdsprocessen. Når den åbne dialogboks vises, skal du dobbeltklikke på den mappe, der indeholder de flettede billeder. Klik derefter på Åbn. Arbejdsprocessen kører automatisk. Hvis det er nødvendigt, skal du stoppe behandlingen ved at klikke på stopknappen.
4. I slutningen af behandlingen skal du kontrollere, at meddelelsen Arbejdsprocessen udførte korrekt i nederste højre hjørne, og at alle blokkene er markeret med et grønt tegn (Figur 2b). Hvis ikke, angiver blokken og den indvendige boks, der viser fejltegnet, det element, der skal korrigeres (Figur 2b).
   BEMÆRK: Når arbejdsprocessen er udført korrekt, kan en ny kørsel ikke startes direkte, og for at behandle arbejdsprocessen igen skal mindst én blok markeres med tegnet "klar til behandling". Hvis du vil ændre en bloks tilstand, skal du enten slette og genskabe en kæde mellem to bokse i denne blok eller blot lukke og genåbne protokollen. Hvis der opstår en fejl under behandlingen, kan en ny kørsel startes direkte. Under en ny kørsel behandles alle blokke af rørledningen, selvom nogle af dem er markeret med det grønne tegn.

Representative Results

Alle de beskrevne analyser er blevet udført på en standard laptop (64-bit, quad-core processor på 2,80 GHz med 16 GB random-access memory (RAM)) arbejder med 64-bit version af Java. Random-access hukommelse er en vigtig parameter at overveje, afhængigt af mængden og opløsningen af billeder til at analysere. Ved hjælp af 32-bit versionen af Java begrænser hukommelsen til omkring 1300 MB, hvilket kunne være uegnet til big data-analyse, mens 64-bit versionen gør det muligt at øge den hukommelse, der er allokeret til Icy. Figur 3 rapporterer den tid, det skal bruges til segmentering af forskellige typer billeder og forskellige opløsninger. Den bekræfter, at høj opløsning øger tidspunktet for segmentering af primære objekter betydeligt.

De data, der præsenteres i de næste afsnit, viser, at arbejdsgangen Understrukturanalyser kan bruges til at løse de fleste af de almindelige problemer, der opstår i cellulær og molekylærbiologi (celletælling, foci-optælling og analyse, translokationsanalyse).

Måling i mange celler af den præcise andel af molekyler koncentreret i et givet rum eller ændring af lokalisering på tværs af subcellulære domæner kan være en meget besværlig og fejlbehæftet opgave, især når det udføres manuelt. Figur 4 illustrerer arbejdsprocessens evne til hurtigt og præcist at kvantificere den beskrevne nukleare translokation af transskriptionsfaktoren NFκB som reaktion på TNFα-stimulering. Billeder, der anvendes til analysen, blev nådigt udarbejdet af Ilya Ravkin (http://www.ravkin.net/SBS/Image-Library.htm) og er offentligt tilgængelige på Broad Bioimage Benchmark Collection¹⁶. Dette sæt indeholder billeder af MCF7- og A549-cellelinjer behandlet med stigende koncentrationer af TNFα. Analysen er udført på mere end 40.000 celler og 96 billeder (48 billeder for hver kanal) fra MCF7 cellelinjen (Figur 4a). Hele analysen (fra import af billeder til databesparelse) tog 26 minutter. Hvert billede svarer til en specifik TNFα-koncentration. De nukleare/cytoplasmatiske proportioner af NFκB var homogene på tværs af alle celler for et givet billede. Af denne grund blev værdierne af alle nukleare eller cytoplasmatiske pixel for hvert billede opsummeret for at beregne de nukleare og cytoplasmatiske proportioner af NFκB, og individualisering af rørende kerner/cytoplasmer under deres segmentering var ikke påkrævet. DAPI-billeder blev behandlet i Segmentering C: Grupperede objekter med konvekse former blokerer for segmentkerner, og den grønne kanal blev brugt til at afgrænse cytoplasterne med segmentation E: Grupperet cytoplasmablok (Figur 4b). Fluorescensanalyse D: Global Translokationsblok blev brugt til at eksportere summen af nukleare og cytoplasmatiske pixelværdier. De opnåede data er repræsenteret i en dosis-respons-kurve (figur 4c) og illustrerer stigningen i NFκB's nukleare andel efter stimulering med stigende koncentrationer af TNFα.

Arbejdsgangen analyserer ikke kun det globale intensitetssignal i forskellige subcellulære rum, men kan også bruges til at registrere foci og udtrække specifikke oplysninger om deres funktioner. Figur 5a illustrerer påvisning af P-organer i individuelle celler ved at lokalisere forstærkeren af mRNA decapping 4 (EDC4) protein. Segmentation A: Ikke-grupperede objekter blok blev brugt til at segmentere kerner, der præsenterer et lavt niveau af klyngedannelse, Segmentering E: Clustered cytoplasma blok til at afgrænse cytoplasorer og Fluorescens Analyse C: 2 kanaler i to rum til at opdage EDC4 foci. Segmenterede objekter identificeres (segmenterede nuclei_0, segmenterede cytoplasms_0), og der indsamles flere oplysninger i det tilsvarende regneark (segmenterede kerner Information og segmenterede cytoplasmer Information) som EDC4 gennemsnitsintensiteten eller antallet/størrelsen af fundne organer i hvert ROI (Figur 5b). Før de analyseres, detekterede organer kan foreløbigt filtreres i henhold til deres område, hvilket kan være nyttigt at udelukke objekter under opløsningen magt mikroskop. For at anslå størrelsen af bevarede objekter kan der indføres en yderligere arealtærskel. Områder af alle de fundne organer er rapporteret i dedikerede regneark (Segmenteret nuclei_Distribution foci størrelse, Segmenteret cytoplasms_Distribution foci størrelse). I dette eksempel fremhæver vi analysen af to celler (segmenterede nuclei_0 and_1 og segmenterede cytoplasm_0 and_1), hvor cytoplasmatisk EDC4 foci påvises. Bemærk, at selv om signalet fra EDC4-proteinet detekteres i både det nukleare og det cytoplasmatiske rum, er det kun det cytoplasmatiske foci, der svarer til P-kroppe. Det nukleare signal skyldes sandsynligvis krydsreaktiviteten af det antistof, der anvendes til at udføre immunfluorescensforsøg. Størrelsen i pixel på hver af foci er givet.

Da virkningen af oxidativt stress (OS) på Cajal Bodies stadig var ukendt, udnyttede vi arbejdsgangens alsidighed til at studere det i tidens kinetik (2 til 20 timer efter OS-induktion med 500 μM H₂O₂) (Figur 6). Cajal Organer er dynamiske strukturer nucleating og opløse inden for nukleoplasma under kontrol af specifikke parametre som transskription sats eller celle cyklus progression. Cajal Organer blev visualiseret ved at lokalisere deres vigtigste strukturelle og funktionelle komponent, coilin protein. Oplysninger om antallet og størrelsen af Cajal organer blev indsamlet ved at studere 2300 individuelle celler fra høj opløsning billeder (3840X3072), der indeholder 3 kanaler: DAPI (blå), 53BP1 (grøn) og coilin (rød) (Figur 6a). Fuld behandling tog mindre end 1 time. Da kerner præsenterede konveks form, og nogle af dem var grupperet, blev blokken Segmentering C: Grupperede objekter med konvekse figurer valgt til at udføre segmenteringen. Da OS er kendt for at fremkalde DNA dobbelt-streng pauser (DDSBs), p53-bindende protein 1 (53BP1), kendt for at være en væsentlig effektor af DNA-skader signalering veje, blev brugt som en markør for at skelne mellem stressede og ikke-stressede celler. I mangel af DNA-skader er 53BP1 homogent fordelt i nukleoplasmen, mens det efter DNA-skader koncentrerer sig om DDSB'er, som let kan skelnes fra foci i mikroskopi. Antallet og størrelsen af både 53BP1 og coilin nukleare foci i hver celle blev analyseret ved hjælp af blokken Fluorescens Analyse B: 2 Kanaler i samme rum. For det første bidrog analysen af 53BP1-data til for hvert tidspunkt af kinetikken at bestemme den bedste tærskel til klassificering af celler efter deres stressstatus. Blandt hele kinetik, OS inducerer en betydelig stigning i 53BP1 foci nummer med en 11-fold stigning på 2, 4 og 8 timer efter induktion af OS (Figur S1). Denne effekt er mindre udtalt ved 6 timer (6,5 gange) på grund af et højere indledende niveau af DSB i ikke-stressede celler. Selv efter 20 timer, en vedvarende stigning forbliver (næsten 6 gange). Disse data afspejler effektiviteten af behandlingen til at fremkalde OS og etablere 53BP1 som en effektiv stressmarkør for både tidlige og sene observationer i mikroskopi. På den anden side blev der observeret en lille andel af stressede celler med et lavt niveau af DDSBs på hvert tidspunkt af kinetikken, hvilket tyder på, at cellerne ikke er homogent stressede, hvilket håndhæver vigtigheden af at bruge en stressmarkør i stressforsøg. På grundlag af ROC-analysen blev der valgt en samlet tærskel på 17 53BP1 foci for at diskriminere mellem stressede og ikke-stressede celler i kinetik (figur S1).

Så antallet og størrelsen af nukleare foci af coilin blev analyseret i henhold til cellens stress status. Der blev observeret en signifikant stigning i antallet af foci 2, 4 og 6 timer efter induktion af stress (figur 6b). Den mest vedvarende effekt er observeret ved 2 timer, antallet af celler med mere end 10 foci stigende fra 0% i de ustressede celler til 75% i de stressede celler. Desuden havde mere end 25% af stressede celler på dette tidspunkt mere end 20 coilin foci. Denne effekt falder gradvist til 8 timer. Ved 20 timer observeres en lille stigning i den første og den tredje kvartil, men data viser også, at 84% og 80% af cellerne præsenterer mindre end 8 foci i ikke-stressede og stressede celler, hhv. Disse data viser, at OS også har sene virkninger på parametre, der styrer nukleationen af Cajal Organer, som kan være forskellige fra tidlige virkninger. Det er interessant, omhyggelig analyse af funktionerne i coilin nukleare foci viste, at den observerede stigning i antallet af coilin foci associerede med et fald i deres størrelse (Figur 6c). F.eks. stiger andelen af coilin foci med et areal under 0,2^{μm 2} fra 26 % til 64 % efter os-induktion. Denne effekt falder til 8 timer, men i modsætning til Cajal Bodies' antal observeres der ingen signifikant ændring ved 20 timer. Dette kan afspejle, at tidlig og sen nukleoplasmatisk omfordeling af Cajal Organer er forskellige begivenheder.

Alt i alt tyder disse data stærkt på, at OS ændrer kernen magt Cajal Organer, inducere en nukleoplasmatisk omfordeling i mange mindre nukleare foci. Da nukleation af Cajal Organer er drevet af deres protein og RNA komponenter, dette tyder på, at OS-effekten kan ændre sammensætningen af Cajal Organer. Inden for Cajal Bodies interagerer coilin-proteinet med flere forskellige proteinpartnere såsom komponenter i SMN-komplekset og Sm-proteiner. Disse interaktioner ofte involveret fosfordomæner af coilin, og man kan forestille sig, at en ændring af strukturen af Cajal Organer kunne være knyttet til ændringer i fosforylering status coilin. Desuden viste de seneste værker, at Cajal Organer ikke er tilfældigt lokaliseret i kernen, og kan påvirke genekspression gennem proksimale forbindelse med specifikke gen loci¹⁷. I betragtning af alle disse kendsgerninger ville det ikke være overraskende, hvis en indvirkning på Cajal-organernes funktionalitet ville ledsage ændringer i deres struktur. Ud fra disse resultater kan vi også spørge, om en sådan Cajal Bodies' remodeling er en passiv konsekvens af OS eller deltager i svaret ved at interagere med specifikke gen loci, for eksempel.

For at teste, om en ændring i coilin udtryk kunne ændre sin lokalisering og ændre kernen af Cajal Organer, vi overudtrykt en udefrakommende GFP-coilin fusion protein. Kerner blev ikke grupperet, så segmentering blev udført med blokken Segmentering A: Ikke-grupperede objekter. For præcist at kvantificere antallet og størrelsen af coilin foci (rødt signal, kanal 1) i henhold til niveauet af GFP-coilin (grønt signal, kanal 2) overekspression, blev blokken Fluorescence Analyse B: 2 Kanaler i samme rum brugt. Niveauet af GFP-coilin blev afspejlet af den gennemsnitlige intensitet af GFP-signalet i den enkelte kerne (figur 7a). I celler med mellem- eller højt niveau af GFP-coilin-overekspression (GFP-intensitet højere end 10) øges antallet af Cajal-kroppe pr. kerne betydeligt med nogle kerner, der viser op til 21 foci (figur 7b). Vi bemærkede også, at lysstyrken (gennemsnitlig intensitet) af Cajal Organer betydeligt stiger parallelt med overekspression niveau, der fører til intensitet mætning. Sådanne mættede områder kan således maskere tilstedeværelsen af mindre og svagere foci. I celler, der overekspørjerer et medium eller højt niveau af GFP-coilin, øges størrelsen af Cajal Bodies også betydeligt, medianværdierne stiger fra 1 til 2 μm² (figur 7c). Desuden er mere end 25 % af cellerne med et højt GFP-coilin-ekspressionsniveau til stede foci med et areal, der er større end 2,5 μm², mens det aldrig overstiger 0,8 μm² i ikke-transficerede celler. Afslutningsvis fører GFP-Coilin overekspression til en betydelig stigning i både antallet og størrelsen af Cajal Organer. Da OS øger antallet af Cajal Organer, men reducerer deres størrelse, kan disse data afspejler, at OS effekt på strukturen af Cajal Organer er sandsynligvis induceret af en ændring af deres sammensætning snarere end af en effekt på den cellulære mængde coilin.

Figur 1: Pipelinen Til understrukturanalyse
Arbejdsgangen er udviklet i Icy, en åben fællesskabsplatform for bioimageinformatik, og udfører automatisk analyse af flere fluorescensmikroskopibilleder. For det første indlæses billeder med flere kanaler automatisk i protokollen og forbehandles for om nødvendigt at forbedre signalet til støjforholdet og fjerne billedartefakter. Derefter isolerer billedsegmentering interesseområder (ROI'er) fra baggrunden. Flere metoder til segmentering er tilgængelige afhængigt af niveauet af klyngedannelse og arten af de objekter af interesse. Segmenterede objekter gemmes med en bestemt beskrivelse (f.eks. billed name_Nucleus_1) i en bestemt mappe og kan bruges/genbruges til efterfølgende analyse. Fluorescerende signaler som pletter analyseres derefter inden for de europæiske roi'er, og flere funktioner (placering, størrelse, form, intensitet, tekstur, staffagenummer og størrelse) eksporteres til et automatisk oprettet regneark. Alle de målte funktioner, såsom antallet af fundne pletter, rapporteres til deskriptoren for det tilsvarende investeringsafkast. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: Grafisk grænseflade i den iskolde arbejdsproces
(a) Arbejdsprocessen består af 13 generelle blokke, som kan grupperes i henhold til deres generelle funktion: Vælg mappe (blok 1) giver adgang til billeder; Flet kanaler (blok 2) bruges til at flette forskellige kanaler af billeder. Blok 3 til 8 er dedikeret til objektsegmentering, som hver især tilpasses til en bestemt kontekst: Segmentering A: Ikke-grupperede objekter, Segmentering B: Objekter, der er grupperet dårligt, Segmentering C: Grupperede objekter med konvekse former, Segmentering D: Grupperede objekter med uregelmæssige former (blok 7, arbejder i tilknytning til blok 6), Segmentering E: Grupperede cytoplasmer. Blok 9 til 11 anvendes til at tælle/analysere foci i delcellerum: Fluorescensanalyse A: 1 Kanal, Fluorescensanalyse B: 2 Kanaler i samme rum og Fluorescensanalyse C: 2 Kanaler i to rum. Blok 12 og 13 er tilpasset til analyse af omplantningshændelser: Fluorescensanalyse D: Global omplantning og fluorescensanalyse E: Individuel celletranslokation. b) Global præsentation af en blokarkitektur. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: Tid, der skal bruges til segmentering som funktion af billedopløsning og objektklyngeniveau
(a) Grafisk illustration af den tid, det er nødvendigt for at udføre segmentering, afhængigt af billedopløsning og klyngeniveau. To forskellige segmenteringsblokke er blevet testet: Segmentering A (for objekter, der ikke er grupperet) og Segmentering D (for grupperede objekter med uregelmæssige former). Behandlingstiden (i sekunder pr. billede) afbildes som en funktion af billedopløsningen (antal pixel). (b) Eksempel på billeder analyseret med enten Segmentering A eller Segmentering D blok. DAPI farvning og segmenterede kerner er angivet. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4: Arbejdsgangsanalyse af en NFκB-nuklear translokationsanalyse som reaktion på TNFα-stimulation
(a) Eksempel på billeder af humane MCF7-celler (humane bryst adenocarcinom cellelinje) behandlet med TNFα fra BBBC014 billedsæt (Broad Bioimage Benchmark Collection)¹². Lokalisering af transskriptionsfaktoren NFκB er blevet undersøgt i celler behandlet med 12 stigende koncentrationer af TNFα (fra 0 til 10^-7g/ml). For hver koncentration blev der foretaget 4 replikater. DAPI-billeder (blå kanal) blev behandlet i Segmentering C: Grupperede objekter med konvekse former blok til segmenteret kerner, og derefter NFκB farvning med FITC (grøn kanal) blev brugt til at afgrænse cytoplasmer med Segmentering E: Clustered cytoplasma blok. Fluorescensanalyse D: Global Translokationsblok blev brugt til at eksportere summen af nukleare og cytoplasmatiske pixelværdier. b) Segmenterede kerner (grå) og cytoplasmer (hvid) anvendes til at bestemme den samlede intensitet af NFκB fluorescerende signal i hvert rum. cc) Dosis-responskurveen fra dataanalysen illustrerer stigningen i NFκB's nukleare andel, efterhånden som TNFα-koncentrationen øges. Billederne er i et 8-bit BMP-format, og billedstørrelsen er 1360 x 1024 pixel. For hver koncentration beregnes standardafvigelsen mellem de 4 replikater og illustreres som fejllinjer. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5: Kvantificering af EDC4 foci (P-kroppe) i cytoplasmaet i de enkelte celler
(a) Co-farvning med DAPI (blå kanal) og Phalloidin (rød kanal) gør det muligt at segmentere og identificere cellekerner og F-actin. EDC4-proteinet (grøn kanal) anvendes som markør for påvisning af P-kroppe, der vides udelukkende at være cytoplasmatiske. Skalalinje, 10 μm. (b) Foci tælles, og flere funktioner (her deres område i pixel) eksporteres til regnearket Resultater, der er struktureret i flere ark. To ark er dedikeret til analyse af kerner og to til analyse af cytoplaser. Hver rå integrerer oplysningerne om et bestemt investeringsafkast. I Nucleus/Cytoplasma Information sheets eksporteres segmenternes karakteristika (ROI ID, størrelse og middelintensitet), efterfulgt af antallet af fundne foci inden for hvert investeringsafkast. Hvis det er nødvendigt, kan der tilføjes en størrelsesgrænse (100 pixel i dette eksempel), og antallet af foci under og over denne tærskel rapporteres i de to sidste kolonner. I Nucleus/Cytoplasm_Distribution af foci-størrelsesark rapporteres arealet (i pixel) af alle de fundne foci i råstørrelsen for det tilsvarende investeringsafkast. I dette eksempel fremhæver vi analysen af to celler (segmenterede cytoplasm_0 and_1), hvor cytoplasmatisk EDC4 foci er blevet påvist. Størrelsen i pixels af hver af foci er også givet. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6: Kinetik af coilin og 53BP1 nucleoplasmic fordeling efter oxidativt stress
Analysen af antallet og størrelsen af foci var baseret på mere end 110 individuelle celler for hvert tidspunkt fra 3 uafhængige kinetik. a) Immunofluorescensdetektion af coilin og 53BP1 foci i HeLa S3-celler under hele behandlingen kinetik med 500 μM H₂O₂. 53BP1 koncentrerer sig om DNA Double-Strand Break sites og bruges til at vurdere effektiviteten af behandlingen på hver celle. Coilin er beriget i Cajal Organer. Cellerne blev fikseret 2, 4, 6, 8 og 20 timer efter oxidativ stressinduktion og co-plettet med anti-coilin (rød kanal) og anti-53BP1 (grøn kanal) antistoffer. Vægtstang, 10 μm. (b) Antallet af coilin nuklear foci efter oxidativt stress. Resultaterne vises som kassevisceller, hvor det centrale mærke er medianen, er boksens nedre og^th øvre kanter 25.^th I celler behandlet med H₂O₂påvises en signifikant stigning i antallet af coilin foci og er maksimal efter 2 og 4 timer i behandlingen. Wilcoxon - Mann Whitney testanalyse viser en signifikant forskel mellem ubehandlede og H₂O₂ behandlede celler (*, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001). cc) Andelen af celler, der har coilin foci-området (μm^2). De fleste foci har et mindre areal på 2 h og 4 timer tidspunkter i forhold til kontrol. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 7: Undersøgelse af Cajal Bodies' nucleation i celler, der overexpresser et GFP-coilin fusionsprotein
aa) HeLa S3-celler blev transficeret i biologiske tre eksemplarer med 500 ng af et plasmid, der udtrykte et GFP-Coilin-fusionsprotein ved hjælp af en standardprocedure i følgende af producentens anbefalinger. Efter 48 timer blev cellerne fikseret og plettet med et antistof mod coilin. DAPI (blå kanal) tillader at segmentere kerner. Til disse analyser blev mere end 100 celler analyseret. GFP-signalet afspejler ektopisk coilin-GFP protein (grøn kanal) lokalisering, mens coilin signal (rød kanal) svarer til både endogene og udefrakommende protein lokalisering. For hver kerne afspejler den gennemsnitlige intensitet af GFP-signalet niveauet af coilin-udtryk. Ifølge denne parameter, funktionerne i Coilin foci er blevet analyseret ved hjælp af blokken Fluorescens Analyse B: 2 Kanaler i samme rum. Skalastang, 10 μm. (b) Forholdet mellem antallet af coilin foci og den gennemsnitlige GFP-intensitet pr. kerne. Resultaterne vises som kassevisceller, hvor det centrale mærke er medianen, den nederste og øverste kant af boksen er 25^th og 75^th percentiler. Wilcoxon - Mann Whitney testanalyse viser en betydelig stigning i antallet af foci for en GFP intensitet >10 (*, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001). c) Forholdet mellem coilin foci-området og den gennemsnitlige GFP-intensitet pr. kerne. Resultaterne vises som kassevisceller, hvor det centrale mærke er medianen, den nederste og øverste kant af boksen er 25^th og 75^th percentiler. Wilcoxon - Mann Whitney testanalyse viser en betydelig stigning i arealet af coilin foci for en GFP intensitet >10 (*, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur S1: Kinetik af 53BP1 nucleoplasmic fordeling efter oxidativstress
a) Kvantificering af 53BP1-kerneledning i ubehandlede eller H₂O_2-behandlede celler efter forskellige inkubationstider. Resultaterne vises som kassevisceller, hvor det centrale mærke er medianen, den nederste og øverste kant af boksen er 25^th og 75^th percentiler. Wilcoxon - Mann Whitney testanalyse viser en signifikant forskel mellem ubehandlede og H₂O₂ behandlede celler (*, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001). b) For hvert tidspunkt for kinetik er der etableret en ROC-kurve (Receiver Operating Characteristic) for at bestemme den bedste tærskel for forskelsbehandling mellem stressede og ikke-stressede celler. Parametrene for hver test er rapporteret i tabellen (Følsomhed, specificitet, TP: ægte positiv, TN: sandt negativ, FP: falsk positiv, FN: falsk negativ). Ud fra disse data blev en global tærskel på 17 53BP1 foci besluttet på at diskriminere stresset fra ikke-stressede celler gennem kinetik. Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Et stigende antal gratis software værktøjer er til rådighed til analyse af fluorescens cellebilleder. Brugerne skal korrekt vælge den passende software i henhold til kompleksiteten af deres problematiske, deres viden i billedbehandling, og til den tid, de ønsker at bruge i deres analyse. Icy, CellProfiler, eller ImageJ / Fiji er kraftfulde værktøjer, der kombinerer både brugervenlighed og funktionalitet³. Isnende er et enkeltstående værktøj, der præsenterer en klar grafisk brugergrænseflade (GUI), og især dens "Protokoller" peg og klik interface, hvorigennem arbejdsgange let kan designes eller manipuleres⁴. Funktionaliteten af denne software er forbedret ved at støtte og udnytte ImageJ plug-ins, og en masse dokumentation er tilgængelig takket være sin store fællesskab af brugere. Vi brugte denne stærke kombination af brugervenlighed og funktionalitet af den iskolde software til at udvikle Substructure Analyzer workflow. Dens vigtigste mål er at foreslå en automatiseret løsning til at udføre en fuldstændig analyse af celle fluorescerende signal fra flere billeder. Analysen omfatter forbehandling af billeder, objektsegmentering og fluorescerende signalanalyse.

Flere protokoller er taknemmeligt deles på Icy hjemmeside og foreslår at bruge Iskolde funktionaliteter til at opdage og analysere fluorescerende signaler som cellulære foci. Nogle af disse protokoller behandler dog kun ét billede pr. løb, eksporter ikke resultaterne i en bestemt fil eller analyserer en enkelt kanal. Andre indeholder ikke indledende segmentering til at bestemme interesseområder (ROI'er) eller foreslå enkle algoritmer som "HK-midler", der ikke er egnet til segmentering af stærkt grupperede objekter. Understrukturanalyse automatiserer alle trin i billedanalysen fra billedforbehandling til segmentering af objekter og detektion/analyse af lysstofrør. Protokollen foreslår også enkle eller mere komplekse metoder til objektsegmentering og eksport af data (navne på de segmenterede objekter, foci analyse) er realiseret i optimerede udgange tilpasset det problematiske. CellProfiler foreslår også kraftige pipelines , der består af moduler , der indkapsler funktionaliteter^18,19. De tilgængelige rørledninger er velegnede til specifikke problemer. Iskolde arbejdsprocesser er et netværk af forskellige bokse, som hver især udfører en bestemt opgave. Gennem "Protokoller" interface, kasser komponere netværket er intuitive og nemme at manipulere. Substructure Analyzer er tilpasset til flere sammenhænge som den simple sammenlægning af kanaler, kvantificering af fluorescerende signaler fordeling mellem to subcellulære rum, analyse af foci i en eller flere kanaler fra en eller to cellulære rum i de enkelte celler. Flere skærme gør det muligt at visualisere de mellemliggende resultater under hver kørsel for at styre behandlingen. Desuden præsenterer Icy ikonlinjer, der grupperer metoderne efter emne, og hvorfra funktioner, der findes i arbejdsprocessen, kan manipuleres separat for manuelt at teste bestemte parametre på nogle billeder, før du bruger dem på et helt billedsæt.

Ligesom i bioimageanalysefeltet er det mest kritiske trin i denne protokol objektsegmenteringen. Protokollen foreslår segmentering af primære objekter, som er det meste af tiden cellekerner, og indeholder også en anden blok, hvilken opgave er at segmentere en anden type objekter i cellen. Kernersegmentering kan være vanskelig, når objekterne er stærkt grupperet, så de rører ved eller overlapper hinanden. Forskellige alternativer til segmentering af primære objekter er indeholdt i protokollen, i henhold til formen af objekterne og niveauet af klyngedannelse, selv om der til dato ingen universel algoritme succes i den fulde segmentering af stærkt grupperede objekter. Segmenteringsprocessen er hovedsageligt begrænset af bestemmelsen af korrekte parametre, der med held kunne segmentere en del af objekterne, men føre til under- eller oversegmentering af en anden del. Brugeren skal udføre forskellige kørsler med forskellige parametre for at få en endelig korrekt segmentering, især for grupperede objekter, der præsenterer heterogene og ikke-konvekse figurer.

Denne protokol er for det meste begrænset af segmenteringstrinnet, som kan være meget tidskrævende og har brug for effektiv computerkonfiguration til de mest komplekse sager. Mere specifikt, jo mere talrige eller komplekse billederne er (grupperede objekter til segment, et stort antal pixels i billederne), jo mere random-access hukommelse (RAM) brugeren vil kræve. Globalt, for eventuelle problematiske, vil brugeren nødt til at køre protokollen på en 64 bit Java Runtime Miljø (frit tilgængelig på Java hjemmeside) og til at bruge en 64 bits operativsystem (OS) for at øge den tilgængelige hukommelse, der anvendes af Icy (hukommelse er begrænset til 1300 MB for 32 bits JRE). På grund af scriptet fungerer protokollen ikke korrekt på en Mac-computer. Desuden stiger antallet af parametre i takt med problemets kompleksitet og vil kræve mere viden inden for billedanalyse. Med hensyn til funktionskriterierne er denne protokol endnu ikke blevet tilpasset til analyse af stablede billeder (tidsstakke, z-stakke), selvom Icy effektivt udfører analyse af denne type data.

Fremtidige opdateringer vil blive realiseret især for at forbedre segmenteringen af komplekse klynge objekter. Yderligere blokke vil blive udviklet for at tilpasse segmenteringen til klyngeformede cellulære strukturer med uregelmæssige ikke-konvekse former. Vi vil også tilpasse arbejdsgangen til analyse af tid og z-stakke (til live billedbehandling og 3D-data).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% Formaldehyde solution (w/v) methanol free	Thermo Fisher Scientific	28908	to fix the cells
Alexa Fluor 488 of goat anti-rabbit	Thermo Fisher Scientific	A-11008	fluorescent secondary antibody
Alexa Fluor 555 of goat anti-mouse	Thermo Fisher Scientific	A-21425	fluorescent secondary antibody
Alexa Fluor 555 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A34055	fluorescent secondary antibody
Bovine serum albumin standard (BSA)	euromedex	04-100-812-E
DMEM	Sigma-Aldrich	D5796-500ml	cell culture medium
Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI	Sigma-Aldrich	DUO82040-5ML	mounting medium
Human: HeLa S3 cells	IGBMC, Strasbourg, France		cell line used to perform the experiments
Hydrogen peroxide solution 30% (H2O2)	Sigma-Aldrich	H1009-100ml	used as a stressing agent
Lipofectamine 2000 Reagent	Thermo Fisher Scientific	11668-019	transfection reagent
Mouse monoclonal anti-coilin	abcam	ab11822	Coilin-specific antibody
Nikon Optiphot-2 fluorescence microscope	Nikon		epifluoresecence microscope
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Thermo Fisher Scientific	31985062	transfection medium
PBS pH 7.4 (10x)	gibco	70011-036	to wash the cells
Rabbit polyclonal anti-53BP1	Thermo Fisher Scientific	PA1-16565	53BP1-specific antibody
Rabbit polyclonal anti-EDC4	Sigma-Aldrich	SAB4200114	EDC4-specific antibody
Triton X-100	Roth	6683	to permeabilize the cells