Bioengineering

Alt Yapı Analizörü: Floresan Mikroskopi Görüntülerinde HücreCisimlerinin Hızlı Araştırılması ve Doğru Analizi için Kullanıcı Dostu İş Akışı

Published: July 15, 2020 doi: 10.3791/60990

Géraud Heckler¹, Christelle Aigueperse¹, Liza Hettal¹, Quentin Thuillier¹, Fabrice de Chaumont², Stéphane Dallongeville², Isabelle Behm-Ansmant¹

¹Université de Lorraine, CNRS, IMoPA F54000 Nancy France, ²Institut Pasteur, BioImage Analysis Unit, CNRS UMR 3691, Paris, France.

Summary

Floresan mikroskopi görüntülerinde belirli hücre bölmelerinde hücresel cisimlerin hızlı araştırılması ve doğru analizi için oluşturulmuş serbestçe kullanılabilir bir iş akışı salıyoruz. Bu kullanıcı dostu iş akışı açık kaynak yazılım Icy üzerinde tasarlanmıştır ve aynı zamanda ImageJ işlevleri kullanır. Boru hattı görüntü analizi nde bilgi olmadan uygun fiyatlı.

Abstract

Son on yılda floresan mikroskopi tekniklerinde uzamsal çözünürlük iyileştirmesi ile gösterildiği gibi canlı hücre görüntüleme ve yüksek işlem mikroskobu tekniklerinde de atılımlar ile karakterize edilmiştir. Bu, tek bir deney için mikroskopi verilerinin miktarında ve karmaşıklığında sürekli bir artışa yol açmıştır. Mikroskopi verilerinin manuel analizi çok zaman alıcı, öznel ve nicel analizleri yasakladığı için, biyogörüntü analizinin otomasyonu neredeyse kaçınılmaz hale gelmektedir. Floresan mikroskopiden biyogörüntülerde sinyal analizini tam olarak otomatikleştirmek için Alt Yapı Analizörü adı verilen bir bilişim iş akışı kurduk. Bu iş akışı kullanıcı dostu açık kaynak platformu Icy üzerinde geliştirilmiştir ve ImageJ işlevleri tarafından tamamlanır. Sinyalin gürültü oranına doğru geliştirilmesi için görüntülerin ön işlenmesini, hücrelerin bireysel bölümlemesi (hücre sınırlarının saptanması) ve belirli hücre bölmelerinde zenginleştirilmiş hücre gövdelerinin algılanmasını/nicelleştirilmesini içerir. Bu iş akışının en büyük avantajı, kullanıcı dostu bir arayüz aracılığıyla görüntü analizi uzmanlığı olmayan kullanıcılara karmaşık biyo-görüntüleme işlevleri önermektir. Ayrıca, son derece modüler ve farklı hücresel alt yapılarda farklı hücre organlarının karşılaştırmalı analizi nükleer / sitoplazmik translokasyon karakterizasyonu çeşitli konulara adapte. Bu iş akışının işlevselliği oksidatif stres (OS) koşulları altında Cajal (kıvrılmış) Organların çalışması ile gösterilmiştir. Floresan mikroskopiden elde edilen veriler, insan hücrelerindeki bütünlüklerinin işletim sistemi indüksiyonundan birkaç saat sonra etkilendiğini göstermektedir. Bu etki karakteristik Cajal Cisimler içine bobin nükleasyonu bir azalma ile karakterizedir, küçük foci artan sayıda bobin bir nükleoplazmik yeniden dağılımı ile ilişkili. CB bileşenleri ile çevresindeki nükleoplazm arasındaki değişimde bobinin merkezi rolü, OS'nin indüklenen bobinin yeniden dağılımının Cajal Cisimlerinin bileşimini ve işlevselliğini etkileyebileceğini düşündürmektedir.

Introduction

Işık mikroskobu ve özellikle floresan mikroskobu biyolojik bilimlerde yaygın olarak kullanılan sağlam ve çok yönlü tekniklerdir. Proteinler veya RNA gibi çeşitli biyomoleküllerin spesifik floresan etiketlemeyoluyla kesin lokalizasyonuna erişim verirler. Son on yılda mikroskobik ve görüntüleme teknolojilerinde hızlı gelişmeler ile karakterize edilmiştir 2014 Nobel Kimya Ödülü Eric Betzig, Stefan W. Hell ve William E. Moerner süper çözülmüş¹floresan mikroskopi mikroskobu (SRFM) gelişimi için verilen . SFRM, geleneksel optik mikroskopinin kırınım sınırını atlayarak nanoboyuta getirir. Canlı görüntüleme veya yüksek iş elde tarama yaklaşımları gibi tekniklerde iyileşme, her deney için tedavi edilmesi gereken verilerin miktarını ve karmaşıklığını da artırır. Çoğu zaman, araştırmacılar hücrelerin yüksek heterojen popülasyonları ile karşı karşıya ve tek hücre düzeyinde fenotipleri analiz etmek istiyorum.

Başlangıçta, foci sayma gibi analizler göz tarafından yapılmıştır ve bu durum bazı araştırmacılar tarafından tercih edilir, çünkü sayım süreci üzerinde tam görsel kontrol sağlar. Ancak, bu tür verilerin manuel analizi çok zaman alıcı, gözlemciler arasında değişkenlik yol açar ve bilgisayar destekli yaklaşımlar yaygın olarak kullanılan ve neredeyse kaçınılmaz hale geliyor böylece daha karmaşık özelliklere erişim vermez². Biyogörüntü bilişim yöntemleri veri analizinin verimliliğini önemli ölçüde artırır ve manuel sayma analizinin kaçınılmaz operatör öznelliği ve potansiyel önyargısı içermez. Bu alandaki artan talep ve bilgisayar gücünün iyileştirilmesi çok sayıda görüntü analiz platformunun geliştirilmesine yol açmıştır. Bazıları serbestçe kullanılabilir ve kişisel bilgisayarlarla analiz yapmak için çeşitli araçlara erişim sağlar. Açık erişim araçları bir sınıflandırma son zamanlarda³ kurulmuştur ve kullanılabilirlik ve işlevselliği birleştiren güçlü bir yazılım olarak Icy⁴ sunar. Ayrıca, Icy ImageJ ile iletişim avantajı vardır.

Görüntü analizi uzmanlığı olmayan kullanıcılar için, ana engeller genellikle iyi anlaşılamayan sorunlu ve doğru ayar parametrelerine göre uygun aracı seçmektir. Ayrıca, kurulum süreleri genellikle uzun. Buzlu kapsamlı bir koleksiyon içinde bulunan bazı eklentileri birleştirerek iş akışı geliştirmek için "Protokoller" adlı kullanıcı dostu nokta ve tıklama arayüzü önerir^4. Esnek modüler tasarım ve nokta-ve-tık arabirimi, programcı olmayanlar için bir analiz ayarlamayı mümkün kılabilir. Burada, işlevi belirli hücresel bölmelerde floresan sinyalleri analiz etmek ve parlaklık, foci sayısı, foci boyutu ve uzamsal dağılım gibi farklı özellikleri ölçmek olan Icy'nin arayüzünde geliştirilen Alt Yapı Analizörüadlı bir iş akışı salıyoruz. Bu iş akışı, sinyal translokasyonunun niceliği, floresan muhabiri ifade eden transfected hücrelerin analizi veya tek tek hücrelerdeki farklı hücresel alt yapılardan gelen fokların analizi gibi çeşitli konuları ele almaktadır. Birden çok görüntünün eşzamanlı olarak işlenmesine olanak tanır ve çıktı sonuçları, sık kullanılan elektronik tablo programlarında açIlebilen sekme sınırlandırılmış bir çalışma sayfasına dışa aktarılır.

Alt Yapı Çözümleyici boru hattı Şekil 1'desunulmuştur. İlk olarak, belirli bir klasörde bulunan tüm görüntüler, sinyallerini gürültü oranına göre geliştirmek için önceden işlenir. Bu adım, aşağıdaki adımların verimliliğini artırır ve çalışma süresini azaltır. Daha sonra, floresan sinyalinin algılandığı görüntü alanlarına karşılık gelen İlgi Bölgeleri (ROI' ler) tanımlanır ve bölümlere alınır. Son olarak, floresan sinyali analiz edilir ve sonuçlar sekme-delimited çalışma sayfasına dışa aktarılır.

Nesne bölümlemesi (sınırların saptanması) görüntü analizinde en zorlu adımdır ve verimliliği elde edilen hücre ölçümlerinin doğruluğunu belirler. Bir görüntüde tanımlanan ilk nesneler (birincil nesneler olarak adlandırılır) genellikle DNA lekeli görüntülerden (DAPI veya Hoechst boyama) çekirdeklerdir, ancak birincil nesneler de bütün hücreler, boncuklar, benekler, tümörler veya lekeli nesneler olabilir. Biyolojik görüntülerin çoğunda hücreler veya çekirdekler birbirine dokunur veya örtüşarak basit ve hızlı algoritmaların başarısız olmasıyla oluşur. Bugüne kadar, hiçbir evrensel algoritma tüm nesnelerin mükemmel segmentasyon gerçekleştirebilirsiniz, çoğunlukla çünkü özellikleri (boyut, şekil veya doku) segmentasyon etkinliğini modüle⁵. Genellikle mikroskop yazılımı ile dağıtılan segmentasyon araçları (Moleküler Cihazlar tarafından MetaMorf Görüntüleme Yazılımı^{gibi 6}, veya Nikon⁷tarafından NIS-Elements Advances Araştırma yazılımı) genellikle korelasyon eşleştirme, eşik veya morfolojik işlemler gibi standart tekniklere dayanmaktadır. Temel sistemlerde verimli olmasına rağmen, bu aşırı genelleştirilmiş yöntemler daha zorlu ve belirli bağlamlarda kullanıldığında hızla sınırlamalar sunar. Gerçekten de, segmentasyon hücre tipi, hücre yoğunluğu veya biyobelirteçler gibi deneysel parametrelere karşı son derece hassastır ve sık sık büyük bir veri kümesi için tekrarlanan ayarlama gerektirir. Alt Yapı Çözümleyici iş akışı, görüntü karmaşıklığına ve kullanıcı gereksinimlerine uyarlanmış farklı alternatifler önermek için hem basit hem de daha gelişmiş algoritmaları bütünleştirir. Yüksek kümelenmiş nesneler için işaretçi tabanlı havza^{algoritması 8'i} özellikle önerir. Bu segmentasyon yönteminin verimliliği, her nesneüzerinde tek tek işaretçilerin seçimine dayanır. Bu işaretçiler, tam segmentasyon için doğru parametreleri elde etmek için çoğu zaman el ile seçilir, bu da kullanıcıların çok sayıda nesneyle karşılaştığında çok zaman alır. Alt Yapı Çözümleyicisi, yüksek verimli bir segmentasyon işlemi sağlayarak bu işaretçilerin otomatik olarak algılanmasını önerir. Segmentasyon, çoğu zaman, görüntü çözümlemesi sınırlayıcı adım ve önemli ölçüde görüntünün çözünürlüğü, görüntü başına nesne sayısı ve nesnelerin kümeleme düzeyine bağlı olarak işlem süresini değiştirebilirsiniz. Tipik ardışık hatlar, standart bir masaüstü bilgisayarda görüntü başına birkaç saniye ile 5 dakika arasında bir süre gerektirir. Daha karmaşık görüntülerin analizi daha güçlü bir bilgisayar ve görüntü analizi nde bazı temel bilgiler gerektirebilir.

Bu iş akışının esnekliği ve işlevselliği temsili sonuçlarda çeşitli örneklerle gösterilmiştir. Bu iş akışının avantajları özellikle oksidatif stres (OS) koşulları altında nükleer alt yapıların incelenmesi ile görüntülenir. Os oksidanlar lehine redoks homeostazı bir dengesizlik karşılık gelir ve reaktif oksijen türlerinin yüksek düzeyde ile ilişkilidir (ROS). ROS sinyal molekülleri olarak hareket ettiği için, konsantrasyonlarındaki ve hücre altı lokalizasyonlarındaki değişiklikler, sinyal iletimi, onarım mekanizmaları, gen ekspresyonu, hücre ölümü ve çoğalma⁹^,¹⁰gibi fizyolojik fonksiyonları düzenleyen sayısız yolu ve ağı olumlu veya olumsuz yönde etkiler. İşletim sistemi böylece doğrudan çeşitli patolojiler (nörodejeneratif ve kardiyovasküler hastalıklar, kanserler, diyabet, vb) değil, aynı zamanda hücresel yaşlanma yer almaktadır. Bu nedenle, işletim sistemi'nin insan hücresinin organizasyonu ve işlevi üzerindeki sonuçlarının deşifre edilmesi, insan patolojilerinin başlangıcında ve gelişiminde os'un rollerinin anlaşılmasında önemli bir adım teşkil etmektedir. İşletim sistemi çeşitli transkripsiyon faktörleri (p53, Nrf2, FOXO3A)¹¹ile transkripsiyon modüle ederek gen ekspresyonunu düzenler, ancak aynı zamanda alternatif rnas¹²^,13^,¹⁴alternatif birleştirme (AS) gibi çeşitli co- ve post-transkripsiyonel süreçlerin düzenlenmesini etkileyerek kurulmuştur .¹⁴ Birincil kodlama ve kodlamayan transkriptlerin alternatif olarak birleştirilmesi, transkript izoformları üreterek genomların kodlama kapasitesini artıran temel bir mekanizmadır. AS, yaklaşık 300 protein ve 5 U-zengin küçük nükleer RNA (UsnRNA) içeren spliceosome adı verilen büyük bir ribonükleoprotein kompleksi tarafından gerçekleştirilir¹⁵. Spliceosome montaj ve AS sıkıca hücrelerde kontrol edilir ve spliceosome olgunlaşma bazı adımlar Cajal Bodies adlı membran-az nükleer bölmeleri içinde meydana gelir. Bu nükleer alt yapılar, yapılarının dinamik yapısı ve bileşimi ile karakterizedir ve bunlar esas olarak RNA ve protein bileşenlerinin bobin proteini ile çok yönlü etkileşimleri ile gerçekleştirilir. Alt Yapı Çözümleyici iş akışı ile binlerce hücrenin analizi, os'un Cajal Cisimler üzerindeki hiçbir zaman tanımlanmamış etkilerinin karakterizasyonuna olanak sağladı. Gerçekten de elde edilen veriler, OS'lerin Cajal Cisimlerinin çekirdekleşmesini modicikçe modiciye dönüştürerek bobin proteininin nükleoplazmik olarak çok sayıda daha küçük nükleer fosiye ye dönüşmesini indüklediğini göstermektedir. Cajal Bodies yapısının böyle bir değişiklik spliceosome olgunlaşmasını etkileyebilir ve OS tarafından AS modülasyonu katılmak.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

NOT: Kullanıcı dostu öğreticiler icyweb sitesinde http://icy.bioimageanalysis.org mevcuttur.

1. Icy ve Alt Yapı Analizörü protokolünü indirin

Buzlu web sitesinden(http://icy.bioimageanalysis.org/download) indirin ve Alt Yapı Analizörü protokolünü indirin: http://icy.bioimageanalysis.org/protocols?sort=latest.
NOT: 64 bit işletim sistemi kullanıyorsanız, Java'nın 64 bit sürümünü kullandığınızdan emin olun. Bu sürüm, Buzlu'ya ayrılan belleği artırmaya olanak sağlar (Tercihler | Genel | Maksimum bellek).

2. Protokolün açılması

Icy'yi açın ve Şerit menüsündeki Araçlar'a tıklayın.
Protokoller Düzenleyicisi arabirimini açmak için Protokoller'e tıklayın.
Yükle'ye tıklayın ve protokol Alt Yapı Analizörü'nüaçın. Protokol yüklemesi birkaç saniye sürebilir. Kullanmadan önce protokolün açılmasının tamamlandığından emin olun.
NOT: İş akışı Şekil 2a'dasunulan 13 genel bloktan oluşmaktadır. Her blok, belirli alt görevleri gerçekleştiren birkaç kutudan oluşan bir ardışık hatlar olarak çalışır.

3. Buzlu iş akışı ile etkileşim

NOT: Her blok veya kutu numaralanır ve iş akışı içinde belirli bir rütbeye sahiptir (Şekil 2b). Bu numaraya tıklandığında, seçili bloğa/kutuya mümkün olan en yakın konum atanır ve diğer blokların/kutuların konumu yeniden düzenlenir. İş akışını hazırlarken blokların doğru sırasına saygı gösterin. Örneğin, Spot Dedektörü bloğunun, Segmentasyon bloklarının Spot Dedektörü bloklarından önce çalışması için önceden tanımlanmış ROI'lara ihtiyacı vardır. Kutuların konumunu değiştirmeyin. Görüntünün adına "." kullanmayın.

Sol üst köşe simgesine tıklayarak, daraltmak, genişletmek, büyütmek, daraltmak veya bloğu kaldırmak(Şekil 2b).
İş akışının her boru hattı, giriş ve çıktıları ile bağlanan bir kutu ağı ile karakterize edilir (Şekil 2b). Bağlantı oluşturmak için Çıktı'yı tıklatın ve imleç bir girişe erişene kadar koruyun. Çıktılar etiketine tıklayarak bağlantılar kaldırılabilir.

4. Görüntü kanallarının birleştirilmesi

Birleştirilmiş görüntüler oluşturmak için Birleştirme Kanalları'nı blokolarak kullanın. Gerekirse, birleştirilecek dizilerin aynı adın önekini ve ardından farklı bir ayırıcıyı görebilmeleri için dosyaları yeniden adlandırın. Örneğin, A Görüntüsü'nden tek tek kanalların dizileri adlandırılmış: ImageA_red ImageA_blue.
NOT: Ayırıcı için, görüntünün adında zaten mevcut olan karakterleri kullanmayın.
Aynı klasörde, birleştirmek için kanal başına yeni bir klasör oluşturun. Örneğin, kırmızı, yeşil ve mavi kanalları birleştirmek için 3 klasör oluşturun ve karşılık gelen sıraları bu klasörlerde depolayın.
Yalnızca Blokları Birleştirme Kanalları'nıkullanın, diğer blokları kaldırın ve protokolü Kanalları Birleştirolarak kaydedin.
1. Parametreleri ayarlamak için kutulara erişin. Her kanal için, sırasıyla Kanal numarası X (1, 5 veya 9 kutuları), Klasör kanal numarası X (2, 6 veya 10 kutu), Ayırıcı kanal numarası X (kutu 3, 7 veya 11) ve Colormap kanalı nb X (4, 8 ve 12 kutuları) kutularını doldurun.
  NOT: Bu kutular yatay olarak dört, her satır aynı kanala karşılık gelen gruplandırılır. Her satırda, ilgili kanalın sırasını doğrudan görselleştirmek için bir ekran da kullanılabilir (23, 24 veya 25 kutuları).
  1. Kanal numarası Xkutusunda, hangi kanalın ayıklanmasını seçin (klasik RGB görüntülerinde, 0=Kırmızı, 1=Yeşil, 2=Mavi). Kullanıcı, Sıra sekmesinde, Buzlu Denetçi penceresindeki görüntünün farklı kanallarına hızlı bir şekilde erişir.
  2. Klasör kanal numarası X kutusuna, X kanalınıngörüntülerini içeren klasörün \Name'sini yazın.
  3. Ayırıcı kanal numarası Xkutusuna, görüntünün adı için kullanılan ayırıcıyı yazın (önceki örnekte: "_red", "_green" ve "_blue").
  4. Kutusunda Colormap kanal nb X, Buzlu ilgili kanal görselleştirmek için kullanmak için hangi colormap modeli ile bir sayı ile gösterir. Kullanılabilir renk eşlemleri Denetçi penceresinin Sıra sekmesinde görünür.
  5. Birleştirilmiş görüntülerin (kutu 28) kutusunda, birleştirilmiş görüntüleri kaydetmek için uzantıyı yazın: .tif, .gif, .jpg, .bmp veya .png.
    NOT: Yalnızca 2 kanalı birleştirmek için, üçüncü kanala karşılık gelen dört kutuyu doldurmayın.
2. Birleştirme Kanalları bloğunun sol üst köşesinde, doğrudan Klasör'ünsağındaki bağlantıya tıklayın. Görünen Aç iletişim kutusunda, kutu klasör kanalı numarası 1 'de (kutu 2) tanımlanan ilk kanalın dizilerini içeren klasöre çift tıklayın. Ardından Aç'atıklayın.
3. Birleştirme Kanalları bloğunun sol üst köşesindeki siyah oku tıklatarak protokolü çalıştırın (daha fazla ayrıntı için bölüm 7'ye bakın). Birleştirilmiş görüntüler, tek tek kanalların klasörleri ile aynı dizinde birleştirme klasörüne kaydedilir.

5. İlgi alanlarının bölümletilmesi

NOT: Alt Yapı Çözümleyicisi, görüntü karmaşıklığına ve kullanıcı ihtiyaçlarına uyarlanmış farklı alternatifler önermek için hem basit hem de daha gelişmiş algoritmaları entegre eder.

Uyarlanmış bloğu seçin.
1. Nesneler birbirine dokunmuyorsa veya kullanıcı kümelenmiş nesneleri tek tek ayırt etmek zorunda değilse, Segmentasyon A: Kümelenmiş olmayan nesnelerikullanın.
2. Nesneler birbirine dokunmadığında, ancak bazıları yakınolduğunda, Segmentasyon B: Kötü kümelenmiş nesnelerikullanın.
3. Yüksek kümelenme düzeyi ve konveks şekli olan nesneler için, blok Segmentasyon C kullanın: Konveks şekilli kümelenmiş nesneler.
4. Nesneler yüksek kümeleme düzeyi mevcut ve düzensiz şekiller varsa, blok Segmentasyon D kullanın: Düzensiz şekiller ile kümelenmiş nesneler.
5. Segmentasyon E: Parçalı çekirdekleri işaretleyici olarak kullanarak dokunmadan sitoplazmaları tek tek segmentlendirmek için kümelenmiş sitoplazmayı kullanın. Bu blok zorunlu işlemek için parçalı çekirdekleri gerekir.
  NOT: Belirli bir alt yapı için verimliliklerini karşılaştırmak veya farklı alt yapı türlerini segmentlemek için aynı çalıştırmada birkaç bloğun kullanılabilmesi için birincil nesne segmentasyon işlemi için bağımsız olarak uyarlanan bloklar. Kümeleme düzeyi aynı görüntü kümesi içinde heterojenseyse, küçük ve yüksek kümelenmiş nesneleri uyarlanmış bloklarda ayrı ayrı işleyerek işleyerek.
Seç Klasörü bloğunun çıktı0'ını (Dosya) seçilen segmentasyon bloğunun klasör girişine bağla.
Seçilen segmentasyon bloğunun parametrelerini ayarlayın.
1. Segmentasyon A: Kümelenmiş olmayan nesneler ve Segmentasyon C: Konveks şekilli kümelenmiş nesneler
  1. Kutu Kanal sinyalinde (kutu 1), nesnelerin kanalını segmente ayarlayın.
  2. Seçenek olarak, gaussian filtresi (kutu 2) kutusunda, nesnelerin içindeki sinyal heterojense X ve Y sigma değerlerini artırın. Gaussfiltresi daha düzgün bölgeler elde etmek için dokuları yumuşatır ve çekirdek segmentasyonunun hızını ve verimliliğini artırır. Nesneler ne kadar küçükse, sigma değeri de o kadar düşüktür. Yüksek sigma değerlerinden kaçının. Varsayılan değerleri 0 olarak ayarlayın.
  3. HK-Means kutusunda (kutu 3), Yoğunluk sınıfları parametresini ve algılanacak nesnelerin yaklaşık minimum ve maksimum boyutlarını (piksel olarak) ayarlayın.
    NOT: Yoğunluk sınıfları için 2 değeri pikselleri 2 sınıfta sınıflar: arka plan ve ön plan. Böylece nesneler ve arka plan arasındaki kontrast yüksek olduğunda uyarlanır. Ön plan nesnelerinin farklı yoğunlukları varsa veya arka planla kontrast düşükse, sınıf sayısını artırın. Varsayılan ayar 2'dir. Nesne boyutu, ilgi çeken nesnenin etrafına el ile bir YG çizilerek hızlı bir şekilde değerlendirilebilir. YG'nin boyutu (Piksellerde Iç) imleçle işaret ederken doğrudan görüntünün üzerinde görünür veya YG istatistik penceresinden erişilebilir (arama çubuğundan açın). Optimal parametreler, her ön plan nesnesi tek bir yg.'dealgılar. Bunlar buzlu olarak el ile tanımlanabilir (Algılama ve İzleme | HK-Anlamına gelir).
  4. Etkin Konturlar kutusunda (kutu 4), nesne kenarlıklarının algılanmasını en iyi duruma getirin. Bu eklenti için ayrıntılı belgeler online olarak kullanılabilir: http://icy.bioimageanalysis.org/plugin/Active_Contours. Doğru parametreler de buzlu olarak el ile tanımlanabilir (Algılama ve İzleme | Etkin Konturlar).
  5. İşlem sırasında, bölümlenmiş nesnelerin görüntülerini kaydetmek için otomatik olarak bir klasör oluşturulur. Metin (kutu 6) kutusunda, bu klasörü adlandırın (ör. Parçalı çekirdekler). Parçalı nesnelerin görüntülerini kaydetmek için biçimi ayarlamak için (Tiff, Gif, Jpeg, BMP, PNG), parçalı nesnelerin görüntülerininkutu biçimini doldurun. Klasör, birleştirilmiş görüntüler içeren klasörde oluşturulur.
  6. İş akışını çalıştırın (ayrıntılar için bölüm 7'ye bakın).
2. Segmentasyon B: Az kümelenmiş nesneler
  1. Kutuları Kanal sinyali, HK-Means, Active Contours, Uzantı parçalı nesneleri ve Metin kaydetmek için parametreleri ayarlamak için 5.3.1 olarak aynı adımları izleyin (Kutuları sıralaması adım 5.3.1 aynı değildir).
  2. Kutuda Call IJ eklentisi (kutu 4), arka plan çıkarma denetlemek için Rolling parametresini ayarlayın. Bu parametreyi en azından arka planın bir parçası olmayan en büyük nesnenin boyutuna ayarlayın. Bu değerin azaltılması arka plan kaldırma artırır ama aynı zamanda ön plan sinyal kaybına neden olabilir.
  3. Kutuda Adaptive histogram dengeleme (kutu 6), ön plan nesneleri ve arka plan arasındaki kontrastları geliştirmek. Eğimi artırmak daha zıt diziler verir.
  4. İş akışını çalıştırın (ayrıntılar için bölüm 7'ye bakın).
3. Segmentasyon D: Düzensiz şekilli kümelenmiş nesneler
  NOT: Her görüntü için üç farklı segmentasyon yöntemi uygulanır: birincisi,HK-kümeleme anlamına gelirile birlikteEtkin Konturyöntemiuygulanır. Daha sonra,klasik havza algoritması(Öklisidan mesafe haritası kullanılarak) daha önce yanlış bölümlenmiş nesnelere uygulanır. Son olarak, birmarker tabanlı havza algoritmasıkullanılır. Yalnızca HK araçları ve marker tabanlı havza yöntemleri nin kullanıcı müdahalesi gerekir. Her iki yöntem için de tüm görüntüler (tam otomatik sürüm) için aynı parametreler uygulanabilir veya her görüntü (yarı otomatik versiyon) için değiştirilebilir. Kullanıcı bu segmentasyon yöntemleri konusunda eğitilmediyse, yarı otomatik işleme şiddetle önerilir. Bu bloğun işlenmesi sırasında, manuel müdahale gereklidir. Bir segmentasyon yöntemi tamamlandığında, kullanıcı nın bir sonraki segmentasyon yönteminin başlangıcından önce yanlış bölümlü nesneleri el ile kaldırması gerekir. Başarıyla bölümlenmiş nesneler kaydedilir ve bir sonraki adımda dikkate alınmaz.' Bu blok blok ile bağlı olmalıdırKümelenmiş/heterojen şekiller birincil nesneler bölümleme İletişim Kutusudoğru çalışmak için.
  1. https://github.com/ijpb/MorphoLibJ/releases'daImageJ koleksiyonu MorphoLibJ'i indirin. MorphoLibJ 1.4.0 sürümü bu protokolde kullanılır. Dosyayı MorphoLibJ_-1.4.0.jar klasörüne yerleştirin. Bu koleksiyonun içeriği hakkında daha fazla bilgi https://imagej.net/MorphoLibJ.
  2. Kutuları Kanal sinyaliparametrelerini ayarlamak için adım 5.3.1 olarak aynı adımları izleyin , Gaussian filtre, Aktif Konturlar, Uzantı parçalı nesneleri ve Metinkaydetmek için . Kutuları sıralaması adım 5.3.1 aynı değildir.
  3. Kutu Adaptif histogram dengeleme parametrelerini ayarlayın (bkz. adım 5.3.2.3).
  4. Altbilgi Arka Planıetkinleştirmek için, Arka Planı Çıkar'a evet yazın? (kutu 5). Else, Hayıryazın . Eklenti etkinleştirilirse, yuvarlanma parametresini (bkz. adım 5.3.2), kutuya Arka Plan parametresini (kutu 7) ayarlayın.
  5. HK-araçlarının otomatikleştirilmesi: Tüm görüntüler (tam otomatik işleme) için aynı parametreleri uygulamak için, sınıfların Nb'sini (kutu 11), Minimum boyutu (kutu 12) ve Maksimum boyutu (kutu13) ayarlayın (bkz. adım 5.3.1). Bu parametreler, en fazla ön plan pikseli seçmek ve ön plan nesnelerinin bireyselleştirilmesini optimize etmek için ayarlanmalıdır. Yarı otomatik işlem sürümü için müdahale gerekmez.
  6. İşaretleyici ekstraksiyonlarının otomatikleştirilmesi: tam otomatik sürüm için, Iç İşaretleyiciler ekstraksiyon kutusunu genişletin (kutu 27) ve komut dosyasının 13. Yarı otomatik işlem sürümü için müdahale gerekmez.
    NOT: İşaretçiler, "dinamik" bir parametre tarafından kontrol edilen bir giriş görüntüsüne genişletilmiş bir minima dönüştürme uygulanarak ayıklanır. İşaretçi tabanlı havza algoritmasında, bu işaretçilerden gelen sel nesne segmentasyongerçekleştirmek için simüle edilir. Ön plan nesnelerinin başarılı bir şekilde bölümlemesi için, ön plan nesnesi başına tek bir işaretçi ayıklanmalıdır. En iyi belirteçlerin ayıklanması için "dinamik" parametrenin ayarı çoğunlukla görüntülerin çözünürlüğüne bağlıdır. Bu nedenle, bu parametreye aşina değilseniz, yarı otomatik sürümü kullanın.
  7. İş akışını çalıştırın (ayrıntılar için bölüm 7'ye bakın).
  8. İşlemin başında, iletişim kutuları HK-anlamına gelir parametreleri ve Marker tabanlı havza art arda açık. Tüm görüntüler (tam otomatik sürüm) için aynı parametreleri uygulamak için EVET'itıklatın. Aksi takdirde, NO'yatıklayın. Bir bilgi kutusu açılır ve "HK-Means eklentisi ile en uygun ROI'ları belirleyin ve görüntüyü kapatın" sorulur. Tamam'a tıklayın ve HK-Means eklentisini manuel olarak uygulayın (Algılama ve İzleme| HK-Araçlar) otomatik olarak açılan görüntüde. HK-Means eklenti kutusunda Export ROI seçeneğini seçin. En fazla ön plan pikseli içeren ROI'lara sahip olmak ve ön plan nesnelerinin bireyselleştirilmesini optimize etmek için en iyi parametreleri uygulayın. En iyi ROI'lar bulunduğunda, görüntüyü doğrudan kapatın.
  9. İlk segmentasyon yönteminin sonunda, bir bilgi kutusu açılır ve "İstenmeyen RO'ları kaldırın ve görüntüyü kapatın" sorar. Bu ROI'lar, parçalanmış nesnelerin kenarlıklarına karşılık gelir. Tamam'ı seçin ve görüntüdeki otomatik olarak açılan yanlış bölümlü nesnelerin RO'larını kaldırın. Bir YG, imleci kenarlıklarına yerleştirerek ve klavyenin "Sil" düğmesini kullanarak kolayca kaldırılabilir. Görüntüyü kapatın. İkinci segmentasyon adımı tamamlandıktan sonra aynı yordamı tekrarlayın.
  10. Bu aşamada, işaretçi tabanlı havza algoritmasının tam otomatikleştirilmesi için EVET düğmesi seçilirse, önceden ayarlanmış parametreler tüm görüntülere uygulanır.
  11. NO düğmesi seçilirse, "İç işaretçileri belirleyin ve ayarlayın" soran bir bilgi kutusu açılır. Tamam tıklayın ve Icy ImageJ arayüzü içinde, Eklentileri gidin | MorphoLibJ | Minima ve Maxima| Genişletilmiş Min & Max. Operasyonda, Genişletilmiş Minima'yıseçin.
  12. Dönüşümün sonucunu otomatik olarak açılan görüntüde ön görselleştirmek için Önizleme'yi seçin. En uygun belirteçler gözlemlenene kadar dinamiği hareket ettirin. İşaretçiler, değeri 255 olan piksel gruplarıdır (beyaz piksel olmak zorunda değildir). En uygun parametreler nesne başına bir işaretçiye yol açar. Önceki iki segmentasyon yöntemiyle iyi bir şekilde bölümlere ayrılmayan kalan nesnelere odaklanın.
  13. Gerekirse, "Açılış" veya "Kapanış" gibi ek morfolojik işlemler uygulayarak belirteçleri geliştirin (Eklentiler | MorphoLibJ | Morfolojik Filtreler). İşaretçilerin son görüntüsünü alırken, açık tutun ve genişletilmiş Minima işlemi için başlangıçta bir giriş olarak kullanılan görüntüyle biten diğer tüm görüntüleri kapatın. ImageJ kutusu bu resimdeki değişiklikleri kaydetmek isterse Hayır'ı tıklatın.
  14. Bilgi Kutusu (kutu 14) içeren görüntülerin Nb kutusunda, Bilgi Kutuları ile kaç görüntünün görünmesi gerektiğini belirleyin.
4. Segmentasyon E: Kümelenmiş sitoplazma
  NOT: Bu blok, sitoplazma segmentasyonunu başlatmak için daha önce parçalanmış çekirdekleri tek tek işaretleyici olarak kullanır. Çekirdek segmentasyon bloğunun kullanmadan önce işlendiğinden emin olun.
  1. Kutu Kanal sitoplazma (kutu 1), sitoplazmik sinyal kanal ayarlayın.
  2. Kutu uzantılı parçalı çekirdekleri (kutu 2), segmentli çekirdeklerin görüntülerini kaydetmek için kullanılan biçimi yazın (tif, jpeg, bmp, png). Varsayılan biçim tif'tir.
  3. Metin (box3) kutusuna, parçalı çekirdekleri içeren klasörün \Name'sini yazın.
  4. Parçalı sitoplazmaların (kutu 4) görüntülerinin biçiminde, segmente edilmiş nesne görüntülerini (Tiff, Gif, Jpeg, BMP, PNG) kaydetmek için kullanılacak biçimi ayarlayın.
  5. İşlem sırasında, parçalı sitoplazmaların görüntülerini kaydetmek için otomatik olarak bir klasör oluşturulur. Metin (kutu 5) kutusunda, bu klasörü adlandırın (ör. Parçalı sitoplazmlar). Klasör, birleştirilmiş görüntüler içeren klasörde oluşturulur.
  6. Gaussian filtresi ve Etkin Konturların parametrelerini ayarlamak için adım 5.3.1'deki gibi aynı adımları izleyin (Dikkatli olun, kutu sıralamaları adım 5.3.1 ile aynı değildir).
  7. İş akışını çalıştırın (ayrıntılar için bölüm 7'ye bakın).

6. Floresan sinyal algılama ve analizi

Uyarlanmış bloğu seçin.
1. Blok Floresan Analizi A: 1 Kanal,segmentli nesnenin bir tür içinde bir kanalda foci algılama ve analiz gerçekleştirmek: çekirdek içinde bobin foci (kırmızı kanal) tespiti.
2. Blok Floresan Analizi B: Aynı bölmedeki 2 kanal,segmentli nesnenin bir türü içinde iki kanal halinde foci algılama ve analiz gerçekleştirmek: bobin tespiti (kırmızı kanal) ve 53BP1 (yeşil kanal) çekirdek içinde foci.
3. Blok Floresan Analizi C: 2 Kanallar iki bölmede,tespit ve foci analizi gerçekleştirmek bir veya iki kanal, özellikle çekirdek ve ilgili sitoplazma içinde: coilin foci tespiti (kırmızı kanal) hem çekirdek içinde ve ilgili sitoplazma veya coilin foci tespiti (kırmızı kanal) çekirdek içinde ve G3BP foci (yeşil kanal) ilgili cysm içinde.
4. Blok Floresan Analizi D: Küresel Translokasyon,iki hücresel bölmelerde (a ve b) bir kanaldan gelen sinyal yüzdesini hesaplar. Örneğin, bir sitoplazma/çekirdek translokasyon tahlillerinde, son "Sonuçlar" tablosundaki her görüntü için hesaplanan nükleer ve sitoplazmaik sinyallerin yüzdelerini dışa aktarın. Nükleer sinyal yüzdesini hesaplamak için kullanılan formül aşağıda gösterilmiştir. Bu blok herhangi bir hücre altı bölmesi için kullanılabilir:
5. Blok Floresan Analizi E: Bireysel Hücre Translokasyonu,her hücre için iki hücresel bölmede bir kanaldan gelen sinyal yüzdesini hesaplar. Bu blok, tek hücreli düzeyde çekirdek/sitoplazma translokasyonu için özel olarak optimize edilsin.
  NOT: Blok Floresan Analizi E: Bireysel Hücre Translokasyonu tek hücre düzeyinde analiz gerçekleştirdiğinden, çekirdeğin ve sitoplazmanın etkin bölümlemesi gerekir.
Blok'un çıktı0'ını (Dosya) Seç Klasörü'nü (blok 1) seçilen bloğun klasör girişine (siyah dairelerhalinde beyaz oklar) bağlayın.
Seçilen bloğun parametrelerini ayarlayın.
1. Floresan Analizi A: 1 Kanal, Floresan Analizi B: Aynı bölmede 2 Kanal ve Floresan Analizi C: İki bölmede 2 Kanal
  1. Kutu Klasör görüntüleri RoI, bir ters eğik çizgi öncesinde parçalı nesnelerin görüntülerini içeren klasörün adını yazın. (Örneğin: \Parçalı çekirdekler).
  2. Kutuformatında, parçalanmış nesnelerin görüntülerinin biçimine (kutu 2), parçalı nesnelerin görüntülerini kaydetmek için kullanılan biçimi yazın (tif, jpeg, bmp, png). Varsayılan biçim tif'tir.
  3. Kutuda Sınırları Öldür? Yes Aksi takdirde, Hayıryazın. ImageJ MorphoLibJ koleksiyonunun yüklenmesi bu işlevi kullanmak için gereklidir (bkz. adım 5.3.3).
  4. Kutu(es) Kanal noktalar sinyalinde,noktaların algılanılması gereken kanalı ayarlayın. Klasik RGB görüntülerinde 0=Kırmızı, 1=Yeşil ve 2=Mavi.
  5. Kutularda lokalize molekülün adı,noktalar içine lokalize molekülün adını yazın. Girilen alanların sayısı molekül sayısına bağlıdır.
  6. Kutu(es) Wavelet Spot DedektörÜ Bloğunda,her kanal için spot algılama parametrelerini ayarlayın. Ölçek(ler) (nokta boyutuna adlandırılır) ve algılamanın duyarlılığını (algılanan nokta sayısını, varsayılan değeri 100 ve minimum değeri 0 olarak azaltır) ayarlayın. Bu eklentinin ayrıntılı belgeleri online olarak mevcuttur: http://icy.bioimageanalysis.org/plugin/Spot_Detector. Parametreler de buzlu olarak el ile tanımlanabilir (Algılama ve İzleme | Spot Dedektörü).
  7. Seçenek olarak, kutudaki Filtre Yatırım Getirisi boyutuna göre,bir boyut aralığı (pikselolarak) ayarlayarak lekelerin algılandığı bölümlenmiş nesneleri filtreleyin. Bu adım, özellikle alt veya aşırı parçalı nesneleri kaldırmak için yararlıdır. Nesnelerin boyutunu el ile tahmin etmek için 5.3.1 adımına bakın. Varsayılan parametreler, ROI'ların boyuta göre filtrele'sini içermez. İki bölmedeki blok 2 Kanallar iki kutu içerir: Çekirdekleri boyuta göre filtreleyin (kutu 19) ve sitoplazmayı boyuta göre filtreleyin (kutu 46).
  8. İsteğe bağlı olarak, kutudaki Filtre noktaları boyutuna göre,istenmeyen yapıları kaldırmak için algılanan noktaları boyutlarına (piksel olarak) göre filtreleyin. Nokta boyutunu el ile tahmin etmek için Algılama ve İzleme'yi tıklatın ve Spot dedektör eklentisini açın. Çıktı seçeneklerinde, YG'ye Dışa Aktar'ıseçin. Varsayılan parametrelerin lekelerin boyuta göre filtrelemesi içermediğini ve filtreuygulanmış noktaların çözümleme için hesaba katılmadığını dikkatli olun. Girilen alan sayısı kanal sayısına bağlıdır.
  9. İsteğe bağlı olarak, kutu Filtre noktalarında,algılanan noktalara ek bir filtre (kontrast, homojenlik, çevre, yuvarlaklık) uygulayın. Varsayılan parametrelerin nokta filtreleme içermediğini ve filtrelenmiş noktaların çözümleme için dikkate alınmadığını dikkatli olun. Girilen alan sayısı kanal sayısına bağlıdır.
  10. İsteğe bağlı olarak, kutularda Spot boyutu eşiği,analiz edilen noktalar alanı (piksel) için bir eşik ayarlayın. Bu eşiğin altında ve üstünde sayılan nokta sayısı nihai Sonuçlar tablosunda dışa aktarılır. Bilgilendirilecek kutu sayısı kanal sayısına bağlıdır.
  11. İş akışını çalıştırın (ayrıntılar için bölüm 7'ye bakın). Veriler, birleştirilmiş görüntüleri içeren klasöre kaydedilen Sonuçlar elektronik tablosunda dışa aktarılır.
2. Floresan Analizi D: Küresel Translokasyon ve Floresan Analizi E: Bireysel Hücre Translokasyonu:
  1. Klasör görüntüleri (1 ve 2 kutuları) kutularına, parçalı nesnelerin görüntülerini içeren klasörün \Adını yazın. Blok Floresan Analizi D: Küresel Translokasyon,yatırım getirisi iki tür roi a ve ROI b olarak tanımlanır. Blok Floresan Analizi E: Bireysel Hücre Translokasyonuiçin, Klasör görüntülerinde parçalı çekirdekler ve Klasör görüntüleri parçalı sitoplazma kutuları, segmentli çekirdekleri ve sitoplazmalar içeren klasörün adını yazın, sırasıyla.
  2. Kanal sinyali kutusuna (kutu 3) sinyalin kanalını girin.
  3. Kutuformatında, parçalanmış nesnelerin görüntülerinin biçimine (kutu 4), parçalı nesnelerin (tif, jpeg, bmp, png) görüntülerini kaydetmek için kullanılan biçimi yazın. Varsayılan biçim tif'tir. Kenarlıkları Öldür seçeneği kenarlık nesnelerini kaldırmak için de kullanılabilir (bkz. adım 6.3.1).
  4. İsteğe bağlı olarak, kutularda Boyut getirisini boyutuna göre filtreleyin,boyut aralığı (piksel olarak) ayarlayarak segmente edilen nesneleri filtreleyin. Bu adım, alt veya aşırı parçalı nesneleri kaldırmak için yararlı olabilir. Nesne boyutunu el ile tahmin etmek için 5.3.1 adımına bakın. Girilen iki alan vardır, kanal başına bir. Varsayılan parametreler, boyuta göre yg filtreleme içermez.
  5. İş akışını çalıştırın (ayrıntılar için bölüm 7'ye bakın). Verileri birleştirilmiş görüntüleri içeren klasöre kaydedilen elektronik tablo sonuçlarına aktarın.

7. Protokolü çalıştırın

Bir çalışmadaki bir bloğu işlemek için, seçili blok ile Klasörü Seç'iarasındaki bağlantıyı kaldırın. Aranan bloğu 1^inci sıraya yerleştirin. İstenilen bloğun sol üst köşesinde, doğrudan klasörünsağındaki bağlantıya tıklayın. Görünen Aç iletişim kutusunda, birleştirilmiş görüntüleri içeren klasöre çift tıklayın. Ardından Aç'atıklayın. İş akışını başlatmak için Çalıştır'ı tıklatın. İşlem durdur düğmesine tıklayarak durdurulabilir.
Bir çalıştırmada farklı blokları işlemek için, Seç Klasörü (blok 1) bloğuyla seçilen blokların bağlantılarını tutun. Sıralamalarının iş akışının iyi işlenmesine izin verdiğinden emin olun. Örneğin, belirli bir bloğun işlemek için parçalanmış nesnelere ihtiyacı varsa, segmentasyon bloğunun daha önce işlediğinden emin olun. İş akışını çalıştırmadan önce kullanılmayan blokları kaldırın ve yeni protokolü başka bir adla kaydedin.
İş akışını başlatmak için Çalıştır'ı tıklatın. Açık iletişim kutusu göründüğünde, birleştirilmiş görüntüleri içeren klasöre çift tıklayın. Ardından Aç'atıklayın. İş akışı otomatik olarak çalışır. Gerekirse, Durdur düğmesine tıklayarak işlemi durdurun.
İşlemin sonunda, çalıştırılan iletinin sağ alt köşede başarılı bir şekilde görünüp görünmediğini ve tüm blokların yeşil bir işaretle işaretlendiğini kontrol edin (Şekil 2b). Değilse, hata işaretini sunan blok ve iç kutu, düzeltilmesi gereken öğeyi gösterir (Şekil 2b).
NOT: İş akışı başarıyla yürütüldükten sonra, yeni bir çalışma doğrudan başlatılamaz ve iş akışını yeniden işlemek için en az bir blok "işlemehazır" işaretiyle işaretlenmelidir. Bir bloğun durumunu değiştirmek için, bu bloğun içindeki iki kutu arasındaki bağlantıyı silmek ve yeniden oluşturmak veya protokolü kapatıp yeniden açmak yeterlidir. İşlem sırasında bir hata oluşursa, doğrudan yeni bir çalıştırma başlatılabilir. Yeni bir çalışma sırasında, bazıları yeşil işaretle işaretlenmiş olsa bile, boru hattının tüm blokları işlenir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Açıklanan tüm analizler standart bir dizüstü bilgisayarda (Java'nın 64 bit sürümüyle çalışan 16 GB rastgele erişimli bellek (RAM)) ile 2,80 GHz'de 64 bit, dört çekirdekli işlemci de gerçekleştirilmiştir. Rasgele erişim bellek miktarı ve analiz etmek görüntülerin çözünürlüğüne bağlı olarak, dikkate alınması gereken önemli bir parametredir. Java'nın 32 bit sürümünün kullanılması, belleği büyük veri analizi için uygun olmayan yaklaşık 1300 MB ile sınırlar, 64 bit versiyonu ise Icy'ye ayrılan belleğin artırılmasına olanak tanır. Şekil 3, farklı görüntü türleri ve farklı çözünürlükler için segmentasyon için gereken zamanı bildirir. Bu yüksek çözünürlük önemli ölçüde birincil nesne segmentasyon süresini artırır onaylar.

Bir sonraki paragraflarda sunulan veriler, Alt Yapı Analizörü iş akışının hücresel ve moleküler biyolojide karşılaşılan yaygın problemlerin çoğunu (hücre sayma, foci sayma ve analiz, translokasyon analizi) çözmek için kullanılabileceğini göstermektedir.

Belirli bir bölme içinde yoğunlaşan moleküllerin kesin oranının çok sayıda hücrede ölçülmesi veya hücre altı etki alanları arasında lokalizasyon değişiminin çok hantal ve hataya yatkın bir görev olması, özellikle el ile yapıldığında. Şekil 4, iş akışının TNFα stimülasyonuna yanıt olarak transkripsiyon faktörü NFκB'nin iyi tanımlanmış nükleer transyerini hızlı ve hassas bir şekilde ölçebilme yeteneğini göstermektedir. Analiz için kullanılan görüntüler nezaketle Ilya Ravkin(http://www.ravkin.net/SBS/Image-Library.htm)tarafından derlenmiş ve genel olarak Geniş Biyoimage Benchmark Collection^{mevcuttur 16}. Bu set, artan TNFα konsantrasyonları ile tedavi edilen MCF7 ve A549 hücre hatlarının görüntülerini içerir. Analiz, MCF7 hücre hattından 40.000'den fazla hücre ve 96 görüntü (her kanal için 48 görüntü) üzerinde gerçekleştirilmiştir(Şekil 4a). Tüm analiz (görüntü alma veri tasarrufu) 26 dakika sürdü. Her görüntü belirli bir TNFα konsantrasyonuna karşılık gelir. NFκB'nin nükleer/sitoplazmik oranları belirli bir görüntü için tüm hücrelerde homojendi. Bu nedenle, her görüntü için, tüm nükleer veya sitoplazmik piksellerin değerleri NFκB'nin nükleer ve sitoplazmik oranlarını hesaplamak için toplandı ve bunların segmentasyonu sırasında dokunmaktaki çekirdeklerin/sitoplazmaların bireyselleştirilmesi gerekli değildi. DAPI görüntüleri Segmentasyon C'de işlenmiştir: Segment çekirdekleri için konveks şekilli kümelenmiş nesneler blok ve yeşil kanal Segmentasyon E ile sitoplazmaları ayırmak için kullanılmıştır: Kümelenmiş sitoplazma bloğu (Şekil 4b). Floresan Analizi D: Nükleer ve sitoplazmik piksel değerlerinin toplamını dışa aktarmak için Küresel Translokasyon bloğu kullanılmıştır. Elde edilen veriler bir doz-yanıt eğrisi(Şekil 4c)temsil edilir ve TNFα artan konsantrasyonları ile stimülasyon sonrası NFκB nükleer oranının artış göstermektedir.

İş akışı sadece farklı hücre altı bölmelerde küresel yoğunluk sinyalini analiz etmekle kalmıyor, aynı zamanda foci'yi tespit etmek ve özellikleri hakkında belirli bilgileri elde etmek için de kullanılabilir. Şekil 5a, mRNA decapping 4 (EDC4) proteininin arttırıcısını lokalize ederek tek tek hücrelerdeki P-cisimlerinin saptanması gösteriştir. Segmentasyon A: Kümesiz nesneler bloğu, düşük kümelenme düzeyi sunan çekirdekleri, Segmentasyon E: Sitoplazmaları ve Floresan Analizi C:EDC4 foci'yi tespit etmek için iki bölmede 2 kanal ı ayırmak için kümelenmiş sitoplazma bloğu segmentinde kullanılmıştır. Parçalı nesneler tanımlanır (Segmente nuclei_0, Segmented cytoplasms_0) ve birden çok bilgi ilgili çalışma sayfasına (Parçalı çekirdek Bilgileri ve Segmentli sitoplazmalar Bilgileri) EDC4 ortalama yoğunluğu veya her YG'de tespit edilen cisimlerin sayısı/boyutu gibi toplanır(Şekil 5b). Analiz edilmeden önce, tespit edilen cisimler bölgelerine göre ön filtrelenebilir ve bu da mikroskobun çözünürlük gücünün altındaki nesneleri dışlamak için yararlı olabilir. Korunan nesnelerin boyutunu tahmin etmek için ek bir alan eşiği getirilebilir. Tespit edilen tüm gövdelerin alanları özel çalışma sayfalarında raporlanır (Parçalı nuclei_Distribution foci boyutu, Segmentli cytoplasms_Distribution foci boyutu). Bu örnekte, sitoplazmik EDC4 focitespit edilen iki hücrenin (Segmentli nuclei_0 and_1 ve Segmentli cytoplasm_0 and_1) analizini vurgularız. EDC4 proteininin sinyali hem nükleer hem de sitoplazmik bölmelerde tespit edilen ekibe rağmen, sadece sitoplazmik foci'nin P-cisimlerine karşılık geldiğini unutmayın. Nükleer sinyal büyük olasılıkla immünoresans deneylerini yapmak için kullanılan antikorların çapraz reaktivitesinden kaynaklanmaktadır. Foci her piksel boyutu verilir.

Daha sonra, oksidatif stresin (OS) Cajal Cisimleri üzerindeki etkisi hala bilinmemekle birlikte, zaman kinetik döneminde (500 μM H₂O₂ile OS indüksiyonundan 2 ila 20 saat sonra) çalışma akışının çok yönlülüğünden yararlandık (Şekil 6). Cajal Cisimleri transkripsiyon oranı veya hücre döngüsü ilerlemesi gibi belirli parametrelerin kontrolü altında nükleoplazm içinde çekirdekve eriten dinamik yapılardır. Cajal Bodies ana yapısal ve fonksiyonel bileşeni olan coilin proteinini lokalize ederek görselleştirildi. Cajal cisimlerinin sayısı ve büyüklüğü hakkında bilgi, 3 kanal içeren yüksek çözünürlüklü görüntülerden (3840X3072) 2300 ayrı hücre incelenerek toplanmıştır: DAPI (mavi), 53BP1 (yeşil) ve coilin (kırmızı)(Şekil 6a). Tam işleme 1 saatten az sürdü. Çekirdekler konveks şeklini sunduğundan ve bazıları kümelenmiş olduğundan, blok Segmentasyon C: Segmentasyon gerçekleştirmek için konveks şekilli kümelenmiş nesneler seçildi. OS DNA çift iplikçik sonları (DDSBs) neden olduğu bilindiği gibi, p53-bağlayıcı protein 1 (53BP1), DNA hasar sinyal yollarının önemli bir etkisi olarak bilinen, stresli ve stresli olmayan hücreler arasında ayrım yapmak için bir belirteç olarak kullanılmıştır. Gerçekten de, DNA hasarları yokluğunda, 53BP1 nükleoplazm içinde homojen olarak dağıtılır, DNA hasarları aşağıdaki ise, DDSBs üzerinde yoğunlaşmıştır, mikroskopi kolayca ayırt edilebilir fosi oluşturur. Her hücredeki 53BP1 ve bobin nükleer odaklarının sayısı ve büyüklüğü blok Floresan Analizi B: Aynı bölmedeki 2 Kanalkullanılarak analiz edilmiştir. İlk olarak, 53BP1 verilerinin analizi kinetik her zaman noktası için en iyi eşik kendi stres durumuna göre hücreleri sınıflandırmak için belirlemek için yardımcı oldu. Tüm kinetik arasında, OS indüksiyonundan sonra 2, 4 ve 8 h'de 11 kat artışla 53BP1 foci sayısında önemli bir artışa neden olur (Şekil S1). Bu etki, stresli olmayan hücrelerde DSB'nin daha yüksek bir başlangıç seviyesi nedeniyle 6 saat (6,5 kat) daha az belirgindir. 20 saat sonra bile, sürekli bir artış (neredeyse 6 kat) kalır. Bu veriler işletim sistemi indüklemek ve mikroskopi hem erken hem de geç gözlemler için etkili bir stres belirteci olarak 53BP1 kurmak için tedavinin verimliliğini yansıtmaktadır. Öte yandan, kinetik her zaman noktasında ddsb düzeyi düşük olan stresli hücrelerin küçük bir oranı gözlendi, bu da hücrelerin homojen olarak stresli olmadığını düşündürerek stres deneylerinde stres belirteci kullanmanın önemini güçlendirdi. ROC analizine dayanarak, kinetik boyunca stresli ve stresli olmayan hücreler arasında ayrım yapmak için 17 53BP1 odak toplam eşik seçilmiştir(Şekil S1).

Daha sonra bobinin nükleer odak sayısı ve boyutu hücrenin stres durumuna göre analiz edildi. Stres indüksiyonu sonrası foci sayısında 2, 4 ve 6 h'de anlamlı bir artış gözlenmiştir(Şekil 6b). En kalıcı etki 2 saat olarak gözlenir, 10'dan fazla fosi olan hücre sayısı stresli olmayan hücrelerde %0'dan stresli hücrelerde %75'e yükselmektedir. Ayrıca, bu zaman noktasında stresli hücrelerin% 25'ten fazla 20 bobin foci vardı. Bu etki kademeli olarak 8 saate kadar azalır. 20 saat, birinci ve üçüncü dörtte küçük bir artış gözlenir, ancak veriler de hücrelerin% 84 ve% 80'i olmayan stresli ve stresli hücrelerde 8 foci daha az mevcut olduğunu göstermektedir, sırasıyla. Bu veriler, işletim sistemi aynı zamanda erken etkileri farklı olabilir Cajal Cisimlerin çekirdekasyon kontrol parametreleri üzerinde geç etkileri olduğunu göstermektedir. İlginçtir, bobin nükleer foci özellikleridikkatli analiz onların boyutunda bir azalma ile bobin foci associates sayısında gözlenen artış ortaya(Şekil 6c). Örneğin, OS indüksiyonundan 2 saat sonra, 0,2 μm^2'nin altında bir alana sahip bobin foci oranı %26'dan %64'e yükselir. Bu etki 8 saate kadar azalır, ancak Cajal Bodies'ın sayısından farklı olarak 20 saat te önemli bir değişiklik gözlenmez. Bu, Cajal Cisimlerinin erken ve geç nükleoplazmik yeniden dağılımının farklı olaylar olduğunu yansıtabilir.

Bu veriler, OS'lerin Cajal Bodies'ın çekirdekleşme gücünü değiştirerek çok sayıda küçük nükleer odak haline nükleoplazmik bir yeniden dağıtım alıbına yol açtığını kuvvetle göstermektedir. Cajal Cisimlerinin çekirdekleşme protein ve RNA bileşenleri tarafından tahrik olduğundan, bu OS etkisi Cajal Cisimlerin bileşimini değiştirebilirsiniz düşündürmektedir. Cajal Bodies içinde, bobin proteini SMN kompleksi ve Sm proteinleri bileşenleri gibi birkaç farklı protein ortakları ile etkileşime. Bu etkileşimler genellikle bobin fosfoetkik etki alanları içeriyordu ve Cajal Cisimlerin yapısında yapılacak bir değişikliğin bobinin fosforilasyon durumundaki değişikliklerle bağlantılı olabileceği hayal edilebilir. Ayrıca, son çalışmalar Cajal Cisimlerinin çekirdek içinde rastgele lokalize olmadığını ve spesifik gen lokusu¹⁷ile proksimal ilişki yoluyla gen ekspresyonunu etkileyebileceğini göstermiştir. Tüm bu gerçekler göz önüne alındığında, Cajal organlarının işlevselliği üzerinde bir etki kendi yapısında değişiklikler eşlik edecek eğer şaşırtıcı olmaz. Bu sonuçlardan, bu tür Cajal Bodies 'remodeling işletim sistemi pasif bir sonucu olup olmadığını ya da belirli gen loci ile etkileşim egörebilirsiniz yanıt katılır, örneğin sorabilirsiniz.

Bobin ekspresyonundaki bir değişikliğin lokalizasyonunu değiştirip değiştirmeyebileceğini test etmek ve Cajal Cisimlerin inusmuzunu değiştirmek için eksojen gfp-coilin füzyon proteinini aşırı ifade ettik. Çekirdekler kümelenmedi, bu nedenle segmentasyon a bloğu ile gerçekleştirildi: Kümesiz nesneler. Daha sonra, gfp-coilin (yeşil sinyal, kanal 2) aşırı ifade seviyesine göre bobin foci (kırmızı sinyal, kanal 1) sayısını ve boyutunu tam olarak ölçmek için blok Floresan Analizi B: Aynı bölmede 2 Kanal kullanılmıştır. GFP-coilin düzeyi bireysel çekirdekteki GFP sinyalinin ortalama yoğunluğu ile yansıtıldı(Şekil 7a). GFP-coilin aşırı ekspresyonu orta veya yüksek düzeyde olan hücrelerde (GFP yoğunluğu 10'dan yüksek), çekirdek başına Cajal Cisimlerinin sayısı 21 foci'ye kadar olan bazı çekirdeklerle önemli ölçüde artar(Şekil 7b). Ayrıca, Cajal Cisimlerinin parlaklığının (ortalama yoğunluğunun) yoğunluk doygunluğuna yol açan aşırı ifade seviyesine paralel olarak önemli ölçüde arttığını fark ettik. Bu tür doymuş bölgeler böylece daha küçük ve sönük odakvarlığını maskeleyebilir. Orta veya yüksek düzeyde GFP-coilin ifade eden hücrelerde, Cajal Cisimlerinin boyutu da önemli ölçüde artar, ortanca değerler 1'den 2 μm^2'ye yükselir(Şekil 7c). Ayrıca, gfp-coilin ekspresyonu düzeyi yüksek olan hücrelerin %25'inden fazlası 2,5 μm^2'dendaha büyük bir alana sahip foci sunarken, transfected olmayan hücrelerde 0,8 μm^2'yi geçmez. Sonuç olarak, GFP-Coilin aşırı ekspresyonu Cajal Bodies hem sayısı ve boyutu önemli bir artışa yol açar. Os Cajal Cisimlerin sayısını artırır ama boyutlarını azaltır yana, bu veriler cajal organları yapısı üzerinde işletim sistemi etkisi büyük olasılıkla kendi bileşimi yerine bobin hücresel miktarı üzerinde bir etkisi tarafından indüklenen yansıtabilir.

Şekil 1: Alt Yapı Çözümleyici boru hattı
İş akışı, biyogörüntü bilişimi için açık bir topluluk platformu olan Buzlu'da geliştirilmiştir ve birden fazla floresan mikroskopi görüntüsünün otomatik analizini gerçekleştirir. İlk olarak, çok kanallı görüntüler otomatik olarak protokol içinde yüklenir ve gerekirse, gürültü oranı sinyalgeliştirmek ve görüntüleme yapıtları kaldırmak için önceden işlenir. Daha sonra, görüntü bölümleme arka plandan ilgi alanları (ROI) yalıtır. Kümeleme düzeyine ve ilgi çekici nesnelerin yapısına bağlı olarak çeşitli segmentasyon yöntemleri mevcuttur. Parçalı nesneler belirli bir klasöre belirli bir tanımlayıcı (örneğin, Resim name_Nucleus_1) ile kaydedilir ve sonraki çözümleme için kullanılabilir/yeniden kullanılabilir. Noktalar gibi floresan sinyaller daha sonra ROI'lar içinde analiz edilir ve birden çok özellik (konum, boyut, şekil, yoğunluk, doku, nokta numarası ve boyut) otomatik olarak oluşturulan bir elektronik tabloya aktarılır. Algılanan nokta sayısı gibi ölçülen tüm özellikler, ilgili YG'nin tanımlayıcısına bildirilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Buzlu iş akışının grafik arabirimi
(a) İş akışı, genel işlevlerine göre gruplandırılabilen 13 genel bloktan oluşur: Klasörü Seçin (blok 1) görüntülere erişime izin verir; Birleştirme Kanalları (blok 2), farklı görüntü kanallarını birleştirmek için kullanılır. Bloklar 3-8 nesne segmentasyonu, her biri belirli bir bağlam için uyarlanmış olan: Segmentasyon A: Kümesiz nesneler, Segmentasyon B: Kötü kümelenmiş nesneler, Segmentasyon C: Konveks şekilli kümelenmiş nesneler, Segmentasyon D: Düzensiz şekilli kümelenmiş nesneler (blok 7, blok 6 ile birlikte çalışır), Segmentasyon E: Kümelenmiş siyonlar. Bloklar 9-11 hücre altı bölmeleri içinde foci saymak / analiz etmek için kullanılır: Floresan Analizi A: 1 Kanal, Floresan Analizi B: Aynı bölmede 2 Kanal ve Floresan Analizi C: İki bölmede 2 Kanal. Blok 12 ve 13 translokasyon olaylarının analizi için uyarlanmıştır: Floresan Analizi D: Küresel Translokasyon ve Floresan Analizi E: Bireysel Hücre Translokasyonu. (b) Blok mimarisinin genel sunumu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Görüntü çözünürlüğü ve nesne kümeleme düzeyinin bir fonksiyonu olarak segmentasyon için gereken süre
(a) Görüntü çözünürlüğü ve kümeleme düzeyine bağlı olarak segmentasyon gerçekleştirmek için gereken sürenin grafiksel çizimi. İki farklı segmentasyon bloğu test edilmiştir: Segmentasyon A (kümelenmiş olmayan nesneler için) ve Segmentasyon D (düzensiz şekillere sahip kümelenmiş nesneler için). İşlem süresi (görüntü başına saniye cinsinden) görüntü çözünürlüğü (piksel sayısı) fonksiyonu olarak çizilir. (b) Segmentasyon A veya Segmentasyon D bloğu ile analiz edilen görüntülerin örneği. DAPI boyama ve segmentli çekirdekleri gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: TNFα stimülasyonuna yanıt olarak nfκB nükleer translokasyon tahlillerinin iş akışı analizi
(a) BBBC014 görüntü setinden TNFα ile tedavi edilen insan MCF7 hücrelerinin (insan meme adenokarsinom hücre hattı) görüntülerine örnek (Geniş Biyoimage Benchmark Collection)¹². Transkripsiyon faktörü NFκB'nin lokalizasyonu 12 artan TNFα konsantrasyonu ile tedavi edilen hücrelerde incelenmiştir (0'dan 10^-10g/mL'ye). Her konsantrasyon için 4 kopya yapıldı. DAPI görüntüleri (mavi kanal) Segmentasyon C'de işlendi: Konveks şekilli kümelenmiş nesneler çekirdekleri segmente etmek için blok, ve daha sonra NFκB ile boyama FITC (yeşil kanal) Segmentasyon E ile sitoplazmalar delineate kullanılmıştır: Kümelenmiş sitoplazma bloğu. Floresan Analizi D: Nükleer ve sitoplazmik piksel değerlerinin toplamını dışa aktarmak için Küresel Translokasyon bloğu kullanılmıştır. (b) Segmentli çekirdekler (gri) ve sitoplazmalar (beyaz) her bölmedeki NFκB floresan sinyalinin toplam yoğunluğunu belirlemek için kullanılır. (c)Veri analizinden elde edilen doz-yanıt eğrisi, TNFα konsantrasyonu arttıkça NFκB nükleer oranının artacağını göstermektedir. Görüntüler 8 bit BMP formatındadır ve görüntü boyutu 1360 x 1024 pikseldir. Her konsantrasyon için, 4 çoğaltma arasındaki standart sapma hesaplanır ve hata çubukları olarak gösterilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Tek tek hücrelerde sitoplazma içinde EDC4 foci (P-cisimlerinin) sayısallaştırılması
(a) DAPI (mavi kanal) ve Phalloidin (kırmızı kanal) ile birlikte boyama hücre çekirdekleri ve F-aktinin segmentasyonunu ve tanımlanmasını sağlar. EDC4 proteini (yeşil kanal) sadece sitoplazmik olduğu bilinen P-organlarının saptanmasında bir belirteç olarak kullanılır. Ölçek çubuğu, 10 μm. (b) Foci sayılır ve çeşitli özellikler (burada piksel kendi alanı) çeşitli sayfalarda yapılandırılan Sonuçlar elektronik tablosuna dışa aktarılır. İki yaprak çekirdek analizi ve iki sitoplazmaanalizi için adamıştır. Her ham, belirli bir YG'nin bilgilerini yerle bir eder. Nucleus/Cytoplazma Bilgi sayfalarında, segmente edilmiş nesnelerin özellikleri dışa aktarılır (RoI ID, boyut ve ortalama yoğunluk), ardından her YG içinde tespit edilen foci sayısı. Gerekirse, bir boyut eşiği (bu örnekte 100 piksel) eklenebilir ve bu eşiğin altındaki ve üzerindeki odak sayısı son iki sütunda bildirilir. Foci boyutundaki levhaların Nucleus/Cytoplasm_Distribution'ında, tespit edilen tüm fosilerin alanı (piksel olarak) ilgili Yatırım Getirisi'nin ham ında raporlanır. Bu örnekte, sitoplazmik EDC4 foci tespit edilen iki hücrenin (Segmentli cytoplasm_0 and_1) analizini vurgulatıyoruz. Foci her piksel boyutu da verilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Oksidatif stres sonrası bobin kinetik ve 53BP1 nükleoplazmik dağılım
Foci sayısı ve boyutu analizi 3 bağımsız kinetik her zaman noktası için 110'dan fazla bireysel hücrelere dayanıyordu. (a) Tedavi kinetik leri boyunca HeLa S3 hücrelerinde 500 μM H₂O₂ile bobin ve 53BP1 focinin immünororeskence tespiti . 53BP1 DNA Çift Iplikli Break siteleri üzerinde yoğunlaşmış ve her hücrede tedavi verimliliğini değerlendirmek için kullanılır. Coilin Cajal Bodies zenginleştirilmiştir. Hücreler oksidatif stres indüksiyonundan sonra 2, 4, 6, 8 ve 20 saat sonra sabitlendi ve anti-coilin (kırmızı kanal) ve anti-53BP1 (yeşil kanal) antikorları ile birlikte boyandı. Ölçek çubuğu, 10 μm. (b) Oksidatif stres sonrası bobin nükleer foci sayısı. Sonuçlar, merkezi işaretin ortanca, alt ve üst kenarlarının 25^ve 75^yüzdelik dilimleri olduğu kutu çizimleri olarak gösterilir. H₂O₂ile tedavi edilen hücrelerde, bobin foci sayısında önemli bir artış saptanır ve tedavinin 2 ve 4 saat sonra maksimal dir. Wilcoxon - Mann Whitney test analizi tedavi edilmeyen hücreler ile H₂O₂ tedavi edilen hücreler (*, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001) arasında anlamlı bir fark olduğunu göstermektedir. (c) Bobin foci alanının işlevindeki hücrelerin oranı (μm^2). Çoğu foci kontrol ile karşılaştırıldığında 2 saat ve 4 saat zaman noktalarında daha küçük bir alana sahip. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7: GFP-coilin füzyon proteinini aşırı eksprese eden hücrelerde Cajal Cisimlerinin çekirdekleşmesinin incelenmesi
(a) HeLa S3 hücreleri, üreticinin tavsiyelerini takiben standart bir prosedür kullanılarak gfp-Coilin füzyon proteinini ifade eden 500 ng plazmid ile biyolojik triplicatelerde geçici olarak transfeced edildi. 48 saat sonra hücreler sabitlendi ve bobine karşı antikor ile boyandı. DAPI (mavi kanal) çekirdekleri segmente etmeye izin verir. Bu analizler için 100'den fazla hücre analiz edildi. GFP sinyali ektopik coilin-GFP proteini (yeşil kanal) lokalizasyonunu yansıtırken, bobin sinyali (kırmızı kanal) hem endojen hem de eksojen protein lokalizasyonuna karşılık gelir. Her çekirdek için, GFP sinyalinin ortalama yoğunluğu bobin ifadesinin düzeyini yansıtır. Bu parametreye göre, Coilin foci özellikleri blok Floresan Analizi B kullanılarak analiz edilmiştir: Aynı bölmede 2 Kanal. Ölçek çubuğu, 10 μm. (b) Bobin foci sayısı ile çekirdek başına ortalama GFP yoğunluğu arasındaki ilişki. Sonuçlar, merkezi işaretin ortanca, alt ve üst kenarının 25^ve 75^yüzdelik dilimleri olduğu kutu çizimleri olarak gösterilir. Wilcoxon - Mann Whitney test analizi gfp yoğunluğu >10 için foci sayısında önemli bir artış olduğunu göstermektedir (*, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001). (c) Bobin foci alanı ile çekirdek başına ortalama GFP yoğunluğu arasındaki ilişki. Sonuçlar, merkezi işaretin ortanca, alt ve üst kenarının 25^ve 75^yüzdelik dilimleri olduğu kutu çizimleri olarak gösterilir. Wilcoxon - Mann Whitney test analizi gfp yoğunluğu >10 (*, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001) için bobin foci alanında önemli bir artış göstermektedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil S1: Oksidatif stres sonrası 53BP1 nükleoplazmik dağılımın kinetik
(a) Farklı kuluçka sürelerinden sonra 53BP1 nükleer fosiile tedavi edilmemiş veya H₂O₂ tedavi edilen hücrelerin sayısallaştırılması. Sonuçlar, merkezi işaretin ortanca, alt ve üst kenarının 25^ve 75^yüzdelik dilimleri olduğu kutu çizimleri olarak gösterilir. Wilcoxon - Mann Whitney test analizi tedavi edilmeyen hücreler ile H₂O₂ tedavi edilen hücreler (*, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001) arasında anlamlı bir fark olduğunu göstermektedir. (b) Kinetik her zaman noktası için, bir ROC (Alıcı Çalışma Karakteristik) eğrisi stresli ve vurgusuz hücreler arasında ayrım yapmak için en iyi eşik belirlemek için kurulmuştur. Her testin parametreleri tabloda raporlanır (Duyarlılık, özgüllük, TP: doğru pozitif, TN: doğru negatif, FP: yanlış pozitif, FN: yanlış negatif). Bu verilerden, 17 53BP1 odak küresel bir eşik kinetik yoluyla stresli olmayan hücrelerden stresli ayrımcılık tespit edilmiştir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Floresan hücre görüntülerinin analizi için giderek artan sayıda özgür yazılım aracı mevcuttur. Kullanıcılar, sorunlu larının karmaşıklığına, görüntü işlemedeki bilgilerine ve analizlerinde harcamak istedikleri zamana göre yeterli yazılımı doğru bir şekilde seçmelidir. Buzlu, CellProfiler veya ImageJ /Fiji hem kullanılabilirlik hem de işlevselliği birleştiren güçlü araçlardır^3. Icy net bir grafik kullanıcı arabirimi (GUI) sunan tek başına bir araçtır, ve özellikle onun "Protokoller" noktası ve iş akışları kolayca tasarlanmış veya manipüle edilebilir iletişim arayüzü tıklayın⁴. Bu yazılımın işlevselliği, ImageJ eklentilerini destekleyerek ve kullanarak geliştirilmiştir ve geniş kullanıcı topluluğu sayesinde birçok belge mevcuttur. Alt Yapı Çözümleyici iş akışını geliştirmek için Buzlu yazılımın kullanılabilirlik ve işlevselliğinin bu güçlü birleşimini kullandık. Ana amacı birden fazla görüntüden hücre floresan sinyal tam bir analiz gerçekleştirmek için otomatik bir çözüm önermektir. Çözümleme, görüntü ön işleme, nesne segmentasyonu ve floresan sinyal çözümlemesi kapsar.

Çeşitli protokoller minnetle Buzlu web sitesinde paylaşılır ve hücresel foci gibi floresan sinyalleri algılamak ve analiz etmek için Buzlu işlevleri kullanmayı öneriyoruz. Ancak, bu protokollerin bazıları çalışan başına yalnızca bir görüntü işleme, belirli bir dosyada sonuçları dışa aktarmaz veya tek bir kanal çözümlemek. Diğerleri, ilgi bölgelerini (ROI' lar) belirlemek için ön segmentasyon içermez veya yüksek kümelenmiş nesnelerin bölümlemesi için uygun olmayan "HK-araçları" gibi basit algoritmalar önermez. Alt Yapı Çözümleyicisi, görüntü ön işlemeden nesnelerin segmentasyonuna ve floresan sinyallerin algılanmasına/analizine kadar görüntü analizinin tüm adımlarını otomatikleştirir. Protokol ayrıca nesne bölümleme ve veri dışa aktarım (segmente nesnelerin adları, foci analizi) için basit veya daha karmaşık yöntemler önerir en iyi duruma getirilmiş çıktılar sorunlu uyarlanır gerçekleştirilir. CellProfiler ayrıca işlevleri saklayan modüllerden oluşan güçlü boru hatları önerir¹⁸^,¹⁹. Mevcut boru hatları belirli sorunlara iyi adapte edilmiştir. Buzlu iş akışları, her biri belirli bir görevi yerine getirerek farklı kutulardan oluşan bir ağdır. "Protokoller" arabirimi sayesinde, ağı oluşturan kutular sezgiseldir ve manipüle edilmesi kolaydır. Alt Yapı Analizörü, kanalların basit birleştirilmesi, iki hücre altı bölme arasındaki floresan sinyal dağılımının niceliği, tek tek hücrelerdeki bir veya iki hücresel bölmeden bir veya birkaç kanaldaki fosi analizi gibi çeşitli bağlamlara uyarlanmıştır. Çeşitli ekranlar, işlemeyi denetlemek için her çalıştırma sırasında ara sonuçları görselleştirmeye olanak sağlar. Ayrıca, Icy, yöntemleri konuya göre gruplandıran ve iş akışında bulunan işlevlerin tüm görüntü kümesinde kullanmadan önce bazı görüntülerdeki belirli parametreleri el ile test etmek için ayrı ayrı manipüle edilebilen simge çubuklarını sunar.

Biyogörüntü analizi alanında olduğu gibi, bu protokolün en kritik adımı nesne segmentasyonudur. Protokol, çoğu zaman hücre çekirdeği olan birincil nesnelerin bölümlemesini önerir ve aynı zamanda hücre içindeki ikinci nesne türünü bölümlere ayırmak için görev veren başka bir blok içerir. Nesneler birbirine dokunacak veya çakışacak şekilde yüksek oranda kümelenmiş olduğunda çekirdek bölümlemesi zor olabilir. Birincil nesnelerin bölümleme için farklı alternatifler, nesnelerin şekline ve kümeleme düzeyine göre, yüksek kümelenmiş nesnelerin tam segmentasyonunda bugüne kadar evrensel algoritma başarısı olmasa bile, protokolde yer almaktadır. Segmentasyon işlemi esas olarak, nesnelerin bir kısmını başarıyla segmente edebilecek ancak başka bir parçanın altında veya aşırı segmentasyonuna yol açabilecek doğru parametrelerin belirlenmesiyle sınırlıdır. Kullanıcı, özellikle heterojen ve dışbüvek olmayan şekiller sunan kümelenmiş nesneler için, son doğru bir segmentasyon elde etmek için farklı parametrelerle farklı çalıştırmalar gerçekleştirmek zorunda kalacak.

Bu protokol çoğunlukla çok zaman alıcı olabilir ve en karmaşık durumlarda güçlü bilgisayar yapılandırması gerekir segmentasyon adımı ile sınırlıdır. Daha spesifik olarak, görüntüler ne kadar çok veya karmaşıksa (bölümlere göre kümelenmiş nesneler, görüntülerde çok sayıda piksel), kullanıcının ihtiyaç duyacakları daha fazla rasgele erişimli bellek (RAM) olur. Genel olarak, herhangi bir sorunlu için, kullanıcı 64 bit Java Runtime Environment (serbestçe Java web sitesinde mevcuttur) üzerinde protokol çalıştırmak ve Buzlu tarafından kullanılan kullanılabilir bellek artırmak için 64 bit işletim sistemi (OS) kullanmak gerekir (bellek 32 bit JRE için 1300 MB ile sınırlıdır). Komut dosyası nedeniyle, protokol Mac bilgisayarda düzgün çalışmıyor. Ayrıca, parametrelerin sayısı sorunun karmaşıklığı ile artar ve görüntü analizinde daha fazla bilgi gerektirir. İşlevsellik ölçütleri ile ilgili olarak, bu protokol, Icy bu tür veriler üzerinde etkin bir şekilde çözümleme gerçekleştirse bile, yığılmış görüntülerin (zaman yığınları, z-yığınları) analizi için henüz uyarlanmamıştır.

Karmaşık kümelenmiş nesnelerin segmentasyonunu iyileştirmek için gelecekteki güncelleştirmeler özellikle gerçekleştirilecektir. Bölümlemenin düzensiz konveks olmayan şekillere sahip kümelenmiş hücresel yapılara uyarlanması için ek bloklar geliştirilecektir. İş akışını zaman ve z yığınlarının (canlı görüntüleme ve 3B veriler için) analizi için de uyarlarız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

G.H., Ministère Délégué à la Recherche et aux Technologies'den lisansüstü burs ile desteklenmiştir. L.H. Institut de Cancérologie de Lorraine (ICL) tarafından lisansüstü burs ile desteklenirken, Q.T. ikinci "Investissements d'Avenir" programı FIGHT-HF(referans: ANR-15-RHU4570004) kapsamında Fransız Ulusal Araştırma Ajansı (ANR) tarafından denetlenen bir kamu hibesi tarafından desteklendi. Bu çalışma CNRS ve Université de Lorraine (UMR 7365) tarafından finanse edilmiştir.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% Formaldehyde solution (w/v) methanol free	Thermo Fisher Scientific	28908	to fix the cells
Alexa Fluor 488 of goat anti-rabbit	Thermo Fisher Scientific	A-11008	fluorescent secondary antibody
Alexa Fluor 555 of goat anti-mouse	Thermo Fisher Scientific	A-21425	fluorescent secondary antibody
Alexa Fluor 555 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A34055	fluorescent secondary antibody
Bovine serum albumin standard (BSA)	euromedex	04-100-812-E
DMEM	Sigma-Aldrich	D5796-500ml	cell culture medium
Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI	Sigma-Aldrich	DUO82040-5ML	mounting medium
Human: HeLa S3 cells	IGBMC, Strasbourg, France		cell line used to perform the experiments
Hydrogen peroxide solution 30% (H₂O₂)	Sigma-Aldrich	H1009-100ml	used as a stressing agent
Lipofectamine 2000 Reagent	Thermo Fisher Scientific	11668-019	transfection reagent
Mouse monoclonal anti-coilin	abcam	ab11822	Coilin-specific antibody
Nikon Optiphot-2 fluorescence microscope	Nikon		epifluoresecence microscope
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Thermo Fisher Scientific	31985062	transfection medium
PBS pH 7.4 (10x)	gibco	70011-036	to wash the cells
Rabbit polyclonal anti-53BP1	Thermo Fisher Scientific	PA1-16565	53BP1-specific antibody
Rabbit polyclonal anti-EDC4	Sigma-Aldrich	SAB4200114	EDC4-specific antibody
Triton X-100	Roth	6683	to permeabilize the cells

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

Möckl, L., Lamb, D. C., Bräuchle, C. Super-resolved fluorescence microscopy: Nobel Prize in Chemistry 2014 for Eric Betzig, Stefan Hell, and William E. Moerner. Angewandte Chemie. 53 (51), 13972-13977 (2014).
Meijering, E., Carpenter, A. E., Peng, H., Hamprecht, F. A., Olivo-Marin, J. -C. Imagining the future of bioimage analysis. Nature Biotechnology. 34 (12), 1250-1255 (2016).
Wiesmann, V., Franz, D., Held, C., Münzenmayer, C., Palmisano, R., Wittenberg, T. Review of free software tools for image analysis of fluorescence cell micrographs. Journal of Microscopy. 257 (1), 39-53 (2015).
de Chaumont, F., et al. Icy: an open bioimage informatics platform for extended reproducible research. Nature Methods. 9 (7), 690-696 (2012).
Girish, V., Vijayalakshmi, A. Affordable image analysis using NIH Image/ImageJ. Indian J Cancer. 41 (1), 47 (2004).
Zaitoun, N. M., Aqel, M. J. Survey on image segmentation techniques. Procedia Computer Science. 65, 797-806 (2015).
Molecular Devices. MetaMorph Microscopy Automation and Image Analysis Software. , Available from: https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/acquisition-and-analysis-software/metamorph-microscopy (2018).
Nikon. NIS-Elements Imaging Software. , Available from: https://www.nikon.com/products/microscope-solutions/lineup/img_soft/nis-element (2014).
Meyer, F., Beucher, S. Morphological segmentation. Journal of Visual Communication and Image Representation. 1 (1), 21-46 (1990).
Schieber, M., Chandel, N. S. ROS Function in Redox Signaling and Oxidative Stress. Current Biology. 24 (10), 453-462 (2014).
D'Autréaux, B., Toledano, M. B. ROS as signalling molecules: mechanisms that generate specificity in ROS homeostasis. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 8 (10), 813-824 (2007).
Davalli, P., Mitic, T., Caporali, A., Lauriola, A., D'Arca, D. ROS, Cell Senescence, and Novel Molecular Mechanisms in Aging and Age-Related Diseases. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2016, 3565127 (2016).
Disher, K., Skandalis, A. Evidence of the modulation of mRNA splicing fidelity in humans by oxidative stress and p53. Genome. 50 (10), 946-953 (2007).
Takeo, K., et al. Oxidative stress-induced alternative splicing of transformer 2β (SFRS10) and CD44 pre-mRNAs in gastric epithelial cells. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 297 (2), 330-338 (2009).
Seo, J., et al. Oxidative Stress Triggers Body-Wide Skipping of Multiple Exons of the Spinal Muscular Atrophy Gene. PLOS ONE. 11 (4), 0154390 (2016).
Will, C. L., Luhrmann, R. Spliceosome Structure and Function. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (7), 003707 (2011).
Ljosa, V., Sokolnicki, K. L., Carpenter, A. E. Annotated high-throughput microscopy image sets for validation. Nature Methods. 9 (7), 637-637 (2012).
Wang, Q., et al. Cajal bodies are linked to genome conformation. Nature Communications. 7, (2016).
Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7, 100 (2006).
McQuin, C., et al. CellProfiler 3.0: Next-generation image processing for biology. PLoS Biology. 16 (7), 2005970 (2018).

Bioengineering

Alt Yapı Analizörü: Floresan Mikroskopi Görüntülerinde HücreCisimlerinin Hızlı Araştırılması ve Doğru Analizi için Kullanıcı Dostu İş Akışı

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.