Detección de proteína S-Acylation utilizando la captura asistida de acilo-resina
Summary
Acyl-RAC (Acyl-Resin Assisted Capture) es un método altamente sensible, confiable y fácil de realizar para detectar la modificación reversible de los residuos de cisteína (S-acylation) en una variedad de muestras biológicas.
Abstract
La proteína S-acylation, también conocida como S-palmitoylation, es una modificación post-traduccional reversible de residuos de cisteína con ácidos grasos de cadena larga a través de un enlace labile tioester. La acilación S, que está emergiendo como un mecanismo regulador generalizado, puede modular casi todos los aspectos de la actividad biológica de las proteínas, desde la formación compleja hasta el tráfico de proteínas y la estabilidad de las proteínas. Los recientes avances en la comprensión de la función biológica de la proteína S-acylation se lograron en gran medida debido al desarrollo de nuevas herramientas bioquímicas que permitieron la detección robusta y sensible de la proteína S-acylation en una variedad de muestras biológicas. Aquí, describimos la captura asistida por resina de acilo (Acyl-RAC), un método desarrollado recientemente basado en la captura selectiva de proteínas endógenamente S-aciladas por cuentas de sepharose tiol-reactivas. En comparación con los enfoques existentes, Acyl-RAC requiere menos pasos y puede producir resultados más fiables cuando se combina con espectrometría de masas para la identificación de nuevos objetivos de acilación S. Una limitación importante en esta técnica es la falta de capacidad para discriminar entre especies de ácidos grasos unidos a las cisteínas a través del mismo enlace tioester.
Introduction
La acilación S es una modificación post-traduccional reversible que implica la adición de una cadena de acilo graso a un residuo interno de cisteína en una proteína diana a través de una unión labile tioester1. Primero se informó como una modificación de proteínas con palmitato, un ácido graso saturado de 16 carbonos2,y por lo tanto esta modificación se conoce a menudo como S-palmitoylation. Además del palmitato, las proteínas pueden ser modificadas reversiblemente por una variedad de ácidos grasos saturados más largos y más cortos (miristate y estearato), monoinsaturados (oleato) y poliinsaturados (araquidonato y eicosapentanoato)3,4,5,6,7. En las células eucariotas, la acilación S es catalizada por una familia de enzimas conocidas como aciltransferasas de proteína DHHC y la reacción inversa de la deccilación de cisteína es catalizada por tilanarias de proteína, la mayoría de las cuales siguen siendo enigmáticas8.
La labilidad del enlace tioester hace que esta modificación lipídica sea reversible, lo que le permite regular dinámicamente el clustering de proteínas, la localización de membranas plasmáticas, el tráfico intracelular, las interacciones proteína-proteína y la estabilidad de proteínas9,,10. En consecuencia, la acilación S se ha relacionado con varios trastornos, incluyendo la enfermedad de Huntington, la enfermedad de Alzheimer y varios tipos de cáncer (próstata, gástrico, vejiga, pulmón, colorrectal), que requiere el desarrollo de métodos confiables para detectar esta modificación de proteína post-traduccional11.
El etiquetado metabólico con palmitato radiactivo ([3H], [14C] o [125I]) fue uno de los primeros enfoques desarrollados para analizar la proteína S-acylation12,13,14. Sin embargo, los métodos basados en radioetiquetado presentan problemas de salud, no son muy sensibles, consumen mucho tiempo y sólo detectan la lipidedeción de proteínas altamente abundantes15. Una alternativa más rápida y no radioactiva al radioetiquetado es el etiquetado metabólico con sondas de ácidos grasos bioortogonales, que se utiliza rutinariamente para analizar la dinámica de la proteína S-acylation16. En este método, un ácido graso con un reportero químico (grupo de alquino o azida) se incorpora a la proteína S-acilado por una proteína acitransferasa. Azide-alkyne Huisgen cycloaddition reaction (clic chemistry) se puede utilizar para unir un grupo funcionalizado, como un fluoróforo o biotina, al ácido graso integrado que permite la detección de la proteína S-acylated17,18,19.
El intercambio de acilina-acilo (ABE) es uno de los métodos bioquímicos ampliamente utilizados para la captura e identificación de proteínas s aciladas que evita algunas de las deficiencias del etiquetado metabólico, como la inadecuación para las muestras de tejido15. Este método se puede aplicar para el análisis de S-acylation en una amplia gama de muestras biológicas, incluyendo tejidos y muestras de células congeladas20,,21. Este método se basa en el escote selectivo del enlace tioéster entre el grupo de acilo y el residuo de cisteína por hidroxilamina neutra. Los grupos tiol liberados son capturados con un derivado de la biotina tiol-reactivo. Las proteínas biotiniladas generadas se purifican con afinidad mediante agarosa de estreptavidina y se analizan mediante inmunoblotting.
Más tarde se introdujo un enfoque alternativo llamado captura asistida de acilo-resina (Acyl-RAC) para reemplazar el paso de biotinylación por la conjugación directa de cisteínas libres por una resina tio-reactiva22,23. Este método tiene menos pasos en comparación con ABE y de forma similar se puede utilizar para detectar la proteína S-acylation en una amplia gama de muestras1.
Acyl-RAC consta de 4 pasos principales(Figura 1),
1. Bloqueo de grupos de tiol libres;
2. Escisión selectiva de la unión tioester de cisteína-acyl con hidroxilamina neutra (HAM) para exponer los grupos de tiol de cisteína;
3. Captura de las cisteínas lipicadas con una resina tiol-reactiva;
4. Enriquecimiento selectivo de las proteínas S-acylated después de la elución con tampón reductor.
Las proteínas capturadas pueden ser analizadas mediante inmunoblotting o sometidas a espectrometría de masas (MS) proteómica para evaluar el proteoma S-acilado en una variada gama de especies y tejidos22,,24,,25. Los sitios individuales de S-acylation también pueden ser identificados por la digestión de la trippsina de las proteínas capturadas y el análisis de los péptidos resultantes por LC-MS/MS22. Aquí, demostramos cómo acile-RAC se puede utilizar para la detección simultánea de S-acylation de múltiples proteínas tanto en una línea celular como en una muestra de tejido.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí, utilizamos con éxito el ensayo acyl-RAC para detectar La acilación S de proteínas seleccionadas tanto en células humanas cultivadas como en células primarias derivadas del tejido del ratón. Este método es simple, sensible y se puede realizar fácilmente con requisitos mínimos de equipos utilizando técnicas de bioquímica estándar. Se ha demostrado que este método identifica con éxito nuevas proteínas S-aciladas, como la subunidad del sistema de transubicación de proteínas (Sec61b), la proteína ribo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por las becas 5R01GM115446 y 1R01GM130840 de los Institutos Nacionales de Salud.
Materials
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail tablets | Sigma | 11836170001 | |
| Eppendorf Centrifuge 5424 | Eppendorf | 22620444 | |
| Hydroxylamine (HAM) | Sigma | 159417 | |
| Methyl methanethiosulfonate (MMTS) | Sigma | 64306 | |
| Mini tube rotator | LabForce | ||
| ML211 | Cayman | 17630 | |
| Multi-Therm Cool-Heat-Shake | Benchmark Scientific | H5000-HC | |
| n-Dodecyl β-D-maltoside (DDM) | Sigma | D641 | |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 | Sigma | P5726 | |
| Thiopropyl-Sepharose 6B (TS) | Sigma | T8387 | |
| Ultrasonics Quantrex Sonicator | L & R |
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