Summary
Ce protocole décrit une approche efficace d’hybridation in situ pour détecter les niveaux d’expression de l’ARNm et les modèles spatiaux des gènes cibles dans le liquide coélomique sipunculus nudus.
Abstract
L’hybridation in situ (ISH) est une technique très informative pour présenter des modèles de distribution cellulaire de gènes spécifiques (p. ex. l’ARNm et l’ARN) dans les tissus. Le ver sipunculide Sipunculus nudus est une ressource de pêche cruciale car il a des valeurs nutritionnelles et médicinales élevées. Actuellement, la recherche sur la biologie moléculaire de Sipunculus nudus n’en est encore qu’à ses balbutiements. Le but de cet article est de développer une méthode sensible pour localiser l’ARNm spécifique dans sipunculus nudus liquide coélomique. Le protocole comprend des étapes détaillées de l’ISH, y compris l’antisense étiqueté digoxigenin et la préparation des riboprobes sens, la collecte de liquide coélomique et la préparation de section, l’hybridation spécifique de riboprobe, l’incubation d’anticorps, la coloration et les traitements de post-coloration. Les résultats représentatifs obtenus à partir d’une expérience réussie utilisant cette méthode sont démontrés. Le protocole devrait également s’appliquer à d’autres espèces de Sipuncula.
Introduction
ISH, à l’aide d’une sonde d’acide nucléique étiquetée pour détecter la séquence spécifique d’ADN ou d’ARN d’intérêt, est une méthode utile pour décrire le modèle d’expression spatiale des gènes cibles dans les tissus morphologiquement conservés1,2,3. Normalement, la séquence cible est générée par la réaction en chaîne de polymérase (PCR), puis utilisée comme modèle pour synthétiser la sonde antisense/sens de l’ARN étiquetée avec de l’uridine-5'-triphosphate digoxigenin. Les échantillons sont fixes et perméabilisés avant l’incubation avec des riboprobe. Après avoir lavé l’excès de sonde, l’hybridation est visualisée par immunohistochimie à l’aide d’un anticorps anti-digoxygenine, qui est alcalin phosphatase-conjugué3,4,5,6.
Sipunculus nudus (Phylum Sipuncula; ordre Sipunculida: Sipunculidae) est un ver marin non mécublé, coelomate et bilatéralement symétrique7,8. Sipunculus nudus est une espèce cosmopolite largement répandue dans les eaux côtières tropicales et tempérées. Il s’agit également d’une ressource importante de pêche marine dans le sud de la Chine en raison de ses valeurs nutritionnelles et médicinales élevées9,10. Cependant, Sipunculus nudus en biologie moléculaire n’en est qu’à ses balbutiements. Pour bien comprendre le rôle biologique des gènes, l’étude des modèles d’expression des gènes à une résolution cellulaire est d’un grand intérêt. Dans l’organisme non-modèle Sipunculus nudus, la méthode ISH, qui est une méthode idéale pour détecter les modèles d’expression des gènes, n’a pas encore été établie. Son liquide coélomique contient plusieurs types de cellules, y compris les granulocytes, les cellules urne, les cellules vésiculaires, les cellules germinales, les érythrocytes,etc. Le double sexe/mab-3 facteur de transcription connexe-1 (dmrt1), utilisé comme gène représentatif dans cette méthode, est un régulateur transcriptionnel fortement conservé de la détermination du sexe et de la différenciation chez la plupart des espèces allant des invertébrés aux mammifères12,13. Dans une gamme d’espèces (c.-à-d. porgy noir, etc.) 14, dmrt1 a été exprimé dans les cellules Sertoli, entourant les cellules germinales, dont la fonction est similaire aux cellules trophoblastiques de Sipunculus nudus. Par conséquent, nous avons émis l’hypothèse que dmrt1 de Sipunculus nudus est exprimé dans les cellules trophoblastiques de spermatozeugmata, et le résultat de la méthode ISH a clairement confirmé l’hypothèse.
Ce protocole décrit pour la première fois ISH, avec des sondes anti-arna anti-ense/sens étiquetées digoxigenin, pour déterminer les modèles d’expression de l’ARNm dans son frottis de fluide coélomique. Les conditions de réaction optimales sont fournies, qui permettent une visualisation très sensible de l’expression de l’ARNm à haute résolution. La méthode ISH développée pourrait être potentiellement appliquée chez plus d’espèces de Sipunculida autres que sipunculus nudus.
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Protocol
La procédure animale a été approuvée par le Comité de soins et de bien-être des animaux de l’Université huaqiao.
1. Préparation de Riboprobe
- Conception d’apprêt
- Ouvrez le programme Primer 3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/). Copiez la séquence dmrt1 (GenBank : MK182259) dans la fenêtre de séquence.
- Définir la longueur de l’apprêt (23-25 bp), la température de fonte (55-60 oC) et le contenu G/C (40-60%). Cliquez sur Pick Primers.
REMARQUE : La taille minimale requise pour la sonde ARN est d’environ 500 bp. Les sondes plus longues ont normalement une spécificité plus élevée. - Ajoutez la séquence de promoteur de polymérase T7 RNA (5, -TAATACGACTCACTATAGGG-3,) à l’une des amorces sélectionnées. Les séquences d’amorce dmrt1 pour ISH sont indiquées dans le tableau 1.
REMARQUE : Pour les sondes sens, le promoteur de polymérase à ARN T7 est situé à l’extrémité 5' des amorces avant. Pour les sondes antisense, le promoteur de polymérase T7 ARN est situé à l’extrémité 5'-extrémité des amorces inversées.
- Amplification PCR
- Placez les tubes de microfuge sur la glace et préparez le mélange de réaction suivant (pour une réaction de 50 L) : 1x mélange de polymérase à l’ADN Taq, 1 g d’ADN (qui est préparé à partir de 100 l de liquide coélomique), 1 m d’apprêt avant, 1 m d’apprêt inversé et eau sans nucléase.
- Mélanger brièvement la réaction PCR par tuyauterie et centrifugeuse.
- Placez le tube de réaction dans un cycle thermique, et exécutez le PCR en utilisant les conditions suivantes : dénaturation initiale à 95 oC pendant 2 min suivie de 36 cycles de dénurescence à 95 oC pour 30 s, annealing à 55-60 oC pour 30 s, extension à 72 oC pour 30 s et une extension finale à 72 oC pour 7 min.
REMARQUE : La température d’annealing doit être optimisée selon les amorces.
- Purification et vérification des produits PCR
- Chargez le mélange de 50 L de PCR directement sur un gel d’agarose de 1 %. Exécuter le gel agarose à 150-180 V pendant 10 min en 0.5x TBE. Isolez les fragments d’ADN spécifiques du gel d’agarose de 1 %.
REMARQUE : L’ADN doit apparaître comme une seule bande et non comme un frottis. - Purifier les fragments d’ADN à l’aide d’un kit d’extraction de gel selon le protocole du fabricant. Quantifier les produits purifiés par spectrophotométrie à une longueur d’onde de 260 nm.
- Vérifier l’authenticité des produits PCR par séquençage.
REMARQUE : (Point de pause) Les produits PCR purifiés peuvent être stockés à -20 oC pendant plusieurs mois.
- Chargez le mélange de 50 L de PCR directement sur un gel d’agarose de 1 %. Exécuter le gel agarose à 150-180 V pendant 10 min en 0.5x TBE. Isolez les fragments d’ADN spécifiques du gel d’agarose de 1 %.
- Synthèse Riboprobe
- Placez les tubes de microfuge sans RNase sur la glace et ajoutez ce qui suit au tube de microfuge (pour une réaction de 10 L) : 1x Digoxygenin RNA Labeling Mix, 1x tampon de transcription, 0,5 L d’inhibiteurs de RNase, 1 L de polymérasés de l’ARN T7, 1 g de produit PCR et de l’eau sans RNase. Mélanger brièvement la réaction par tuyauterie et centrifugeuse. Incuber pendant 2 h à 37 oC.
- Ajouter 2 L de DNase I. sans RNase. Mélanger brièvement la réaction par tuyauterie et centrifugeuse. Incuber pendant 15 min à 37 oC.
- Ajouter 2 L 0,2 M EDTA (pH 8.0). Mélanger brièvement la réaction par tuyauterie et centrifugeuse.
- Ajouter 2,5 l de 4 M LiCl et 75 l’éthanol préchilled à la réaction ci-dessus. Bien mélanger. Laisser reposer 30 min à -70 oC.
- Centrifugeuse à 12 000 x g pendant 10 min à 4 oC. Décant l’éthanol. Ajouter 1 ml d’éthanol précpiné à 70 % (v/v) et laver les précipitations en mélangeant doucement.
- Centrifugeuse à 12 000 x g pendant 5 min à 4 oC. Décanter l’éthanol de 70 % et sécher brièvement les précipitations près d’une lampe à alcool. Dissoudre les précipitations en ajoutant 30 L d’eau sans RNase et mélanger délicatement.
- Chargez 2 L d’ARN synthétisé sur un gel d’agarose de 1 %. Exécuter le gel agarose à 180 V pendant 5-10 min en 0.5x TBE. Mesurer la concentration de l’ARN étiqueté à l’aide d’un spectrophotomètre à une longueur d’onde de 260 nm.
- Utilisez des microfuges sans RNase et des conseils de filtre pour éviter la contamination par les RNase.
REMARQUE : (point de pause) Les sondes étiquetées digoxygenine peuvent être stockées à -70 oC pendant plusieurs mois.
- Utilisez des microfuges sans RNase et des conseils de filtre pour éviter la contamination par les RNase.
2. Collecte de fluides coélomiciques
- Fixer les nudus S. sur la table de dissection avec des épingles. Ouvrez le corps des S. nudus avec de petits ciseaux autoclaved. Isoler le liquide coélomique avec une pipette.
- Recueillir et transférer 1 mL de liquide coélomique à l’égard d’une pipette sur des lames de microscope traitées en polyD-lysine. Appliquer le liquide coélomique uniformément à l’égard d’une pointe de pipette. Sécher les lames à l’air pendant 1 h à 37 oC.
3. Hybridation in situ
- Jour 1
- Réhydrabiliser les lames dans un bocal à coloration de la glissière contenant 100 ml de pyrocarbonate de diéthyle 1x traité de phosphate salin tamponné (DEPC-PBS). Réhydra 3 fois avec 1x DEPC-PBS, 5 min par lavage avec une agitation douce.
- Perméabiliser le frottis de liquide coélomique par digestion avec 10 g/mL proteinase K à température ambiante pendant 5 min. Incuber les glissières dans 4% de paraformaldehyde (PFA) pendant 20 minutes pour arrêter la digestion. Laver les diapositives en 1x DEPC-PBS avec une agitation douce pendant 5 min 3 fois.
- Ajouter 50 L de mélange d’hybridation (HM) contenant le sens/ riboprobe antisense sur les diapositives et ajouter un slip de couverture.
- Ajouter le tampon de boîte humide dans la boîte humide. Mettez les diapositives dans la boîte humide et scellez bien avec le film de paraffine. Hybrider la nuit (au moins 16 h) à 60 oC.
- Jour 2
- Préchauffer le tampon de lavage à 65 oC. Immerger la glissière dans le pot de coloration de la diapositive contenant le tampon de lavage et laisser reposer jusqu’à ce que le coverlip glisse automatiquement. Il faut environ 5 min.
- Laver 2 fois avec un tampon de lavage à 65 oC, 30 min par lavage avec une agitation douce. Laver 2 fois avec un citrate salin-sodium (SSC) de 0,2x à 65 oC, 30 min par lavage avec une douce agitation. Laver 2 fois avec tampon d’acide mâle contenant Tween 20 (MABT) à température ambiante, 30 min par lavage avec une agitation douce.
- Incuber les toboggans à température ambiante pendant 3 à 4 h dans le tampon de blocage. Incuber les diapositives dans 1 mL anti-digoxigenin-AP Fab fragments solution diluée à 1/5000 avec le tampon de blocage à 4 oC pendant la nuit.
- Jour 3
- Retirez la solution d’anticorps et lavez brièvement les diapositives dans LE MABT. Laver 4 fois avec LE MABT à température ambiante, 25 min par lavage avec une agitation douce.
- Incuber les lames avec tampon alcalin de phosphatase à température ambiante 3 fois, 5 min par lavage. Retirez le tampon alcalin phosphatase et ajoutez 1 ml de 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP)/nitro bleu tétrazolium (NBT) solution de colorant. Gardez les diapositives dans l’obscurité.
- Observez la réaction de couleur périodiquement sous un microscope optique. Lorsque la couleur est entièrement développée (temps de réaction dans la gamme de 1-4 h), laver les diapositives 2 fois avec MABT à température ambiante, 5 min par lavage avec une agitation douce.
- Laver 2 fois avec la solution d’arrêt à température ambiante, 15 min par lavage avec l’agitation douce. Incuber les lames dans le méthanol pour enlever l’excès de tache, à température ambiante pendant 30 min. Selon la couleur de fond, le lavage de méthanol peut être fait 2 ou 3 fois et le temps de décoloration peut être prolongé.
- Laver 2 fois avec MABT à température ambiante, 5 min par lavage avec une agitation douce. Transférer les diapositives sur un papier filtre frais. Ajouter 50 L de glycérol. Ajouter les coverlips et observer microscopiquement.
REMARQUE : La composition de la solution est présentée dans le tableau 2.
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Representative Results
Un résumé des étapes de l’ISH est illustré dans la figure 1. Les riboprobes de sens et correspondants pour dmrt1 ont été synthétisés des produits de PCR amplifiés des cDNA fluides coelomic. L’authenticité des produits PCR a été vérifiée par séquençage direct. Riboprobes ont été synthétisés à l’aide de polymérases T7 ARN selon les protocoles du fabricant et un rapport précédent4 avec quelques modifications mineures. Les signaux représentatifs de l’ISH sont indiqués à la figure 2. ISH de Sipunculus nudus liquide coélomique avec riboprobe antisense qui cible dmrt1 révèle colorant violet concentré dans les cellules trophoblastiques de la spermatozeugmata (figure 2A, B, flèches rouges). Un riboprobe sens a été utilisé comme un contrôle négatif, et le nervure de sens pour dmrt1 n’a pas détecté de signal d’hybridation(figure 2C).
Figure 1. Diagramme de flux de l’ISH. Les boîtes bleues sont les étapes pour synthétiser le riboprobe. Les boîtes vert clair sont des étapes pour les procédures in situ. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2. L’expression de dmrt1 dans sipunculus nudus liquide coélomique détecté par ISH. (A, B) Hybridation avec riboprobe antisens dmrt1. (C) Hybridation avec riboprobe de sens dmrt1. Les flèches rouges représentent des signaux d’hybridation dans les cellules trophoblastiques. sz, spermatozeugmata. Barre d’échelle : 50 m. Ce chiffre a été modifié à partir de Li et al.15. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Nom | Séquence (5 '-3 ') |
| Anti-Sonde F | ACAATGTAGCAGGGTTTAATCTTGG |
| Anti-Sonde R | TAATACGACTCACTATAGGGAGACTGTTCTCTATCTATCTATCCACCATCCAGTAA |
| Sense-Probe F | TAATACGACTCACTATAGGGAGAACAATGTAGCAGGGTTTAATCTTGG |
| Sense-Probe R | CTGTTTTCTCTATCTATCTATCTATCTACCATCCAGTAA |
Tableau 1. Les séquences d’amorce dmrt1.
| Réactif | Composition |
| 5 TBE (1 L) | 54 g de Tris, 27,5 g d’acide borique et 20 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0). |
| 10 PBS (5 L) | 400 g de NaCl, 10 g de KCl, 72 g de Na2HPO4 et 12 g de KH2PO4. |
| DEPC-PBS (1 L) | 1 L de 1 PBS et 1 mL DEPC. |
| PFA de 4 % en 1 PBS (100 ml, pH 7,4) | 4 g de PFA et 100 ml PBS. |
| 10 mg/mL proteinase K (1 ml) | 10 mg de proteinase K. |
| 20 SSC (1 L) | 175,3 g de NaCl et 88,2 g de sel de trisodium d’acide citrique. |
| Tampon de boîte humide (50 ml) | 2,5 ml de 20 SSC, 22,5 ml d’eau libre RNase et 25 ml de formamide déionisé. |
| Mélange d’hybridation (HM, 200 ml) | 100 ml de formamide déionisé, 50 ml de 20 SSC, 10 mg d’héparine, 100 mg d’ARR, 0,39 g d’acide citrique, 200 ll de Tween-20 et RNase eau libre à 200 mL. |
| Tampon de lavage (1 L) | 50 ml d’eau stérile de 20 x SSC, 500 ml de formamide déionisé, 450 ml d’eau stérile et 1 mL Tween-20. |
| MABT (1 L) | 11,6 g d’acide masculin, 8,77 g de NaCl, 8,25 g de NaOH et 1 mL Tween-20. |
| Blocage du tampon | 1 maBT, 2% de sérum de moutons (vol/vol) et 2 mg/mL BSA. |
| Tampon alcalin de phosphatase | 100 mM NaCl, 100 mM Tris HCl (pH 9,5), 50 mM MgCl2, et 0,1% Tween 20 (vol/vol). |
| Solution Stop | 0,1 M glycine, pH 2.2. |
Tableau 2. La composition des solutions utilisées dans le protocole ISH.
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Discussion
Des études antérieures ont montré que l’ISH est adapté pour détecter plusieurs ARN cibles16,17,18. Dans ce protocole, nous avons décrit une méthode ISH haute résolution pour détecter l’ARNm dans le fluide coélomique et mettre l’accent sur les conditions d’hybridation optimisées dans sipunculus nudus. Les signaux évidents de dmrt1 que nous avons observés ont démontré l’application réussie de ce protocole dans la détection de l’expression génique(figure 2).
Au cours de l’expérience, une série d’étapes doivent être particulièrement attention. Tout d’abord, les riboprobes sens pour les gènes cibles doivent être synthétisés comme le contrôle. Après la synthèse, la qualité du riboprobe doit être vérifiée sur un gel. Une mauvaise synthèse de l’ARN n’entraînera aucune coloration dans les sections. Deuxièmement, le processus de collecte de l’échantillon doit être doux pour prévenir la déformation cellulaire et l’expérience doit être effectuée immédiatement après la collecte de fluide coélomique pour prévenir la dégradation de l’ARN. Troisièmement, le temps et les temps d’incubation doivent être exactement suivis dans toutes les étapes sans raccourcir ou allonger. En particulier, prêter attention au moment du traitement proteinase K. Un temps de traitement trop long de proteinase K conduira à la destruction de la structure cellulaire de l’échantillon, tandis que le temps de traitement trop court ne permettra pas à la riboprobe d’entrer dans la cellule correctement. Enfin, les diapositives ne doivent pas se dessécher pendant l’expérience. Cette méthode implique une étape d’hybridation à 60 oC, ce qui augmentera les risques d’évaporation des réactifs. Comme indiqué dans la section protocole, les diapositives doivent être mises dans une boîte humide et recouvertes de film de paraffine pour éviter l’évaporation.
Une limitation de ce protocole est l’acquisition de séquences de riboprobe dans l’organisme non-modèle Sipunculus nudus, parce que l’ARNm mal séquencé peut conférer une faible spécificité du riboprobe. Avec le développement de la technologie de séquençage, de plus en plus de séquences de haute qualité de Sipunculus nudus seront libérés, ce qui permettra d’améliorer considérablement cette situation.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ces travaux ont été soutenus par le Young Scientists Fund de la National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31801034), la Natural Science Foundation of Fujian Province, China (2016J011161), les Fonds de recherche scientifique de l’Université Huaqiao (15BS306) et le Fonds novateur de post-études en recherche scientifique de l’Université Huaqiao.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Biowest | 111860 | |
| Anti-digoxigenin-AP Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| BCIP/NBT alkaline phosphatase color development kit | Beyotime | C3206 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | B2064 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Citric acid | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 5949-29-1 | |
| Citric acid trisodium | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 4/3/6132 | |
| Coverslips | Beyotime | FCGF60 | |
| Deionized formamide | Amresco | 12/7/1975 | |
| Diethyl pyrocarbonate, DEPC | Sigma | D5758 | Noxious substance |
| Digoxigenin (DIG) RNA Labeling Mix | Roche | 11277073910 | |
| DNase I, RNase-free | Invitrogen | 18047019 | |
| EDTA | Sigma | 431788 | |
| Electrophoresis gel imaging | Bio-Rad | Universal Hood III | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 64-17-5 | |
| Gel extraction kits | Omega | D2500 | |
| Gel-electrophoresis apparatus | Beijing Liuyi Instrument Factory | DYY-6C | |
| Glycerol | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 56-81-5 | |
| Glycine | Sigma | G5417 | |
| Heparin | Sigma | 8/1/9041 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7447-40-7 | |
| KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7778-77-0 | |
| LiCl | Sigma | 203637 | |
| Maleic acid | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 110-16-7 | |
| Methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 67-56-1 | Noxious substance |
| MgCl2 | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7786-30-3 | |
| Na2HPO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7558-79-4 | |
| NaCl | Biofount | JT0001 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 1310-73-2 | Corrosive |
| Paraffin film | Bemis Company, Inc. | PM-996 | |
| Paraformaldehyde, PFA | Sigma | 158127 | Noxious substance |
| PCR Instrument | Life Technology | Proflex | |
| Pins | Deli | 16 | |
| Pipette | Eppendorf | plus G | |
| Poly-D-lysine treated microscope slides | Liusheng | VER_A01 | |
| Proteinase K | Sigma | SRE0005 | |
| RNase free water | HyClone | SH30538. 02 | |
| RNase inhibitor | Roche | 3335399001 | |
| S. nudus | |||
| Sheep serum | Beyotime | C0265 | |
| Slide staining jar | Beyotime | FG010 | |
| Slide storage box | Beyotime | FBX011 | |
| Small autoclaved scissors | Shuanglu | sku_8330 | |
| Spectrophotometers | Thermo Fisher | NanoDrop 2000/2000c | |
| T7 RNA polymerases | Roche | 10881767001 | |
| Taq DNA polymerase mix (2X) | Thermo Scientific | K1081 | |
| Tris HCl | Sigma | RES3098T | |
| tRNA | Roche | 10109517001 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Water bath | Zhengzhou Great Wall Scientific Industrial | HH-S2 |
References
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