Summary
Detta protokoll beskriver en effektiv in situ hybridisering metod för att upptäcka mRNA uttryck nivåer och rumsliga mönster av målgener i Sipunculus nudus coelomic vätska.
Abstract
In situ hybridisering (ISH) är en mycket informativ teknik för att presentera cellulära distributionsmönster av specifika gener (t.ex. mRNA och ncRNA) i vävnader. Den sipunculid mask Sipunculus nudus är en avgörande fiske resurs eftersom den har höga näringsmässiga och medicinska värden. För närvarande är forskningen om molekylärbiologi Sipunculus nudus fortfarande i sin linda. Syftet med denna artikel är att utveckla en känslig metod för att lokalisera specifika mRNA i Sipunculus nudus coelomic vätska. Protokollet innehåller detaljerade steg av ISH, inklusive digoxigenin-märkt antisense och känsla riboprobe beredning, coelomic vätska insamling och avsnitt beredning, specifika riboprobe hybridisering, antikroppar inkubation, färgning och efter färgning behandlingar. De representativa resultat som erhållits från ett lyckat experiment med denna metod visas. Protokollet bör också tillämpas på andra Sipuncula-arter.
Introduction
ISH, med hjälp av en märkt nukleinsyrsond för att upptäcka den specifika DNA- eller RNA-sekvensen av intresse, är en användbar metod för att beskriva det rumsliga uttrycksmönstret för målgener i morfologiskt konserverade vävnader1,,2,3. Normalt genereras målsekvensen av polymeraskedjereaktion (PCR), och används sedan som mall för att syntetisera antisense/sense RNA-sonden märkt med digoxigeninuridin-5'-triphosphate. Proverna är fixerade och permeabiliserade före inkubation med ribosonbe. Efter tvättning av överskottssonden visualiseras hybridiseringen av immunohistokemi med hjälp av en anti-digoxygeninantikropp, som är alkalisk fosfataskonjugerad3,,4,5,6.
Sipunculus nudus (Phylum Sipuncula; beställ Sipunculida: Sipunculidae) är en osegmenterad, coelomate och bilateralt symmetrisk marin mask7,8. Sipunculus nudus är en kosmopolitisk art som är utbrett i tropiska och tempererade kustvatten. Det är också en viktig marin fiskeriresurs i södra Kina på grund av dess höga närings- och medicinska värden9,,10. Sipunculus nudus i molekylärbiologi är dock fortfarande i sin linda. För att till fullo förstå genernas biologiska roll är undersökningen av geners uttrycksmönster vid en cellupplösning av stort intresse. I icke-modellorganismen Sipunculus nudushar ISH-metoden, som är en idealisk metod för att upptäcka genuttrycksmönstren, ännu inte fastställts. Dess coelomic vätska innehåller flera celltyper, inklusive granulocyter, urnceller, vesikulära celler, könsceller, erytrocyter, etc11. Den dubbla kön/mab-3 relaterade transkriptionsfaktor-1 (dmrt1), som används som en representativ gen i denna metod, är en mycket bevarad transkriptionsregulator för könsbestämning och differentiering hos de flesta arter som sträcker sig från ryggradslösa djur till däggdjur12,13. I en rad olika arter (dvs. svart porgy, etc.) 14, dmrt1 uttrycktes i Sertoli celler, som omger könsceller, vars funktion liknar trofoblast celler av Sipunculus nudus. Därför hypotesen vi att dmrt1 av Sipunculus nudus uttrycks i trophoblast celler av spermatozeugmata, och resultatet av ISH metoden bekräftade tydligt hypotesen.
Detta protokoll för första gången beskriver ISH, med digoxigenin-märkt antisense/sense mRNA sonder, att bestämma mRNA uttryck mönster i sin coelomic vätska utstryk. De optimala reaktionsförhållandena levereras, vilket möjliggör mycket känslig visualisering av mRNA-uttryck vid hög upplösning. Den utvecklade ISH-metoden skulle kunna tillämpas på fler sipunculida arter än Sipunculus nudus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djurförsöket godkändes av djurskydds- och djurskyddskommittén vid Huaqiao-universitetet.
1. Beredning av ribosonber
- Primer design
- Öppna programmet Primer 3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/). Kopiera dmrt1-sekvensen (GenBank: MK182259) till sekvensfönstret.
- Ställ in primerlängd (23-25 bp), smälttemperatur (55-60 °C) och G/C-halt (40-60%). Klicka på Välj primers.
OBS: Den minimala storlek som krävs för RNA-sonden är cirka 500 bp. Längre sonder har normalt högre specificitet. - Lägg till T7 RNA polymeras promotor sekvens (5, -TAATACGACTCACTATAGGG-3,) till en av de valda primers. Dmrt1-grundfärgssekvenserna för ISH visas i tabell 1.
OBS: För avkänningssonder finns T7 RNA-polymeras promotorn vid 5'-änden av de främre grundfärgerna. För antisense-sonder finns T7 RNA-polymeras promotorn vid 5'-änden av de omvända grundfärgerna.
- PCR förstärkning
- Placera mikrobränslerören på is och förbered följande reaktionsblandning (för en μl μl reaktion): 1x Taq DNA-polymerasblandning, 1 μg cDNA (som framställs från 100 μl coelomvätska), 1 μM framåtprimer, 1 μM omvänd primer och nukleasfritt vatten.
- Blanda PCR-reaktionen genom pipettering och centrifug en kort stund.
- Placera reaktionsröret i en termisk cykeltur på 95 °C för 30 s, glödgning vid 55-60 °C i 30 s, förlängning vid 72 °C i 30 s och en slutlig förlängning vid 72 °C i 7 min.
Glödgningstemperaturen bör optimeras enligt grundfärgerna.
- PCR produktrening och verifiering
- Ladda 50 μl PCR-blandningen direkt på en 1% agarosgel. Kör agarosgeln på 150-180 V i 10 min i 0,5 x TBE. Isolera de specifika DNA-fragmenten från 1% agarosgel.
OBS: DNA ska visas som ett enda band och inte som ett utstryk. - Rena DNA-fragmenten med hjälp av en gelextraktionssats enligt tillverkarens protokoll. Kvantifiera de renade produkterna genom spektrofotometri vid en våglängd på 260 nm.
- Kontrollera äktheten av PCR-produkterna genom sekvensering.
OBS: (Pauspunkt) De renade PCR-produkterna kan förvaras vid -20 °C i flera månader.
- Ladda 50 μl PCR-blandningen direkt på en 1% agarosgel. Kör agarosgeln på 150-180 V i 10 min i 0,5 x TBE. Isolera de specifika DNA-fragmenten från 1% agarosgel.
- Riboson syntes
- Placera RNase-fria mikrobränslerör på is och tillsätt följande till mikrobränsleröret (för en 10 μL reaktion): 1x Digoxygenin RNA-märkningsmix, 1x transkriptionsbuffert, 0,5 μL RNase-hämmare, 1 μL T7 RNA-polymeraser, 1 μg PCR-produkt och RNase-fritt vatten. Blanda reaktionen genom pipettering och centrifug kort. Inkubera i 2 timmar vid 37 °C.
- Tillsätt 2 μL RNase-fri DNase I. Blanda reaktionen genom pipettering och centrifug kort. Inkubera i 15 min vid 37 °C.
- Tillsätt 2 μL 0,2 M EDTA (pH 8.0). Blanda reaktionen genom pipettering och centrifug kort.
- Tillsätt 2,5 μl 4 M LiCl och 75 μL förklockad etanol till ovanstående reaktion. Blanda väl. Låt stå i 30 min vid -70 °C.
- Centrifug vid 12 000 x g i 10 min vid 4 °C. Dekantera etanolen. Tillsätt 1 ml prechilled 70% etanol (v / v) och tvätta nederbörden genom att blanda försiktigt.
- Centrifug vid 12 000 x g i 5 min vid 4 °C. Dekantera 70% etanol och torka nederbörden kort nära en alkohollampa. Lös upp nederbörden genom att tillsätta 30 μL RNase-fritt vatten och blanda försiktigt.
- Ladda 2 μL syntetiserad RNA på en 1% agarosgel. Kör agarosgelen på 180 V i 5-10 min i 0,5 x TBE. Mät koncentrationen av det märkta RNA med hjälp av en spektrofotometer vid en våglängd på 260 nm.
- Använd RNase-fria mikrobränslerör och filterspetsar för att undvika RNase-kontaminering.
OBS: (Pauspunkt) De digoxygeninmärkta sonderna kan förvaras vid -70 °C i flera månader.
- Använd RNase-fria mikrobränslerör och filterspetsar för att undvika RNase-kontaminering.
2. Coelomic vätskesamling
- Fixa S. nudus på dissekeringsbordet med stift. Öppna S. nudus kropp med liten autoklaverad sax. Isolera den coelomiska vätskan med en pipett.
- Samla upp och överför 1 ml coelomisk vätska med en pipett till poly-D-lysinbehandlade mikroskopglas. Applicera den coelomiska vätskan jämnt med en pipettspets. Lufttorka rutschbanorna i 1 h vid 37 °C.
3. In situ hybridisering
- Dag 1
- Rehydrera diabilderna i en rutig färgburk som innehåller 100 ml 1x dietyrofakarbonatbehandlad fosfatbuffrad koksaltlösning (DEPC-PBS). Rehydrera 3 gånger med 1x DEPC-PBS, 5 min per tvätt med mild omrörning.
- Permeabilisera utstryket av coelomic vätska genom matsmältning med 10 μg/mL proteinas K vid rumstemperatur i 5 min. Inkubera bilderna i 4% paraformaldehyd (PFA) i 20 min för att stoppa matsmältningen. Tvätta bilderna i 1x DEPC-PBS med mild omrörning i 5 min 3 gånger.
- Tillsätt 50 μl hybridiseringsblandning (HM) som innehåller känsla/antisense ribosonbe på bilderna och tillsätt en täckslip.
- Lägg till våtboxbuffert i den våta lådan. Lägg bilderna i våtboxen och försegla väl med paraffinfilm. Hybridisera över natten (minst 16 timmar) vid 60 °C.
- Dag 2
- Värm tvättbufferten vid 65 °C. Sänk ned rutschkanan i skjutfärgningsburken som innehåller tvättbufferten och låt den stå tills täcket glider av automatiskt. Det tar ca 5 min.
- Tvätta 2 gånger med tvättbuffert vid 65 °C, 30 min per tvätt med mild omrörning. Tvätta 2 gånger med 0,2 x saltlösningsnatriumcitrat (SSC) vid 65 °C, 30 min per tvätt med mild omrörning. Tvätta 2 gånger med maleic acid buffert som innehåller Tween 20 (MABT) vid rumstemperatur, 30 min per tvätt med mild omrörning.
- Inkubera rutschbanorna i rumstemperatur i 3–4 timmar i blockeringsbufferten. Inkubera bilderna i 1 ml anti-digoxigenin-AP Fab fragment lösning utspätt vid 1/5000 med blockerande buffert vid 4 °C över natten.
- Dag 3
- Ta bort antikroppslösningen och tvätta bilderna en kort stund i MABT. Tvätta 4 gånger med MABT i rumstemperatur, 25 min per tvätt med mild omrörning.
- Inkubera bilderna med alkalisk fosfatasbuffert vid rumstemperatur 3 gånger, 5 min per tvätt. Ta bort den alkaliska fosfatasbufferten och tillsätt 1 ml 5-bromo-4-kloro-3-indolylfosfat (BCIP)/nitro blå tetrazolium (NBT) färgningslösning. Håll bilderna i mörker.
- Observera färgreaktionen regelbundet under ett optiskt mikroskop. När färgen är fullt utvecklad (reaktionstid i intervallet 1-4 h), tvätta bilderna 2 gånger med MABT i rumstemperatur, 5 min per tvätt med mild omrörning.
- Tvätta 2 gånger med stopplösning i rumstemperatur, 15 min per tvätt med mild omrörning. Inkubera rutschbanorna i metanol för att avlägsna överflödig fläck, vid rumstemperatur i 30 min. Enligt bakgrundsfärgen kan metanoltvätten göras 2 eller 3 gånger och avfärgningstiden kan förlängas.
- Tvätta 2 gånger med MABT i rumstemperatur, 5 min per tvätt med mild omrörning. Överför bilderna till ett nytt filterpapper. Tillsätt 50 μL glycerol. Tillsätt täcken och observera mikroskopiskt.
OBS: Lösningssammansättningen visas i tabell 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En sammanfattning av de steg som ingår i ISH illustreras i figur 1. Antisense och motsvarande känsla riboprobes för dmrt1 syntetiserades från PCR produkter förstärks från coelomic vätska cDNAs. Pcr-produkternas äkthet kontrollerades genom direkt sekvensering. Riboprobes syntetiserades med T7 RNA polymeraser enligt tillverkarens protokoll och en tidigare rapport4 med några mindre ändringar. De representativa signalerna från ISH visas i figur 2. ISH av Sipunculus nudus coelomic vätska med antisense riboprobe som riktar dmrt1 avslöjar lila färgning koncentrerad till trophoblast celler i spermatozeugmata (Figur 2A, B, röda pilar). En känsla riboprobe användes som en negativ kontroll, och känslan riboprobe för dmrt1 inte upptäcka någon hybridisering signal (Figur 2C).
Bild 1. Flödesschema för ISH. Blå lådor är stegen för att syntetisera ribosonbe. Ljusgröna lådor är steg för in situ-procedurer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Uttrycket av dmrt1 i Sipunculus nudus coelomic vätska upptäcks av ISH. (A, B) Hybridisering med dmrt1 antisense riboprobe. (C) Hybridisering med dmrt1 känsla ribosonbe. De röda pilarna representerar hybridiseringssignaler i trofoblastceller. sz, spermatozeugmata. Skala bar: 50 μm. Denna siffra har ändrats från Li et al.15. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Namn | Sekvens (5′-3′) |
| Anti-Probe F | ACAATGTAGCAGGGTTTAATCTTGG |
| Anti-Probe R | TAATACGACTCACTATAGGGAGACTGTTTTCTCTATGCATCCAGTAA |
| Sense-Probe F | TAATACGACTCACTATAGGGAGAACAATGTAGCAGGGTTTACTTGG |
| Sense-Probe R | CTGTTTTCTCTATGCATCCAGTAA |
Tabell 1. Dmrt1-grundfärgssekvenserna. dmrt1
| Reagens | Sammansättning |
| 5 × TBE (1 L) | 54 g Tris, 27,5 g borsyra och 20 ml 0,5 M EDTA (pH 8.0). |
| 10 × PBS (5 L) | 400 g NaCl, 10 g KCl, 72 g Na2HPO4 och 12 g KH2PO4. |
| DEPC-PBS (1 L) | 1 L av 1 × PBS och 1 ml DEPC. |
| 4% PFA i 1 × PBS (100 ml, pH 7.4) | 4 g PFA och 100 ml PBS. |
| 10 mg/ml proteinas K (1 ml) | 10 mg proteinas K. |
| 20 × SSC (1 L) | 175,3 g NaCl och 88,2 g citronsyratriiumsalt. |
| Våt låda buffert (50 ml) | 2,5 ml 20 × SSC, 22,5 ml RNase fritt vatten och 25 ml avjoniserad formamid. |
| Hybridiseringsmix (HM, 200 ml) | 100 ml avjoniserad formamid, 50 ml 20 × SSC, 10 mg heparin, 100 mg tRNA, 0,39 g citronsyra, 200 μL Tween-20 och RNase fritt vatten till 200 ml. |
| Tvättbuffert (1 L) | 50 ml 20 × SSC, 500 ml avjoniserad formamid, 450 ml sterilt vatten och 1 ml Tween-20. |
| MABT (1 L) | 11,6 g maleiksyra, 8,77 g NaCl, 8,25 g NaOH och 1 ml Tween-20. |
| Blockera buffert | 1 × MABT, 2% fårserum (vol/vol) och 2 mg/ml BSA. |
| Alkalisk fosfatasbuffert | 100 mM NaCl, 100 mM Tris HCl (pH 9.5), 50 mM MgCl2och 0,1% Tween 20 (vol/vol). |
| Stoppa lösning | 0,1 M glycin, pH 2.2. |
Tabell 2. Sammansättningen av lösningar som används i ISH-protokollet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tidigare studier visade att ISH är lämplig för att upptäcka flera mål RNA16,17,18. I detta protokoll beskrev vi en högupplöst ISH-metod för att upptäcka mRNA i coelomic vätska och betona optimerade hybridisering villkor i Sipunculus nudus. De uppenbara signalerna från dmrt1 vi observerade visade en framgångsrik tillämpning av detta protokoll vid påvisande av genuttryck (figur 2).
Under experimentet måste en rad steg ägnas särskild uppmärksamhet. För det första måste känsla ribosonber för målgener syntetiseras som kontroll. Efter syntesen bör kvaliteten på ribosonben kontrolleras på en gel. Dålig RNA-syntes resulterar inte i någon färgning i sektionerna. För det andra bör provinsamlingsprocessen vara skonsam för att förhindra celldeformation och experimentet måste utföras omedelbart efter coelomic vätskeuppsamling för att förhindra RNA-nedbrytning. För det tredje bör inkubationstiden och inkubationstiden följas exakt i alla steg utan att förkorta eller förlänga. I synnerhet uppmärksamma tidpunkten för proteinas K behandling. För lång behandlingstid av proteinas K kommer att leda till förstörelse av cellstrukturen i provet, medan för kort behandlingstid inte tillåter ribosonben att komma in i cellen ordentligt. Slutligen bör diabilder inte torka ut under experimentet. Denna metod innebär en hybridisering steg vid 60 °C, vilket kommer att öka riskerna för reagens avdunstning. Som anges i protokollsektionen skall diabilder sättas i en våt låda och täckas med paraffinfilm för att undvika avdunstning.
En begränsning av detta protokoll är förvärv av riboprobe sekvenser i icke-modell organism Sipunculus nudus, eftersom dåligt sekvenserade mRNA kan ge låg specificitet riboprobe. Med utvecklingen av sekvenseringsteknik kommer fler och fler högkvalitativa sekvenser av Sipunculus nudus att släppas, vilket kommer att förbättra denna situation avsevärt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Young Scientists Fund of the National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31801034), Natural Science Foundation of Fujian Province, China (2016J01161), Scientific Research Funds of Huaqiao University (15BS306) och Postgraduates Innovative Fund in Scientific Research of Huaqiao University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Biowest | 111860 | |
| Anti-digoxigenin-AP Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| BCIP/NBT alkaline phosphatase color development kit | Beyotime | C3206 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | B2064 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Citric acid | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 5949-29-1 | |
| Citric acid trisodium | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 4/3/6132 | |
| Coverslips | Beyotime | FCGF60 | |
| Deionized formamide | Amresco | 12/7/1975 | |
| Diethyl pyrocarbonate, DEPC | Sigma | D5758 | Noxious substance |
| Digoxigenin (DIG) RNA Labeling Mix | Roche | 11277073910 | |
| DNase I, RNase-free | Invitrogen | 18047019 | |
| EDTA | Sigma | 431788 | |
| Electrophoresis gel imaging | Bio-Rad | Universal Hood III | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 64-17-5 | |
| Gel extraction kits | Omega | D2500 | |
| Gel-electrophoresis apparatus | Beijing Liuyi Instrument Factory | DYY-6C | |
| Glycerol | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 56-81-5 | |
| Glycine | Sigma | G5417 | |
| Heparin | Sigma | 8/1/9041 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7447-40-7 | |
| KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7778-77-0 | |
| LiCl | Sigma | 203637 | |
| Maleic acid | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 110-16-7 | |
| Methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 67-56-1 | Noxious substance |
| MgCl2 | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7786-30-3 | |
| Na2HPO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7558-79-4 | |
| NaCl | Biofount | JT0001 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 1310-73-2 | Corrosive |
| Paraffin film | Bemis Company, Inc. | PM-996 | |
| Paraformaldehyde, PFA | Sigma | 158127 | Noxious substance |
| PCR Instrument | Life Technology | Proflex | |
| Pins | Deli | 16 | |
| Pipette | Eppendorf | plus G | |
| Poly-D-lysine treated microscope slides | Liusheng | VER_A01 | |
| Proteinase K | Sigma | SRE0005 | |
| RNase free water | HyClone | SH30538. 02 | |
| RNase inhibitor | Roche | 3335399001 | |
| S. nudus | |||
| Sheep serum | Beyotime | C0265 | |
| Slide staining jar | Beyotime | FG010 | |
| Slide storage box | Beyotime | FBX011 | |
| Small autoclaved scissors | Shuanglu | sku_8330 | |
| Spectrophotometers | Thermo Fisher | NanoDrop 2000/2000c | |
| T7 RNA polymerases | Roche | 10881767001 | |
| Taq DNA polymerase mix (2X) | Thermo Scientific | K1081 | |
| Tris HCl | Sigma | RES3098T | |
| tRNA | Roche | 10109517001 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Water bath | Zhengzhou Great Wall Scientific Industrial | HH-S2 |
References
- Tsai, C. J., Harding, S. A.
- Koshiba-Takeuchi, K. Whole-mount and section in situ hybridization in mouse embryos for detecting mRNA expression and localization. Methods in Cell Biology. 1752, 123-131 (2018).
- Wu, J., Feng, J. Q., Wang, X. In situ hybridization on mouse paraffin sections using DIG-labeled RNA probes. Methods in Molecular Biology. 1922, 163-171 (2019).
- Thisse, C., Thisse, B. High resolution in situ hybridization on whole-mount zebrafish embryo. Nature Protocols. 3, 59-69 (2008).
- Luc, H., Sears, C., Raczka, A., Gross, J. B. Wholemount in situ hybridization for Astyanax embryos. Journal of Visualized Experiments. (145), (2019).
- Abler, L. L., et al. A high throughput in situ hybridization method to characterize mRNA expression patterns in the fetal mouse lower urogenital tract. Journal of Visualized Experiments. (54), (2011).
- Du, X., Chen, Z., Deng, Y., Wang, Q. Comparative analysis of genetic diversity and population structure of Sipunculus nudus as revealed by mitochondrial COI sequences. Biochemical Genetics. 47, 884 (2009).
- Lemer, S., et al. Re-evaluating the phylogeny of Sipuncula through transcriptomics. Molecular Phylogenetics and Evolution. 83, 174-183 (2015).
- Jiang, S., et al. Radioprotective effects of Sipunculus nudus L. polysaccharide combined with WR-2721, rhIL-11 and rhG-CSF on radiation-injured mice. Journal of Radiation Research. 56, 515-522 (2015).
- Zhang, C. X., Dai, Z. R., Cai, Q. X. Anti-inflammatory and anti-nociceptive activities of Sipunculus nudus L. extract. Journal of Ethnopharmacology. 137, 1177-1182 (2011).
- Ying, X. P., et al. The fine structure of coelomocytes in the sipunculid Phascolosoma esculenta. Micron. 41, 71-78 (2010).
- Raymond, C. S., Murphy, M. W., O'Sullivan, M. G., Bardwell, V. J., Zarkower, D. Dmrt1, a gene related to worm and fly sexual regulators, is required for mammalian testis differentiation. Genes & Development. 14, 2587-2595 (2000).
- Kopp, A. Dmrt genes in the development and evolution of sexual dimorphism. Trends in Genetics. 28, 175-184 (2012).
- Wu, G. C., et al. Testicular dmrt1 is involved in the sexual fate of the ovotestis in the protandrous black porgy. Biology of Reproduction. 86, 41 (2012).
- Li, W. H., Wu, Y. Q., Ma, G. X., Yuan, M. R., Xu, R. A. Cloning and expression analysis of peanut worms transcription factor dmrt1. Acta Hydrobiologica Sinica. 43, 1210-1215 (2019).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).
- Baleriola, J., Jean, Y., Troy, C., Hengst, U. Detection of axonally localized mRNAs in brain sections using high-resolution in situ hybridization. Journal of Visualized Experiments. (100), e52799 (2015).
- Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts. Methods in Enzymology. 225, 361 (1993).
