Summary
子宮エレクトロポレーションの二重は、空間的および時間的に分離された細胞集団を標的にすることを可能にする。この技術は、通常の条件で蛍光タンパク質を使用して、また、目的の遺伝子を摂動する機能実験の後に、それらの細胞集団間の相互作用を視覚化するのに有用である。
Abstract
子宮内エレクトロポレーションは、哺乳類のコルチコ形成の根底にある分子および細胞機構を研究するために広く使用されるin vivo DNA伝達技術である。この手順は、脳室を利用して目的のDNAの導入を可能にし、一対の電極を使用して、遺伝物質の入り口を心室、神経幹細胞を裏打ちする細胞に向ける。この方法により、研究者は望ましい細胞にラベルを付けたり、それらの細胞に関心のある遺伝子の発現を操作することができます。それは神経移動を標的とするアッセイ、系統の追跡および軸索経路の発見を含む複数の適用を、備えている。この方法の重要な特徴は、その時間的および地域的制御であり、胚致死性または特定のCREドライバーマウスの欠如に関連する潜在的な問題の回避を可能にする。この技術のもう一つの関連する側面は、新しいマウスラインの生成を伴う経済的および時間的な制限を大幅に減らすのに役立ち、異なる発達年齢で脳の遠い領域に由来する細胞型間の相互作用の研究において特に重要になる。ここでは、空間的および時間的に分離された細胞集団のターゲットを可能にする二重エレクトロポレーション戦略について説明する。このアプローチにより、選択した蛍光タンパク質を使用して異なる場所の細胞の異なるサブタイプを標識して視覚化したり、これらの異なる細胞によって発現する目的の遺伝子を適切な時期に操作したりできます。この戦略は、子宮内エレクトロポレーションの可能性を高め、密接な接触を確立するために移行する時間的および空間的に分離された細胞集団の挙動を研究する強力なツールを提供し、軸索予測を介した長距離相互作用を研究し、時間的および経済的コストを削減する。
Introduction
大脳皮質は非常に複雑で複雑に組織化された構造です。このような組織の程度を達成するために、皮質投影ニューロンは、その側頭発生、皮質プレート内の最終目的地への移行、および短距離および長距離接続の確立1、22を必要とする複雑な発達過程を経る。長い間、コルチコ形成を研究する古典的な方法は、関心のある遺伝子のノックアウトまたはノックインマウスモデルの使用に基づいていました。しかし、この戦略、特に条件付きノックアウトマウスの使用は時間と高価であり、遺伝的冗長性の存在や特定のCREドライバの欠如などに関する追加の問題を提示することがあります。これらの問題に対処するために生じたアプローチの1つは、今日では皮質の発達を研究するために広く使用されている、子宮エレクトロポレーション33、44です。子宮内エレクトロポレーションは、体細胞トランスジェネシスに使用される技術であり、神経幹細胞およびその子孫を生体内で標的化することを可能にする。この方法は、インビボでの遺伝子操作(すなわち、機能アッセイの利得または,損失)7、8、9、8生体9外および培養細胞8、10における電気泳動皮質を単離するための蛍光タンパク質105、6の発現によって細胞を標識するために使用することができる。56さらに、子宮内のエレクトロポレーションでは、標的領域の時間的および地域的制御が可能である。この技術は、多くの用途を有し、広く神経移動、幹細胞分裂、神経結合性、および他の被験者898、9、11、1211,12を研究するために使用されています。,
現在の原稿は、子宮エレクトロポレーションで二重と呼ぶ子宮エレクトロポレーション変異体の使用を記述し、異なる時間的および空間的起源を有する大脳皮質における細胞の相互作用を分析する。これらの研究は、いくつかのトランスジェニックラインの組み合わせ使用を必要とするため、マウスモデルを採用する際に完了するには非常に複雑です。本論文に記載されているプロトコルの応用例としては、隣接する細胞間の密接な相互作用の研究や、長距離投影による遠距離細胞間の相互作用の研究が挙げられる。この方法では、同じ胚上で時間的および空間的に分離された子宮エレクトロポレーション手術において2つの独立した独立を行い、関心のある異なる細胞集団を標的とする。このアプローチの利点は、野生型動物を使用して一方または両方のタイプのニューロンで遺伝子機能を操作する可能性です。さらに、これらの機能実験は、細胞質または膜タグ付き蛍光タンパク質の発現と組み合わせて、樹状突起および軸索を含む標的細胞の微細形態を可視化し、細胞相互作用の可能性のある差異をコントロール(すなわち、蛍光タンパク質で標識した細胞のみ)に比較して分析することができる。
ここで説明するプロトコルは、新皮質内の細胞相互作用の研究に焦点を当てていますが、この戦略は、小脳15のような他の構造のサブパラリウムまたは視床13、14、,14または他の構造の細胞間相互作用のような子宮エレクトロポレーションで標的とすることができる皮質外領域との相互作用を調べるためにも使用できます。異なる領域のターゲット設定は、電極の向きとDNAが注入される心室(側面、第3、または第4)に基づいています。ここで説明した戦略では、機能実験における結合性/インナビネーションの一般的な変化を評価するのに役立つ、かなりの数の細胞にラベルを付けることができます。それにもかかわらず、接続性の微細な変化を研究するために、子宮エレクトロポレーション中の改変版を使用して、まばらな標識を得て、単一細胞16を同定することができる。要約すると、子宮内の二重エレクトロポレーションは、時間的および空間的に分離された細胞集団を標的化し、制御条件下でまたは機能的実験と組み合わせて、それらの相互作用を詳細に研究することを可能にする汎用性の高い方法であり、時間的および経済的コストを大幅に削減する。
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Protocol
ここに記載されている手順は、実験を担当する倫理委員会、バレンシア大学の動物福祉およびアグリカルチュラコンセラースによって承認されています。 デサロロ農村、緊急クリマチカ・イ・トランティシオン・エコロギカ・オブ・コンビニダード・バレンシアナのエコロギカは、スペインの法律の実Decreto 53/2013および欧州議会および理事会の指令2010/63/EUでレビューされた国際実験動物科学評議会(ICLAS)のガイドラインを遵守しています。
注: このプロトコルは 2 つの異なる目的を伴います: 1)最初の研究は、「戦略 A」と呼ばれ、同じ脳半球内の Cajal-Retzius 細胞 (CR 細胞) と初期の皮質投影ニューロン間の相互作用の分析を可能にします。2)第2の研究「ストラテジーB」は、新皮質の対側側への上層のカロス投影ニューロンの内インベーションを調べるために行われる。
1. 前外科準備
- DNA調製
- 目的のプラスミドを使用して化学的または電気的に対応する大腸菌DH5α細胞を変換し、適切な抗生物質でLB寒天プレートにプレートし、37°Cで一晩インキュベートします。
注:ここで使用されるすべてのプラスミドには、蛍光レポータータンパク質(CAG-mCherryおよびCAG-EGFP戦略AとCAG-BFPのためのCAG-mCherryとCAG-EGFP)の発現を駆動するチキンβアクチン(CAG)の一般的なプロモーターが含まれています。それらのすべては、アンピシリン(AMP)に対する耐性を含む。 - 各プラスミド変換から個々のコロニーを選び、激しい揺れ(200rpm)で37°Cで3-4時間の間に細菌培養管中のルリアブロス+アンピシリン(LB+AMP)の2mLでスターター液体培養を開始します。その後、500mLのエルレンマイヤーフラスコに大きな細菌培養液をセットし、200mLのLB+AMPと1mLのスターター培養を加えた。200rpmで軌道シェーカーで37°Cで一晩インキュベートします。
- 内部毒素フリーのマキシプレップキット(材料表)を使用して、液体培養物から純粋で濃縮されたプラスミドDNAを得るために製造業者の指示に従ってください。DNAを約50~100μLの内毒素フリーTris-EDTA(TE)バッファーに再懸濁して、5μg/μL以上の濃度を得る。
- 各手術ごとに、1μLの速緑色色素を含む最終体積10μLの溶液、各プラスミドに対して1μg/μLの最終濃度に対する目的のプラスミドDNA溶液、および内毒素を含まないTEバッファーを用意します。例えば、高速グリーン色素1μL、5μg/μLプラスミドDNA溶液2μL、および7μLのTEバッファーを混合します。
- 目的のプラスミドを使用して化学的または電気的に対応する大腸菌DH5α細胞を変換し、適切な抗生物質でLB寒天プレートにプレートし、37°Cで一晩インキュベートします。
- ピペットプル
- ホウケイ酸ガラスの毛細血管(1/0.58 mm外径/内径)を垂直マイクロピペットプーラーに引き込み、先端が1-1.5cmの長さに達するまで、解剖用鉗子を解剖スコープで約30°の角度でトリムします。
- 手術室のセットアップ
- すべての装置を操作テーブル(すなわち、ピンセット、はさみ、鉗子、マイクロピペット、針、針ホルダー)に置きます。加熱パッドをオンにし、無菌の外科吸収パッドで覆います。吸入麻酔用の機械内の貯蔵所がイオブルランで満たされ、酸素タンクに十分な酸素が含まれ、システムが正常に機能することを確認してください。
注:手術室と耐性材料は、可能な限り無菌に保たれる必要があります(すなわち、すべての材料は手術前にオートクレーブされ、表面は70%エタノールで消毒されなければなりません)。プラチナ電極は、最初に殺菌石鹸で最初に、2番目に手術前に70%エタノールで慎重に殺菌する必要があります。 - ペニシリンストレプトマイシン1:100を含む無菌生理食糸溶液を100 mLで調製し、10cmのペトリ皿を充填します。加熱されたパッドの上にプレートを置き、溶液を温めます。
- 1 mL のシリンジに鎮痛液 150 μL (例えば 0.1 mg/kg ブプレノルフィン) を充填します。
- ステップ1.1.4で調製した最終的なプラスミドDNA溶液の5μLでプルドピペットをロードします。口制御された吸引管に毛細管を接続します。
- すべての装置を操作テーブル(すなわち、ピンセット、はさみ、鉗子、マイクロピペット、針、針ホルダー)に置きます。加熱パッドをオンにし、無菌の外科吸収パッドで覆います。吸入麻酔用の機械内の貯蔵所がイオブルランで満たされ、酸素タンクに十分な酸素が含まれ、システムが正常に機能することを確認してください。
2. 子宮の最初のエレクトロポレーション手術
- E11.5(戦略A)またはE13.5(戦略B)C57BL/6妊娠マウスを閉じた誘導チャンバー内に配置し、0.8 L/minで2.5%(v/v)イオブルランを使用し、麻酔が行われるまで待ちます。マウスを加熱パッドに移し、イオブルランの一定の配達のためにマスクに鼻を入れます。適切な麻酔の指標としてペダル反射の欠如を確認してください。
注:Eムブリオニック年齢は、膣プラグが観察される日に基づいて決定されます(E0.5)。 - 妊娠中の女性に鎮痛液(0.1mg/kgブプレノルフィン)を皮下注射する。手順中に目が乾燥するのを防ぐために、綿棒を使用して各目に目の軟膏を1滴塗布します。
- マウスの腹部を電気カミソリで剃り、70%(v/v)エタノールワイプで2倍、ヨウ素ワイプで1回、エタノールワイプで最後に1回洗浄します。
- はさみを使用して、動物の右側の皮膚を通して30mmの長い切開を行い、鈍いへらで筋肉から隣接する皮膚を慎重に分離します。その後、腹壁に2回目の切開を行います。
- 腹部を、その中心に40mmの長さのスリットを含む70%エタノールで以前に汚染された折り畳まれたティッシュペーパーで覆います。リング鉗子で慎重に腹腔から子宮を引き出す。
注:子宮は、手順全体の間にステップ1.3.2で調製された暖かい生理液で濡れ続ける必要があります。 - ステップ1.1.4で調製したDNA溶液でプルドピペットをプリロードします。速い緑色の染料が心室の中で目立つまで口制御された吸引管を使用して、選択した半球の側心室に胚当たりのDNA溶液の約0.5μLを注入する。
- 鉗子型白金電極を、注入された胚の頭部の周りに横に置く(図1Aおよび図2Aに示すように)。電極を向き、目的の脳領域をターゲットにします。正極を内側壁に向けて、皮質のヘム(戦略A)を電気的に泳がすか、または側皮質(戦略B)に向かって、その領域で生成された細胞にラベルを付けます。
注:すべての場合において、心臓と胎盤は胚生存を確実にするために避けなければなりません。 - 表1に示す適応症に従って方波エレクトロポレーターを使用して電気パルスの特定のシーケンスを適用します(戦略A E11.5胚:25Vと40msの4パルス、950ミリ秒間隔で区切られ、戦略B E13.5胚:35Vと60msの5パルス、950ms間隔)。
- 慎重に鉗子で腹腔に戻って子宮を置き、暖かい生理液でそれを満たし、針6-0縫合で腹壁を閉じます。針6-0縫合または縫合クリップを使用して、皮膚で行われた最初の切開の両側を結合します。
- 加熱パッド上の動物を維持し、麻酔から回復するまでそれを監視します。 自宅のケージに入れたヒドロゲル溶液に、アナゲシア(150 μL)の余分な用量を提供します。
- 手術後24時間、鎮痛(150μL)の余分な用量を投与する。痛みや苦痛の可能性を目視で毎日監視し続けます。動物の行動を観察し、通常の後肢反射を検査し、縫合糸を検査して、創傷の舐めや傷による損傷の可能性のある徴候を検査する。
3. 子宮電散の第2
- 最初の手術の2日後に、ステップ2.1-2.3を繰り返します。手術後の妊婦の回復は非常に良好ですが、2回目の手術を行う前に正常な行動を示し、痛みや苦痛の兆候がないことを確認してください(戦略AのE13.5胚と戦略BのE15.5)。
- ステップ2.4のように皮膚を通して30mmの長さの切開を行い、今度は動物の左側に腹壁で2回目の切開を行います。ステップ2.5で説明したように、注意して、感染した組織の上に子宮を露出させる。
注:以前に反対側で行われた切開を妨げないように注意してください。 - 戦略Aの場合は以前に電気電解された半球の側脳室にDNA溶液の胚当たり約0.5μL、およびストラテジーBの対側半球の側脳室に注入する。
注:正常な発達を示す胚のみを使用し、再吸収の兆候はありません。 - ステップ2.7で説明したように胚の頭部の周りに電極を置き、正極を横皮質に向け、表1に示す適応症に従って適切なパルスを適用する(戦略A E13.5胚:35Vの5パルスと950ミリ秒間隔で分離された60ミリ秒;戦略B E15.5胚:50Vと800ミリ秒の間隔で分離した)。
- 手順 2.8-2.10 に従って手術を続行し、完了します。
4. 組織の収穫と切除
- 戦略A
- 第2のエレクトロポレーション(E17.5)の4日後に、妊婦の子宮頸部脱臼を行い、それを座合位置に置く。
- はさみを使用して、腹側切開を行って子宮の角を抽出し、鉗子で氷の上に置かれた1倍のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で満たされたペトリ皿に入れます。
注:低温で胚の麻酔を可能にします。 - ピンセットを使用して、羊膜嚢から胚を抽出し、解剖スコープの下で新しいPBSで満たされたペトリ皿に鉗子でそれらを転送します。鉗子を使用して慎重に胚の頭を保持し、最初に頭の上の皮膚を取り除き、次に頭蓋骨を取り除くためにピンセットで脳の解離を行います。露出した脳を引き抜くためにへらを使用してください。
- スプーンで脳を収集し、固定溶液(1x PBSで4%[w/v]パラホルムアルデヒド[PFA])で満たされた48ウェルプレートに堆積します。例えば、逆起起起蛍光顕微鏡を用いて脳を調べることで、両方のエレクトロポレーションの成功結果を直ちにテストします。
- 胎児の脳を軌道シェーカーで4°Cで一晩固定する。PFAの痕跡を除去するために1x PBSで洗浄してください。次に、抗真菌防腐剤(1x PBS-0.05%(w/v)アジドナトリウムでPBSに移します。
注意:PFAおよびアジ化ナトリウムは、細胞毒性化合物であり、その使用中に特別な予防措置が必要です。 - 1x PBSで4%(w/v)低融点アガロースに固定された脳を埋め込み、固まるまで〜10分待ちます。嗅球を上向きにしてシアノクリレート接着剤を使用してビブラートメ組織ホルダーに貼り付け、コロナセクションを得ます。
- ビブラートを開始し、希望のパラメータを選択します:100 μm幅、0.60 μm/s速度、0.60 mmの振幅。
- ビブラートメ容器の中で脳を固定し、1x PBS溶液で満たし、1x PBS-0.05%(w/v)ナトリウムアジドナトリウムで満たされた48ウェルプレートにブラシの助けを借りてコロナシリアルセクションを収集し始め、脳の完全な描写(例えば、井戸あたり約7セクション、胚あたり6つの井戸)を持ちます。
- 細かいブラシを使用して顕微鏡ガラススライドに目的のセクションを取り付けます。ガラスカバーリップでそれらをカバーします。長期保存のために、フォトブリーチおよび光酸化を防ぐ取り付け媒体を加える。直立した蛍光顕微鏡でスライドを観察し、エレクトロポレーションの有効性を評価します。
- 戦略B
- E13.5およびE15.5で以前に電気ポポレートされた子犬を生み出し、P15がステップ4.1.4で使用したのと同じ固定溶液を使用して心筋灌流を行うのを待つ。
- 灌流の直前に、腹腔内投与量75/1mg/kgケタミン/メデトミジン。ペダル反射が失われたら、マウスを上頭線の位置に固定し、はさみを使用して中央線に沿って腹側切開を行い、リブケージとダイヤフラムの両方を露出させます。
- ダイヤフラムを切り、肋骨ケージを開けて心臓にアクセスします。止まり歯を使用してリブケージを保持し、細かいはさみで右心房に切開を行います。
- 柔軟性のあるチューブで接続された針で左心室を蠕動灌流ポンプに浸透させます。心筋灌流を開始し、5.5 mL/min(合計時間〜5分)の一定の流束で4%PFAの少なくとも25 mLを送達する。
- 浸透した動物の脳を解剖する。まず、はさみと鉗子で頭の上の皮膚を取り除きます。はさみを使用して頭蓋骨を切断し始め、それらが完全に取り除かれるまで慎重に頭蓋骨のセクションを引き離します。最後に、へらの助けを借りて脳を抽出します。
- 脳を24のウェルプレートに移し、軌道シェーカーで4°Cで一晩4%PFAで固定します。PBSで0.05%(w/v)ナトリウムアジドでPFAを置き換えることによって固定を停止します。
注: ステップ 4.1.5 で示されているように、1x PBS で中間洗浄を行うことをお勧めします。 - ステップ 4.1.6-4.1.9 を繰り返し、出生後脳のビブラートメのパラメータを変更します(40 μm 幅、1.20 μm/s 速度、0.5 mm の振幅)。
注:免疫細胞化学または免疫蛍光は、特定の細胞マーカーを検出するか、エレクトロポレーションに使用される蛍光タンパク質のシグナルを増強するために行うことができます。
5. 共焦点蛍光イメージングと解析
- 共焦点顕微鏡をオンにし、取り付けられた脳切片を含む顕微鏡スライドを顕微鏡スライドホルダーに置き、蛍光画像が撮影されるチャンネルを選択します(すなわち、BFPの場合は420-460 nm、GFPの場合は490-540 nm、mCherryとtdTomatoの場合は570-620 nm)。
- サンプルスキャンを実行して、二重エレクトロポレーション出力の一般的なビューのために、2つの異なる波長で各脳部の地図画像を取得します。終了したら、10xレンズとマルチエリア-Z-スタックタイムラプス観測モードを選択します。これにより、脳のセクション内のさまざまなXYZ局在で蛍光画像の自動取得をプログラミングすることができます。
- 選択した各領域(XY)に、適切な画像化パラメータ(すなわち、レーザー強度、光乗数感度、最小分解能1,024 x 1,024)を設定し、蛍光が見えるサンプルの平面に従ってスキャンの深さ(Z)を設定します。
- 選択したすべての領域の低倍率(10x)画像を取得し、顕微鏡ビューアソフトウェアを使用してOIFからTIFF形式にエクスポートします。
- 60xレンズに変更し、ステップ5.3を繰り返し、より詳細な方法で細胞と細胞の相互作用を観察するために高倍率画像をキャプチャします。手順 5.4 で示すようにエクスポートします。
- 取得した画像をイメージングソフトウェア(フィジーなど)で開き、さらなる分析を行います。
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Representative Results
隣接する細胞間の相互作用は、遠位の場所と異なる時期に発生した:Cajal-Retzius細胞(CR細胞)と早期移行皮質投影ニューロン(戦略A)
CR細胞と初期皮質突起ニューロンの相互作用は、二重エレクトロポレーション戦略8を用いてネクチンおよびカドヘリン接着分子を介してソマル転座を調節するために必要であると以前に説明した。CR細胞は、ペリウムの縁にある神経エピテリウムに由来し、接線的に移動して皮質の最も表面的な部分を移し、限界領域17、18、1918は、大脳皮質の増殖帯で皮質投影ニューロンが生成され、19新皮質プレート20に放射状に移動する。17両方のタイプの細胞の生成には時間的な違いがあります。CR細胞はE10.521、22から非常に初期の胚段階で生成され、22ソマル転座によって移行する皮質投影ニューロンはE12.5-E13.523から生まれる。子宮内二重エレクトロポレーションを使用して、手術間の時間的ギャップは、その起源の場所(皮質のヘム)の1つでE11.5を標的とするCR細胞が、E13.5で標識された皮質投影ニューロンとの接触を確立するために時間内に体性感覚領域を含む側新皮質の限界領域に到達することを可能にする(図1A、B)。B強化されたGFP(EGFP)を発現する投影ニューロンの主要なプロセスは、皮質の限界領域にやたらと耕成し、mCherryを発現するCR細胞のプロセスと混ざり合う(図1C)。機能的実験は、投影ニューロンまたはCR細胞によって発現される細胞細胞接着分子の摂動が、両細胞タイプ8間の接触の変化の結果としてそれらのプロセスの樹型化に影響を及ぼすことを示している。
異なる時期に生成された遠位細胞間の長期相互作用:上層のカロス投影ニューロンを新皮質の対側側にインナベーションする(ストラテジーB)
カロスカル皮質投影ニューロンは大脳皮質全体に存在し、上層24に多く存在する。これらのニューロンは、脳梁を介して軸索を投影し、それらの標的細胞、対側皮質25、26、27,26の異なる層にわたって位置する投影ニューロンに27接触する。上層投影ニューロンは、下層ニューロンよりも進化的に新しく、霊長類28で大幅に拡張されています。これらの細胞は複雑な思考とより高い連想タスクに重要であり、この細胞集団によって特異的に発現される遺伝子群の機能不全は最近自閉症29と関連している。
上層に位置するカロスプロジェクションニューロンの亜集団と、その標的細胞が対半球全体に分布する相互作用を具体的に研究するために、我々は子宮エレクトロポレーションプロトコルの二重を開発した。上層のカロス法の細胞に標識するために、BFP発現プラスミドを用いてE13.5で子宮エレクトロポレーションを行った(図2A-C)。Cこの年齢は、多くの層Vニューロンを含む広範な皮質投影ニューロン集団を標的にするだけでなく、上層(図2C)に位置するかなりの数のニューロンを標的にするだけでなく、基本的には対側半球からのカロス投影ニューロンのすべての標的領域をカバーすることができるため、戦略的に選ばれました。E15.5の対側側の第2のエレクトロポレーションは、上層のカロスプロジェクションニューロン亜集団(nEGFPおよびmtdTomatoを発現する)を標的とした(図2A、B、D)が、以前の年齢で生まれた低層投影ニューロンは標的としなかった。BDしたがって、異種慢性二重エレクトロポレーションの必要性は、関心のある突出細胞の生成とそれらによってインナートされた細胞の生成の異なる時間のために正当化された。これらの上層標的ニューロンは、特徴的な樹状化パターンを持つ対側半球に軸索を送る(図2C)。この典型的な軸索の樹状化パターンの違いは、この二重エレクトロポレーションプロトコルを用いた標的細胞における機能実験のゲインまたは損失時に評価することができる。高倍率分析は、対側半球における標的投影ニューロンを内面化するカロス軸索を詳細に示している(図2E)。
図1:テュートロエレクトロポレーション戦略における戦略A.ダブルは、空間的および時間的起源の異なる細胞間の密接な相互作用を研究する。(A) EGFPを発現するmCherryおよび皮質投影ニューロンを発現するCR細胞を標的とするプロトコルの概略図。(B)皮質の皮質と側皮質における二重エレクトロポレーション後の脳のコロナ部の代表的な画像。皮質のヘム(赤)を標的とする細胞は接線的に移動し、新皮質の限界領域を引き込む。皮質の心室領域に標識された細胞は、新皮質プレートに入るために放射状に移動する皮質投影ニューロン(緑色)を生成する。スケールバー= 200 μm(C) パネルBに箱入り面積の拡大率は、横皮質と二重エレクトロポレーションプロトコルの後に標識された2種類の細胞を表示する。破線は、限界ゾーンと皮質プレートを囲みます。スケールバー= 100 μm. 右の高倍率は、CR細胞の体とプロセスと混ざり合う投影ニューロンの帯状化された主要プロセスを含む限界ゾーンの詳細を示します。スケールバー = 10 μm. Ctx = 皮質;ヘム=皮質のヘム;MZ = 周辺ゾーン;CP = 皮質プレート;IZ = 中間ゾーン。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:戦略B.空間と時間的起源の異なる細胞間の長距離相互作用を研究するための二重エレクトロポレーション戦略。(A) 異なる半球の体性感覚領域を含む側新皮質の皮質投影ニューロンの異なる集団を子宮エレクトロポレーションの二重化によって標的とする戦略を示すスキーム。E13.5を標的とした右半球の体性感覚皮質におけるプロジェクションニューロンがBFPを発現した。E15.5を標的とする対側側の標的投影ニューロンは、核EGFP(nEGFP)および膜標的tdTomato(mtdTomato)を発現した。(B)パネルAに記載されたプラスミドで二重エレクトロポレーション手術を受けた脳のコロナ部の代表的な画像。BFPまたはnEGFPによって標識された細胞の異なる分布と、E15.5で標識された上層のカロスプロジェクションニューロン(mtdTomato)の軸索の強烈な標識に注意してください。スケールバー= 500 μm(C) 二重電気電解された脳の右半球に位置する体性感覚皮質の画像。層全体の投影ニューロン(青)の広い分布と、対角半球を標的とする投影ニューロンから来るカロス軸索(赤)の多量のアーボル化に注意してください。スケールバー= 100 μm(D) 二重電気電離脳の左半球における体性感覚皮質の画像。nEGFP(緑)の発現によって示されるように、皮質プレートの上部にある標的投影ニューロンの離散局在化、ならびに細胞体およびすべての神経細胞突起(赤)を取り巻く赤いラベルを持つ多量の赤い標識に注意してください。スケールバー= 100 μm(E) 右半球の体性感覚皮質の高倍率画像は、標的型投影ニューロンの周りのカロス軸索の樹状化の詳細を示す。スケールバー= 10 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 戦略 | エレクトロポレーションの順序 | ターゲットセル | 対象地域 | 心室注入 | 電極の位置 | 電圧とパルス | 使用されるプラスミド | 分析の時代 |
| A | まずは | E11.5のCRセル | 皮質ヘム | 左 | 左半球の正(内側壁に向けて) | 25 V、40ミリ秒、4p | カグムチェリー | E17.5 |
| 2 番目 | E13.5における皮質投影ニューロン | 体性感覚皮質 | 左 | 左半球で正 | 35 V、60ミリ秒、5p | カグ・エグフ | ||
| (皮質に向かって) | ||||||||
| B | まずは | E13.5における皮質投影ニューロン | 体性感覚皮質 | そうです | 右半球の正 | 35 V、60ミリ秒、5p | カグ-BFP | P15 |
| (皮質に向かって) | ||||||||
| 2 番目 | E15.5における皮質投影ニューロン | 体性感覚皮質 | 左 | 左半球で正 | 50 V、80ミリ秒、5p | CAG-nEGFP-2A-mTdトマト | ||
| (皮質に向かって) |
表1:異なる実験で使用されるエレクトロポレーション条件の概要。
| 戦略Aにおける子宮の二重の後の胚の生存 | |||||||||
| ごみの数 | 胚の初期数 | 最初のEPを生き残った胚の数 | 第2EPを生存する胚の数 | 最初のEP後の生存率 | 2 番目の EP* 後の生存率 | 世界生存率の割合 | |||
| 9 | 総数 | (平均ごみ ± SD) | 総数 | (平均ごみ ± SD) | 総数 | (平均ごみ ± SD) | 75% | 83.33% | 62.50% |
| 64 | 7.11 ± 2.08 | 48 | 5.33 ± 1.22 | 40 | 4.44 ± 1.01 | ||||
| 最初の EP の後に中止された胚の数 | 第2EP後に中止された胚の数 | 中止された胚の総数 | 最初のEP後の中絶の% | 2 回目の EP* 後の中絶の % | 世界中絶率の割合 | ||||
| 総数 | (平均ごみ ± SD) | 総数 | (平均ごみ ± SD) | 総数 | (平均ごみ ± SD) | 25% | 16.66% | 37.50% | |
| 16 | 1.8 ± 1.09 | 8 | 0.88 ± 0.78 | 24 | 2.67 ± 1.32 | ||||
| *生存と中絶は、最初のエレクトロポレーションを生き残った胚を考慮して計算 | |||||||||
表2:戦略Aにおける子宮エレクトロポレーションにおける二重に続く胚の生存
| 戦略Bに続く胚と子犬の生存(二重EP E13.5およびE15.5) | |||||||||||
| ごみの数 | 胚の初期数 | 最初のEPを生き残った胚の数 | ダブルEP後に生まれた子犬の数 | P15で生存している胚の数 | 最初のEP後の生存率 | 第2EP後の生存率 | P15での生存率 | ||||
| 8 | 総数 | (平均ごみ ± SD) | 総数 | (平均ごみ ± SD) | 総数 | (平均ごみ ± SD) | 総数 | (平均ごみ ± SD) | 88.46% | 82.69% | 55.77% |
| 52 | 6.5 ± 2 | 46 | 5.75 ± 2.05 | 43 | 5.38 ± 1.77 | 29 | 3.63 ± 1.6 | ||||
| E13.5における単一EPに続く胚および子犬の生存 | ||||||||
| ごみの数 | 胚の初期数 | EPの後に生まれた子犬の数 | P15で生存している胚の数 | EP後の生存率 | P15での生存率 | |||
| 11 | 総数 | (平均ごみ ± SD) | 総数 | (平均ごみ ± SD) | 総数 | (平均ごみ ± SD) | 89.74% | 57.69% |
| 78 | 7.1 ± 1.64 | 70 | 6.36 ± 1.7 | 45 | 4.09 ± 2.07 | |||
表3:簡単なエレクトロポレーションと比較して、戦略Bにおける子宮エレクトロポレーションにおける二重に続く子犬の生存率。
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Discussion
大脳皮質のような細胞密度の高い領域における生体内での細胞間相互作用の研究は複雑な作業です。神経突起を標識する抗体の使用を含む従来のアプローチは、異なる細胞集団に対する特異的マーカーがないため、適切ではない。特定の細胞型が蛍光タンパク質を発現するトランスジェニックマウスモデルの使用は、神経細胞のプロセスを可視化するのに有用であるが、これはそのようなモデルの利用可能性に依存する。このタスクは、ノックアウトマウスのような他の動物モデルの使用を伴うため、対象遺伝子の摂動時に2つの特定の細胞タイプ間の相互作用の可能性のある違いを視覚化しようとするとさらに複雑になります。これらの問題のすべては、経済的および一時的なコストのために、過去にこれらの研究を複雑にしました。
子宮エレクトロポレーションのような生体内で体細胞トランスジェネシスを可能にする新しい技術の出現は、このプロトコルに記載されているような戦略を設計する可能性を提供し、このタイプの実験をより実現可能にします。この出版物および以前に出版された研究8に示された結果は、このプロトコル1)が異なる時間および空間的起源を有する細胞集団の標的化を正常に可能にすることを示している。2)は、高解像度で細胞と細胞の接触の可視化を可能にします。3)機能実験後の細胞接触の違いを検出するのに有用である。
子宮エレクトロポレーションの広い使用にもかかわらず、この技術は安全に手術を行い、それらを損傷することなく胚を操作し、所望の領域の正しいターゲティングを保証するためにかなりの訓練を必要とする。しかし、このトレーニングの後、妊娠中の女性の生存率は優れており(私たちの手の中では約100%)、子宮エレクトロポレーションではシングルとダブルの間に違いは見つかりませんでした。シングルとダブルの電気ポレートの妊娠中の女性は、手術から非常に迅速に回復します。大多数の症例では、単一または二重手術の翌日の行動は正常に見え、これらの妊娠中の女性は痛みや苦痛の明らかな兆候なしに食べたり、飲んだり、歩いたり、さらには困難なく登ったりします。
第1および第2のエレクトロポレーション後の胚の生存も全体的に良好であり、そして胚の年齢が増加するにつれて中絶率が低下する(表2および表3)。主な難しさは、両方のエレクトロポレーションでのターゲティングに成功した点です。E13.5以降の古い胚では、成功の度合いは非常に高いです。E11.5のような初期の年齢は、胚の小さなサイズが取り扱いと注射をより困難にし、それに加えて生存に影響を与えるので、より困難です。しかし、第1E11.5エレクトロポレーションを生き残った胚は、E13.5での第2のエレクトロポレーション後に生存率が非常に良好である(表2)。この技術の能力を向上させるために、私たちは強く〜E14.5で子犬の手術を練習し、若い年齢で手術を試みることをお勧めします。
もう一つの課題は、手術を受けている母親が常にすべての子犬の世話をするとは限らないので、出生後の生存であるが、妊娠中の女性は単一または二重の電気ポポレートが問題なく子犬を提供する(表3)、その行動とフィットネスの状態は正常に見える。私たちの手の中で、そしてここで説明するタイミングで、我々は、単純かつ二重エレクトロポレーション後の出生後生存に重要な違いは見つかりません(表3)が、可能な生存問題を回避するために、実際の母親が出生時に貧しい母親の行動を示すときに出産時に母親を育てるために移動することができます。出産日前に妊娠中の女性に余分なネスティング材料と豊富な食物を提供することも、子犬の生存率を高めるのに役立ちます。
この戦略の主な利点の1つは、機能研究のための野生型マウスの使用であるが、例えば、CREレポーターマウスや関心のある遺伝子のためのフロックスマウスに適用することもできます。これらのマウスでは、CRE-recombinase発現プラスミドのエレクトロポレーションは、標的細胞におけるレポーター遺伝子の永久発現または所望の遺伝子の不活性化をそれぞれ可能にする。機能実験では、目的の細胞タイプでのみコンストラクトの発現を制御することもできます。例えば、ニューロンプロモーターは、ニューロンでのみ候補遺伝子を操作し、神経幹細胞ではなく、前駆細胞レベルで望ましくない効果を防止するために使用することができます。これらの考慮事項のすべては、時間と標的領域の制御と共に、子宮エレクトロポレーションの二重を皮質内だけでなく、この技術を使用して標的とすることができる他の構造においても細胞と細胞の相互作用を研究するための非常に汎用性の高い技術を作ります。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
著者らは、クリスティーナ・アンドレス・カルボネルとバレンシア大学のアニマルケア施設のメンバーに対し、技術支援を求めて感謝している。また、イザベル・ファリニャスとサクラメント・R・フェロンの試薬と機器の共有に感謝したいと思います。I.M.Wは、インセラーシア・デ・エドゥカシオン・デ・バレンシア(GJIDI/2018/A/221)のガランティア・ジュベニル契約によって資金提供され、D.dA.Dはシエンシア大臣、イノバシオン・イ・ユニバーシダーデス(MICINN)(FPI-PRE2018-086150)によって資金提供されています。C.Gil-Sanzは、スペインのイノバシオン・イ・ウニバーシダーデス(MICINN)のスペイン大臣からラモン・イ・カハル・グラント(RYC-2015-19058)を保持しています。この作品はRYC-2015-19058およびSAF2017-82880-R(MICINN)に資金を提供しました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A9518-25G | |
| Aspirator tube | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Baby-mixter hemostat (perfusion) | Fine Science Tools (FST) | 13013-14 | |
| Borosilicate glass capillary | WPI | 1B100-6 | |
| Buprenorphine (BUPREX 0,3 mg/ml) | Rb Pharmaceuticals Limited | 921425 | |
| CAG-BFP plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| CAG-EGFP plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| CAG-mCherry plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| CAG-mtdTomato-2A-nGFP plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| Confocal microscope | Olympus | FV10i | |
| Cotton Swabs | BFHCVDF | ||
| Cyanoacrylate glue | B. Braun Surgical | 1050044 | |
| Dissecting scope | Zeiss | stemi 305 | |
| Dumont Forceps #5 Fine Forceps | Fine Science Tools (FST) | 11254-20 | |
| ECM830 Square Wave Electroporator | BTX | 45-0052 | |
| Electric Razor | Oster | 76998 | |
| Endotoxin-free TE buffer | QIAGEN | 1018499 | |
| Ethanol wipes | BFHCVDF | ||
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools (FST) | 11150-10 | |
| Eye ointment | Alcon | 682542.6 | |
| Fast Green dye | Sigma-Aldrich | F7252-5G | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools (FST) | 14069-09 | |
| Fluorescence LEDs | CoolLED | pE-300-W | |
| Genopure Plasmid Maxi Kit | Roche | 3143422001 | |
| Halsted-Mosquito Hemostats (suture) | Fine Science Tools (FST) | 91308-12 | |
| Heating Pad | UFESA | AL5514 | |
| Inverted epifluorescence microscope | Nikon | Eclipse TE2000-S | |
| Iodine wipes | Lorsoul | ||
| Isofluorane vaporizer | Flow-Meter | A15B5001 | |
| Isoflurane | Karizoo | 586259 | |
| Ketamine (Anastemine) | Fatro Ibérica SL | 583889-2 | |
| Kimtech precision wipes | Kimberly-Clark | 7252 | |
| LB (Lennox) Agar GEN | Labkem | AGLB-00P-500 | |
| LB (Lennox) broth GEN | Labkem | LBBR-00P-500 | |
| Low-melting point agarose | Fisher Scientific | BP165-25 | |
| Medetomidine (Sedator) | Dechra | 573749.2 | |
| Microscope coverslips | Menel-Gläser | 15747592 | |
| Microscope Slides | Labbox | SLIB-F10-050 | |
| Mounting medium | Electron Microscopy Sciences | 17984-25 | |
| Mutiwell plates (24) | SPL Life Sciences | 32024 | |
| Mutiwell plates (48) | SPL Life Sciences | 32048 | |
| NaCl (for saline solution) | Fisher Scientific | 10112640 | |
| Needle 25 G (BD Microlance 3) | Becton, Dickinson and Company | 300600 | |
| Orbital incubator S150 | Stuart Scientific | 5133 | |
| P Selecta Incubator | J. P. Selecta, s.a. | 0485472 | |
| Paraformaldehyde | PanReac AppliedChem | A3813 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma -Aldrich | P4333 | |
| Peristaltic perfusion pump | Cole-Parmer | EW-07522-30 | |
| Platinum Tweezertrode, 5 mm Diameter | Btx | 45-0489 | |
| Reflex Skin Closure System - 7mm Clips, box of 100 | AgnThos | 203-1000 | |
| Reflex Skin Closure System - Clip Applyer, 7mm | AgnThos | 204-1000 | |
| Ring Forceps | Fine Science Tools (FST) | 11103-09 | |
| Sodium azide | PanReac AppliedChem | 122712-1608 | |
| Surgical absorbent pad (steryle) | HK Surgical | PD-M | |
| Suture (Surgicryl PGA 6-0) | SMI Suture Materials | BYD11071512 | |
| Syringe 1ml (BD plastipak) | Becton, Dickinson and Company | 303172 | |
| Tissue Culture Dish 100 x 20 mm | Falcon | 353003 | |
| Vertical Micropipette Puller | Sutter Instrument Co | P-30 | |
| Vertical microscope | Nikon | Eclipse Ni | |
| Vibratome | Leica | VT1200S |
References
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