Summary

Dupla em Eletroporação utero para atingir populações celulares temporais e espacialmente separadas

Published: June 14, 2020
doi:

Summary

O dobro na eletroporação uteral permite atingir populações celulares que são separadas espacial e temporalmente. Esta técnica é útil para visualizar interações entre essas populações celulares usando proteínas fluorescentes em condições normais, mas também após experimentos funcionais para perturbado genes de interesse.

Abstract

No útero a eletroporação é uma técnica de transferência de DNA in vivo amplamente usada para estudar os mecanismos moleculares e celulares subjacentes à corticogênese dos mamíferos. Este procedimento aproveita os ventrículos cerebrais para permitir a introdução do DNA de interesse e usa um par de eletrodos para direcionar a entrada do material genético para as células que revestem o ventrículo, as células-tronco neurais. Este método permite que os pesquisadores rotulem as células desejadas e/ou manipulem a expressão de genes de interesse nessas células. Possui várias aplicações, incluindo ensaios direcionados à migração neuronal, rastreamento de linhagem e localização axonal. Uma característica importante deste método é o seu controle temporal e regional, permitindo a evasão de potenciais problemas relacionados com a letalidade embrionária ou a falta de ratos condutores de CRE específicos. Outro aspecto relevante dessa técnica é que ela ajuda a reduzir consideravelmente as limitações econômicas e temporais que envolvem a geração de novas linhas de camundongos, que se tornam particularmente importantes no estudo de interações entre tipos celulares que se originam em áreas distantes do cérebro em diferentes idades de desenvolvimento. Aqui descrevemos uma estratégia de eletroporação dupla que permite o direcionamento de populações celulares que são separadas espacial e temporalmente. Com essa abordagem podemos rotular diferentes subtipos de células em diferentes locais com proteínas fluorescentes selecionadas para visualizá-las, e/ou podemos manipular genes de interesse expressos por essas diferentes células nos momentos apropriados. Essa estratégia aumenta o potencial da eletroporação uteral e fornece uma poderosa ferramenta para estudar o comportamento de populações celulares temporais e espacialmente separadas que migram para estabelecer contatos próximos, bem como interações de longo alcance através de projeções axonais, reduzindo custos temporais e econômicos.

Introduction

O córtex cerebral é uma estrutura muito complexa e intrincadamente organizada. Para alcançar tal grau de organização, os neurônios de projeção cortical passam por processos complexos de desenvolvimento que requerem sua geração temporal, migração para seu destino final na placa cortical e o estabelecimento de conexões de curto e longo alcance1,,2. Por muito tempo, a maneira clássica de estudar corticogênese foi baseada no uso de modelos murinos de nocaute ou knock-in de genes de interesse. No entanto, essa estratégia, e particularmente o uso de camundongos eliminatórios condicionais, é demorada e cara, e às vezes apresenta problemas adicionais quanto à existência de redundância genética ou à falta de drivers específicos de CRE, entre outras questões. Uma das abordagens que surgiram para tentar resolver esses problemas e que hoje é amplamente utilizada para estudar o desenvolvimento cortical está na eletroporaçãoutero 3,4. No útero a eletroporação é uma técnica usada para transgênese somática, permitindo o direcionamento in vivo de células-tronco neurais e sua prole. Este método pode ser usado para rotular células pela expressão de proteínas fluorescentes5,6, para manipulação genética in vivo (ou seja, ganho ou perda de ensaios de função)7,8,9, para isolar cortices eletroporados in vitro e cultura de células8,,10. Além disso, no útero a eletroporação permite o controle temporal e regional da área alvo. Esta técnica possui inúmeras aplicações e tem sido amplamente utilizada para estudar migração neuronal, divisão de células-tronco, conectividade neuronal e outros sujeitos8,,9,,11,12.

O manuscrito atual descreve o uso de uma variante de eletroporação uteral, denominada dupla em eletroporação uteral, para analisar as interações das células no córtex cerebral com diferentes origens temporais e espaciais. Esses estudos são extremamente complexos de serem concluídos ao empregar modelos murinos porque requerem o uso combinado de várias linhas transgênicas. Algumas das aplicações do protocolo descrito neste artigo incluem o estudo de interações próximas entre células vizinhas, bem como interações entre células distantes através de projeções de longo alcance. O método requer a realização de duas cirurgias de eletroporação uteral, separadas temporal e espacialmente, nos mesmos embriões para atingir diferentes populações celulares de interesse. A vantagem dessa abordagem é a possibilidade de manipular a função genética em um ou ambos os tipos de neurônios usando animais do tipo selvagem. Além disso, esses experimentos funcionais podem ser combinados com a expressão de proteínas fluorescentes citoplasmáticas ou marcadas por membrana para visualizar a morfologia fina das células-alvo, incluindo dendritos e axônios, e analisar possíveis diferenças nas interações celulares em comparação com um controle (ou seja, células apenas rotuladas com a proteína fluorescente).

O protocolo delineado aqui é focado no estudo das interações celulares dentro do neocórtex, mas essa estratégia também poderia ser usada para examinar interações com áreas extracorticais que podem ser direcionadas usando na eletroporação utero, como o subpallium ou o tálamo13,14, ou interações célula-células em outras estruturas, como o cerebelo15. O direcionamento de diferentes áreas baseia-se na orientação dos eletrodos e no ventrículo onde o DNA é injetado (lateral, terceiro ou quarto). Com a estratégia descrita aqui, podemos rotular um número substancial de células, o que é útil para avaliar mudanças gerais na conectividade/inervação em experimentos funcionais. No entanto, para estudar mudanças finas na conectividade, pode-se usar versões modificadas de eletroporação uteróptero para obter rotulagem mais esparsa e identificar células únicas16. Em resumo, o dobro da eletroporação uteral é um método versátil que permite direcionar populações celulares temporais e espacialmente separadas e estudar suas interações em detalhes, seja em condições de controle ou combinadas com experimentos funcionais, reduzindo consideravelmente os custos temporais e econômicos.

Protocol

O procedimento aqui descrito foi aprovado pelo comitê de ética responsável pela experimentação, pelo bem-estar animal da Universidad de Valência e da Conselleria de Agricultura, Desarrollo Rural, Emergencia Climática y Transición Ecológica da Comunidad Valenciana, e adere às diretrizes do Conselho Internacional de Ciência Animal Laboratorial (ICLAS) revisado no Real Decreto 53/2013 da legislação espanhola, bem como na Diretiva 2010/63/UE do Parlamento Europeu e do Conselho. NOTA: …

Representative Results

As interações entre as células vizinhas originaram-se em locais distais e em diferentes épocas: células de Cajal-Retzius (células CR) e neurônios de projeção cortical migratórios precoces (estratégia A) A interação das células de CR e dos neurônios de projeção cortical precoce foi descrita anteriormente como necessária para regular a translocação somal via moléculas de adesão de néctina e cadherina usando uma estratégia de eletroporação dupla<sup clas…

Discussion

O estudo das interações célula-células in vivo em regiões com alta densidade celular como o córtex cerebral é uma tarefa complexa. Abordagens tradicionais, incluindo o uso de anticorpos para rotular neurites, não são adequadas devido à falta de marcadores específicos para diferentes populações celulares. O uso de modelos transgênicos de murina, onde um determinado tipo de célula expressa uma proteína fluorescente, é útil para visualizar os processos neuronais, mas isso depende da disponibilidade de tais…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores agradecem a Cristina Andrés Carbonell e aos membros da unidade de Cuidados com Animais da Universidad de Valência pela assistência técnica. Também queremos agradecer a Isabel Fariñas e Sacramento R. Ferrón pelos reagentes e pelo compartilhamento de seus equipamentos conosco. A I.M.W é financiada por um contrato da Garantía Juvenil da Conselleria de Educación de Valencia (GJIDI/2018/A/221), a D.d.D é financiada pelo Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (MICINN) (FPI-PRE2018-086150). C.Gil-Sanz detém um Ramón y Cajal Grant (RYC-2015-19058) do Ministério espanhol de Ciencia, Innovación y Universidades (MICINN). Este Trabalho foi financiado RYC-2015-19058 e SAF2017-82880-R (MICINN).

Materials

Ampicillin sodium salt Sigma-Aldrich A9518-25G
Aspirator tube Sigma-Aldrich A5177-5EA
Baby-mixter hemostat (perfusion) Fine Science Tools (FST) 13013-14
Borosilicate glass capillary WPI 1B100-6
Buprenorphine (BUPREX 0,3 mg/ml) Rb Pharmaceuticals Limited 921425
CAG-BFP plasmid Kindly provided by U.Müller Lab
CAG-EGFP plasmid Kindly provided by U.Müller Lab
CAG-mCherry plasmid Kindly provided by U.Müller Lab
CAG-mtdTomato-2A-nGFP plasmid Kindly provided by U.Müller Lab
Confocal microscope Olympus FV10i
Cotton Swabs BFHCVDF
Cyanoacrylate glue B. Braun Surgical 1050044
Dissecting scope Zeiss stemi 305
Dumont Forceps #5 Fine Forceps Fine Science Tools (FST) 11254-20
ECM830 Square Wave Electroporator BTX 45-0052
Electric Razor Oster 76998
Endotoxin-free TE buffer QIAGEN 1018499
Ethanol wipes BFHCVDF
Extra Fine Graefe Forceps Fine Science Tools (FST) 11150-10
Eye ointment Alcon 682542.6
Fast Green dye Sigma-Aldrich F7252-5G
Fine Scissors Fine Science Tools (FST) 14069-09
Fluorescence LEDs CoolLED pE-300-W
Genopure Plasmid Maxi Kit Roche 3143422001
Halsted-Mosquito Hemostats (suture) Fine Science Tools (FST) 91308-12
Heating Pad UFESA AL5514
Inverted epifluorescence microscope Nikon Eclipse TE2000-S
Iodine wipes Lorsoul
Isofluorane vaporizer Flow-Meter A15B5001
Isoflurane Karizoo 586259
Ketamine (Anastemine) Fatro Ibérica SL 583889-2
Kimtech precision wipes Kimberly-Clark 7252
LB (Lennox) Agar GEN Labkem AGLB-00P-500
LB (Lennox) broth GEN Labkem LBBR-00P-500
Low-melting point agarose Fisher Scientific BP165-25
Medetomidine (Sedator) Dechra 573749.2
Microscope coverslips Menel-Gläser 15747592
Microscope Slides Labbox SLIB-F10-050
Mounting medium Electron Microscopy Sciences 17984-25
Mutiwell plates (24) SPL Life Sciences 32024
Mutiwell plates (48) SPL Life Sciences 32048
NaCl (for saline solution) Fisher Scientific 10112640
Needle 25 G (BD Microlance 3) Becton, Dickinson and Company 300600
Orbital incubator S150 Stuart Scientific 5133
P Selecta Incubator J. P. Selecta, s.a. 0485472
Paraformaldehyde PanReac AppliedChem A3813
Penicillin-Streptomycin Sigma -Aldrich P4333
Peristaltic perfusion pump Cole-Parmer EW-07522-30
Platinum Tweezertrode, 5 mm Diameter Btx 45-0489
Reflex Skin Closure System – 7mm Clips, box of 100 AgnThos 203-1000
Reflex Skin Closure System – Clip Applyer, 7mm AgnThos 204-1000
Ring Forceps Fine Science Tools (FST) 11103-09
Sodium azide PanReac AppliedChem 122712-1608
Surgical absorbent pad (steryle) HK Surgical PD-M
Suture (Surgicryl PGA 6-0) SMI Suture Materials BYD11071512
Syringe 1ml (BD plastipak) Becton, Dickinson and Company 303172
Tissue Culture Dish 100 x 20 mm Falcon 353003
Vertical Micropipette Puller Sutter Instrument Co P-30
Vertical microscope Nikon Eclipse Ni
Vibratome Leica VT1200S

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Mateos-White, I., Fabra-Beser, J., de Agustín-Durán, D., Gil-Sanz, C. Double In Utero Electroporation to Target Temporally and Spatially Separated Cell Populations. J. Vis. Exp. (160), e61046, doi:10.3791/61046 (2020).

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