Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

توليد سريع وسلس من فيروسات الجدري المؤتلفة باستخدام نطاق المضيف والاختيار البصري

Published: May 24, 2020 doi: 10.3791/61049
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1
1Department of Medial Microbiology and Immunology, School of Medicine, University of California Davis, 2Department of Microbiology and Immunology, University of Texas Medical Branch at Galveston
* These authors contributed equally

Summary

هذا هو وسيلة لتوليد "ندبة" فيروسات vaccinia المؤتلفة باستخدام اختيار مجموعة المضيف وتحديد البصرية للفيروسات المؤتلفة.

Abstract

كان لفيروس فاشينيا (VACV) دور ًا أساسيًا في القضاء على فيروس الدوالي (VARV)، وهو العامل المسبب للجدري، من الطبيعة. ومنذ استخدامه لأول مرة كلقاح، تم تطوير فيروس نقص المناعة البشرية المضاد للفيروسات السّافية كناقل للقاحات العلاجية وباعتباره فيروساً أوانيلاتيكياً. تستفيد هذه التطبيقات من الجينوم VACV الذي يتم التلاعب به بسهولة ومجموعة المضيف الواسعة كمنصة متميزة لتوليد فيروسات مؤتلفة مع مجموعة متنوعة من التطبيقات العلاجية. وقد وضعت عدة أساليب لتوليد VACV المؤتلف، بما في ذلك أساليب اختيار علامة واختيار المهيمنة العابرة. هنا ، نقدم تحسين ًا لطريقة اختيار مجموعة المضيف إلى جانب التعرف البصري للفيروسات المؤتلفة. لدينا طريقة يستفيد من الضغط الانتقائي التي تولدها المضيف ة مضادة للفيروسات بروتين كيناس R (PKR) إلى جانب جين الانصهار الفلورسنت التعبير عن MCherry الموسومة E3L، واحدة من اثنين من الخصوم PKR VACV. ويحيط الكاسيت، بما في ذلك الجين من الفائدة والانصهار mCherry-E3L من قبل تسلسل المستمدة من الجينوم VACV. بين الجين من الفائدة وmCherry-E3L هي منطقة أصغر التي هي مطابقة لأول ~ 150 النيوكليوتيدات من الذراع 3'، لتعزيز إعادة التركيب المتجانسة وفقدان الجين mCherry-E3L بعد الاختيار. نحن نثبت أن هذه الطريقة تسمح بكفاءة، وتوليد سلس من rVACV في مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا دون الحاجة إلى اختيار المخدرات أو فحص واسع النطاق للفيروسات المتحولة.

Introduction

كان لفيروس فاشينيا (VACV) دورًا أساسيًا في أول عملية ناجحة للقضاء على أحد مسببات الأمراض البشرية، وهو فيروس الدوالي (VARV)، من الطبيعة. منذ إبادة فيروس الدوالي ، لا تزال فيروسات الجدري بما في ذلك VACV مفيدة للفيروسات العلاجية لكل من الطب البشري والحيواني. على سبيل المثال، كان لقاح فيروس داء الكلب القائم على VACV فعالاً جداً في منع انتقال داء الكلب السيلفاتي في أوروبا1 والولايات المتحدة2. في الآونة الأخيرة، شهدت فيروسات الجدري المؤتلفة التي تعبر عن مجموعة متنوعة من الجزيئات المضادة للورم (على سبيل المثال، الأجسام المضادة ذات السلسلة الواحدة أو الإريثروبويتين البشري) نجاحًا مشجعًا كعوامل oncolytic3,4,5. VACV جذابة بشكل خاص كناقل لأنها قابلة بسهولة للتلاعب الجيني ، وتمتلك مجموعة مضيفة واسعة ، ومستقرة في ظل مجموعة متنوعة من الظروف ، مما يسمح بسهولة النقل وقابلية اللقاح في المجال6،7. وفي حين تم تطوير تقنيات متعددة لتوليد الـ VACV المؤتلف ة للتجارب المختبرية وتوليد اللقاحات، فإن الاستراتيجيات الحالية لتوليد هذه الفيروسات لها قيود ملحوظة.

وبسبب فائدة VACV، تم وضع استراتيجيات متعددة لتوليد فيروسات مؤتلفة. تستخدم الاستراتيجية الأولى إعادة التركيب المتجانسة لإدخال كاسيت بما في ذلك الجين المتحول وجين علامة يمكن اختياره مثل جين مقاومة المضادات الحيوية. ويحيط الكاسيت من قبل اثنين ~ 500 النيوكليوتيدات (NT) أو أكبر الأسلحة توجيه الجين إلى موقع معين في الجينوم الفيروسي، والتي يتم دمجها بعد ذلك بشكل ثابت من قبل أحداث كروس مزدوجة8,9,10. وهذه الاستراتيجية سريعة وفعالة؛ ومع ذلك ، فإنه يؤدي إلى مواد وراثية إضافية في شكل جين علامة التي قد تنتج آثار غير متوقعة. وعلاوة على ذلك، هناك حد أعلى عملي لعدد الجينات التي يمكن إدخالها محدودة بعدد علامات فريدة من نوعها قابلة للاختيار المتاحة. وقد عالجت استراتيجيات الاختيار المهيمنالعابر (TDS) هذه المسألة عن طريق تيسير توليد الفيروسات المؤتلفة "الندبية"11. باستخدام هذه الاستراتيجية، يتم دمج البلازميد الذي يحتوي على جين VACV متحول وجين علامة قابل للاختيار في الجينوم الفيروسي، ولكن دون وجود حمض نووي إضافي VACV. وينتج عن هذا النهج التكامل العابر للبلازميد بأكمله وازدواجية الجين VACV نتيجة للتكامل من خلال حدث كروس واحد. هذا الوسيط مستقر طالما يتم الحفاظ عليه تحت ضغط الاختيار ، مما يسمح بإثراء هذا البناء. عند إزالة التحديد، يتيح تكرار VACV حدث تقاطع ثانٍ يؤدي إلى إزالة البلازميد والتشكيل اللاحق للنوع البري (wt) أو الفيروس المؤتلف بنسبة 50:50 تقريبًا. في حين أن TDS يولد الفيروسات المؤتلفة دون الحاجة إلى إدخال مستقر من الحمض النووي الأجنبي، يجب فحص استنساخ الفيروسات متعددة للطفرة المتوقعة عن طريق تحليل التسلسل، وهي خطوة يحتمل أن تستغرق وقتا طويلا ومكلفة.

هنا، نقدم نهجا لتوليد فيروسات الجدري المؤتلفة الجمع بين أفضل جوانب كل من هذه النهج، على غرار النهج الذي تم وصفه لتكرار vaccinia تعديل غير كفء أنقرة12،13،14. تجمع هذه الاستراتيجية بين اختيار النطاق البصري والمضيف لتوليد الفيروسات المؤتلفة بسرعة عن طريق أحداث كروس مزدوجة ، والقضاء بعد ذلك على جين علامة قابلة للاختيار عن طريق إعادة التركيب المتجانسة. يسمح هذا النهج بتوليد سريع من المتحولات بوساطة إعادة التركيب المتجانسة ، مع الطبيعة "الندبية" لنهج TDS ، في حين لا تتطلب خطوة فحص لاحقة للتمييز بين النوع البري والفيروسات المتحولة. تستخدم طريقتنا أيضًا اختيار نطاق المضيف بدلاً من اختيار المضادات الحيوية ، مما يقضي على خطر التغيرات الفينوتيبيك المستحثة كيميائيًا في خط الخلية. لهذا النهج، اخترنا استخدام البروتين المضاد للفيروسات المضيف كيناز R (PKR) كعامل انتقائي لتوليد VACV المؤتلف. يتم التعبير عن PKR كمومر غير نشط في معظم أنواع الخلايا15. على ربط الحمض النووي الريبي مزدوجة تقطعت بهم السبل (dsRNA) في المجالات N-المحطة الطرفية dsRNA ملزمة، PKR dimerizes وautophosphorylated16. هذا الشكل النشط من الفوسفور PKR القوائم وحدة فرعية ألفا من عامل بدء eukaryotic 2 (eIF2), في نهاية المطاف تثبيط تسليم البادئ ميثيونيل-رنا إلى الريبوسوم, وبالتالي منع الترجمة داخل الخلايا وتمنع على نطاق واسع تكرار العديد من عائلات الفيروسات17,,18.

واستجابة للنشاط المضاد للفيروسات الواسع والقوي لـ PKR، طورت العديد من الفيروسات استراتيجية واحدة على الأقل لمنع تنشيط PKR. معظم الفيروسات الجدري التعبير عن اثنين من الخصوم PKR, مشفرة من قبل الجينات E3L و K3L في VACV, التي العداء PKR من خلال آليتين متميزتين19. E3 يمنع PKR homodimerization عن طريق ربط مزدوجة تقطعت بهم السبل RNA20,21, في حين K3 بمثابة مثبط pseudosubstrate عن طريق ملزمة مباشرة إلى PKR تنشيط وبالتالي تثبيط التفاعل مع الركيزة eIF2α22. والأهم من ذلك، أن هذين الخصمين PKR لا تمنع بالضرورة PKR من جميع الأنواع. على سبيل المثال، المتجانس K3 من فيروس جدري الغنم منعت بقوة PKR من الأغنام، في حين أن الجدري E3 homolog لم تظهر كبيرة PKR تثبيط23،24. في هذه الدراسة، نقدم طريقة لاستخدام الضغط الانتقائي بوساطة PKR جنبا إلى جنب مع اختيار الفلورسينس لتوليد المؤتلف VACV حذف لE3L و K3L (VC-R4)، والتي لا يمكن تكرارها في الخلايا المختصة PKR المستمدة من أنواع متنوعة. هذا الفيروس المؤتلف يوفر خلفية ممتازة للجيل السريع من الفيروسات المؤتلفة التي تعبر عن الجينات تحت سيطرة المروج E3L الأصلي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. توليد متجه إعادة التركيب

  1. تصميم التمهيديات لتوليد كاسيت التحديد. تصميم كل amplicon الفردية مع تسلسل متداخلة مع amplicons المجاورة وناقلات لتسهيل الجمعية الأنزيمية isothermal من جزيئات الحمض النووي، وتسمى أيضا جمعية جيبسون، وذلك باستخدام أي من عدة أدوات التصميم التمهيدي على الانترنت.
    ملاحظة: يمكن أيضاً إكمال هذا البروتوكول باستخدام أساليب الاستنساخ التقليدية المستندة إلى الإندوكليس التقييد. في هذه الحالة، تصميم التمهيديات مع مواقع التقييد المناسبة بدلاً من تسلسل متداخلة.
  2. باستخدام التمهيديات المصممة في الخطوة 1.1، PCR تضخيم العناصر التالية بالترتيب من 5 'إلى 3'(الشكل 1):~ 500 النيوكليوتيدات من المنطقة الجينومية VACV 5' من E3L (5' الذراع)، EGFP أو جين الفائدة، ~ 150 النيوكليوتيدات من منطقة علم الجينوم VACV على الفور 3 ' من E3L (قصيرة 3' الذراع), الاصطناعية في وقت مبكر / أواخر مروج فيروس الجدري25,الجين الانصهار mCherry-E3L, و ~ 500 النيوكليوتيدات من المنطقة الجينومية VACV 3' من E3L بما في ذلك الذراع قصيرة 3 '(طويلة 3' الذراع).
    1. في أنبوب PCR، إضافة الكواشف بالترتيب التالي لكل amplicon: 17 ميكرولتر من المياه الحرة DNase، 1.2 ميكرولتر من كل التمهيدي (التركيز الأولي = 10 ميكرومتر، والتركيز النهائي = 0.5 ميكرومتر)، و5 ميكرولتر من عازل تفاعل تفاعل PCR 5x، وحمض نووي قالب (10 نانوغرام للأمبلات المضخمة من البلازميدات: EGFP و E/L المروج-mCherry-E3L كاسيت؛ 100 نانوغرام للampاميل المضخمة من الحمض النووي الجينومي الفيروسي: 5' و 3' الأسلحة)، و 0.5 ميكرولتر من الحمض النووي ضبط حجم المياه المضافة لحجم رد فعل نهائي قدره 50 ميكرولتر.
      ملاحظة: يجب تحديد تركيز الحمض النووي القالب تجريبيا، ولكن نبدأ عموما مع 10 نانوغرام / رد فعل.
    2. ضع الأنبوب (الأنابيب) في دراجة حرارية، وذاب الحمض النووي عند 98 درجة مئوية لمدة 30 سنة، ثم استخدم 25 جولة من بروتوكول PCR من ثلاث خطوات: 98 درجة مئوية لمدة 5 سنوات، و55 درجة مئوية لمدة 10 سنوات، و72 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة.
      ملاحظة: تحديد درجة حرارة الذوبان استنادًا إلى TM المقترحة من الشركة المصنعة لكل مجموعة التمهيدي. تحديد وقت التمديد المناسب استنادًا إلى طول كل أمبيريكون (دقيقة واحدة/كيلوبايت).
  3. تصور منتجات التضخيم على هلام أغاروز 1٪. أضف 10 ميكرولتر من كل منتج من منتجات الحمض النووي و2 ميكرولتر من مخزن التحميل المؤقت لكل بئر، واعمل بمعدل 8 V/cm لمدة ساعة واحدة.
  4. هلام تنقية كل amplicon باستخدام مجموعة استخراج هلام الحمض النووي وبروتوكول الشركة المصنعة. يلمع amplicons من العمود عن طريق إضافة 50 ميكرولتر من الماء الحر DNase والطرد المركزي على الفور.
  5. خطياً متجه الاستنساخ pUC19 باستخدام الهضم EcoRI endonuclease. إلى أنبوب، إضافة 1 ميكروغرام من pUC19، والمياه إلى حجم 17 ميكرولتر، 2 لتر من المخزن المؤقت التفاعل، و 1 μL (20 وحدة) من EcoRI. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    1. تصور منتجات التضخيم على هلام agarose 1 ٪ تشغيل في 8 V / cm لمدة 1 ساعة. استئصال الفرقة من هلام، وتنقية المنتج باستخدام مجموعة استخراج هلام الحمض النووي كما هو موضح في الخطوة 1.4.
  6. Ligate جميع من الأفراد، هلام الأمبير النقي ومتجه الخطية باستخدام مجموعة مزيج رئيسي.
    1. إلى أنبوب PCR، إضافة 0.2 pmol من pUC19 الخطية وكل amplicon (ذراع 5' ، EGFP ، ذراع قصيرة 3 ، E / L المروج - mCherry - E3L كاسيت ، 3'arm). أضف DNase الماء المجاني إلى حجم نهائي قدره 10 ميكرولتر ، ثم أضف 10 ميكرولتر من مزيج تجميع الحمض النووي الرئيسي. عينات الاحتضان في 50 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  7. تحويل الإشريكية القولونية المختصة كيميائيا مع 2 ميكرولتر من المنتج المجمعمن الخطوة 1.6 كما هو موضح سابقا26,27. لوحة 100 ميكرولتر من الخلايا المحولة على لوحات LB agarose التي تحتوي على 100 ميكروغرام / مل أمبيسيلين. احتضان لوحات بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
  8. اختيار مستعمرات معزولة جيدا ونقل المستعمرات الفردية إلى أنابيب تحتوي على مرق لوريا مع 100 ميكروغرام / مل الأمبيسيلين. احتضان الأنابيب بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في حين تهتز في 225 دورة في الدقيقة.
  9. عزل plasmids من الثقافة بين عشية وضحاها باستخدام مجموعة miniprep plasmid. تحقق من تركيز ونقاء الحمض النووي باستخدام مطياف. نسبة A260/A280 بين 1.8 و 2.0 مقبولة.
  10. إرسال plasmids لتسلسل Sanger لتحديد ما إذا كان منتج الاستنساخ المطلوب هو الصحيح. تخزين الحمض النووي في -20 درجة مئوية.

2. توليد الفيروس المؤتلف

  1. تصيب أحادية الخلايا المناسبة مع الفيروس إلى أن يتم إعادة دمجها في تعدد العدوى من 1.0 (وزارة الداخلية = 1.0) في لوحة 6 بئر. احتضان الخلايا المصابة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة ساعة واحدة. ثم يستنشق الوسط واستبدله بـ DMEM الطازج. احتضان الخلايا المصابة عند 37 درجة مئوية و 5% CO2.
    ملاحظة: لتكرار الفيروسات المختصة مثل فيروس vaccinia الذي يفتقر K3L22،خط خلية مثل خط الخلية الكلى الأرنب الأوروبي RK13 (ATCC #CCL-37) أو BSC-40 هو المناسب. ومع ذلك ، لتكرار الفيروسات نقص ، مثل الفيروس الموصوف في هذه الورقة التي تفتقر إلى كل من خصوم PKR E3L و K3L ، مطلوب خط خلية مكملة للتعبير عن هذين الجينين في الخلايا العابرة أو PKR بالضربة القاضية أو خروج المغلوب.
  2. نقل الخلايا المصابة بـ 500 نانوغرام من الناقل المتولدة والتحقق من صحتها في الخطوة 1.10 باستخدام كاشف الحلويات المتاحة تجارياً بعد بروتوكول الشركة المصنعة. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 48 ساعة.
    ملاحظة: إذا كان استخدام فيروس vaccinia تفتقر إلى كل من E3L و K3L، فإن الضغط الانتقائي بوساطة PKR دفع اختيار الفيروسات المؤتلفة والحفاظ على التعبير عن بروتين الانصهار mCherry-E3L في هذه الخلايا. إذا رغبت في ذلك ، ينبغي أيضا أن يكون من الممكن لPCR تضخيم فقط إدراج لاستخدامها في الترانزة بدلا من plasmid كله.
  3. 48 ساعة بعد العدوى، حصاد أحادية المصابة. في بعض الحالات ، يمكن حصاد الخلايا عن طريق الأنابيب ، ولكن إذا كانت لا تزال ملتزمة بإحكام ، فحصادها بكشط الخلايا. تجميد ذوبان الخلايا ثلاث مرات، ثم سونيكات يليس لمدة 15 s في 50٪ السعة. تخزين هذا حلي في -80 درجة مئوية حتى تكون جاهزة للاستخدام.
  4. بشكل متسلسل 10 أضعاف تمييع الزلة المحصّلة في الخطوة 2.3 من 10-1 إلى10-6 بإضافة 120 ميكرولتر من الليسيإلى 1080 ميكرولتر من DMEM (10-1)، ثم إضافة 120 ميكرولتر من هذا التخفيف إلى 1080 ميكرولتر من DMEM (10-2)، وتكرار هذه العملية أربع مرات أخرى.-1-2 إضافة 1 مل من كل تخفيف إلى بئر الفردية، ملتوية من خط الخلية المختصة PKR، في هذه الحالة خلايا RK13.
    1. احتضان الخلايا المصابة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة ساعة واحدة. ثم نستنشق المتوسطة واستبدالها بحاضنة DMEM الطازجة للخلايا المصابة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
  5. 24 إلى 48 ساعة بعد العدوى، وتحديد الفيروسات المؤتلفة عن طريق المجهر الفلوري. لويحات من الفيروسات المؤتلفة التعبير عن الفلورسينس الأحمر بسبب التكامل الجين الانصهار mCherry-E3L(الشكل 2). إذا تم استخدام فيروس خال من مثبطات PKR في البداية ، فإن جميع اللويحات ستحتوي على فيروس مؤتلف.
  6. البلاك تنقية الفيروسات المؤتلفة ثلاث مرات على خلايا RK13. بعد الجولة النهائية لتنقية البلاك ، يجب أن تعبر جميع اللويحات عن الفلورسينس الأحمر.
  7. تصيب لوحة 6 بئر من خلايا RK13 تعبر عن مثبطات VACV PKR E3L و K3L (خلايا RK13+E3L +K3L28)مع فيروس الفلورسcing الأحمر المنقاة من الخطوة 2.6. تهدف لحوالي 50-100 لويحات لكل بئر.
    ملاحظة: توفر هذه الخلايا الخصوم PKR VACV في trans وتخفيف الضغط الانتقائي PKR بوساطة للحفاظ على الجين الانصهار mCherry-E3L، وبالتالي تعزيز الجيل "الندب" من الفيروس المؤتلف.
  8. تحديد الفيروسات المنهارة بواسطة المجهر الفلوري باستخدام المجهر EVOS2، ومكعب مرشح GFP (الإثارة: 470/22، الانبعاثات: 525/50) ومكعب مرشح RFP (الإثارة: 531/40، الانبعاثات: 593/40).
    ملاحظة: التردد الذي يتم فيه فقدان جين الاندماج mCherry-E3L هو حوالي 2.5٪(الجدول 2). إذا لم يتم تضمين EGFP كجين علامة ، فإن لويحات الفيروسات المتحولة التي فقدت جين الاندماج mCherry-E3L ستكون عديمة اللون.
  9. تنقية البلاك الأخضر فقط (VC-R4) أو لويحات عديم اللون (E3L) ثلاث مرات على خلايا RK13+E3L+K3L. تأكد من عدم وجود لويحات حمراء فلورية.
  10. تأكد من فقدان mCherry-E3L ووجود الطفرة المتوقعة بواسطة تسلسل PCR وSanger.
    ملاحظة: إذا كان الجين أو طفرة الفائدة لا يحتوي على نشاط مثبط PKR، يجب أن تزرع الفيروسات المؤتلفة على خلايا RK13 +E3L+K3L أو ما يعادل PKR تثبيط أو PKR خط الخلية ناقص(الشكل 3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

استخدمنا الرسم التخطيطي الإجراء في الشكل 1 لتوليد VACV تفتقر إلى كل من الخصوم PKR E3L و K3L، عن طريق استبدال E3L مع EGFP في فيروس تم حذفه بالفعل لK3L (vP872). ويبين الشكل 2 اللويحات الفلورية الحمراء في خلايا RK13 الكفؤة PKR مما يدل على التعبير الفيروسي لmCherry-E3L، وكذلك EGFP أعرب عنها في خلايا RK13 +E3L +K3L مما يؤكد فقدان E3L وانهيار علامة الاختيار mCherry-E3L. الشكل 3 يؤكد أن هذا الفيروس المؤتلف، VC-R4، تفتقر إلى كل من الخصوم PKR لا يمكن تكرار في PKR الخلايا RK13 المختصة، في حين أن الفيروس الأم، vP872 التعبير عن E3L، هو النسخ المتماثل المختصة. للتأكد من أن هذا العجز عن النسخ المتماثل في خلايا RK13 كان فقط بسبب فقدان E3L ، استبدلنا EGFP في VC-R4 مع E3L ، لإنشاء فيروس إرجاع باستخدام نفس بروتوكول التحديد. الشكل 3 أيضاً التحقق من صحة هذا الفيروس returnant ينسخ بكفاءة كما vP872 في خلايا RK13. ومن المثير للاهتمام، تم تحديد لويحات عديم اللون بما يتفق مع انهيار علامة الاختيار mCherry-E3L قبل الاختيار في خلايا RK13+E3+K3 المطلوبة بشكل عام لتحديد المؤتلفات "الخالية من الندبة"، على الأرجح بسبب هوية التسلسل الموسع بين كاسيت إعادة التركيب mCherry-E3L وجين E3L الذي يتم إدراجه في VC-R4. لذلك، لتحديد كفاءة إعادة التركيب ومعدل الانهيار انتخبنا لإنتاج الفيروسات التي تعبر عن فيروس الجدري PKR خصم K3L لتجنب مشكلة الانهيار المبكر23. يشير الشكل 4 إلى ظهور لويحات عديمة اللون (رؤوس الأسهم) بعد إصابة خلايا RK13+E3L+K3L. ويبين الجدول 1 نتائج ثلاث تجارب مستقلة، حيث خضع 12.6 في المائة في المتوسط من virions ذرية إعادة تركيب مع البلازميد المنقولة، على غرار الترددات المبلغ عنها سابقا29،30،31. الجدول 2 تفاصيل تواتر اللويحات عديم اللون بالنسبة إلى مجموع اللويحات في خلايا RK13 + E3L + K3L ، مما يدل على معدل انهيار وفقدان علامة اختيار mCherry-E3L حدث على تردد حوالي 1.8 ٪.

Figure 1
الشكل 1: رسم بياني لـ p837-GOI-mCherry-E3L بالإضافة إلى استراتيجية إعادة التركيب المرئية والمضيفة. (A)5' الذراع (أسود) و 3 ' الذراع (رمادي) الجناح locus E3L (البني) في VACV. (ب)في p837-GOI-mCherry-E3L، هذه الأسلحة تحيط كاسيت يحتوي على جين الفائدة (GOI)، في هذه الحالة EGFP، (الأخضر) فصل من mCherry-E3L (الأحمر) الجينات الانصهار تحت السيطرة على الاصطناعية في وقت مبكر / أواخر المروّج فيروس الجدري25 الأزرق) من قبل ذراع قصيرة 3 '(رمادي). هذه الأسلحة الخارجية محرك تركيبة متجانسة بين VACV وp837-GOI-mCherry-E3L. تشير رؤوس الأسهم السوداء إلى مواقع الالتمهيديات المتداخلة المستخدمة لتوليد هذا البلازميد من قبل استنساخ جيبسون. (C)عندما تتم إزالة الضغط الانتقائي PKR، يمكن اختيار الفيروسات التي خضعت لإعادة التركيب داخل الجزيئية بين الأسلحة 3 قصيرة وطويلة. (D)ينتج عنه فيروس (VC-R4) يحتوي فقط على جين الفائدة في وضع E3L. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: ميكروغرافيات فلورية من (أعلى) لوحة فيروس المؤتلف بعد 24 ساعة من إعادة الجمع مع p837-GOI-mCherry-E3L التعبير عن كل من mCherry (يسار) وEGFP (يمين) في خلايا RK13. (أسفل) تم إزالة الميكروجراف للوحة فيروس مؤتلف بعد 48 ساعة من الضغط الانتقائي بوساطة PKR في خلايا RK13++ ، معبرًا عن EGFP (يمين) ولكن ليس mCherry (يسار). يشير شريط المقياس إلى 650 ميكرومتر لجميع الألواح. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: VC-R4 لا يمكن تكرار في الخلايا المختصة PKR. تم إصابة خطوط الخلايا المشار إليها بـ vP872 (الأزرق) أو VC-R4 (أخضر) أو VC-R4+ E3L (أرجواني) في وزارة الداخلية = 0.1. 48 ساعة بعد العدوى تم حصاد الخلايا المصابة وtitered عن طريق التخفيف التسلسلي على خلايا RK13 + E3L + K3L. يتم الإبلاغ عن Titers في PFU/mL، تمثل أشرطة الأخطاء الانحراف المعياري لثلاث تجارب تكرار. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: فقدان التعبير mCherry-E3L في خلايا RK13+E3L+K3L. تراكب الفلورسنت والمرحلة التباين micrographs من VC-R4 +K3L-mCherry-E3L المصابة RK13 +E3L +K3L الخلايا. ثلاث لويحات لم تعد تعبر عن mCherry (دوائر) بسبب انهيار كاسيت الاختيار مما يؤدي إلى VC-R4 + K3L. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

التجربة الأولى التجربة الثانية التجربة الثالثة
لويحات حمراء (RK13) 30 11 18
مجموع اللويحات (RK13 +E3L +K3L) 225 64 249
معدل إعادة التركيب 13.30% 17.20% 7.20%

الجدول 1: إعادة تركيب تردد VACV مع p837-K3L-mCherry-E3L plasmid.

التجربة الأولى التجربة الثانية التجربة الثالثة
مجموع اللويحات (RK13 +E3L +K3L) 115 44 210
لويحات عديمة اللون (RK13+E3L+K3L) 3 1 1
معدل إعادة التركيب 2.60% 2.30% 0.50%

الجدول 2: تواتر فقدان mCherry-E3L من خلايا VC-R4+K3L-mCherry-E3L في خلايا RK13+E3+K3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هنا نقدم الاختلاف من استراتيجية اختيار علامة عابرة 32 لتوليد فيروسات vaccinia المؤتلفدون دون الاحتفاظ الحمض النووي الأجنبي في الفيروس المؤتلف النهائي. تستخدم استراتيجيتنا ضغطًا انتقائيًا بوساطة البروتين المضاد للفيروسات النباتية المضيف PKR بدلاً من أشكال أخرى من الضغط الانتقائي مثل المضادات الحيوية. استخدام الجينات المضادة للفيروسات المضيفة يلغي إمكانية التغيرات الفينوتيبيك الناجمة كيميائيا في الخلايا، أو زيادة خطر الطفرة بسبب أدوية الاختيار. وعلاوة على ذلك، على عكس اختيار المخدرات، لا توجد مرحلة تأخر لنهجنا، لأن PKR يتم التعبير عنها بشكل تأسيسي في جميع الخلايا. الاختيار البصري الثانوي القائم على التعبير mCherry يحسن أيضا خصوصية هذه الطريقة من خلال ضمان أن يتم اختيار اللوحات التي تعبر عن transgene فقط خلال المرحلة الأولى، وكفاءة على قدم المساواة كعلامة انتقائية سلبية أثناء اختيار الفيروسات المؤتلفة الناضجة التي فقدت الجين mCherry-E3L.

الخطوات الأكثر أهمية لهذه الاستراتيجية إعادة التركيب هي توليد ناقلات إعادة التركيب المناسبة، وتنقية البلاك المناسبة لضمان أن الفيروس المحدد هو clonal. في هذه الورقة نقترح "تجمع جيبسون" لتوليد متجه إعادة التركيب. هذه الاستراتيجية فعالة للغاية وتسمح بتجميع جميع الأجزاء التي تتألف من متجه إعادة التركيب في يوم واحد. ومع ذلك ، لأن الذراع 3 قصيرة 'وطويلة 3 ' ذراع حصة متواليات متطابقة ، وهذه الشظايا لديها القدرة على أن تكون مجتمعة خلال رد فعل الاستنساخ ، وبعض ناقلات قد لا تحتوي على كاسيت mCherry -E3L. في تجربتنا هذا أمر نادر الحدوث ولكن تأكيد بنية الناقل بعد الاستنساخ ضروري. كما قمنا بتوليد ناقلات إعادة التركيب لهذه الاستراتيجية باستخدام الأساليب التقليدية للendonuclease وligase. هذه الاستراتيجية تتجنب المشكلة المذكورة أعلاه ولكن يمكن أن تكون أكثر كثافة في العمالة. تنقية البلاك واضحة بشكل عام وتعتمد في المقام الأول على استخدام الخلايا المتساهلة المناسبة لإعادة التركيب الأولية ، والخلايا الكفؤة PKR لتنقية البلاك الأولي لضمان أن الفيروسات المؤتلفة فقط يمكن تكرارها ، ثم الخلايا المتساهلة مرة أخرى لتسهيل إعادة التركيب داخل الجزيئية وفقدان العلامة القابلة للتحديد. ولذلك فإن الاهتمام الوثيق بخطوط الخلايا أمر بالغ الأهمية للتطبيق الناجح والفعال لهذه الاستراتيجية.

في هذه الدراسة، ونحن نظهر استخدام هذه الطريقة لتوليد VACV المؤتلف حذف لكل من خصوم PKR E3L و K3L والتعبير عن EGFP تحت سيطرة المروج E3L. وللمضي قدما، سيكون هذا الفيروس بمثابة خلفية فعالة للفيروسات المؤتلفة في المستقبل، لأنه غير قادر على التكرار في الخلايا المختصة PKR. لذلك ، سيكون هناك ضغط انتقائي قوي بوساطة PKR لدفع كاسيت إعادة تركيب mCherry-E3L إلى virions ذرية وفي الوقت نفسه منع تكرار الفيروس غير المؤتلف بشكل أساسي. وعلاوة على ذلك، فإن فقدان EGFP عن طريق استيعاب كاسيت إعادة التركيب هو علامة اختيار ثانوية مفيدة لضمان عدم إصابة اللويحات المختارة بفيروس غير مؤتلف. لاحظنا معدلات إعادة التركيب بما يتفق مع معدلات الإبلاغ عنها سابقا ً لـ VACV ، ولكن علامات الفلورسنت البصرية تزيد من كفاءة توليد الفيروسات المؤتلفة من خلال ضمان زيادة احتمال اختيار الفيروسات المؤتلفة المناسبة. ملاحظتنا لويحات عديم اللون بعد جولتين من الاختيار على الخلايا الكفاءة PKR، ويفترض أن يرجع ذلك إلى زيادة طول تسلسل متطابقة بين E3L والجينات علامة MCherry-E3L، تشير إلى أن معدل فقدان mCherry-E3L قد يكون "ضبطها" عن طريق زيادة أو تقليل طول الذراع القصيرة 3'. القيد الأساسي لهذه التقنية هو استخدام PKR كضغط انتقائي للمؤتلفات. الاستخدام الأكثر كفاءة من هذه الاستراتيجية إعادة التركيب هو توليد هذه الفيروسات في خلفية تفتقر إلى خصوم PKR. ومع ذلك ، فإن علامة اختيار الألوان تسمح باستخدام استراتيجية إعادة التركيب هذه حتى بدون الاختيار بوساطة PKR ، ببساطة عن طريق تنقية اللويحات التي تعبر عن mCherry. في حين أن عدم وجود ضغط انتقائي بوساطة PKR سيقلل من كفاءة خطوة الفحص الأولى ، فإن النسبة المئوية لللويحات المعبرة عن mCherry لا تزال عالية بما يكفي بحيث يكون الاختيار القائم على الألوان قابلاً للتطبيق. وبالتالي ، يمكن استخدام هذه الطريقة لإدراج ما يقرب من أي جين في جينوم فيروس الجدري.

كما يتضح من إدراج EGFP ، مع هذا النهج ، يمكن إدخال أي جين بسرعة في وضع E3L تحت سيطرة المروج الأصلي ، شريطة أن يتم استخدام الخلايا الخالية PKR أو خطوط الخلايا المجاملة لتجارب المصب إذا لم يكن الترانجين خصمًا PKR. هذه الاستراتيجية، جنبا إلى جنب مع فيروس VC-R4 التي نبلغ عنها هنا، ويضيف طريقة جديدة وقوية لتوليد بسرعة وموثوقية فيروسات vaccinia المؤتلفة باستخدام الضغط الانتقائي بوساطة المضيف وتحديد البصرية من المؤتلفات في وقت مبكر من هذه العملية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ولا يعلن صاحبا البلاغ عن مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgments

تم تمويل هذا المشروع من قبل المعاهد الوطنية للصحة (AI114851) إلى ريال سعودي.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2X-Q5 Master Mix NEB M0492L High-fidelity polymerase used in PCR
Ampicillin ThermoFisher Scientific 11593027 Bacterial selective agent
Disposable Cell Scrapers ThermoFisher Scientific 08-100-242 Cell scraper to harvest infected cells
EVOS FL Auto 2 Cell imaging system ThermoFisher Scientific AMAFD2000 Fluorescent microscope
EVOS Light Cube, GFP ThermoFisher AMEP4651 GFP Cube
EVOS Light Cube, RFP ThermoFisher AMEP4652 RFP Cube
GenJet SignaGen Laboratories SL100489 Transfection reagent
Luria Bertani (LB) Broth Gibco 10855021 Bacterial growth medium
Monarch DNA gel extraction kit NEB T1020L Gel purification kit used to purify amplicons and linearized vectors
Monarch Plasmid Miniprep kit NEB T1010L Miniprep kit ussed to purify plasmids
NanoDrop One ThermoFisher Scientific ND-ONE-W Spectrophotometer used to measure RNA and DNA concentration
NEBuilder Master Mix NEB E2621L Isothermal enzymatic assembly kit used to generate the recombination vector
Q500 Sonicator Qsonica Q500-110 Sonicator for virus lysates
RK13 cells ATCC CCL-37 Rabbit kidney cells
VWR Multiwell Cell Culture plates VWR 10062-892 Cell culture plates

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brochier, B., et al. Large-scale eradication of rabies using recombinant vaccinia-rabies vaccine. Nature. 354 (6354), 520-522 (1991).
  2. Pastoret, P. P., Brochier, B. The development and use of a vaccinia-rabies recombinant oral vaccine for the control of wildlife rabies; a link between Jenner and Pasteur. Epidemiology and Infection. 116 (3), 235-240 (1996).
  3. Chan, W. M., McFadden, G. Oncolytic Poxviruses. Annual review of virology. 1 (1), 119-141 (2014).
  4. Nguyen, D. H., et al. Vaccinia virus-mediated expression of human erythropoietin in tumors enhances virotherapy and alleviates cancer-related anemia in mice. Molecular Therapy. 21 (11), 2054-2062 (2013).
  5. Frentzen, A., et al. Anti-VEGF single-chain antibody GLAF-1 encoded by oncolytic vaccinia virus significantly enhances antitumor therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12915-12920 (2009).
  6. Pastoret, P. P., Vanderplasschen, A. Poxviruses as vaccine vectors. Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. 26 (5-6), 343-355 (2003).
  7. COLLIER, L. H. The development of a stable smallpox vaccine. The Journal of Hygiene. 53 (1), 76-101 (1955).
  8. Weir, J. P., Bajszár, G., Moss, B. Mapping of the vaccinia virus thymidine kinase gene by marker rescue and by cell-free translation of selected mRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (4), 1210-1214 (1982).
  9. Mackett, M., Smith, G. L., Moss, B. Vaccinia virus: a selectable eukaryotic cloning and expression vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (23), 7415-7419 (1982).
  10. Nakano, E., Panicali, D., Paoletti, E. Molecular genetics of vaccinia virus: demonstration of marker rescue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (5), 1593-1596 (1982).
  11. Falkner, F. G., Moss, B. Transient dominant selection of recombinant vaccinia viruses. Journal of Virology. 64 (6), 3108-3111 (1990).
  12. Staib, C., Drexler, I., Ohlmann, M., Wintersperger, S., Erfle, V., Sutter, G. Transient Host Range Selection for Genetic Engineering of Modified Vaccinia Virus Ankara. BioTechniques. 28 (6), 1137-1148 (2000).
  13. Staib, C., Drexler, I., Sutter, G. Construction and Isolation of Recombinant MVA. Vaccinia Virus and Poxvirology. , 77-99 (2004).
  14. Di Lullo, G., et al. Marker gene swapping facilitates recombinant Modified Vaccinia Virus Ankara production by host-range selection. Journal of Virological Methods. 156 (1-2), 37-43 (2009).
  15. Pfaller, C. K., Li, Z., George, C. X., Samuel, C. E. Protein kinase PKR and RNA adenosine deaminase ADAR1: New roles for old players as modulators of the interferon response. Current Opinion in Immunology. 23 (5), 573-582 (2011).
  16. Bevilacqua, P. C., George, C. X., Samuel, C. E., Cech, T. R. Binding of the protein kinase PKR to RNAs with secondary structure defects: Role of the tandem A - G mismatch and noncontigous helixes. Biochemistry. 37 (18), 6303-6316 (1998).
  17. Krishnamoorthy, T., Pavitt, G. D., Zhang, F., Dever, T. E., Hinnebusch, A. G. Tight Binding of the Phosphorylated Subunit of Initiation Factor 2 (eIF2) to the Regulatory Subunits of Guanine Nucleotide Exchange Factor eIF2B Is Required for Inhibition of Translation Initiation. Molecular and Cellular Biology. 21 (15), 5018-5030 (2001).
  18. Rothenburg, S., Georgiadis, M. M., Wek, R. C. Evolution of eIF2α kinases: Adapting translational control to diverse stresses. Evolution of the Protein Synthesis Machinery and Its Regulation. , 235-260 (2016).
  19. Bratke, K. A., McLysaght, A., Rothenburg, S. A survey of host range genes in poxvirus genomes. Infection, Genetics and Evolution. 14, 406-425 (2013).
  20. Chang, H. W., Watson, J. C., Jacobs, B. L. The E3L gene of vaccinia virus encodes an inhibitor of the interferon-induced, double-stranded RNA-dependent protein kinase. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (11), 4825-4829 (1992).
  21. Romano, P. R., et al. Inhibition of double-stranded RNA-dependent protein kinase PKR by vaccinia virus E3: role of complex formation and the E3 N-terminal domain. Molecular and Cellular Biology. 18 (12), 7304-7316 (1998).
  22. Beattie, E., Tartaglia, J., Paoletti, E. Vaccinia virus-encoded eIF-2 alpha homolog abrogates the antiviral effect of interferon. Virology. 183 (1), 419-422 (1991).
  23. Park, C., Peng, C., Brennan, G., Rothenburg, S. Species-specific inhibition of antiviral protein kinase R by capripoxviruses and vaccinia virus. Annals of the New York Academy of Sciences. 1438 (1), 18-29 (2019).
  24. Rothenburg, S., Brennan, G. Species-Specific Host-Virus Interactions: Implications for Viral Host Range and Virulence. Trends in Microbiology. , (2019).
  25. Chakrabarti, S., Sisler, J. R., Moss, B. Compact, synthetic, vaccinia virus early/late promoter for protein expression. BioTechniques. 23 (6), 1094-1097 (1997).
  26. Chung, C. T., Niemela, S. L., Miller, R. H. One-step preparation of competent Escherichia coli: Transformation and storage of bacterial cells in the same solution (recombinant DNA). Biochemistry. 86, 2172-2175 (1989).
  27. Chung, C. T., Miller, R. H. Preparation and storage of competent Escherichia coli cells. Methods in Enzymology. 218, 621-627 (1993).
  28. Rahman, M. M., Liu, J., Chan, W. M., Rothenburg, S., McFadden, G. Myxoma Virus Protein M029 Is a Dual Function Immunomodulator that Inhibits PKR and Also Conscripts RHA/DHX9 to Promote Expanded Host Tropism and Viral Replication. PLOS Pathogens. 9 (7), 1003465 (2013).
  29. Evans, D. H., Stuart, D., McFadden, G. High levels of genetic recombination among cotransfected plasmid DNAs in poxvirus-infected mammalian cells. Journal of Virology. 62 (2), 367-375 (1988).
  30. Ball, L. A. High-frequency homologous recombination in vaccinia virus DNA. Journal of Virology. 61 (6), 1788-1795 (1987).
  31. Spyropoulos, D. D., Roberts, B. E., Panicali, D. L., Cohen, L. K. Delineation of the viral products of recombination in vaccinia virus-infected cells. Journal of Virology. 62 (3), 1046-1054 (1988).
  32. Liu, L., et al. Transient dominant host-range selection using Chinese hamster ovary cells to generate marker-free recombinant viral vectors from vaccinia virus. BioTechniques. 62 (4), 183-187 (2017).

Tags

علم المناعة والعدوى، العدد 159، فيروس فاشينيا، إعادة التركيب، فيروس الجدري، مجموعة المضيف، بروتين كيناز R، E3L-mCherry
توليد سريع وسلس من فيروسات الجدري المؤتلفة باستخدام نطاق المضيف والاختيار البصري
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vipat, S., Brennan, G., Park, C.,… More

Vipat, S., Brennan, G., Park, C., Haller, S. L., Rothenburg, S. Rapid, Seamless Generation of Recombinant Poxviruses using Host Range and Visual Selection. J. Vis. Exp. (159), e61049, doi:10.3791/61049 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter