Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Rask, sømløs generering av rekombinante poxvirus ved hjelp av vertsområde og visuelt utvalg

Published: May 24, 2020 doi: 10.3791/61049
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1
1Department of Medial Microbiology and Immunology, School of Medicine, University of California Davis, 2Department of Microbiology and Immunology, University of Texas Medical Branch at Galveston
* These authors contributed equally

Summary

Dette er en metode for å generere "arrløse" rekombinant vaccinia virus ved hjelp av vertsområde valg og visuell identifikasjon av rekombinant virus.

Abstract

Vaccinia virus (VACV) var medvirkende til å utrydde variola virus (VARV), årsaksmiddel av kopper, fra naturen. Siden første gangs bruk som vaksine har VACV blitt utviklet som vektor for terapeutiske vaksiner og som et onkolytisk virus. Disse programmene drar nytte av VACVs lett manipulerte genom og brede vertsområde som en enestående plattform for å generere rekombinantvirus med en rekke terapeutiske applikasjoner. Flere metoder er utviklet for å generere rekombinant VACV, inkludert markørvalgmetoder og forbigående dominerende utvalg. Her presenterer vi en forbedring av en vertsområdevalgmetode kombinert med visuell identifisering av rekombinantvirus. Vår metode utnytter selektivt trykk generert av verten antiviral protein kinase R (PKR) kombinert med en fluorescerende fusjon gen uttrykker mCherry-merket E3L, en av to VACV PKR antagonister. Kassetten, inkludert genet av interesse og mCherry-E3L fusjon er flankert av sekvenser avledet fra VACV genom. Mellom genet av interesse og mCherry-E3L er en mindre region som er identisk med de første ~ 150 nukleotider av 3 'arm, for å fremme homolog rekombinasjon og tap av mCherry-E3L genet etter valg. Vi viser at denne metoden tillater effektiv, sømløs generering av rVACV i en rekke celletyper uten å kreve legemiddelvalg eller omfattende screening for muterte virus.

Introduction

Vaccinia virus (VACV) var medvirkende for den første vellykkede utryddelse av et humant patogen, variola virus (VARV), fra naturen. Helt siden utryddelsen av variolavirus har poxvirus inkludert VACV fortsatt å være nyttige terapeutiske virus for både menneskelig og animalsk medisin. For eksempel har en VACV-basert rabiesvirusvaksine vært svært effektiv i å forhindre overføring av sylvatiske rabies i Europa1 og USA2. Mer nylig, rekombinant poxviruses uttrykker en rekke anti-tumor molekyler (f.eks en-kjede antistoffer eller menneskelig erytropoietin) har sett oppmuntrende suksess som onkolytiske midler3,4,5. VACV er spesielt attraktiv som vektor fordi det er lett mottagelig for genetisk manipulasjon, har et bredt vertsområde, og det er stabilt under en rekke forhold, slik at enkel transport og vaksine levedyktighet i feltet6,7. Mens flere teknikker er utviklet for å generere rekombinant VACV for laboratorieeksperimenter og vaksinegenerering, har dagens strategier for å generere disse virusene bemerkelsesverdige begrensninger.

På grunn av nytten av VACV, flere strategier for å generere rekombinant virus har blitt utviklet. Den første strategien benytter homolog rekombinasjon for å introdusere en kassett, inkludert transgene og et valgbart markørgen som et antibiotikaresistensgen. Kassetten er flankert av to ~ 500 nukleotider (nt) eller større armer som dirigerer genet til et bestemt sted i det virale genomet, som deretter stabilt integrert av doble crossover hendelser8,9,10. Denne strategien er rask og effektiv; Det resulterer imidlertid i ekstra genetisk materiale i form av markørgenet som kan gi uventede effekter. Videre er det en praktisk øvre grense for antall transgener som kan innføres begrenset av antall unike valgbare markører tilgjengelig. Forbigående dominerende utvalg (TDS) strategier har adressert dette problemet ved å legge til rette for generering av "knappe" rekombinant virus11. Ved hjelp av denne strategien er en plasmid som inneholder et mutert VACV-gen og et valgbart markørgen integrert i det virale genomet, men uten ytterligere flankering av VACV DNA. Denne tilnærmingen resulterer i forbigående integrering av hele plasmid og duplisering av VACV genet som følge av integrering av en enkelt crossover hendelse. Dette mellomspillet er stabilt så lenge det opprettholdes under utvalgstrykk, noe som tillater berikelse av denne konstruksjonen. Når valget fjernes, muliggjør VACV duplisering en andre crossover-hendelse som resulterer i fjerning av plasmid og påfølgende dannelse av enten vill type (wt) eller rekombinant virus i et omtrentlig 50:50-forhold. Mens TDS genererer rekombinant virus uten å kreve stabil innføring av utenlandsk DNA, flere viruskloner må screenes for den forventede mutasjonen ved sekvensering analyse, en potensielt tidkrevende og kostbart skritt.

Her presenterer vi en tilnærming til å generere rekombinant poxvirus som kombinerer de beste aspektene ved hver av disse tilnærmingene, lik en tilnærming som er beskrevet for replikering inkompetentmodifisert vaccinia Ankara12,13,14. Denne strategien kombinerer visuelt og vertsutvalgsvalg for raskt å generere rekombinantvirus ved doble crossover-hendelser, og deretter eliminere det valgbare markørgenet ved homolog rekombinasjon. Denne tilnærmingen tillater den raske generasjonen mutanter mediert av homolog rekombinasjon, med den "knappe" naturen til TDS tilnærminger, samtidig som det ikke krever et påfølgende screeningtrinn for å skille vill type og mutant virus. Vår metode bruker også vertsområdevalg i stedet for antibiotikavalg, og eliminerer risikoen for kjemisk induserte fenotypiske endringer i cellelinjen. For denne tilnærmingen har vi valgt å bruke verten antiviral protein kinase R (PKR) som selektiv middel for å generere rekombinant VACV. PKR uttrykkes som en inaktiv monomer i de fleste celletyper15. Ved binding av dobbeltstrandede RNA (dsRNA) ved N-terminal dsRNA-bindende domener, dimmer PKR og er autofosforylert16. Denne aktive formen for PKR fosforlater alfa-underenheten av eukaryyotisk initieringsfaktor 2 (eIF2), til slutt hemme levering av initiator methionyl-tRNA til ribosom, og dermed hindre intracellulær oversettelse og bredt hemme replikering av mange virus familier17,18.

Som svar på den brede og potente antivirale aktiviteten til PKR, har mange virus utviklet seg minst én strategi for å forhindre PKR-aktivering. De fleste poxviruses uttrykke to PKR antagonister, kodet av E3L og K3L gener i VACV, som antagoniserer PKR gjennom to forskjellige mekanismer19. E3 forhindrer PKR homodimerization ved å binde dobbeltstrandede RNA20,21, mens K3 fungerer som pseudosubsstrathemmer ved å binde direkte til aktivert PKR og dermed hemme interaksjon med substratet eIF2α22. Viktigere, disse to PKR antagonister ikke nødvendigvis hemme PKR fra alle arter. For eksempel, K3 homolog fra sheeppox viruset sterkt hemmet PKR fra sauer, mens sheeppox E3 homolog viste ikke betydelig PKR hemming23,24. I denne studien presenterer vi en metode for å bruke PKR-mediert selektivt trykk kombinert med fluorescensvalg for å generere en VACV rekombinant slettet for E3L og K3L (VC-R4), som ikke kan replikere i PKR kompetente celler avledet fra ulike arter. Dette rekombinantviruset gir en utmerket bakgrunn for rask generering av rekombinantvirus som uttrykker gener under kontroll av den innfødte E3L-arrangøren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Generere rekombinasjonsvektoren

  1. Design primere for å generere utvalgskassetten. Design hver enkelt amplicon med overlappende sekvenser med nærliggende amplicons og vektoren for å lette isothermal enzymatisk montering av DNA molekyler, også kalt Gibson montering, ved hjelp av noen av flere online primer design verktøy.
    MERK: Denne protokollen kan også fullføres ved hjelp av tradisjonelle begrensningendonukleasebaserte kloningsmetoder. I så fall designprimerer med de riktige begrensningsstedene i stedet for med overlappende sekvenser.
  2. Ved hjelp av primere designet i trinn 1.1 forsterker PCR følgende elementer for fra 5' til 3'(Figur 1): ~ 500 nukleotider i VACV genomiske regionen 5' av E3L (5'-arm), EGFP eller genet av interesse, ~ 150 nukleotider fra VACV genomiske regionen umiddelbart 3 ' av E3L (kort 3 'arm), en syntetisk tidlig / sent poxvirus promotor25, mCherry-E3L fusjongenet, og ~ 500 nukleotider fra VACV genomiske regionen 3 ' av E3L inkludert den korte 3 'arm (lang 3 'arm).
    1. I et PCR-rør legger du til reagensene i følgende rekkefølge for hver amplicon: 17 μL DNase fritt vann, 1,2 μL av hver primer (innledende konsentrasjon = 10 μM, endelig konsentrasjon = 0,5 μM), 5 μL av 5x PCR reaksjonsbuffer, mal DNA (10 ng for amplicons forsterket fra plasmider: EGFP og E/L promoter-mCherry-E3L kassett; 100 ng for amplicons forsterket av viral genomisk DNA: 5' og 3'arms), og 0,5 μL DNA polymerase. Juster volumet av vann som er tilsatt for et endelig reaksjonsvolum på 50 μL.
      MERK: Konsentrasjonen av mal DNA bør bestemmes empirisk, men vi starter vanligvis med 10 ng / reaksjon.
    2. Plasser rørene i en termocycler, og smelt DNA ved 98 °C i 30 s, og bruk deretter 25 runder av en tretrinns PCR-protokoll: 98 °C for 5 s, 55 °C i 10 s og 72 °C i 1 min.
      MERK: Bestem smeltetemperaturen basert på produsentens foreslåtte Tm for hvert primersett. Bestem riktig forlengelsestid basert på lengden på hver amplicon (1 minutt/kb).
  3. Visualiser forsterkningsproduktene på en 1% agarosegel. Tilsett 10 μL av hvert DNA-produkt og 2 μL lastebuffer til hver brønn, og løp med 8 V/cm i 1 t.
  4. Gel renser hver amplicon ved hjelp av et DNA gelekstraksjonssett og produsentens protokoll. Elute amplicons fra kolonnen ved å legge til 50 μL dnase fritt vann og umiddelbart sentrifuging.
  5. Lineariser pUC19 kloning vektor ved hjelp av EcoRI endonuclease fordøyelse. Til et rør tilsett 1 μg pUC19, vann til et volum på 17 μL, 2 L reaksjonsbuffer og 1 μL (20 enheter) EcoRI. Inkuber ved 37 °C i 1 time.
    1. Visualiser forsterkningsproduktene på en 1% agarose gel som går på 8 V/cm i 1 time. Avgiftsrør båndet fra gelen, og rense produktet ved hjelp av DNA gelekstraksjonssettet som beskrevet i trinn 1.4.
  6. Ligate alle de enkelte, gel renset amplicons og linearisert vektor ved hjelp av en master mix kit.
    1. Til et PCR-rør, tilsett 0,2 pmol av linearisert pUC19 og hver amplicon (5' arm, EGFP, kort 3's arm, E/L promotor-mCherry-E3L kassett, 3'arm). Tilsett DNase fritt vann til et endelig volum på 10 μL, og tilsett deretter 10 μL DNA-monteringsmesterblanding. Inkuber prøvene ved 50 °C i 1 t.
  7. Forvandle kjemisk kompetent E. coli med 2 μL av det monterte produktet fra trinn 1.6 som tidligere beskrevet26,27. Plate 100 μL av de transformerte cellene på LB agaroseplater som inneholder 100 μg/ml ampicillin. Inkuber platene over natten ved 37 °C.
  8. Plukk godt isolerte kolonier og overfør individuelle kolonier til rør som inneholder Luria buljong med 100 μg / ml amicillin. Inkuber rørene over natten ved 37 °C mens du rister ved 225 rpm.
  9. Isolere plasmids fra natten kultur ved hjelp av en plasmid miniprep kit. Kontroller dna-konsentrasjonen og renheten ved hjelp av et spektrotometer. Et A260/A280-forhold mellom 1,8 og 2,0 er akseptabelt.
  10. Send inn plasmidene for Sanger-sekvensering for å avgjøre om ønsket kloningsprodukt er riktig. Oppbevar DNA ved -20 °C.

2. Generere rekombinantviruset

  1. Infisere en confluent monolayer av egnede celler med viruset som skal kombineres på nytt med en mangfold av infeksjon på 1,0 (MOI = 1,0) i en 6-brønnplate. Inkuber de infiserte cellene ved 37 °C og 5 % CO2 i 1 time. Deretter aspirere mediet og erstatte den med frisk DMEM. Inkuber de infiserte cellene ved 37 °C og 5 % CO2.
    MERK: For replikering kompetente virus som et vaccinia virus som mangler K3L22, er en cellelinje som europeisk kanin nyrecellelinje RK13 (ATCC #CCL-37) eller BSC-40 hensiktsmessig. Men for replikering mangelfullvirus, slik som viruset beskrevet i dette papiret mangler både PKR antagonister E3L og K3L, en komplementerende cellelinje uttrykker disse to genene i trans eller PKR knock-down eller knock-out celler er nødvendig.
  2. Transfect de infiserte cellene med 500 ng av vektoren generert og validert i trinn 1.10 ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig transfection reagens etter produsentens protokoll. Inkuber cellene ved 37 °C og 5 % CO2 i 48 timer.
    MERK: Hvis du bruker et vaccinia-virus som mangler både E3L og K3L, vil PKR-mediert selektivt trykk drive valg av recombined virus og opprettholde uttrykk for mCherry-E3L fusjonsprotein i disse cellene. Hvis ønskelig, bør det også være mulig å PCR forsterke bare innsatsen som skal brukes til transfection i stedet for hele plasmid.
  3. 48 timer etter infeksjon, høst det infiserte monolaget. I noen tilfeller kan cellene høstes ved pipettering, men hvis de fortsatt er tett festet, høstdem med en celleskraper. Frys-tine cellene tre ganger, og deretter sonicate lysates for 15 s på 50% amplitude. Oppbevar denne lysaten ved -80 °C til den er klar til bruk.
  4. Serielt 10-fold fortynne lysate høstet i trinn 2,3 fra 10-1 til 10-6 ved å legge til 120 μL av lysat til 1080 μL dmem (10-1),og deretter legge til 120 μL av denne fortynningen til 1080 μL dmem (10-2),og gjenta denne prosessen fire ganger til. Legg til 1 ml hver fortynning til en individuell, confluent brønn av en PKR kompetent cellelinje, i dette tilfellet RK13 celler.
    1. Inkuber de infiserte cellene ved 37 °C og 5 % CO2 i 1 time. Deretter aspirere mediet og erstatte den med frisk DMEM Inkuber de infiserte cellene ved 37 °C og 5% CO2.
  5. 24 til 48 timer etter infeksjon, identifisere rekombinant virus ved fluorescens mikroskopi. Plakk fra rekombinantvirus uttrykker rød fluorescens på grunn av integrering av mCherry-E3L fusjonsgenet (Figur 2). Hvis et virus uten PKR-hemmere ble brukt i utgangspunktet, vil alle plakk inneholde rekombinantvirus.
  6. Plakk renser rekombinantvirus tre ganger på RK13-celler. Etter den siste runden med plakkrensing, bør alle plakk uttrykke rød fluorescens.
  7. Inmitter en sammenblanding 6-brønnplate med RK13-celler som uttrykker VACV PKR-hemmerne E3L og K3L (RK13+E3L+K3L-celler28) med det plakkrensede røde fluorescerende viruset fra trinn 2.6. Sikt på ca 50-100 plaketter per brønn.
    MERK: Disse cellene gir VACV PKR-antagonistene i trans og lindrer det PKR-medierte selektive trykket for å opprettholde mCherry-E3L-fusjonsgenet, og fremmer dermed "knappløs" generasjon av rekombinantviruset.
  8. Identifiser skjulte virus ved fluorescensmikroskopi ved hjelp av et EVOS2-mikroskop og en GFP-filterkube (eksitasjon: 470/22, Utslipp: 525/50) og en RFP-filterkube (Eksitasjon: 531/40, Utslipp: 593/40).
    MERK: Frekvensen som fusjonsgenet mCherry-E3L går tapt på, er ca. 2,5 % (Tabell 2). Hvis EGFP ikke er inkludert som markørgen, vil plakk fra muterte virus som har mistet fusjonsgenet mCherry-E3L være fargeløst.
  9. Plakk renser bare grønt (VC-R4) eller fargeløse plakk (E3L) tre ganger på RK13+E3L+K3L-celler. Sørg for at ingen plakk fluorescerer rødt.
  10. Bekreft tap av mCherry-E3L og tilstedeværelsen av forventet mutasjon av PCR og Sanger sekvensering.
    MERK: Hvis genet eller mutasjonen av interesse ikke har PKR-hemmende aktivitet, må rekombinantvirus dyrkes på RK13+E3L+K3L-celler eller en tilsvarende PKR-hemmet eller PKR-mangelfull cellelinje (figur 3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi brukte prosedyren som er diagramt i figur 1 til å generere en VACV som mangler både PKR-antagonister E3L og K3L, ved å erstatte E3L med EGFP i et virus som allerede er slettet for K3L (vP872). Figur 2 viser røde fluorescerende plakk i PKR kompetente RK13-celler som indikerer viral uttrykk for mCherry-E3L, samt EGFP uttrykt i RK13+E3L+K3L-celler som bekrefter tapet av E3L og sammenbruddet av mCherry-E3L-markeringsmarkøren. Figur 3 bekrefter at dette rekombinantviruset, VC-R4, som mangler begge PKR-antagonistene ikke kan replikere i PKR kompetente RK13-celler, mens det overordnede viruset, vP872 som uttrykker E3L, er replikering kompetent. For å bekrefte at denne manglende evnen til å replikere i RK13-celler bare skyldtes tap av E3L, erstattet vi EGFP i VC-R4 med E3L, for å generere et reversivt virus ved hjelp av samme utvalgsprotokoll. Figur 3 bekrefter også at dette revertant viruset replikerer like effektivt som vP872 i RK13 celler. Interessant, fargeløse plakk i samsvar med kollaps av mCherry-E3L utvalg markør ble identifisert før valg i RK13 + E3 + K3 celler som er generelt nødvendig for å velge "arrløse" rekombinanter, sannsynligvis på grunn av den utvidede sekvensidentiteten mellom mCherry-E3L rekombinasjonskassetten og E3L genet blir satt inn i VC-R4. Derfor, for å bestemme effektiviteten av rekombinasjon og frekvensen av kollaps vi valgte å produsere virus som uttrykker poxvirus PKR antagonist K3L for å unngå problemet med tidlig kollaps23. Figur 4 indikerer utseendet på fargeløse plakk (pilspisser) etter infeksjon av RK13+E3L+K3L-celler. Tabell 1 viser resultatene av tre uavhengige eksperimenter, hvor i gjennomsnitt 12,6% av avkom virions hadde gjennomgått rekombinasjon med transfected plasmid, lik tidligere rapporterte frekvenser29,30,31. Tabell 2 beskriver hyppigheten av fargeløse plakk i forhold til totalt antall plakk i RK13+E3L+K3L-celler, som viser frekvensen av kollaps og tap av mCherry-E3L-markeringsmarkøren forekom med en frekvens på ca. 1,8 %.

Figure 1
Figur 1: Diagram over p837-GOI-mCherry-E3L samt vertsområdet og visuell rekombinasjonsstrategi. (A) 5's arm (svart) og 3's arm (grå) flankerer E3L-gresslys (brun) i VACV. (B) I p837-GOI-mCherry-E3L flankerer disse armene en kassett som inneholder genet av interesse (GOI), i dette tilfellet EGFP, (grønn) atskilt fra et mCherry-E3L (rødt) fusjonsgen under kontroll av den syntetiske tidlig /sen poxviruspromoter25 blå) med en kort 3's arm (grå).25 Disse ytre armene driver homolog rekombinasjon mellom VACV og p837-GOI-mCherry-E3L. Svarte pilspisser indikerer nettstedene til de overlappende primere som brukes til å generere denne plasmid av Gibson kloning. (C) Når PKR selektivt trykk fjernes, kan virus som har gjennomgått intramolekylær rekombinasjon mellom de korte og lange 3's armer velges. (D) Som resulterer i et virus (VC-R4) som bare inneholder genet av interesse for E3L-gresshoppe. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Fluorescerende mikrografer av (øverst) en rekombinant virusplakk 24 timer etter rekombinasjon med p837-GOI-mCherry-E3L som uttrykker både mCherry (venstre) og EGFP (høyre) i RK13-celler. (Nederst) Mikrograf av en rekombinant virusplakk 48 timer etter at PKR-mediert selektivt trykk er fjernet i RK13 ++ celler, uttrykker EGFP (høyre), men ikke mCherry (venstre). Skalalinjen indikerer 650 μm for alle paneler. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: VC-R4 kan ikke replikere i PKR kompetente celler. De angitte cellelinjene ble infisert med vP872 (blå), VC-R4 (grønn) eller VC-R4+E3L (magenta) ved MOI = 0,1. 48 timer etter infeksjon de infiserte cellene ble høstet og titered av seriell fortynning på RK13 + E3L + K3L celler. Titers rapporteres i PFU/ml, feillinjer representerer standardavviket for tre replikeringseksperimenter. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Tap av mCherry-E3L-uttrykk i RK13+E3L+K3L-celler. Overlegg av fluorescerende og fasekontrastmikrografer av VC-R4+K3L-mCherry-E3L-infiserte RK13+E3L+K3L-celler. Tre plaketter ikke lenger uttrykke mCherry (sirkler) på grunn av kollaps av valgkassetten gir VC-R4 + K3L. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Eksperiment 1 Eksperiment 2 Eksperiment 3
Røde plaketter (RK13) 30 11 18
Totalt antall plaketter (RK13+E3L+K3L) 225 64 249
Rekombinasjonshastighet 13.30% 17.20% 7.20%

Tabell 1: Rekombinasjonsfrekvens for VACV med p837-K3L-mCherry-E3L plasmid.

Eksperiment 1 Eksperiment 2 Eksperiment 3
Totalt antall plaketter (RK13+E3L+K3L) 115 44 210
Fargeløse plaketter (RK13+E3L+K3L) 3 1 1
Rekombinasjonshastighet 2.60% 2.30% 0.50%

Tabell 2: Hyppigheten av mCherry-E3L tap fra VC-R4+K3L-mCherry-E3L i RK13+E3+K3 celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her presenterer vi en variant av en forbigående markør valgstrategi 32 for å generere rekombinant vaccinia virus uten å beholde utenlandsk DNA i det endelige rekombinantviruset. Vår strategi bruker selektivt trykk mediert av verten antiviralprotein PKR i stedet for andre former for selektivt trykk som antibiotika. Bruken av vertsantivirale gener eliminerer muligheten for kjemisk induserte fenotypic endringer i cellene, eller økt risiko for mutasjon på grunn av utvalgnarkotika. Videre, i motsetning til med narkotikavalg, er det ingen lagfase for vår tilnærming, fordi PKR uttrykkes konstitutivt i alle celler. Sekundærvisuelt utvalg basert på mCherry-uttrykk forbedrer også spesifisiteten til denne metoden ved å sikre at bare plakk som uttrykker transgene plukkes i første fase, og er like effektiv som en negativ selektiv markør mens du velger modne rekombinantvirus som har mistet mCherry-E3L-genet.

De mest kritiske trinnene for denne rekombinasjonsstrategien er genereringen av riktig rekombinasjonsvektor, og passende plakkrensing for å sikre at det valgte viruset er klonal. I dette papiret foreslår vi "Gibson montering" for å generere rekombinasjonvektoren. Denne strategien er ekstremt effektiv og tillater montering av alle fragmentene som består av rekombinasjonsvektoren på en enkelt dag. Men fordi den korte 3's arm og den lange 3's arm deler identiske sekvenser, disse fragmentene har potensial til å bli slått sammen under kloning reaksjonen, og noen vektorer kan ikke inneholde mCherry-E3L kassett. Etter vår erfaring er dette sjelden, men det er nødvendig å bekrefte strukturen i vektoren etter kloning. Vi har også generert rekombinasjonsvektorer for denne strategien ved hjelp av tradisjonelle endonuclease og ligase metoder. Denne strategien unngår problemet beskrevet ovenfor, men kan være mer arbeidskrevende. Plakkrensing er generelt grei og er primært avhengig av å bruke passende tillatte celler for den første rekombinasjonen, PKR-kompetente celler for innledende plakkrensing for å sikre at bare rekombinante virus kan replikere, og deretter permissive celler igjen for å lette intramolekylær rekombinasjon og tap av den valgbare markøren. Følg med på cellelinjer er derfor avgjørende for vellykket og effektiv anvendelse av denne strategien.

I denne studien viser vi bruken av denne metoden for å generere en VACV rekombinant slettet for både PKR-antagonister E3L og K3L og uttrykker EGFP under kontroll av E3L-arrangøren. Fremover, Dette viruset vil tjene som en effektiv bakgrunn for fremtidige rekombinant virus, som det er ute av stand til å replikere i PKR kompetente celler. Derfor vil det være sterkt PKR-mediert selektivt trykk for å drive mCherry-E3L rekombinasjonskassetten til avkomvirioner samtidig som det i hovedsak forhindrer replikering av ikke-rekombinantvirus. Videre er tapet av EGFP ved opptak av rekombinasjonskassetten en nyttig sekundær utvalgsmarkør for å sikre at plukkede plakk ikke er co-infisert med et ikke-rekombinant virus. Vi observerte rekombinasjonsrater i samsvar med tidligere rapporterte priser for VACV, men de visuelle fluorescerende markørene øker effektiviteten ved å generere rekombinantvirus ved å sikre at det er sannsynlig at de riktige rekombinantvirusene velges. Vår observasjon av fargeløse plakk etter to runder med valg på PKR-kompetente celler, antagelig på grunn av den økte lengden på identisk sekvens mellom E3L og mCherry-E3L markørgenet, antyder at frekvensen av mCherry-E3L-tap kan "justeres" ved å øke eller redusere lengden på 3's korte arm. Den primære begrensningen av denne teknikken er bruk av PKR som selektivt trykk for rekombinanter. Den mest effektive bruken av denne rekombinasjonsstrategien genererer disse virusene i en bakgrunn som mangler PKR-antagonister. Den koloriske utvalgsmarkøren gjør imidlertid at denne rekombinasjonsstrategien kan brukes selv uten valg mediert av PKR, bare ved plakksomisering av mCherry-uttrykkende plakk. Mens mangelen på PKR-mediert selektivt trykk vil redusere effektiviteten av det første screeningtrinnet, er prosentandelen av mCherry som uttrykker plakk fortsatt høy nok til at fargebasert utvalg er levedyktig. Dermed kan denne metoden brukes til å sette inn nesten alle gener i poxvirusgenomet.

Som demonstrert ved innsetting av EGFP, med denne tilnærmingen, kan ethvert gen raskt settes inn i E3L-gresshopperen under kontroll av den innfødte arrangøren, forutsatt at PKR nullceller eller komplimenterende cellelinjer brukes til nedstrømseksperimenter hvis transgene ikke er en PKR-antagonist. Denne strategien, kombinert med VC-R4-viruset som vi rapporterer her, legger til en ny og potent metode for raskt og pålitelig å generere rekombinant vaccinia virus ved hjelp av vertsmediert selektivt trykk og visuell identifisering av rekombinanter tidlig i prosessen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Dette prosjektet ble finansiert av National Institutes of Health (AI114851) til SR.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2X-Q5 Master Mix NEB M0492L High-fidelity polymerase used in PCR
Ampicillin ThermoFisher Scientific 11593027 Bacterial selective agent
Disposable Cell Scrapers ThermoFisher Scientific 08-100-242 Cell scraper to harvest infected cells
EVOS FL Auto 2 Cell imaging system ThermoFisher Scientific AMAFD2000 Fluorescent microscope
EVOS Light Cube, GFP ThermoFisher AMEP4651 GFP Cube
EVOS Light Cube, RFP ThermoFisher AMEP4652 RFP Cube
GenJet SignaGen Laboratories SL100489 Transfection reagent
Luria Bertani (LB) Broth Gibco 10855021 Bacterial growth medium
Monarch DNA gel extraction kit NEB T1020L Gel purification kit used to purify amplicons and linearized vectors
Monarch Plasmid Miniprep kit NEB T1010L Miniprep kit ussed to purify plasmids
NanoDrop One ThermoFisher Scientific ND-ONE-W Spectrophotometer used to measure RNA and DNA concentration
NEBuilder Master Mix NEB E2621L Isothermal enzymatic assembly kit used to generate the recombination vector
Q500 Sonicator Qsonica Q500-110 Sonicator for virus lysates
RK13 cells ATCC CCL-37 Rabbit kidney cells
VWR Multiwell Cell Culture plates VWR 10062-892 Cell culture plates

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brochier, B., et al. Large-scale eradication of rabies using recombinant vaccinia-rabies vaccine. Nature. 354 (6354), 520-522 (1991).
  2. Pastoret, P. P., Brochier, B. The development and use of a vaccinia-rabies recombinant oral vaccine for the control of wildlife rabies; a link between Jenner and Pasteur. Epidemiology and Infection. 116 (3), 235-240 (1996).
  3. Chan, W. M., McFadden, G. Oncolytic Poxviruses. Annual review of virology. 1 (1), 119-141 (2014).
  4. Nguyen, D. H., et al. Vaccinia virus-mediated expression of human erythropoietin in tumors enhances virotherapy and alleviates cancer-related anemia in mice. Molecular Therapy. 21 (11), 2054-2062 (2013).
  5. Frentzen, A., et al. Anti-VEGF single-chain antibody GLAF-1 encoded by oncolytic vaccinia virus significantly enhances antitumor therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12915-12920 (2009).
  6. Pastoret, P. P., Vanderplasschen, A. Poxviruses as vaccine vectors. Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. 26 (5-6), 343-355 (2003).
  7. COLLIER, L. H. The development of a stable smallpox vaccine. The Journal of Hygiene. 53 (1), 76-101 (1955).
  8. Weir, J. P., Bajszár, G., Moss, B. Mapping of the vaccinia virus thymidine kinase gene by marker rescue and by cell-free translation of selected mRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (4), 1210-1214 (1982).
  9. Mackett, M., Smith, G. L., Moss, B. Vaccinia virus: a selectable eukaryotic cloning and expression vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (23), 7415-7419 (1982).
  10. Nakano, E., Panicali, D., Paoletti, E. Molecular genetics of vaccinia virus: demonstration of marker rescue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (5), 1593-1596 (1982).
  11. Falkner, F. G., Moss, B. Transient dominant selection of recombinant vaccinia viruses. Journal of Virology. 64 (6), 3108-3111 (1990).
  12. Staib, C., Drexler, I., Ohlmann, M., Wintersperger, S., Erfle, V., Sutter, G. Transient Host Range Selection for Genetic Engineering of Modified Vaccinia Virus Ankara. BioTechniques. 28 (6), 1137-1148 (2000).
  13. Staib, C., Drexler, I., Sutter, G. Construction and Isolation of Recombinant MVA. Vaccinia Virus and Poxvirology. , 77-99 (2004).
  14. Di Lullo, G., et al. Marker gene swapping facilitates recombinant Modified Vaccinia Virus Ankara production by host-range selection. Journal of Virological Methods. 156 (1-2), 37-43 (2009).
  15. Pfaller, C. K., Li, Z., George, C. X., Samuel, C. E. Protein kinase PKR and RNA adenosine deaminase ADAR1: New roles for old players as modulators of the interferon response. Current Opinion in Immunology. 23 (5), 573-582 (2011).
  16. Bevilacqua, P. C., George, C. X., Samuel, C. E., Cech, T. R. Binding of the protein kinase PKR to RNAs with secondary structure defects: Role of the tandem A - G mismatch and noncontigous helixes. Biochemistry. 37 (18), 6303-6316 (1998).
  17. Krishnamoorthy, T., Pavitt, G. D., Zhang, F., Dever, T. E., Hinnebusch, A. G. Tight Binding of the Phosphorylated Subunit of Initiation Factor 2 (eIF2) to the Regulatory Subunits of Guanine Nucleotide Exchange Factor eIF2B Is Required for Inhibition of Translation Initiation. Molecular and Cellular Biology. 21 (15), 5018-5030 (2001).
  18. Rothenburg, S., Georgiadis, M. M., Wek, R. C. Evolution of eIF2α kinases: Adapting translational control to diverse stresses. Evolution of the Protein Synthesis Machinery and Its Regulation. , 235-260 (2016).
  19. Bratke, K. A., McLysaght, A., Rothenburg, S. A survey of host range genes in poxvirus genomes. Infection, Genetics and Evolution. 14, 406-425 (2013).
  20. Chang, H. W., Watson, J. C., Jacobs, B. L. The E3L gene of vaccinia virus encodes an inhibitor of the interferon-induced, double-stranded RNA-dependent protein kinase. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (11), 4825-4829 (1992).
  21. Romano, P. R., et al. Inhibition of double-stranded RNA-dependent protein kinase PKR by vaccinia virus E3: role of complex formation and the E3 N-terminal domain. Molecular and Cellular Biology. 18 (12), 7304-7316 (1998).
  22. Beattie, E., Tartaglia, J., Paoletti, E. Vaccinia virus-encoded eIF-2 alpha homolog abrogates the antiviral effect of interferon. Virology. 183 (1), 419-422 (1991).
  23. Park, C., Peng, C., Brennan, G., Rothenburg, S. Species-specific inhibition of antiviral protein kinase R by capripoxviruses and vaccinia virus. Annals of the New York Academy of Sciences. 1438 (1), 18-29 (2019).
  24. Rothenburg, S., Brennan, G. Species-Specific Host-Virus Interactions: Implications for Viral Host Range and Virulence. Trends in Microbiology. , (2019).
  25. Chakrabarti, S., Sisler, J. R., Moss, B. Compact, synthetic, vaccinia virus early/late promoter for protein expression. BioTechniques. 23 (6), 1094-1097 (1997).
  26. Chung, C. T., Niemela, S. L., Miller, R. H. One-step preparation of competent Escherichia coli: Transformation and storage of bacterial cells in the same solution (recombinant DNA). Biochemistry. 86, 2172-2175 (1989).
  27. Chung, C. T., Miller, R. H. Preparation and storage of competent Escherichia coli cells. Methods in Enzymology. 218, 621-627 (1993).
  28. Rahman, M. M., Liu, J., Chan, W. M., Rothenburg, S., McFadden, G. Myxoma Virus Protein M029 Is a Dual Function Immunomodulator that Inhibits PKR and Also Conscripts RHA/DHX9 to Promote Expanded Host Tropism and Viral Replication. PLOS Pathogens. 9 (7), 1003465 (2013).
  29. Evans, D. H., Stuart, D., McFadden, G. High levels of genetic recombination among cotransfected plasmid DNAs in poxvirus-infected mammalian cells. Journal of Virology. 62 (2), 367-375 (1988).
  30. Ball, L. A. High-frequency homologous recombination in vaccinia virus DNA. Journal of Virology. 61 (6), 1788-1795 (1987).
  31. Spyropoulos, D. D., Roberts, B. E., Panicali, D. L., Cohen, L. K. Delineation of the viral products of recombination in vaccinia virus-infected cells. Journal of Virology. 62 (3), 1046-1054 (1988).
  32. Liu, L., et al. Transient dominant host-range selection using Chinese hamster ovary cells to generate marker-free recombinant viral vectors from vaccinia virus. BioTechniques. 62 (4), 183-187 (2017).

Tags

Immunologi og infeksjon Utgave 159 Vaccinia virus Rekombinasjon Poxvirus Vertsområde Protein kinase R E3L-mCherry
Rask, sømløs generering av rekombinante poxvirus ved hjelp av vertsområde og visuelt utvalg
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vipat, S., Brennan, G., Park, C.,… More

Vipat, S., Brennan, G., Park, C., Haller, S. L., Rothenburg, S. Rapid, Seamless Generation of Recombinant Poxviruses using Host Range and Visual Selection. J. Vis. Exp. (159), e61049, doi:10.3791/61049 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter