Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

דור מהיר, ללא תפר של רקומביננטי Poxviruses באמצעות טווח מארח ובחירה חזותית

Published: May 24, 2020 doi: 10.3791/61049
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1
1Department of Medial Microbiology and Immunology, School of Medicine, University of California Davis, 2Department of Microbiology and Immunology, University of Texas Medical Branch at Galveston
* These authors contributed equally

Summary

זוהי שיטה להפקת וירוסים "להוריד" רקומביננטי vaccinia באמצעות בחירה בטווח המארח וזיהוי חזותי של רקומביננטי וירוסים.

Abstract

Vaccinia וירוס (VACV) היה אינסטרומנטלי וירוס בריאולה (VARV), הסוכן סיבתי של אבעבועות שחורות, מן הטבע. מאז השימוש הראשון שלה כחיסון, VACV פותחה כווקטור עבור חיסונים טיפוליים כמו וירוס oncolytic. יישומים אלה מנצלים את הגנום של VACV בקלות מניפולציה וטווח מארח רחב כפלטפורמה מצטיינים לייצר וירוסים רקומביננטי עם מגוון רחב של יישומים טיפוליים. מספר שיטות פותחו כדי ליצור רקומביננטי VACV, כולל סמן שיטות בחירה שולטת ארעי. כאן, אנו מציגים עידון של שיטת בחירת טווח מארח ביחד עם זיהוי חזותי של וירוסים רקומביננטי. השיטה שלנו מנצלת לחץ סלקטיבי שנוצר על ידי מארח אנטי חלבון קינאז R (PKR) בשילוב עם גן היתוך פלורסנט ביטוי mCherry-tagged E3L, אחד משני היריבים VACV PKR. הקלטת, כולל הגן של הריבית ואת הפיוז mCherry-E3L מוקף רצפים נגזר הגנום VACV. בין הגן של הריבית ו-mCherry-E3L הוא אזור קטן יותר זהה הראשון ~ 150 נוקלאוטידים של 3 ' זרוע, כדי לקדם הומוולוגי מחדש ואובדן של הגן mCherry-E3L לאחר בחירה. אנו מדגימים כי שיטה זו מאפשרת דור יעיל, חלקה של rVACV במגוון סוגי תאים מבלי לדרוש בחירת סמים או הקרנה נרחבת עבור וירוסים מוטציה.

Introduction

Vaccinia וירוס (vacv) היה אינסטרומנטלי החיסול המוצלח הראשון של פתוגן אנושי, וירוס אבעבועות (varv), מן הטבע. מאז ההשמדה של וירוס אבעבועות, poxviruses כולל vacv המשיכו להיות שימושי וירוסים טיפולית עבור תרופות לבני אדם ובעלי חיים. לדוגמה, חיסון וירוס כלבת מבוסס VACV היה יעיל מאוד במניעת שידור של כלבת sylvatic באירופה1 ואת ארצות הברית2. לאחרונה, רקומביננטי poxviruses ביטוי מגוון של מולקולות נגד הגידול (g., שרשרת יחיד נוגדנים או אריתרופויאטין האדם) ראו לעודד הצלחה כסוכני oncolytic3,4,5. Vacv הוא אטרקטיבי במיוחד כמו וקטור כי זה קל מאוד מניפולציה גנטית, בעל טווח מארח רחב, והוא יציב תחת מגוון של תנאים, המאפשר הובלה קלה וכדאיות החיסון בשדה6,7. בעוד טכניקות מרובות פותחו כדי ליצור רקומביננטי VACV עבור ניסויים במעבדה הדור חיסון, אסטרטגיות נוכחיות להפקת וירוסים אלה יש מגבלות הבולטים.

בגלל השירות של VACV, אסטרטגיות מרובות כדי ליצור וירוסים רקומביננטי פותחו. האסטרטגיה הראשונה מעסיקה מחדש הומולוגי להציג קלטת כולל את הטרנסגנים ואת גן סמן לבחירה כגון גן עמידות לאנטיביוטיקה. הקלטת מוקף על ידי שני ~ 500 נוקלאוטידים (nt) או זרועות גדולות יותר הנחיית הגן לאתר מסוים בגנום ויראלי, אשר משולבים אז באופן מיוחד על ידי אירועים מוצלב כפול8,9,10. אסטרטגיה זו היא מהירה ויעילה; עם זאת, זה התוצאה חומר גנטי נוסף בצורה של הגן סמן שעשוי לייצר אפקטים בלתי צפויים. יתר על כן, יש מגבלה עליונה מעשית מספר הטרנסגנים שניתן להציג מוגבל על ידי מספר סמנים ייחודיים לבחירה זמין. אסטרטגיות בחירה שולטת (TDS) זמניות התייחסו לבעיה זו על ידי הקלה על הדור של "להוריד" רקומביננטי וירוסים11. באמצעות אסטרטגיה זו, פלסטלינה המכיל גן VACV מוטציה ו גן סמן לבחירה משולבים הגנום הנגיפי, אך ללא תוספת של ה-DNA VACV האגף. גישה זו מהווה שילוב ארעי של הפלסטיות כולו והשכפול של הגן VACV כתוצאה של שילוב של אירוע מוצלב אחד. ביניים זו יציבה כל עוד היא נשמרת תחת לחץ בחירה, תוך התרת העשרת המבנה. כאשר הבחירה מוסרת, שכפול VACV מאפשר אירוע מוצלב השני שתוצאתו הסרת הפלסמיד והיווצרות הבאים של סוג פראי (wt) או רקומביננטי וירוס ביחס 50:50 משוער. בעוד TDS מייצרת וירוסים רקומביננטי ללא צורך הקדמה יציבה של DNA זר, שיבוטים וירוסים מרובים חייב להיות מוקרן עבור מוטציה צפויה על ידי ניתוח רצף, שלב פוטנציאלי ארוך ויקר.

כאן, אנו מציגים גישה ליצירת רקומביננטי poxviruses המשלב את ההיבטים הטובים ביותר של כל אחת מגישות אלה, בדומה לגישה שתוארה עבור השכפול שונה vaccinia אנקרה12,13,14. אסטרטגיה זו משלבת טווח חזותי ומארח בחירה כדי ליצור במהירות רקומביננטי וירוסים על-ידי מוצלב אירועים כפולים, ולאחר מכן לחסל את הגן סמן לבחירה על ידי שילוב מחדש של הומוולוגי. גישה זו מאפשרת את הדור המהיר של מוטציות מתווכת על ידי שילוב הומוולוגי, עם הטבע "ללא צלקות" של גישות TDS, בעוד שאינו דורש צעד ההקרנה הבאים כדי להבחין סוג פראי ווירוסים מוטציה. השיטה שלנו גם משתמשת בבחירת טווח המארח במקום של בחירה אנטיביוטית, ביטול הסיכון של שינויי פנופאיות המושרה כימית בקו התא. עבור גישה זו, בחרנו להשתמש מארח אנטי חלבון קינאז R (PKR) כמו סוכן סלקטיבי כדי ליצור רקומביננטי VACV. PKR מבוטא כמונומר לא פעיל ברוב סוגי התאים15. באמצעות כריכה כפולה של רנ א (dsRNA) ב-N-terminal dsRNA-מתחם הכריכה, PKR והוא בתצוגה מקדימה של16. זו צורה פעילה של pkr זרחנית אלפא יחידת המשנה של הגורם החניכה איקריוטית 2 (eIF2), בסופו של דבר עיכוב מסירת מתיונין היוזם-trna ל ריבוחלק, ובכך מניעת תרגום תאיים ומעכב באופן נרחב את השכפול של משפחות וירוסים רבים17,18.

בתגובה לפעילות האנטי-ויראלית הרחבה והחזקה של PKR, וירוסים רבים התפתחו לפחות אסטרטגיה אחת כדי למנוע הפעלת PKR. רוב poxviruses לבטא שני האנטוניסטים PKR, מקודד על ידי E3L ו K3L גנים ב VACV, אשר מרגיז PKR באמצעות שני מנגנונים נפרדים19. E3 מונע pkr הומומיזציה על ידי מחייב כפול תקוע RNA20,21, בעוד K3 משמש מעכבי מדומה במצע על ידי קשירה ישירות pkr מופעל ובכך מעכב אינטראקציה עם המצע שלה eIF2α22. הדבר החשוב ביותר הוא ששני האנטניסטים האלה אינם מעכבים בהכרח את PKR מכל המינים. לדוגמה, הK3 הומולוג מנגיף הטיח מעכבות מאוד את הצאן מכבשים, ואילו הוולוג באמצעות הפלאפון E3 הומולוג לא הראה באופן משמעותי את העיכוב pkr23,24. במחקר זה, אנו מציגים שיטה להשתמש PKR-תיווך בלחץ סלקטיבי בשילוב עם בחירת הזריחה כדי ליצור רקומביננטי VACV נמחק עבור E3L ו K3L (VC-4), אשר לא יכול לשכפל בתאים המוסמכים PKR נגזר ממינים שונים. וירוס רקומביננטי זה מספק רקע מצוין עבור הדור המהיר של וירוסים רקומביננטי ביטוי גנים תחת שליטה של מקדם E3L מקורי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. יצירת וקטור שילוב מחדש

  1. עיצוב התחל כדי ליצור את קלטת הבחירה. עיצוב כל בודד אמפליקון עם רצפים חופפים עם הגברה השכנה וקטור כדי להקל על הרכבה אנזימטית איזותרמי של מולקולות DNA, נקרא גם האסיפה גיבסון, באמצעות כל אחד מספר כלים באינטרנט פריימר עיצוב.
    הערה: ניתן להשלים פרוטוקול זה גם באמצעות שיטות שכפול המבוססות על הגבלה מסורתית endonuclease. במקרה כזה, עיצוב התחל עם אתרי ההגבלה המתאימים ולא עם רצפים חופפים.
  2. באמצעות התחל שתוכנן בשלב 1.1, PCR להגביר את האלמנטים הבאים על מנת 5 ' עד 3 ' (איור 1): ~ 500 נוקלאוטידים של אזור גנומית של vacv 5 ' של E3L (5 ' זרוע), egfp או הגן של עניין, ~ 150 נוקלאוטידים מן האזור הגנומי vacv מיד 3 ' של E3L (קצר 3 ' זרוע), מוקדם סינתטי/מאוחר מיזם poxvirus25, גן היתוך mcherry-E3L, ו ~ 500 נוקלאוטידים מן האזור הגנומי vacv 3 ' של E3L כולל קצר 3 ' זרוע (ארוך 3 ' זרוע
    1. בצינור PCR, להוסיף את הריאגנטים בסדר הבא עבור כל amplicon: 17 μL של DNase מים חינם, 1.2 μL של כל פריימר (ריכוז ראשוני = 10 μM, הריכוז הסופי = 0.5 μM), 5 μL של מאגר התגובה של ה-PCR 5x, תבנית DNA (10 ng עבור הגברה המוגברת מ פלמידים: egfp ו-E/L יזם-mCherry-E3L הקלטת; 100 ng עבור הגברה המוגברת של dna גנומית ויראלי: 5 ' ו-3 זרועות), 0.5 כוונן את נפח המים הנוספים עבור נפח התגובה הסופי של 50 μL.
      הערה: הריכוז של ה-DNA תבנית יש לקבוע באופן אמפירי, אבל אנחנו בדרך כלל מתחילים עם 10 ng/התגובה.
    2. מניחים את הצינור (s) בתוך הצנטרזה, ולהמיס את ה-DNA ב 98 ° c עבור 30, ולאחר מכן להשתמש 25 סיבובים של פרוטוקול PCR שלושה צעדים: 98 ° צ' עבור 5 s, 55 ° צ' עבור 10 s, ו 72 ° c עבור 1 דקות.
      הערה: לקבוע את טמפרטורת ההיתוך בהתבסס על היצרן של הציע Tm עבור כל מערכת תחל. קבע את זמן ההרחבה המתאים בהתאם לאורך של כל אמפליקון (1 דקה/kb).
  3. המחש את מוצרי הגברה על 1% ג'ל. הוסף 10 μL של כל מוצר DNA ו 2 μL של טעינת מאגר כל טוב, ולרוץ ב 8 V/cm עבור 1 h.
  4. ג'ל לטהר כל אמפליקון באמצעות ערכת החילוץ ג'ל DNA ופרוטוקול של היצרן. Elute הגברה מן העמודה על ידי הוספת 50 μL של DNase מים בחינם ומיד תפרידו.
  5. Linearize pUC19 שיבוט וקטור שימוש בעיכול Ecori endonuclease. לצינור, להוסיף 1 μg של pUC19, מים לנפח של 17 μL, 2 L של מאגר התגובה, ו 1 μL (20 יחידות) של Ecori. מודטה ב 37 ° c בשביל 1 h.
    1. המחש את מוצרי הגברה על 1% צמח ג'ל לרוץ ב 8 V/cm עבור 1 h. בלו את הלהקה מן הג, ולטהר את המוצר באמצעות ערכת החילוץ ג'ל ה-DNA כמתואר בשלב 1.4.
  6. ליגייט כל הפרט, ג'ל מטוהרים הגברה וקטור ליניאריות באמצעות ערכת ערבוב הורים.
    1. לצינור ה-PCR, להוסיף 0.2 pmol של לינpUC19 ו כל אמפליקון (5 ' זרוע, egfp, קצר 3 ' זרוע, E/L יזם-mcherry-E3L הקלטת, 3 ' זרוע). הוסף DNase מים ללא תשלום לנפח הסופי של 10 μL, ולאחר מכן להוסיף 10 μL של מיקס בסיס להרכבת DNA. מודטה דגימות ב 50 ° c בשביל 1 h.
  7. שינוי כימית המוסמכת E. coli עם 2 μl של המוצר המורכב משלב 1.6 כפי שמתואר בעבר26,27. צלחת 100 μL של תאים שעברו שינוי בלוחות LB agarose המכילים 100 μg/mL אמפיצילין. מודאת הצלחות לילה. ב-37 ° c
  8. בחרו מושבות מבודדות והעבירו מושבות בודדות לצינורות המכילים ציר לוריא עם 100 μg/mL אמפיצילין. מודטה את הצינורות לילה ב 37 ° צ' בעת טלטול ב 225 סל ד.
  9. לבודד את הפלסטלינה מן התרבות הלילה באמצעות ערכת המיכין פלמיד. בדוק את הריכוז והטוהר של הדנ א באמצעות ספקטרוסקופיה. יחס A260/A280 בין 1.8 ו-2.0 מקובל.
  10. הגישו את הפלמידים לרצף של סאנגר כדי לקבוע אם מוצר השכפול הרצוי נכון. אחסן את הדנ א ב-20 ° c.

2. יצירת הווירוס הרקומביננטי

  1. להדביק מונאולייר שוטפת של תאים מתאימים עם הווירוס להיות משולב מחדש בריבוי של זיהום של 1.0 (משרד הבית = 1.0) בצלחת 6-היטב. מודטה את התאים הנגועים ב 37 ° צ' ו 5% CO2 עבור 1 h. ואז לאכול את המדיום ולהחליף אותו עם DMEM טרי. מודטה את התאים הנגועים ב 37 ° צ' ו 5% CO2.
    הערה: עבור וירוסים מוכשרים לשכפול כגון וירוס vaccinia חסר K3L22, קו תא כגון קו כליות הארנב האירופי RK13 (atcc #CCL-37) או תואר ראשון-40 מתאים. עם זאת, עבור וירוסים לקוי השכפול, כגון וירוס המתואר בנייר זה חסר גם PKR האנטוניסטים E3L ו K3L, קו תא משלימים המבטא שני גנים אלה טרנס או pkr להפיל או להפיל תאים נדרשים.
  2. מעבר לתאים הנגועים עם 500 ng של הווקטור שנוצר ומאומת בשלב 1.10 באמצעות מסחרי הזיהום זמין מסחרית לאחר פרוטוקול של היצרן. מודטה את התאים ב 37 ° צ' ו 5% CO2 עבור 48 h.
    הערה: אם באמצעות וירוס vaccinia חסרים הן E3L ו K3L, לחץ סלקטיבי PKR-תיווך יהיה לנהוג בחירה של וירוסים משולבים מחדש ולשמור על ביטוי של חלבון היתוך mCherry-E3L בתאים אלה. במידת הצורך, יש לאפשר גם ל-PCR להגביר רק את התוספת לשימוש לצורך העברה במקום את כל הפלפסנה.
  3. 48 שעות לאחר זיהום, לקצור את המונאולייר הנגוע. במקרים מסוימים, התאים ניתן לקצור על ידי ליטוף, אבל אם הם עדיין חזק היטב, לקצור אותם עם מגרד התא. להקפיא את התאים שלוש פעמים, ולאחר מכן sonicate lysates עבור 15 s ב 50% משרעת. אחסן את זה ב-80 ° צ' עד מוכן לשימוש.
  4. סרילי 10-קיפול לדלל את ליפוסט שנקטפו בשלב 2.3 מ 10-1 עד 10-6 על ידי הוספת 120 μl שלlysate כדי 1080 ΜL של dmem (10-1), ולאחר מכן הוספת 120 μl של דילול זה כדי 1080 μl של dmem (10-2), וחוזר על תהליך זה ארבע פעמים נוספות הוסף 1 מ ל של כל דילול לאדם, היטב שוטפת של קו תא מוסמך PKR, במקרה זה RK13 תאים.
    1. מודטה את התאים הנגועים ב 37 ° צ' ו 5% CO2 עבור 1 h. לאחר מכן ומכה את המדיום ולהחליף אותו עם מחדש DMEM התאים הנגועים ב 37 ° צ' ו 5% CO2.
  5. 24 עד 48 שעות לאחר זיהום, לזהות וירוסים רקומביננטי על ידי המיקרוסקופיה פלואורסצנטית. שלטי רקומביננטי וירוסים לבטא פלואורסצנטית אדום בשל אינטגרציה של mCherry-E3L גן היתוך (איור 2). אם וירוס נטול מעכבי PKR נעשה שימוש בתחילה, כל הפלאק יכיל וירוס רקומביננטי.
  6. פלאק לטהר רקומביננטי וירוסים שלוש פעמים על RK13 תאים. לאחר הסיבוב האחרון של טיהור פלאק, כל הפלאק צריך לבטא את הזריחה האדומה.
  7. הדביקו את הצלחת 6-באר של תאים RK13 לבטא את מעכבי pkr E3L ו K3L (RK13 + E3L + K3L תאים28) עם מטוהרים מטוהר אדום רואה וירוס משלב 2.6. המטרה עבור כ 50-100 שלטים לכל טוב.
    הערה: תאים אלה מספקים את היריבים VACV PKR בטרנס ולהקל על הלחץ הסלקטיבי PKR-תיווך כדי לשמור על גן היתוך mCherry-E3L, ובכך לקדם את "להוריד" הדור של הנגיף רקומביננטי.
  8. זיהוי וירוסים מכווצים על ידי מיקרוסקופ הקרינה הפלואורסצנטית באמצעות מיקרוסקופ EVOS2, וקוביית מסנן GFP (עירור: 470/22, פליטה: 525/50) ו קוביית מסנן RFP (עירור: 531/40, פליטה: 593/40).
    הערה: התדירות שבה הגן היתוך mCherry-E3L לאיבוד הוא כ 2.5% (טבלה 2). אם EGFP אינו כלול כמו גן סמן, לוחיות של וירוסים מוטציה כי איבדו את גן ההיתוך mCherry-E3L יהיה חסר צבע.
  9. פלאק לטהר ירוק בלבד (VC-4) או לוחיות צבע (E3L) שלוש פעמים על RK13 + E3L + K3L תאים. ודא שאין לוחיות שלטים אדומות.
  10. אשר את ההפסד של מE3L ונוכחותו של המוטציה הצפויה על ידי הרצף PCR ו-Sanger.
    הערה: אם הגן או מוטציה של עניין אין פעילות מעכבות PKR, רקומביננטי וירוסים יש לגדל על RK13 + E3L + K3L תאים או שווה ערך PKR-עכבות או קו תא לקוי PKR (איור 3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

השתמשנו בתרשים ההליך באיור 1 כדי ליצור vacv חסרים גם pkr האנטוניסטים E3L ו K3L, על ידי החלפת E3L עם egfp בווירוס נמחק כבר עבור K3L (vP872). איור 2 מראה שלטי פלורסנט אדום ב-pkr תאים RK13 המוסמכים מעיד על ביטוי נגיפי של mcherry-E3L, כמו גם egfp הביע בRK13 + E3L + K3L תאים המאשרים אובדן של E3L והתמוטטות של סמן הבחירה mcherry-E3L. איור 3 מאשרת כי זה וירוס רקומביננטי, VC-4, חסר שני היריבים pkr לא יכול לשכפל בתאי RK13 המוסמכת pkr, בעוד וירוס האב, vP872 ביטוי E3L, הוא שכפול המוסמכת. כדי לוודא כי חוסר יכולת לשכפל בתאי RK13 היה רק בשל אובדן של E3L, החלפנו EGFP ב VC-אר-אר עם E3L, כדי ליצור וירוס השסטנט באמצעות אותו פרוטוקול בחירה. איור 3 גם מאמת כי וירוס זה ההזיות משכפל ביעילות כמו vP872 בתאי RK13. מעניין, שלטים חסרי צבע העקביים עם התמוטטות של סמן הבחירה mCherry-E3L זוהו לפני הבחירה בRK13 + E3 + K3 תאים הנדרשים בדרך כלל כדי לבחור "להוריד" recombinants, סביר להניח בגלל הזהות רצף מורחב בין הקלטת המשולבת mCherry-E3L שנוספו הגן E3L לתוך VC-אר. לכן, כדי לקבוע את היעילות של שילוב מחדש ואת שיעור הקריסה שבחרנו לייצר וירוסים ביטוי poxvirus ירוס PKR היריב K3L כדי למנוע את הבעיה של התמוטטות מוקדמת23. איור 4 מציין את המראה של לוחיות צבע (ראשי חץ) לאחר זיהום של RK13 + E3L + K3L תאים. טבלה 1 מציגה את התוצאות של שלושה ניסויים עצמאיים, כאשר בממוצע 12.6% של צאצאי הצאצאים עברו שילוב עם הפלפידי החדש, בדומה לתדרים שדווחו בעבר29,30,31. טבלה 2 מפרט את תדירות הפלאק החסר צבע ביחס לפלאק הכולל ב RK13 + E3L + K3L תאים, הדגמת קצב התמוטטות ואובדן של סמן הבחירה של mcherry-E3L אירעה בתדירות של כ 1.8%.

Figure 1
איור 1: תרשים של p837-הגוי-מE3L, כמו גם את האסטרטגיה לטווח המארח ושילוב חזותי מחדש. (A) 5 ' זרוע (שחור) ו 3 ' זרוע (אפור) האגף E3L לוקוס (חום) ב vacv. (ב) ב P837-גוי-MCHERRY-E3L, הזרועות האלה לאגף קלטת המכילה את הגן של עניין (הארה), במקרה זה egfp, (ירוק) הופרדו מ-mcherry-E3L (אדום) היתוך בשליטה של מוקדם סינתטי/מאוחר poxvirus יזם25 כחול) ידי קצר 3 ' זרוע (אפור). הנשק החיצוני הזה כונן הומולוגי מחדש בין ואקום לבין p837-גוי-מדובדבן-E3L. ראשי חץ שחורים מצביעים על האתרים של התחל החופף ששימש להפקת הפלמיד הזה על ידי שיבוט גיבסון. (ג) כאשר הלחץ הסלקטיבי pkr מוסר, וירוסים שעברו שילוב מולקולרי בין הזמן הקצר והארוך 3 ' הזרועות ניתן לבחור. (ד) היוצר וירוס (VC-אר-אר) המכיל רק את הגן של העניין בE3L לוקוס. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: מיקרוגרפים פלורסנט של (למעלה) לוח וירוס רקומביננטי 24 שעות לאחר שילוב מחדש עם p837-הגוי-mCherry-E3L ביטוי הן mcherry (שמאל) ו EGFP (מימין) ב RK13 תאים. תחתית Micrograph של רקומביננטי וירוס פלאק 48 שעות לאחר הלחץ הסלקטיבי PKR-תיווך הוסר ב RK13 + + תאים, ביטוי EGFP (מימין) אבל לא mCherry (משמאל). סרגל קנה המידה מציין 650 יקרומטר עבור כל החלוניות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: VC-4 אינו יכול לשכפל בתאים המוסמכים PKR. קווי התאים שצוינו נדבקו ב-vP872 (כחול), VC-אר-אר (ירוק), או VC-אר-אר + E3L (מגנטה) ב-מוי = 0.1. 48 שעות לאחר זיהום התאים הנגועים נקצרו ומאז על ידי דילול סדרתי ב RK13 + E3L + K3L תאים. Titers מדווחים ב PFU/mL, שגיאות בארים מייצגים את סטיית התקן של שלושה ניסויים לשכפל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: הפסד של ביטוי MCHERRY-מידי ב-RK13 + E3L + K3L תאים. כיסוי של מיקרוגרפים מבוססי פלורסנט ובעל ניגודיות פאזה של VC-אר-אר + K3L-mCherry-E3L נגוע RK13 + E3L + K3L תאים. שלושה שלטים כבר לא מבטאים את mCherry (עיגולים) בשל קריסה של הקלטת בחירה מניב VC-K3L +. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

ניסוי 1 הניסוי השני ניסוי 3
שלטים אדומים (RK13) 30 11 18
סה כ שלטים (RK13 + E3L + K3L) 225 64 249
קצב שילוב מחדש 13.30% 17.20% 7.20%

טבלה 1: תדירות שילוב מחדש של VACV עם p837-K3L-mCherry-E3L פלמיד.

ניסוי 1 הניסוי השני ניסוי 3
סה כ שלטים (RK13 + E3L + K3L) 115 44 210
לוחיות צבע (RK13 + E3L + K3L) 3 1 1
קצב שילוב מחדש 2.60% 2.30% 0.50%

שולחן 2: תדירות ההפסד של מE3L מVC-אר-אר + K3L-מ-E3L בRK13 + E3 + K3 תאים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כאן אנו מציגים וריאציה של אסטרטגיה בחירת סמן ארעי 32 כדי ליצור וירוסים רקומביננטי vaccinia ללא שמירה על DNA זר בווירוס רקומביננטי הסופי. האסטרטגיה שלנו עושה שימוש בלחץ סלקטיבי בתיווך על ידי המארחים אנטי חלבון PKR ולא צורות אחרות של לחץ סלקטיבי כגון אנטיביוטיקה. השימוש של גנים ויראליים מארחים מבטלת את האפשרות של שינויים המושרה באמצעות כימית בתאים, או סיכון מוגבר של מוטציה בשל תרופות בחירה. יתר על כן, בניגוד לבחירת סמים, אין שלב השהיה עבור הגישה שלנו, כי PKR מתבטא באופן מכונן בכל התאים. מבחר חזותי משני המבוסס על ביטוי mCherry גם משפר את הספציפיות של שיטה זו על ידי הבטחת כי רק שלטים המבטאים את המשגר הם נאספו בשלב הראשון, והוא יעיל באותה מידה כמו סמן סלקטיבי שלילי תוך בחירת וירוסים רקומביננטי בוגרים שאיבדו את הגן mCherry-E3L.

השלבים הקריטיים ביותר עבור אסטרטגיה זו שילוב מחדש הם הדור של הווקטור המשולב מחדש המתאים, וטיהור פלאק המתאים כדי להבטיח כי הנגיף שנבחר הוא שבטים. במאמר זה אנו ממליצים "מכלול גיבסון" כדי ליצור את שילוב מחדש וקטור. אסטרטגיה זו יעילה ביותר ומאפשרת הרכבה של כל השברים המרכיבים את הווקטור המשולב מחדש ביום אחד. עם זאת, מכיוון שהיד הקצרה 3 ' ואת הזרוע הארוכה 3 ' לשתף רצפים זהים, שברים אלה יש את הפוטנציאל להתאחד יחד במהלך תגובת שיבוט, וקטורים מסוימים לא יכול להכיל את הקלטת mCherry-E3L. בניסיון שלנו זה נדיר אבל המאשר את מבנה הווקטור לאחר שיבוט הוא הכרחי. יש לנו גם שנוצר וקטורים שילוב מחדש עבור אסטרטגיה זו באמצעות endonuclease מסורתית ושיטות ליגאז. אסטרטגיה זו נמנעת מהבעיה המתוארת לעיל, אך יכולה להיות יותר אינטנסיבית מעבודה. טיהור פלאק הוא בדרך כלל ישיר והוא מבוססת בעיקר על שימוש בתאים מתירני המתאים לחידוש הראשוני, התאים PKR-המוסמכת עבור טיהור הפלאק הראשונית כדי להבטיח שרק רקומביננטי וירוסים יכולים לשכפל, ולאחר מכן מתירני שוב תאים כדי להקל על שילוב מולקולרי ואובדן של סמן לבחירה. יש לשים לב לקווי התאים ולכן חיוני ליישום מוצלח ויעיל של אסטרטגיה זו.

במחקר זה, אנו מדגימים את השימוש בשיטה זו כדי ליצור רקומביננטי VACV נמחק עבור שני היריבים PKR E3L ו K3L וביטוי EGFP תחת שליטה של מקדם E3L. הולך קדימה, וירוס זה ישמש כרקע יעיל לווירוסים רקומביננטי עתידיים, כפי שהוא אינו מסוגל לשכפל בתאים המוסמכים PKR. לכן, יהיה חזק PKR מתווך הלחץ סלקטיבי כדי לנהוג את הקלטת mCherry-E3L שילוב מחדש לתוך צאצאי צאצאים תוך באותו זמן למעשה מניעת שכפול של וירוס שאינו רקומביננטי. יתר על כן, אובדן של EGFP על ידי ספיגה של הקלטת שילוב מחדש הוא סמן בחירה משנית שימושי כדי להבטיח שלטים שנאספו אינם נגועים שיתוף עם וירוס לא רקומביננטי. הבחנו שיעורי שילוב מחדש עקבי עם שיעורי שדווחו בעבר עבור VACV, אבל סמני פלורסנט חזותיים להגביר את היעילות של יצירת וירוסים רקומביננטי ידי להבטיח כי הגדלת הסבירות כי הווירוסים הרקומביננטי המתאימים נבחרו. ההתבוננות שלנו של הפלאק צבע לאחר שני סיבובים של בחירה על התאים PKR-המוסמכת, כנראה בשל האורך המוגבר של רצף זהה בין E3L והגן mCherry-E3L סמן, מציע כי הקצב של הפסד mCherry-E3L עשוי להיות "מכוון" על ידי הגדלת או להקטין את אורכו של 3 ' יד קצרה. המגבלה העיקרית של טכניקה זו היא השימוש PKR כלחץ סלקטיבי עבור recombinants. השימוש היעיל ביותר של אסטרטגיה זו שילוב מחדש מייצר וירוסים אלה ברקע חסר PKR היריבים. עם זאת, סמן הבחירה מטרי צביעה מאפשר אסטרטגיה זו שילוב מחדש לשמש גם ללא הבחירה מתווכת על ידי PKR, פשוט על ידי פלאק לטהר את הפלאק המבטא. בעוד המחסור PKR-תיווך סלקטיבי לחץ תפחית את היעילות של הצעד הראשון ההקרנה, אחוז מהפלאק המבטא mCherry הוא עדיין גבוה מספיק כי צבע מבוסס בחירה הוא בר קיימא. כך, שיטה זו יכולה לשמש כדי להוסיף כמעט כל גן לתוך הגנום poxvirus.

כפי שניתן להדגים על ידי החדרת EGFP, עם גישה זו, כל גן יכול להיות מוכנס במהירות לתוך E3L לוקוס תחת שליטה של היזם יליד, בתנאי כי PKR null תאים או קווי תא משכר משמשים לניסויים במורד הזרם אם הטרנסוגן אינו היריב PKR. אסטרטגיה זו, בשילוב עם וירוס VC-אר שאנו מדווחים כאן, מוסיף שיטה חדשה וחזקה במהירות ובאמינות ליצור וירוסים רקומביננטי vaccinia באמצעות לחץ מארח-תיווך סלקטיבי וזיהוי חזותי של recombinants מוקדם בתהליך.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים לא מצהירים על אינטרסים פיננסיים מתחרים.

Acknowledgments

פרויקט זה מומן על ידי המכון הלאומי לבריאות (AI114851) ל-SR.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2X-Q5 Master Mix NEB M0492L High-fidelity polymerase used in PCR
Ampicillin ThermoFisher Scientific 11593027 Bacterial selective agent
Disposable Cell Scrapers ThermoFisher Scientific 08-100-242 Cell scraper to harvest infected cells
EVOS FL Auto 2 Cell imaging system ThermoFisher Scientific AMAFD2000 Fluorescent microscope
EVOS Light Cube, GFP ThermoFisher AMEP4651 GFP Cube
EVOS Light Cube, RFP ThermoFisher AMEP4652 RFP Cube
GenJet SignaGen Laboratories SL100489 Transfection reagent
Luria Bertani (LB) Broth Gibco 10855021 Bacterial growth medium
Monarch DNA gel extraction kit NEB T1020L Gel purification kit used to purify amplicons and linearized vectors
Monarch Plasmid Miniprep kit NEB T1010L Miniprep kit ussed to purify plasmids
NanoDrop One ThermoFisher Scientific ND-ONE-W Spectrophotometer used to measure RNA and DNA concentration
NEBuilder Master Mix NEB E2621L Isothermal enzymatic assembly kit used to generate the recombination vector
Q500 Sonicator Qsonica Q500-110 Sonicator for virus lysates
RK13 cells ATCC CCL-37 Rabbit kidney cells
VWR Multiwell Cell Culture plates VWR 10062-892 Cell culture plates

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brochier, B., et al. Large-scale eradication of rabies using recombinant vaccinia-rabies vaccine. Nature. 354 (6354), 520-522 (1991).
  2. Pastoret, P. P., Brochier, B. The development and use of a vaccinia-rabies recombinant oral vaccine for the control of wildlife rabies; a link between Jenner and Pasteur. Epidemiology and Infection. 116 (3), 235-240 (1996).
  3. Chan, W. M., McFadden, G. Oncolytic Poxviruses. Annual review of virology. 1 (1), 119-141 (2014).
  4. Nguyen, D. H., et al. Vaccinia virus-mediated expression of human erythropoietin in tumors enhances virotherapy and alleviates cancer-related anemia in mice. Molecular Therapy. 21 (11), 2054-2062 (2013).
  5. Frentzen, A., et al. Anti-VEGF single-chain antibody GLAF-1 encoded by oncolytic vaccinia virus significantly enhances antitumor therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12915-12920 (2009).
  6. Pastoret, P. P., Vanderplasschen, A. Poxviruses as vaccine vectors. Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. 26 (5-6), 343-355 (2003).
  7. COLLIER, L. H. The development of a stable smallpox vaccine. The Journal of Hygiene. 53 (1), 76-101 (1955).
  8. Weir, J. P., Bajszár, G., Moss, B. Mapping of the vaccinia virus thymidine kinase gene by marker rescue and by cell-free translation of selected mRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (4), 1210-1214 (1982).
  9. Mackett, M., Smith, G. L., Moss, B. Vaccinia virus: a selectable eukaryotic cloning and expression vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (23), 7415-7419 (1982).
  10. Nakano, E., Panicali, D., Paoletti, E. Molecular genetics of vaccinia virus: demonstration of marker rescue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (5), 1593-1596 (1982).
  11. Falkner, F. G., Moss, B. Transient dominant selection of recombinant vaccinia viruses. Journal of Virology. 64 (6), 3108-3111 (1990).
  12. Staib, C., Drexler, I., Ohlmann, M., Wintersperger, S., Erfle, V., Sutter, G. Transient Host Range Selection for Genetic Engineering of Modified Vaccinia Virus Ankara. BioTechniques. 28 (6), 1137-1148 (2000).
  13. Staib, C., Drexler, I., Sutter, G. Construction and Isolation of Recombinant MVA. Vaccinia Virus and Poxvirology. , 77-99 (2004).
  14. Di Lullo, G., et al. Marker gene swapping facilitates recombinant Modified Vaccinia Virus Ankara production by host-range selection. Journal of Virological Methods. 156 (1-2), 37-43 (2009).
  15. Pfaller, C. K., Li, Z., George, C. X., Samuel, C. E. Protein kinase PKR and RNA adenosine deaminase ADAR1: New roles for old players as modulators of the interferon response. Current Opinion in Immunology. 23 (5), 573-582 (2011).
  16. Bevilacqua, P. C., George, C. X., Samuel, C. E., Cech, T. R. Binding of the protein kinase PKR to RNAs with secondary structure defects: Role of the tandem A - G mismatch and noncontigous helixes. Biochemistry. 37 (18), 6303-6316 (1998).
  17. Krishnamoorthy, T., Pavitt, G. D., Zhang, F., Dever, T. E., Hinnebusch, A. G. Tight Binding of the Phosphorylated Subunit of Initiation Factor 2 (eIF2) to the Regulatory Subunits of Guanine Nucleotide Exchange Factor eIF2B Is Required for Inhibition of Translation Initiation. Molecular and Cellular Biology. 21 (15), 5018-5030 (2001).
  18. Rothenburg, S., Georgiadis, M. M., Wek, R. C. Evolution of eIF2α kinases: Adapting translational control to diverse stresses. Evolution of the Protein Synthesis Machinery and Its Regulation. , 235-260 (2016).
  19. Bratke, K. A., McLysaght, A., Rothenburg, S. A survey of host range genes in poxvirus genomes. Infection, Genetics and Evolution. 14, 406-425 (2013).
  20. Chang, H. W., Watson, J. C., Jacobs, B. L. The E3L gene of vaccinia virus encodes an inhibitor of the interferon-induced, double-stranded RNA-dependent protein kinase. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (11), 4825-4829 (1992).
  21. Romano, P. R., et al. Inhibition of double-stranded RNA-dependent protein kinase PKR by vaccinia virus E3: role of complex formation and the E3 N-terminal domain. Molecular and Cellular Biology. 18 (12), 7304-7316 (1998).
  22. Beattie, E., Tartaglia, J., Paoletti, E. Vaccinia virus-encoded eIF-2 alpha homolog abrogates the antiviral effect of interferon. Virology. 183 (1), 419-422 (1991).
  23. Park, C., Peng, C., Brennan, G., Rothenburg, S. Species-specific inhibition of antiviral protein kinase R by capripoxviruses and vaccinia virus. Annals of the New York Academy of Sciences. 1438 (1), 18-29 (2019).
  24. Rothenburg, S., Brennan, G. Species-Specific Host-Virus Interactions: Implications for Viral Host Range and Virulence. Trends in Microbiology. , (2019).
  25. Chakrabarti, S., Sisler, J. R., Moss, B. Compact, synthetic, vaccinia virus early/late promoter for protein expression. BioTechniques. 23 (6), 1094-1097 (1997).
  26. Chung, C. T., Niemela, S. L., Miller, R. H. One-step preparation of competent Escherichia coli: Transformation and storage of bacterial cells in the same solution (recombinant DNA). Biochemistry. 86, 2172-2175 (1989).
  27. Chung, C. T., Miller, R. H. Preparation and storage of competent Escherichia coli cells. Methods in Enzymology. 218, 621-627 (1993).
  28. Rahman, M. M., Liu, J., Chan, W. M., Rothenburg, S., McFadden, G. Myxoma Virus Protein M029 Is a Dual Function Immunomodulator that Inhibits PKR and Also Conscripts RHA/DHX9 to Promote Expanded Host Tropism and Viral Replication. PLOS Pathogens. 9 (7), 1003465 (2013).
  29. Evans, D. H., Stuart, D., McFadden, G. High levels of genetic recombination among cotransfected plasmid DNAs in poxvirus-infected mammalian cells. Journal of Virology. 62 (2), 367-375 (1988).
  30. Ball, L. A. High-frequency homologous recombination in vaccinia virus DNA. Journal of Virology. 61 (6), 1788-1795 (1987).
  31. Spyropoulos, D. D., Roberts, B. E., Panicali, D. L., Cohen, L. K. Delineation of the viral products of recombination in vaccinia virus-infected cells. Journal of Virology. 62 (3), 1046-1054 (1988).
  32. Liu, L., et al. Transient dominant host-range selection using Chinese hamster ovary cells to generate marker-free recombinant viral vectors from vaccinia virus. BioTechniques. 62 (4), 183-187 (2017).

Tags

אימונולוגיה וזיהום סוגיה 159 וירוס Vaccinia Recombination Poxvirus מגוון מחשב מארח קינאז בחלבון E3L-mCherry
דור מהיר, ללא תפר של רקומביננטי Poxviruses באמצעות טווח מארח ובחירה חזותית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vipat, S., Brennan, G., Park, C.,… More

Vipat, S., Brennan, G., Park, C., Haller, S. L., Rothenburg, S. Rapid, Seamless Generation of Recombinant Poxviruses using Host Range and Visual Selection. J. Vis. Exp. (159), e61049, doi:10.3791/61049 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter