Summary
Dette manuskript præsenterer en protokol til at fremkalde aktiv eksperimentel autoimmun encephalomyelitis (EAE) i mus. En metode til isolering og karakterisering af de infiltrerede lymfocytter i centralnervesystemet (CNS) præsenteres også for at vise, hvordan lymfocytter er involveret i udviklingen af CNS autoimmun sygdom.
Abstract
Multipel sklerose (MS) er en autoimmun sygdom i centralnervesystemet (CNS) forårsaget af kombinationen af miljømæssige faktorer og modtagelig genetisk baggrund. Eksperimentel autoimmun encephalomyelitis (EAE) er en typisk sygdomsmodel af MS, der i vid udstrækning anvendes til undersøgelse af patogenese, hvor T-lymfocytter, der er specifikke for myelinantigener, indleder en inflammatorisk reaktion i CNS. Det er meget vigtigt at vurdere, hvordan lymfocytter i CNS regulere udviklingen af sygdom. Men, tilgang til måling af mængden og kvaliteten af infiltrerede lymfocytter i CNS er meget begrænset på grund af vanskelighederne med at isolere og detektere infiltrerede lymfocytter fra hjernen. Dette manuskript præsenterer en protokol for, der er nyttig for isolering, identifikation og karakterisering af infiltrerede lymfocytter fra CNS og vil være nyttigt for vores forståelse af, hvordan lymfocytter er involveret i udviklingen af CNS autoimmune sygdom.
Introduction
Som en kronisk demyeliniserende sygdom i CNS, MS påvirker omkring 2,5 millioner mennesker på verdensplan og mangler helbredende behandlinger1. Det betragtes også som en autoimmun sygdom, hvor myelin antigen specifikke T lymfocytter indlede en inflammatorisk reaktion og føre til demyelinisering og axonal skade i CNS2. Eksperimentel autoimmun encephalomyelitis (EAE) er blevet udbredt til at undersøge patogene mekanismer af MS som en klassisk autoimmun demyelinær sygdom model i CNS3. Der er to måder at fremkalde EAE: den ene er at fremkalde EAE aktivt ved at immunisere dyr med myelin komponenter, en anden er adoptivoverførsel ved at overføre encephalitogenic T-celler i receptor2,,4,5. Modtageligheden for EAE er forskellige i forskellige dyrestammer6. I C57BL/6 mus, myelin oligodendrocyt glycoprotein (MOG) 35-55 udfordring inducerer en monofasisk sygdom med omfattende demyelinisering og betændelse i CNS, som ofte anvendes i forsøg med gen-målrettede mus7.
Generering af myelinspecifikke reaktive T-celler er nødvendig for forekomst og udvikling af sygdom i EAE og er et immunologisk tegn på både EAE og MS. Aktiverede autoreaktive T-lymfocytter krydser blod-hjernebarrieren (BBB) i den sunde CNS og initierer EAE-sygdommen. Når MOG 35-55 Ag er stødt på, disse T lymfocytter fremkalde betændelse og rekruttering af effektor celler i CNS, resulterer i demyelinisering og axon destruktion8,9. I EAE-modellen er der rigelige beviser for, at neuroantigenspecifikke CD4+ T-celler kan initiere og opretholde neuroinflammation og patologi3,10. Afhængigt af de vigtigste cytokiner, der produceres, er CD4+ T-lymfocytter blevet klassificeret i forskellige delmængder: Th1 (karakteriseret ved produktion af interferon-γ), Th2 (karakteriseret ved produktion af interleukin 4) og Th17 (karakteriseret ved produktion af interleukin 17). Det menes, at aktivering af Th1 og Th17 celler bidrage til induktion, vedligeholdelse og regulering af inflammatorisk demyelinisering i EAE og MS ved at udskille effektor cytokiner IFN-γ og IL-17, som er i stand til at aktivere makrofager og rekruttere neutrofiler til de steder inflammatoriske at fremskynde læsioner11.
Da autoreaktive T-celler krydser BBB i CNS og fremkalder sygdomsudvikling i MS og EAE, er det meget vigtigt at analysere T-celler i CNS. Der er dog meget få etablerede protokoller for isolering af lymfocytter fra CNS12. Derfor blev der udviklet en metode, der er optimeret til isolering af mononukleare celler fra hjernen og analyse af T-lymfocytter med markører CD45, CD11b, CD3, CD4, INF-g og IL-17 for flowcytometri. Metoden bruger MOG35-55 adjuvans Mycobacterium tuberkulose H37 Ra og Pertussis Toksin Working Solution (PTX) til at fremkalde en aktiv immuniseringsmodel af EAE i mus. Derefter anvendes mekaniske adskillelses- og tæthedsgradientueringsmetoder til isolering af CNS mononukleare celler. Endelig bruges en optimeret flow cytometri gating strategi til at identificere T lymfocytter og delmængder fra hjernen ved farvning flere markører.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder, der er beskrevet her, er blevet godkendt af dyrene udvalg af School of Basic Medical Sciences, Shanghai Jiao Tong University.
1. Fremstilling af materialerne
- Brug MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK sekvensen af MOG35-55 til at opnå det frysede peptid fra kommercielle kilder. Sørg for, at peptidets renhed er >95%. Der klargøres 10 mg/ml MOG-lageropløsning i fosfatbufferet saltvand (PBS), og der opbevares ved -20 °C.
- Der klargør en 4 mg/ml stockopløsning af M. tuberkulose H37 Ra ved at sætte et 100 mg rør M. tuberkulose H37 Ra i 25 ml af Complete Freunds Adjuvant (CFA) og blanding. Lageropløsningen opbevares ved -20 °C.
- Der klargørs 1 ng/μL Pertussis Toksinarbejdsopløsning (PTX) ved at tilsætte 50 μg PTX i 50 ml PBS. Arbejdsopløsningen opbevares ved -20 °C.
- Opbevar alle antistoffer (dvs. FITC anti-mus CD3, PE/Cy7 anti-mus CD4, PerCP/Cy5.5 anti-mus CD11b, Alexa Fluor700 anti-mus CD45.2, PE anti-mus IL-17A, og APC anti-mus IFN-γ) ved 4 °C.
- Gør Flow Cytometri Farvning (FCS) Buffer ved at tilføje 2 mM ethylendiamin tetraacetsyre (EDTA) og 1% føtal kvæg serum (FBS) i 500 ml PBS.
2. Hus af C57BL/6 mus
- Brug hunC57BL/6 mus i alderen 8-12 uger.
- Akklimatisere C57BL/6J mus i mindst 7 dage før injektionen.
- Hus mus i et dyreanlæg under patogen-fri forhold ved konstant temperatur og fugtighed i en 12 h lys / mørk cyklus og giver fri adgang til vand og standard pellet fødevarer.
3. Immunisering af C57BL/6 mus
- Lad alle lageropløsninger blive ladt i 15 minutter ved stuetemperatur (RT) for at sikre fuldstændig rehydrering.
- 300 μL MOG-peptidsopløsning fortyndes med 700 μL PBS til klargøring af 3 mg/ml arbejdsopløsning.
- Sæt 1 ml M. tuberkulose H37 Ra lageropløsning og 1 ml MOG35-55 peptider arbejdsopløsning i separate 10 ml sprøjter, og brug derefter en firevejs stophane til at emulgere i mindst 10 min. Sørg for fuldstændig emulgering før injektion.
- Bedøve mus på toppen af EAE med en intraperitoniel injektion af 1% natrium pentobarbital (50 mg/kg).
- Med en 1 ml sprøjte injicerer subkutende mus med 100 μL MOG 35-55/CFA emulsion (300 μg/200 μL) to steder, begge på bagsiden nær halsen. Subkutanet injicere kontrol mus med 200 μL PBS.
- Samme dag (dag 0) og på dag 2 efter immunisering (PI) injicerer Intraperitonealt mus med 200 μL 1 ng/μL PTX-arbejdsopløsning. Intraperitoneally injicere kontrol mus med 200 μL PBS.
- Overfør musene til deres hjem bur med en opvarmning pad.
- Alle mus undersøges og gradiskes hver dag efter injektionen på en blindet måde for de neurologiske tegn, der er vist i tabel 111,13. Aflive dyrene, hvis scoren er værre end grad 4.
- Optag vægtændringerne under sygdomsforløbet. Dette er en værdifuld yderligere foranstaltning for sygdomsaktivitet i EAE-modellen11,13.
- Tilsæt den første dag af kliniske tegn for individuelle mus og dividere med antallet af mus i gruppen; resultatet er starten. Tilføj den første dag i den maksimale EAE-score for individuelle mus, og divider med antallet af mus i gruppen. resultatet er toppen.
4. Enkeltcellesuspension fra hjernen
- Fortyndet tæthedsgradientmedium i forholdet 9:1 med PBS i et 15 ml konisk rør for at give en endelig opløsning på 100 %.
- Bedøve mus på toppen af EAE med en intraperitoniel injektion af 1% natrium pentobarbital (50 mg/kg) og perfuse intracardially med 20 ml steril iskold PBS. Opnå dette ved langsomt og støt at injicere PBS i hjertets venstre hjertekammer ved hjælp af en 20 ml sprøjte og åbne højre atrium.
- Skær kraniet forsigtigt fra næsen til halsen, derefter fjerne hjernen fra kraniekassen i 10 ml RPMI i 50 ml koniske rør. Bland godt for at fjerne klæbende røde blodlegemer. Fjern derefter mediet ved aspiration og tilsæt 10 ml RPMI.
- Placer hjerner og medium i en 100 mm skål. Hak fint med et barberblad.
- Overfør 6 ml fra skålen til en iskold 7 ml sintret glashomogenisator med en ren pipette. Undgå at efterlade store mængder væv i pipetten. En lille mængde er uundgåelig.
- Grind hjernen ved hjælp af "løs" stemplet af støderen først, derefter bruge den "stramme" stemplet, indtil suspensionen er homogen, og hæld i en prechilled 15 ml konisk rør og holde på is.
- Når alle prøverne er homogeniseret, anslås volumen. Juster lydstyrken med RPMI til 7 ml. Derefter anbringes 3 ml iskold 100% kældermembranmatrix i et kølet 15 ml konisk centrifugerør og tilsæt 7 ml af hjernen homogenat for at give et endeligt 30% tæthedsgradientmedium. Bland ved inversion et par gange. Må ikke vortex.
- For at sikre en skarp grænseflade, omhyggeligt og langsomt tilføje 1 ml af 70% underlag tæthed gradient medium i RPMI med en 3 ml pipette.
- Centrifuge ved 800 x g for kun 20 min ved 4 °C. Indstil accelerationen til 1 og deceleration til 0. Efter centrifugering, aspirere næsten alle de øverste fase, være omhyggelig med helt at fjerne myelin øverst(Figur 1).
- Fjern grænsefladen i et nyt 15 centrifugerør. Juster lydstyrken til 10 ml med RPMI.
- Centrifuge ved 500 x g i 10 min. Efter centrifugering, aspirere supernatant. Opslæm pellet i ~ 200 μL flow cytometri farvning (FSC) buffer. Pillerne er derefter klar til at plette for FACS.
5. Flow cytometrisk analyse af enkelte celler fra hjernen
- Brug et hæmocytometer og mikroskop til at tælle cellerne. Der tilsættes 10 μL af cellerne til 10 μL trypanblå, blandes godt, og der skal sættes 10 μL på et hæmocytometer for at tælle cellerne. Derefter beregnes antallet af levende celler pr. mikroliter under et omvendt mikroskop (f.eks.
- Aliquot ca 2 x 106 af celler i RPMI i en enkelt brønd af en 96 brønd plade.
- Tilføj 500x celle stimulation cocktail plus protein transport hæmmere til brøndene.
- Pladen inkuberes i inkubatoren ved 37 °C i 4 timer.
- Centrifuge cellerne ved 400 x g i 5 min ved RT. Kassér supernatanten og opslæm cellerne i 100 μL FCS Buffer.
- Preincubate cellerne med anti-mus CD16/CD32 Fc blok (1:33) i 10 min ved 4 °C før farvning at blokere uspecifikke Fc-medieret interaktioner.
- Pletcelleoverflademarkører uden vask. Tilføj anti-mus CD45.2 (1:200), anti-mus CD11b (1:200), anti-mus CD3 (1:200), og anti-mus CD4 (1:200) antistoffer.
BEMÆRK: For at bestemme positive og negative porte skal der farves en fluorescens minus en (FMO) for hver farve og et isotypekontrolantistof. - Pladen inkuberes i mindst 30 minutter ved 4 °C eller på is. Beskyt mod lys.
- Vask cellerne ved at tilføje FCS Buffer. Brug 200 μL/brønd til mikrotiterplader. Centrifuge ved 400 x g i 5 min. ved RT. Kassér supernatanten.
- Der tilsættes 200 μL intracellulær (IC) fikseringsbuffer til hver brønd for at fiksere cellerne. Sørg for, at cellerne er fuldt resuspenderet i opløsningen.
- Inkuber 30-60 min på RT. Beskyt mod lys.
- Centrifuge prøverne ved 400 x g ved RT i 5 min. Kassér supernatanten.
- Der tilsættes 200 μL 1x permeabiliseringsbuffer til hver brønd, og prøverne centrifugeres ved 400 x g ved RT i 5 min. Kassér supernatanten.
- Pellets skal opbruges i restvolumen, og volumenet justeres til ca. 100 μL med en permeabiliseringsbuffer.
- Der tilsættes antimuse-IL-17A (1:200) og antimusede IFN-g (1:200) antistoffer til påvisning af intracellulære antigener på celler.
- Inkuberes i mindst 30 minutter ved 4 °C. Beskyt mod lys.
- Der tilsættes 100 μL 1x permeabiliseringsbuffer til hver brønd, og prøverne centrifugeres ved 400 x g ved RT i 5 min. Kassér supernatanten.
- Opslænkning af de farvede celler i 100 μL flowcytometrifarvningsbuffer.
- Analysér efter flowcytometri.
BEMÆRK: Laser- og kompensationsindstillingerne på flowcytometeret justeres, prøverne placeres på cytometeret, og alle hændelser registreres i henhold til producentens anbefalinger.
6. Dataanalyse
- Gate singlets ved hjælp af FSC-A vs FSC-H og SSC-A vs SSC-H.
- Gate live celler ved hjælp af FSC-A og SSC-A baseret på størrelse.
- Dernæst identificere leukocytter, undtagen monocytter, ved gating på CD45+ CD11b- celler.
- Derefter identificere cd4 T lymfocytter ved gating på CD3 + CD4 + celler.
- Endelig identificeres delsætterne Th1 og Th17 ved at gating på IFN-γ+ celler og IL-17+ celler separat, og de positive og negative populationer ved hjælp af isotypekontrol og FMO bestemmes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter immunisering af C57BL/6 mus blev alle mus vejet, undersøgt og klassificeret dagligt for neurologiske tegn. EAE's repræsentative kliniske forløb bør resultere i en sygdomskurve som præsenteret i figur 2A og en ændring af kropsvægten i musen som præsenteret i figur 2B. C57BL/6 mus immuniseret med MOG35-55 normalt begyndte at udvikle sygdomssymptomer omkring dag 10-12 og opnåede toppen af sygdommen omkring dag 15-21 efter aktiv immunisering (Figur 2A). Vægtændring var en værdifuld indikator i EAE-modellen. Før sygdommens indtræden steg kropsvægten af immuniserede mus gradvist, og derefter faldt de typisk korreleret med de stigende sygdomssymptomer. På toppen af EAE viste mus også den laveste kropsvægt (Figur 2B). Så kropsvægt genvundet lidt som kliniske symptomer faldt. Musene kom sig dog normalt ikke helt. C57BL/6 mus udviklede en monofase kronisk sygdomspatologi ved MOG35-55-udfordringen (Figur 2A).
Eae's kliniske sværhedsgrad er direkte forbundet med automatisk aktivering af T-celler14. Neuroantigen-specifikke CD4+ T-celler er i stand til at indlede og opretholde neuroinflammation og patologi i EAE3. De typiske egenskaber ved CD4+T-celler i toppen af EAE er vist i figur 3. Endvidere blev andelen af delmængder af Th1 og Th17 i encephalitogene celler, som er de vigtigste patogene celler, der mægle EAE, analyseret ved flowcytometri. Efter adskillelsen af en enkeltcellesuspension fra hjernen blev cellerne plettet med CD45, CD11b, CD3, CD4, IFN-γ og IL-17 antistoffer, som udtrykkes af T-lymfocytter. FSC-A vs FSC-H og SSC-A vs SSC-H blev brugt til gate singlets (Figur 3A, B), så FSC-A vs SSC-A blev brugt til gate levende celler baseret på størrelse og granularitet (Figur 3C). Efter, CD45+ CD11b- celler blev gated til at identificere leukocytter undtagen monocytter (Figur 3D). Derefter blev porten sat på CD3+CD4+ for at identificere CD4+ T lymfocytter (Figur 3E). Endelig blev IFN-γ og IL-17 anvendt til at identificere delmængderne 1.Figure 3F Ifølge den kliniske sværhedsgrad af sygdommen, repræsentative resultater viste, at IFN-γ-producerende Th1 og IL-17-producerende Th17 celler signifikant steg i encephalitogene celler fra EAE mus.
| Grade | Klinisk tegn |
| 0 | ingen sygdom |
| 1 | nedsat haletone eller lidt klodset gangart |
| 2 | hale atoni og moderat klodset gangart og / eller dårlig rette evne |
| 3 | lemmer svaghed |
| 4 | lemmer lammelse |
| 5 | døende tilstand. |
Tabel 1: Klinisk pointsystem. C57BL/6 mus blev immuniseret med MOG35-55 peptid. Derefter blev der registreret neurologiske tegn. Der blev anvendt et 5-punkts pointsystem til at vurdere sværhedsgraden af EAE.
Figur 1: Skematisk for Percoll-gradientopsætningen til isolering af mononukleare celler. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Eae's repræsentative kurs. EAE blev induceret i C57BL/6 mus ved injektion af MOG35-55 som beskrevet i protokollen. Den kliniske score (A) og ændringen af kropsvægt (B) blev bestemt i disse mus. Data præsenteres som middelværdi ± SEM. n = 8 for hver gruppe. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Repræsentativ flowcytometrianalyse af lymfocytter i hjernen. En enkeltcellesuspension blev isoleret fra hjernen i toppen af EAE. Gating strategi T lymfocytter er vist. Singlets blev gated som FSC-A vs FSC-H og SSC-A vs SSC-H (A,B). Levende celler blev gated som FSC-A vs SSC-A (C). Leukocytter undtagen monocytter blev gated som CD45+ CD11b- (D). CD4+ T lymfocytter blev gated som CD3+CD4+ (E). Th1 og Th17 delmængder blev gated som IFN-γ+ og IL-17+ (F). Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne undersøgelse præsenterer en protokol til at fremkalde og overvåge EAE ved hjælp af MOG35-55 i C57BL/6 mus, som betragtes som en typisk neuroimmunologisk eksperimentel dyremodel af MS. EAE kan induceres varierende mus stammer eller den type protein, der anvendes til induktion i henhold til formålet med undersøgelsen. For eksempel, ved hjælp af PLP139-151 peptid i SJL mus kan fremkalde en recidiveløsning-remitterende EAE sygdom kursus, der er særligt velegnet til vurdering af terapeutiske virkninger på tilbagefald15. Den her beskrevne forsøgsprocedure kan også anvendes på andre EAE-protokoller7. I denne model er C57BL/6 mus immuniseret med MOG35-55 peptid og udvikler en monofasisk sygdom. Et 5-punkts pointsystem bruges til at vurdere sværhedsgraden af EAE. Selv om flere scoringssystemer fra 0-3 point eller 0-10 point er ansat til at score sygdomssværhedsgrad7,16,17, viser disse resultater, at et 5-punkts scoringssystem er i stand til at bestemme statistisk signifikante forskelle i sygdomsscorer mellem grupper og andre EAE-scoringssystemer, der ikke fører til åbenlyse forbedringer.
EAE-sværhedsgraden evalueres generelt med et klinisk EAE-partitur, der tager hensyn til sværhedsgraden af neurologisk dysfunktion11,13. For at sikre sammenligneligheden af forsøget for alle mus er det vigtigt at holde dem under de samme betingelser, herunder ændringer af bur, administration af mad og vand, og især mushusforhold. Desuden bør krydsimmunisering også udføres for at undgå bur-specifikke fænomener fremkaldt af investigator.
Denne undersøgelse giver en metode til at adskille mononukleare celler fra CNS, der er egnet til FACS analyse eller funktionelle undersøgelse. For at sikre, at blodet fjernes fra CNS-vævet, skal musene perfunderes, før vævet adskilles. Rensningen af de mononukleare celler på en tæthedsgradientuering er et vigtigt skridt i isolationen. For at sikre en adskillelseseffekt indstilles centrifugens acceleration og deceleration til henholdsvis 1 og 0. Ved hjælp af denne metode er udbyttet af en enkelt celle normalt lavt fra normal hjerne, men højere fra syge hjerner med EAE. Repræsentative resultater viser, at der er en tydelig stigning i CD3+CD4+ T lymfocytter, især IFN-γ producerende celler og IL-17 producerende celler, som anses for at bidrage til den forværrede sygdom.
Der er visse begrænsninger i denne protokol. EAE-modellen med MOG35-55 viser hovedsageligt et CD4+ T celledrevet immunologisk respons. Hvis rollen som CD8+ T-celler og B-celler skal analyseres, bør alternative protokoller overvejes. Som en CNS inflammatorisk sygdom, en alvorlig patologisk fænotype findes også i rygmarven i EAE model. Men på grund af tilstedeværelsen af store mængder myelin, er det svært at få nok enkelte celler fra rygmarven til FACS analyse. I så fald, ved hjælp af immunohistochemistry eller immunofluorescens at analysere rygmarvsvæv er nødvendig. Der er også forskere, der sætter hjernen og rygmarven sammen for at adskille mononukleare celler til FACS analyse12. Denne protokol adskiller enkelte celler fra hjernen til FACS analyse og rygmarvsvæv til immunhisemi og immunfluorescens analyse.
Betydningen af T-lymfocytter i immunreguleringen af MS og EAE har fået mere og mere opmærksomhed på det seneste. Meget af den offentliggjorte litteratur fokuserer på milt og lymfeknuder11; lymfocytter findes dog i hele CNS af EAE-mus, og derfor er den karakteristiske analyse af T-lymfocytter i CNS nødvendig. Immunhistologisk farvning af sektioner kan identificere infiltrerende celler i CNS. Men, fænoypiske og funktionelle analyse er begrænset. Efter isolering af immuncellerne fra CNS af normale eller syge mus, analysen af mere detaljerede fænotyper bliver mulig. Med denne metode kan T-lymfocytter i hjernen studeres celle for celle, og ekspressionen af forskellige overflademarkører, cytokiner, chemokines og transskriptionsfaktorer (f.eks. intracellulære proteiner) kan analyseres bedre. Protokollen vil være nyttig for fremtidige undersøgelser for at vurdere fænotype og funktion af T lymfocytter i hjernen i løbet af MS og EAE.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at erklære.
Acknowledgments
Denne forskning blev støttet af National Natural Science Foundation of China tilskud (31570921 til ZJ, 81571533 til LS), Shanghai Municipal Commission of Health, and Family Planning (201540206 til ZJ), Ruijin Hospital North forskningstilskud (2017ZX01 til ZJ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor700 anti-mouse CD45.2 | eBioscience | 56-0454-82 | |
| Anti-Mouse CD16/CD32 Fc block | BioLegend | 101302 | |
| APC anti-mouse IFN-g | eBioscience | 17-7311-82 | |
| BD LSRFortessa X-20 | BD | ||
| Dounce homogenizer | Wheaton | 353107542 | |
| eBioscience Cell Stimulation Cocktail (plus protein transport inhibitors) (500X) | eBioscience | 00-4975-03 | |
| eBioscience Intracellular Fixation & Permeabilization Buffer Set | eBioscience | 88-8824-00 | |
| FITC anti-mouse CD3 | BioLegend | 100203 | |
| FITC Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400605 | |
| Freund's Adjuvant Complete (CFA) | Sigma-Aldrich | F5881 | |
| Mouse IgG2a kappa Isotype Control (eBM2a), Alexa Fluor 700, eBioscience | eBioscience | 56-4724-80 | |
| Mycobacterium tuberculosis H37 Ra | Difco Laboratories | 231141 | |
| PE anti-mouse IL-17A | eBioscience | 12-7177-81 | |
| PE/Cy7 anti-mouse CD4 | BioLegend | 100422 | |
| PE/Cy7 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400617 | |
| Percoll | GE | 17-0891-01 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD11b | BioLegend | 101228 | |
| PerCP/Cy5.5 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400631 | |
| pertussis toxin (PTX) | Sigma-Aldrich | P-2980 | |
| Rat IgG1 kappa Isotype Control (eBRG1), APC, eBioscience | eBioscience | 17-4301-82 | |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control (eBR2a), PE, eBioscience | eBioscience | 12-4321-80 | |
| Rat MOG35–55 peptides | Biosynth International | MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK |
References
- Milo, R., Kahana, E. Multiple sclerosis: geoepidemiology, genetics and the environment. Autoimmunity Reviews. 9, 387-394 (2010).
- Gold, R., Linington, C., Lassmann, H. Understanding pathogenesis and therapy of multiple sclerosis via animal models: 70 years of merits and culprits in experimental autoimmune encephalomyelitis research. Brain : A Journal of Neurology. 129, 1953-1971 (2006).
- Simmons, S. B., Pierson, E. R., Lee, S. Y., Goverman, J. M. Modeling the heterogeneity of multiple sclerosis in animals. Trends in Immunology. 34 (8), 410-422 (2013).
- Lassmann, H., Wisniewski, H. M. Chronic relapsing experimental allergic encephalomyelitis: clinicopathological comparison with multiple sclerosis. Archives of Neurology. 36, 490-497 (1979).
- Bernard, C. C., Leydon, J., Mackay, I. R. T cell necessity in the pathogenesis of experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. European Journal of Immunology. 6, 655-660 (1976).
- Yasuda, T., Tsumita, T., Nagai, Y., Mitsuzawa, E., Ohtani, S. Experimental allergic encephalomyelitis (EAE) in mice. I. Induction of EAE with mouse spinal cord homogenate and myelin basic protein. Japanese Journal of Experimental Medicine. 45, 423-427 (1975).
- Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells. European Journal of Immunology. 25, 1951-1959 (1995).
- Bramow, S., et al. Demyelination versus remyelination in progressive multiple sclerosis. Brain. 133, 2983-2998 (2010).
- Sospedra, M., Martin, R. Immunology of multiple sclerosis. Annual Reviews in Immunology. 23, 683-747 (2005).
- McGinley, A. M., Edwards, S. C., Raverdeau, M., Mills, K. H. G. Th17 cells, gammadelta T cells and their interplay in EAE and multiple sclerosis. Journal of Autoimmunity. 20 (14), 3394 (2018).
- Ji, Z., et al. Thiamine deficiency promotes T cell infiltration in experimental autoimmune encephalomyelitis: the involvement of CCL2. Journal of Immunology. 193, 2157-2167 (2014).
- Manglani, M., Gossa, S., McGavern, D. B. Leukocyte Isolation from Brain, Spinal Cord, and Meninges for Flow Cytometric Analysis. Current Protocols in Immunology. 121, 44 (2018).
- Ji, Z., et al. Obesity promotes EAE through IL-6 and MCP-1-mediated T cells infiltration. Frontiers in Immunology. 10, 1881 (2019).
- Reiseter, B. S., Miller, G. T., Happ, M. P., Kasaian, M. T. Treatment of murine experimental autoimmune encephalomyelitis with a myelin basic protein peptide analog alters the cellular composition of leukocytes infiltrating the cerebrospinal fluid. Journal of Neuroimmunology. 91, 156-170 (1998).
- Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. Journal of Visualized Experiments. (86), e51275 (2014).
- Miller, S. D., Karpus, W. J. Experimental autoimmune encephalomyelitis in the mouse. Current Protocols in Immunology. , Chapter 15, Unit 15 11 (2007).
- Tietz, S. M., Engelhardt, B. Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo. Journal of Visualized Experiments. (145), e59249 (2019).
