Dette manuskriptet presenterer en protokoll for å indusere aktiv eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE) hos mus. En metode for isolasjon og karakterisering av infiltrerte lymfocytter i sentralnervesystemet (CNS) presenteres også for å vise hvordan lymfocytter er involvert i utviklingen av CNS autoimmun sykdom.
Multippel sklerose (MS) er en autoimmun sykdom i sentralnervesystemet (CNS) forårsaket av kombinasjonen av miljøfaktorer og mottakelig genetisk bakgrunn. Eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE) er en typisk sykdomsmodell av MS som er mye brukt til å undersøke patogenesen der T-lymfocytter spesifikke for myelinantigener initierer en inflammatorisk reaksjon i CNS. Det er svært viktig å vurdere hvordan lymfocytter i CNS regulerer utviklingen av sykdommen. Imidlertid er tilnærmingen for å måle mengden og kvaliteten på infiltrerte lymfocytter i CNS svært begrenset på grunn av vanskelighetene med å isolere og oppdage infiltrerte lymfocytter fra hjernen. Dette manuskriptet presenterer en protokoll for det som er nyttig for isolasjon, identifisering og karakterisering av infiltrerte lymfocytter fra CNS og vil være nyttig for vår forståelse av hvordan lymfocytter er involvert i utviklingen av CNS autoimmun sykdom.
Som en kronisk demyeliniserende sykdom i CNS påvirker MS ca. 2,5 millioner mennesker over hele verden og mangler kurative behandlinger1. Det regnes også som en autoimmun sykdom, hvor myelinantigenspesifikke T-lymfocytter initierer en inflammatorisk reaksjon og fører til demyelinasjon og axonal skade i CNS2. Eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE) har blitt mye brukt til å undersøke patogene mekanismer av MS som en klassisk autoimmun demyelinasjonssykdomsmodell i CNS3. Det er to måter å indusere EAE: en er å indusere EAE aktivt ved å immunisere dyr med myelinkomponenter, en annen er adoptivoverføring ved å overføre encefalitogene T-celler tilreseptor 2,,4,,5. Følsomheten for EAE er forskjellige i forskjellige dyrestammer6. I C57BL/6 mus induserer myelin oligodendrocyttglykoprotein (MOG) 35–55-utfordring en monofasisk sykdom med omfattende demyelinasjon og betennelse i CNS, som ofte brukes i eksperimenter med genmålrettede mus7.
Genereringen av myelinspesifikke reaktive T-celler er nødvendig for forekomst og utvikling av sykdom i EAE og er et immunologisk tegn på både EAE og MS. Aktiverte autoreaktive T-lymfocytter krysser blodhjernsbarrieren (BBB) inn i den sunne CNS og initierer EAE-sykdommen. Når MOG 35–55 Ag oppstår, induserer disse T-lymfocytene betennelse og rekruttering av effektorceller til CNS, noe som resulterer i demyelinasjon og aksonødeleggelse8,9. I EAE-modellen er det rikelig med bevis for at nevroantigenspesifikke CD4+ T-celler kan initiere og opprettholde nevroinflammasjon og patologi3,10. Avhengig av de store cytokinene som produseres, har CD4+ T-lymfocytter blitt klassifisert i forskjellige undergrupper: Th1 (preget av produksjon av interferon-γ), Th2 (preget av produksjon av interleukin 4), og Th17 (preget av produksjon av interleukin 17). Det antas at aktivering av Th1 og Th17 celler bidra til induksjon, vedlikehold og regulering av inflammatorisk demyelination i EAE og MS ved å skille ut effektor cytokiner IFN-γ og IL-17, som er i stand til å aktivere makrofager og rekruttere nøytrofiler til de inflammatoriske stedene for å akselererelesjonene 11.
Fordi autoreaktive T-celler krysser BBB inn i CNS og induserer utviklingen av sykdom i MS og EAE, er det svært viktig å analysere T-celler i CNS. Det er imidlertid svært få etablerte protokoller for isolering av lymfocytter fra CNS12. Derfor ble en metode optimalisert for å isolere mononukleære celler fra hjernen og analysere T-lymfocytter med markører CD45, CD11b, CD3, CD4, INF-g og IL-17 for strømningscytometri utviklet. Metoden bruker MOG35–55 adjuvant Mycobacterium tuberculosis H37 Ra og Pertussis Toxin Working Solution (PTX) for å indusere en aktiv immuniseringsmodell av EAE hos mus. Deretter brukes mekanisk separasjon og tetthet gradient sentrifugeringsmetoder for isolering av CNS mononukleære celler. Til slutt brukes en optimalisert strømningscytometri gating strategi for å identifisere T-lymfocytter og undergrupper fra hjernen ved å farge flere markører.
Denne studien presenterer en protokoll for å indusere og overvåke EAE ved hjelp av MOG35-55 i C57BL/6 mus, som regnes som en typisk nevroimmunologisk eksperimentell dyremodell av MS. EAE kan induseres varierende musstammer eller type protein som brukes til induksjon i henhold til formålet med studien. For eksempel kan bruk av PLP139-151 peptid hos SJL-mus indusere et residerende remitteringskurs for EAE-sykdom som er spesielt egnet for å vurdere terapeutiske effekter på tilbakefall15. Den eks…
The authors have nothing to disclose.
Denne forskningen ble støttet av National Natural Science Foundation of China stipend (31570921 til ZJ, 81571533 til LS), Shanghai Municipal Commission of Health, og Familieplanlegging (201540206 til ZJ), Ruijin Hospital North forskningsstipend (2017ZX01 til ZJ).
Alexa Fluor700 anti-mouse CD45.2 | eBioscience | 56-0454-82 | |
Anti-Mouse CD16/CD32 Fc block | BioLegend | 101302 | |
APC anti-mouse IFN-g | eBioscience | 17-7311-82 | |
BD LSRFortessa X-20 | BD | ||
Dounce homogenizer | Wheaton | 353107542 | |
eBioscience Cell Stimulation Cocktail (plus protein transport inhibitors) (500X) | eBioscience | 00-4975-03 | |
eBioscience Intracellular Fixation & Permeabilization Buffer Set | eBioscience | 88-8824-00 | |
FITC anti-mouse CD3 | BioLegend | 100203 | |
FITC Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400605 | |
Freund's Adjuvant Complete (CFA) | Sigma-Aldrich | F5881 | |
Mouse IgG2a kappa Isotype Control (eBM2a), Alexa Fluor 700, eBioscience | eBioscience | 56-4724-80 | |
Mycobacterium tuberculosis H37 Ra | Difco Laboratories | 231141 | |
PE anti-mouse IL-17A | eBioscience | 12-7177-81 | |
PE/Cy7 anti-mouse CD4 | BioLegend | 100422 | |
PE/Cy7 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400617 | |
Percoll | GE | 17-0891-01 | |
PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD11b | BioLegend | 101228 | |
PerCP/Cy5.5 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400631 | |
pertussis toxin (PTX) | Sigma-Aldrich | P-2980 | |
Rat IgG1 kappa Isotype Control (eBRG1), APC, eBioscience | eBioscience | 17-4301-82 | |
Rat IgG2a kappa Isotype Control (eBR2a), PE, eBioscience | eBioscience | 12-4321-80 | |
Rat MOG35–55 peptides | Biosynth International | MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK |