Vi presenterar en modell av skandinaviska hjärtsjukdomar med hjälp av kardiomyocyter som härrör från mänskliga inducerad pluripotenta stamceller, tillsammans med en metod för kvantitativ utvärdering av vävnadsskador som orsakas av ischemi. Denna modell kan ge en användbar plattform för läkemedelsscreening och ytterligare forskning om ischemisk hjärtsjukdom.
Ischemisk hjärtsjukdom är en betydande dödsorsak över hela världen. Det har därför varit föremål för en enorm mängd forskning, ofta med små djurmodeller som gnagare. Människohjärtats fysiologi skiljer sig dock avsevärt från gnagarhjärtats, vilket understryker behovet av kliniskt relevanta modeller för att studera hjärtsjukdom. Här presenterar vi ett protokoll för att modellera ischemisk hjärtsjukdom med hjälp av kardiomyocyter differentierade från mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (hiPS-CMs) och att kvantifiera skador och funktionella nedskrivningar av de ischemiska kardiomyocyter. Exponering för 2% syre utan glukos och serum ökar andelen skadade celler, vilket indikeras genom färgning av kärnan med propidium iodid, och minskar cellulär livskraft. Dessa villkor minskar också kontraktility av hiPS-CMs som bekräftas av förskjutning vektor fält analys av mikroskopiska videobilder. Detta protokoll kan vidare ge en bekväm metod för personligt anpassad läkemedelsscreening genom att underlätta användningen av hiPS-celler från enskilda patienter. Därför kan denna modell av ischemisk hjärtsjukdom, baserad på iPS-CMs av mänskligt ursprung, ge en användbar plattform för läkemedelsscreening och ytterligare forskning om ischemisk hjärtsjukdom.
Ischemisk hjärtsjukdom (IHD) är erkänd över hela världen som den vanligaste dödsorsaken, och det uppskattades vara ansvarig för mer än nio miljoner dödsfall i 20161. Förekomsten av hjärt-kärlsjukdom fortsätter att öka, och globaliseringen verkar ha bidragit till förekomsten av riskfaktorer hjärtsjukdomar i utvecklingsländerna. Därför är studien av IHD blir allt mer brådskande2.
Experimentella modeller av hjärt-kärlsjukdom är avgörande för att studera mekanismerna för sjukdom, noggrannhet diagnos, och utveckling av nya terapier. Flera experimentella modeller har föreslagits av många laboratorier. Det är av yttersta vikt att välja en modell med betydande fördelar; genomförbarhet, repeterbarhet och likhet med mänskliga sjukdomar är nyckelfaktorer vid valet av modeller för hjärt- ochkärlsjukdomar 3. Mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs) som bär på specifika kardiomyopati-associerade mutationer är ett lovande alternativ till djurmodeller4. Även om många strategier har beskrivits för att inducera kardiomyocyter med hjälp av iPSCs5,6,77,8,9, här ger vi en enkel metod för att producera en IHD-modell med hjälp av kardiomyocyter differentierade från hiPSCs, där mödosamt urval av kardiomyocyte med hjälp av markörer inte tillämpas. I denna metod väljs kardiomyocyter funktionellt genom att analysera spontan kontraktion.
Induktion av kardiomyocyter med hjälp av hiPSCs undviker djuroffer och tekniskt svårt kirurgi. Upprättande av djurmodeller av IHD kräver utmanande kirurgiska tekniker10. Att perfekt simulera de olika patofysiologiska aspekterna av mänskliga hjärtsjukdomar som hjärtfrekvens och actionpotentialer från gnagares fysiologi är nästan omöjligt. Tillsammans med moral och etik att använda djurmodeller, är utvecklingen av nya experimentella modeller än djurmodeller absolut nödvändigt. Kardiomyocyter differentierade från mänskliga iPS-celler bättre efterlikna det fysiologiska tillståndet i det mänskliga hjärtat. I detta protokoll upprättar vi en modell av IHD med hjälp av kardiomyocyter som härrör från hiPS-celler (hiPS-CMs). I vår modell leder berövande av syre och glukos till en minskning av den kontraktila kraft och livskraft hiPS-CMs. Vår metod ger en ny metod för modell-IHD och visar en ny plattform för studiet av denna sjukdom.
Forskare använder ofta laboratoriet små djurmodeller för att utföra IHD-experiment. Här utvecklade vi en cellkulturmodell av mänsklig IHD för att utföra sådana experiment.
Det största problemet en användare av detta protokoll kan möta är låg hastighet av differentierade kardiomyocyter. Flera steg bör vidtas med stor omsorg för att förbättra graden av framgångsrik differentiering: (a) vara skonsam vid pipettering eftersom cellerna lätt lossnar efter tillsättning av cellen dissociation enzymer reagens, b) om man lägger till Y-27632 ökar överlevnadsgraden för iPS-celler vid lösgöring, och c) tidpunkten för medelstora förändringar i början av differentiering bör vara exakt 48 h från varandra för att säkerställa kontrollerat uttryck för gener som är involverade i differentiering.
Angående de extracellulära matrisproteiner som används för beläggning av ytan på odlingsplattan, kan andra material än laminin vi använde i detta protokoll användas. Till exempel används Matrigel14,15, och gelatin16,17 för den matarfria underhållskulturen hos hiPSCs. Enligt Haraguchi et al., hiPSCs seedade på Matrigel var framgångsrikt differentieras till hjärt cell ark18.
Det finns ett antal föregående studier angående odlingsmodeller för sjukdomsmodellering med hjälp av kardiomyocyter som härrör från hiPSCs. När det gäller modellering av ischemi-reperfusion skada, manipuleringar av den cellulära miljön, såsom hyperkalemi, acidos, och laktat ackumulering, har införts19. Andra metoder är cell pelletering för att hindra syre diffusion20 och metabolisk hämning med hjälp av cyanid21. I det nuvarande protokollet uppnåddes cellskada genom relativt enkel metod, nämligen 24 h berövande av syre och näringsämnen. Man bör dock se till att överväga korrekta patofysiologiska processer av den ischemiska hjärtsjukdomen, eftersom det verkligen finns skillnader mellan sjukdomen in vivo och sjukdomsmodellen för det aktuella protokollet, såsom närvaron eller frånvaron av tredimensionell cellulär miljö och blod.
Angående den teknologiska aspekten av utvärderingen av kardiomyocytefunktionen rapporterade Toepfer et al. en MatLab-baserad algoritm för att bestämma sarkomerkontraktion och avslappning i hiPS-CMs22. Smith et al. rapporterade en avancerad metod för hög genomströmning elektrofysiologisk analys av retbara celler som härrör från hiPS-CMs, med hjälp av sofistikerade nanotopografiskt mönstrade multielektrod arrayer23,24. Fördelen med vårt protokoll är att det bara kräver konventionell programvara och förbrukningsvaror, såsom imageJ programvara och 96-brunnsplattor.
Med avseende på syrenivån i hjärtat, syretrycket i vener som når hjärtat tros vara 40 mmHg25. Enligt McDougal et al., det extracellulära syretrycket under hypoxi beräknas vara <12,8 mmHg26. Genom att tillämpa metoden av Rond o.a.27, beräknas syretrycket i odlingsmediet (salthalt: 35‰) under det hypoxiska tillståndet (2% syre) vid 37 °C som behandlats med det aktuella protokollet till 14,9 mmHg, vilket är högre än uppskattningen ovan. Intressant, Al-Ani et al. rapporterade att det finns en gradient av syre tryck i odlingsmediet, och syretrycket påverkas av celltyp, sådd densitet, och medelhög volym28. Vanligtvis är syrekoncentrationen längst ner på odlingsplattan där celler bor den lägsta. Därför skulle effekten av djup i odlingsmediet ytterligare minska det effektiva syretrycket nära hiPS-CMs. För att inducera tillräckliga skador på hiPS-CMs med hjälp av hypoxiskt tillstånd, måste noggrann uppmärksamhet ägnas åt djupet av medium och cellernas densitet.
Vår hiPS-CM-modell, som ligger mycket nära de fysiologiska tillstånden hos mänskliga hjärt myocyter, efterliknar med fördel mänsklig IHD. Djurmodellbaserade metoder inkluderar etiska, tekniska och akademiska frågor. Särskilt in vivo modeller kräver en avancerad teknik för mikrokirurgi för att uppnå reproducerbara data: t.ex., ocklusion av den främre fallande grenen av vänster kranskärl i gnagare3. HiPS-CM-modellen som beskrivs häri övervinner dessa kritiska hinder och ger en användbar, relevant och repeterbar plattform för hjärt-kärlsjukdom.
Vissa begränsningar bör dock noteras. En uppenbar skillnad mellan iPS-inducerad kardiomyocyter och normala kardiomyocyter är frånvaron av T-tubuli29, och vi inte inkludera humoral faktorer såsom vävnadsskador inducerad av leukocyter och aktivering av ett komplement system i vår studie. Dessutom bör graden av differentierade kardiomyocyter i denna modell (20,7 ± 9,6%, Kompletterande Figur 3) förbättras. Den nyligen publicerade publikationen av Halloin et al. beskriver en skalbar, kemiskt definierad metod för att inducera hiPS-CM renhet av >95% av kemiska WNT-vägmodulatorer utan krav på något urval av markörer30. Ändå är vår modell av mänskliga IHD relativt enkel och kliniskt tillämplig (t.ex. drog screening med hjälp av patient-härledda iPS celler). Vår modell är också en unik plattform för att ytterligare belysa mekanismer som ligger bakom IHDs.
The authors have nothing to disclose.
Denna studie stöddes av JSPS KAKENHI, Fonden för främjande av gemensam internationell forskning (Fostering Joint International Research), 17KK0168. Författarna erkänner tacksamt Central Research Laboratory, Okayama University Medical School för hjälp av FACS.
Actin staining reagent (ActinRed 555 ReadyProbes Reagent) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | R37112 | |
Anti cardiac troponin T antibody | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | MA5-12960 | |
Cardiomyocyte maintenance medium (PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A2921201 | |
Cell dissociation enzymes (TrypLE Select) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 12563011 | |
Differentiation medium A (PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A2921201 | |
Differentiation medium B (PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A2921201 | |
FACS Aria III system | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | ||
Fluorescenct microscope | KEYENCE, Osaka, Japan | BZ-X710 | |
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A28175 | |
Human iPS cells | RIKEN, Tsukuba, Japan | 201B7 | |
Hypoxic incubator | SANYO, Osaka, Japan | MCO-175M | |
iPSC growth medium (Essential 8 Medium) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A1517001 | |
iPSC maintenance medium (StemFit AK02N) | Ajinomoto, Tokyo, Japan | RCAK02N | |
Laminin (iMatrix-511) | Nippi, Tokyo, Japan | iMatrix-511 | |
MTT assay kit (MTT Cell Proliferation Assay Kit) | Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, USA | 10009365 | |
Nucleus staining reagent (NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | R37606 | |
Triton X-100 | Nacalai Tesque, Kyoto, Japan | 35501-02 |