Summary
Rapporteret her er en protokol til kvantificering af infektiøse virale partikler ved hjælp af realtidsovervågning af elektrisk impedans af inficerede celler. En praktisk anvendelse af denne metode præsenteres ved at kvantificere influenza A-virushenfald under forskellige fysisk-kemiske parametre, der efterligner miljøforholdene.
Abstract
Metoder til kvantificering af viruspartikler udgør et kritisk aspekt af mange virologiundersøgelser. Selvom der findes flere pålidelige teknikker, er de enten tidskrævende eller ude af stand til at opdage små variationer. Præsenteret her er en protokol til præcis kvantificering af viral titer ved at analysere elektriske impedansvariationer af inficerede celler i realtid. Cellulær impedans måles gennem guldmikroelektrodebiosensorer placeret under cellerne i mikroplader, hvor størrelsen afhænger af antallet af celler samt deres størrelse og form. Denne protokol tillader realtidsanalyse af celleproliferation, levedygtighed, morfologi og migration med øget følsomhed. Der gives også et eksempel på en praktisk anvendelse ved at kvantificere henfaldet af influenza A-virus (IAV), der er underkastet forskellige fysisk-kemiske parametre, der påvirker viral infektivitet over tid (dvs. temperatur, saltholdighed og pH). For sådanne applikationer reducerer protokollen den nødvendige arbejdsbyrde, samtidig med at der genereres præcise kvantificeringsdata for infektiøse viruspartikler. Det gør det muligt at sammenligne inaktiveringsskråninger mellem forskellige IAV, hvilket afspejler deres evne til at fortsætte i et givet miljø. Denne protokol er let at udføre, er meget reproducerbar og kan anvendes på enhver virus, der producerer cytopatiske virkninger i cellekultur.
Introduction
Overførslen af en virus er afhængig af kombinationen af flere faktorer. For en virus, der udskilles i miljøet, afhænger dens transmission også af evnen til at fortsætte under forhold uden for værten. Undersøgelse af viral inaktivering generelt er derfor et afgørende skridt i retning af at hjælpe de nationale sundhedsmyndigheder og politiske beslutningstagere med at gennemføre kontrol- og biosikkerhedsforanstaltninger.
Viden om viruspersistens i naturlige og laboratoriemæssige omgivelser er steget betydeligt i løbet af det sidste årti. I tilfælde af influenza A-vira (IAV) underkaster deres transmissionsveje virale partikler til en lang række miljøforhold. Specifikt kan de overføres via 1) fækal-orale veje gennem vand (dvs. fuglevirus) eller 2) direkte eller indirekte kontakt med forurenede fomitter samt aerosoler og åndedrætsdråber (dvs. fjerkræ- og pattedyrvirus)1. Under alle omstændigheder underkastes IAV forskellige fysisk-kemiske parametre (dvs. pH, saltholdighed, temperatur og fugtighed), som mere eller mindre hurtigt påvirker deres smitsomhed2,3,4,5,6,7,8,9. Det er af stor betydning, navnlig med hensyn til zoonotiske og pandemiske vira, at vurdere miljøfaktorernes potentiale til at påvirke virusdynamikken og risikoen for eksponering og overførsel på tværs af arter.
Hidtil er traditionelle virologiteknikker (dvs. viral titerbestemmelse gennem plaqueassays eller 50% vævskultur infektiøs dosisestimering) blevet brugt til at vurdere IAV-smitsomhed over tid; men disse teknikker er tidskrævende og kræver mange forsyninger10,11,12. Måling af inficerede celler impedans over tid med mikroelektroder tjener som et nyttigt værktøj til at overvåge IAV-overlevelse under forskellige miljøforhold samt viral inaktivering generelt. Denne metode giver objektive data i realtid, der erstatter subjektiv menneskelig observation af cytopatiske virkninger. Det kan bruges til at bestemme virustitrering og dermed erstatte traditionelle målinger med lavere konfidensintervaller og undgå arbejdskrævende endepunkter.
Der findes en lineær korrelation mellem titreringsresultater opnået ved måling af celleimpedans og ved klassisk plaqueassay eller TCID50-metoder. Derfor kan data opnået med den impedansbaserede titreringsmetode let transformeres i TCID50- eller pfu-værdier ved at oprette en standardkurve med seriel fortynding af virussen13,14,15,16,17. Påvisning, kvantificering og effekt af neutraliserende antistoffer, der er til stede i serumprøver, kan også opnås ved anvendelse af denne eksperimentelle tilgang18,19. For nylig er impedansbaserede cellulære assays blevet brugt til at screene og evaluere antivirale forbindelser mod Equid alphaherpesvirus20.
Denne teknologi er blevet brugt til at evaluere persistensen af IAV'er i saltvand ved forskellige temperaturer og til at identificere mutationer i hæmagglutinin af IAV, der øger eller mindsker IAV-persistens i miljøet21. En sådan screening ville kræve et omfattende arbejde, hvis der anvendes traditionelle titreringsmetoder. Denne metode kan dog bruges til enhver virus, der har indflydelse på cellemorfologi, cellenummer og celleoverfladefastgørelsesstyrke. Det kan også bruges til at overvåge vedholdenhed under forskellige miljøforhold (dvs. i luften, i vand eller på overflader).
Den protokol, der er beskrevet her, anvender IAV-overlevelse i vand som et eksempel. Humane influenzavirus udsættes for forskellige fysisk-kemiske parametre i længere perioder. Saltvand (35 g/l NaCl) vand ved 35 °C blev valgt som miljømodel baseret på tidligere resultater9. Resterende infektivitet af eksponerede vira kvantificeres på forskellige tidspunkter gennem celleinfektion. MDCK-celler, referencecelletypen til IAV-amplifikation, podes på 16 brøndmikrotiterplader belagt med mikroelektrodesensorer og inficeres af eksponerede vira 24 timer senere. Celleimpedans måles hvert 15. minut og udtrykkes som en vilkårlig enhed kaldet celleindekset (CI). Cytopatiske virkninger induceret af influenzavirus, hvis debuthastighed direkte afhænger af antallet af infektiøse virale partikler, der podes til cellekulturen, fører til CI-fald, som efterfølgende kvantificeres som CIT50-værdien . Denne værdi svarer til den tid, der er nødvendig for at måle en reduktion på 50% fra den oprindelige CI (dvs. før virustilsætning). CIT50-værdier beregnet for flere miljøeksponeringstider gør det muligt at fratregne inaktiveringshældningen af et virus efter lineær regression af CIT50-værdier .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Håndtere alle influenzavirus i henhold til passende krav til biosikkerhedsniveau (BSL-2 eller højere afhængigt af undertypen). Brug IAV-stammer med en lav passagehistorik (mindre end 5x på MDCK-celler) for at sikre lav variation mellem eksperimenter.
1. Fremstilling af reagenser og udgangsmaterialer
- Fremstilling af MDCK-celler og sterilt cellekulturmedium
- Dyrk Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) celler i modificeret Eagle's medium (MEM) suppleret med 10% varme inaktiveret føtal kalveserum (FCS) og antibiotika (100 enheder / ml penicillin, 100 mg / ml streptomycin).
- Efter optøning skal MDCK-celler passeres mindst 2x, før de inficeres for at sikre fuldstændig genopretning (men mindre end 30 passager for at undgå enhver drift i cellefænotyper).
- Frø 75 cm2 vævskulturkolbe(r) indeholdende 30 ml steril 1x MEM med 7,5 x 106 MDCK-celler og inkuberer ved 37 °C i befugtet 5 % CO2-inkubator .
- Forberedelse af impedansovervågningsudstyr
- Instrumentet anbrings i inkubatoren ved 35 °C, og lad det varme op i mindst 2 timer.
- Tilslut den til styreenheden placeret uden for inkubatoren.
- Fortsæt til rengøringsprocedurer som anbefalet af producenten, inden du starter resten af eksperimentet.
- Produktion af IAV-lagre på MDCK-celler
- For at formere og forstærke H1N1-vira skal du frø 7,5 x 106 MDCK-celler på to 75 cm2 vævskulturkolber og inkubere i 24 timer ved 37 °C for at nå 90-100 % sammenløb.
- Dekanter cellekulturmediet fra cellemonolaget i 75 cm2 kolber. Vask cellerne med 5 ml steril 1x PBS.
- Fjern PBS og tilsæt 5 ml 1x PBS for at vaske cellerne igen.
- Mærk en kolbe som kontrol, og fjern PBS, før du tilsætter 15 ml virusformeringsmedier (1x MEM med 0% FCS) forsigtigt på monolaget. Inkubere denne kolbe i en inkubator, der holdes på 35 °C med 5 % CO2. Brug det til sammenligning efter 3 dages formering.
- Fortynd et hætteglas med IAV-lager ved RT. Fortynd virussen til den passende koncentration i et 1,5 ml rør indeholdende virusformeringsmedier (1x MEM med 0% FCS).
- 1x PBS fjernes fra 75 cm2-kolben , og MDCK-celler inficeres ved en mangfoldighed af infektion (MOI) på 1 x 10-3 eller 1 x 10-4 plakdannende enheder pr. celle (pfu/celle) ved at tilsætte 1 ml af det fortyndede virus til cellemonolaget.
- Adsorber virus til MDCK-celler i 45 minutter ved RT ved at omrøre kolben regelmæssigt hvert 15. minut.
- Fjern forsigtigt inokulummet, og tilsæt 15 ml virusformeringsmedier pr. kolbe indeholdende 1 μg/ml TPCK-trypsin (trypsin/L-1-tosylamid-2-phenylethylchlormethylketon) for at spalte det virale hæmagglutinin HA0 i HA1- og HA2-underenheder (en begivenhed, der er nødvendig for HA-fusion med den endosomale membran og frigivelse af det virale genom)22.
- Kolberne inkuberes ved 35 °C og 5 % CO2 i mindst 3 dage for at replikere virusset.
- Overhold MDCK-celler under et mikroskop ved 40x forstørrelse og se efter cytopatiske virkninger (CPE) på cellerne (ved at sammenligne med cellekontrolkolben). Hvis CPE ikke er komplet (dvs. ca. 80 % af cellerne løsnes fra substratet), anblives kolberne tilbage i inkubatoren i yderligere 24 timer.
- Når CPE er afsluttet, dekanteres cellekultursupernatanten og centrifugen ved 300 x g i 10 minutter for at pelletere det cellulære affald.
- Overfør det klarede supernatant til et 15 ml rør og aliquot afkomsvirus til sterile kryogene hætteglas til engangsbrug. Anbring straks kryorørene ved -80 °C for at fryse og lagre vira.
2. Bestemmelse af passende cellemængde til infektion af celler
BEMÆRK: Under alle eksperimenter skal du altid opbevare pladerne på ikke-elektrostatiske overflader, såsom papirindpakningerne fra emballagen. Følg punkt 2 nedenfor for at bestemme den mest hensigtsmæssige koncentration af celler, der skal podes i den elektroniske mikrotiterplade (designet som E-plade).
- MDCK-celler forberedes i 75 cm2 kolber for at opnå nyspaltede celler (ca. 80 % sammenløb) 24 timer før forsøget.
- Vask celler med 5 ml 1x PBS og fjern dem ved at tilsætte 3 ml 0,25% Trypsin-EDTA-opløsning.
- Tilsæt 7 ml frisk cellekulturmedium og tæl celler ved hjælp af en automatiseret celletæller med trypanblå farvning.
- Juster cellekoncentrationen til 400.000 celler / ml med cellekulturmedier. Udfør to gange serielle fortyndinger i yderligere rør for at opnå celletætheder på 200.000; 100,000; 50,000; 25,000; 12,500; og 6.250 celler/ml. Juster cellernes fortyndingsområde i henhold til celletypen og deres vækstadfærd.
- Lad E-pladen (Table of Materials) stå ved RT i flere minutter, og tilsæt 100 μL cellekulturmedier til hver brønd ved hjælp af en flerkanalspipette. Rør ikke ved elektroderne på E-pladen.
- Lås holderne op, og sæt pladens forende i vuggelommen på impedansmåleinstrumentet (Table of Materials). Luk døren til inkubatoren.
- Åbn softwaren.
- I "Standardopsætning af eksperimentmønster" skal du vælge den eller de valgte vugger og dobbeltklikke på den øverste side og derefter skrive navnet på eksperimentet. Klik på "Layout" og indtast de nødvendige prøveoplysninger for hver valgt brønd på pladen; klik derefter på "Anvend", når du er færdig. Klik på "Planlæg" | "Trin" | "Tilføj et trin". Softwaren tilføjer automatisk et trin på 1 s for at måle baggrundsimpedansen (CI).
- Klik på "Start / Fortsæt" på fanen "Udfør". Klik på "Plot", tilføj alle prøver ved at vælge de bevilgede brønde, og sørg for, at CI er mellem -0,1 og 0,1, før du fortsætter til næste trin.
- Fjern pladen fra holderen.
- Der tilsættes 100 μL af hver cellesuspension fra trin 2.4 i to eksemplarer til de relevante brønde og 100 μL cellemedier i brønde, der anvendes som kontroller. Lad E-pladen stå i den laminære strømningshætte i 30 minutter ved RT for at muliggøre ensartet fordeling af cellerne i bunden af brøndene.
- Sæt E-pladen i vuggelommen. Klik på "Planlæg" | "Tilføj trin" i softwaren, og indtast værdier for at overvåge celler hvert 30. minut i 200 gentagelser. Vælg derefter "Start / Fortsæt".
- Kontroller og plot CI-dataene ved at klikke på knappen "Plot" i softwaren. Vælg koncentrationen af celler, der er lige før den stationære fase 24 timer efter såning på pladen, for at opnå celler, der stadig er i en vækstfase under virusinfektion. Stationær fase nås, når CI er på sit maksimum.
3. Korrelation mellem CIT50-værdier og mangfoldighed af infektion
- Tilsæt 100 μL sterilt 1x MEM-dyrkningsmedium i hver brønd på E-pladen. Sæt E-pladen i instrumentets vuggelomme ved 35 °C. Mål baggrunden som beskrevet i trin 2.7.
- Fjern E-pladen fra holderen.
- Frø 3 x 104 friskspaltede MDCK-celler på hver brønd i den elektroniske mikrotiterplade og dyrk dem i 24 timer ved 35 °C med 5 % CO2 , så de er i en replikativ fase under IAV-infektion.
- MDCK-celler inficeres med forskellige 10 gange fortyndinger af en kendt 6 log10 TCID50/ml titer af H1N1-virus ved hjælp af omvendt pipettering til reproducerbarhed ved at følge nedenstående trin:
- Skyl MDCK-celler 2x med 100 μL MEM uden FCS (virusformeringsmedier). Vær opmærksom på at fjerne alle medier efter den anden vask for at undgå yderligere fortynding af inokulumet.
- Tilsæt 100 μL viral suspension i hver brønd ved hjælp af enkeltkanalpipette. For at undgå forurening skal du fortsætte med at starte fra venstre mod højre og derefter fra top til bund i pladen, mens du dækker de resterende brønde med låget.
- Sæt pladen i instrumentets vuggelomme ved 35 °C. Vær forsigtig for at undgå pludselige bevægelser, der potentielt kan føre til forurening.
- Begynd at overvåge celleimpedansen hvert 15. minut i løbet af mindst 100 timer som beskrevet i trin 2.10.
- Efter de to målecyklusser (dvs. 30 minutter) skal du sætte apparatet på pause ved at klikke på "Pause" under fanen "Udfør" og fjerne E-pladen fra holderen.
- Tilsæt 1 μg/ml TPCK-trypsin til virusformeringsmediet for at spalte det virale hæmagglutinin.
- Tilsæt 100 μL virusformeringsmedier indeholdende TPCK-trypsin i hver brønd, og indsæt E-pladen i vuggelommen.
- Klik på "Start / Fortsæt" på fanen "Udfør".
BEMÆRK: Glem ikke at oprette en negativ kontrol svarende til mock-inficerede celler ved at erstatte viral suspension med virusformeringsmedier.
4. IAV overlevelse kinetik
- Udsæt IAV for saltvand destilleret vand ved 35 °C og test for deres smitsomhed over tid ved at måle celleimpedansfald.
- Saltvand destilleret vand ved at tilsætte NaCl til en endelig koncentration på 35 g/l i destilleret vand. Tilsæt 900 μL saltvand i 2 ml kryorør.
- Tilsæt 100 μL virusbestand i saltvand, og kryorørene anbringes i en inkubator (35 °C, 5 % CO2) i 1 time, 24 timer eller 48 timer.
- Frø 100 μL (indeholdende 3 x 104) af nyspaltede MDCK-celler på en 16 brønds mikrotiterplade og vokser i 24 timer ved 37 °C og 5 % CO2.
- Celler inficeres med 100 μL eksponerede vira (tidligere fortyndet 10x i dyrkningsmedier) ved hjælp af omvendt pipetteringsmetode til reproducerbarhed ved at gentage pkt. 3.4.
- Overvåg celleimpedans hvert 15. minut i mindst 100 timer.
5. Evaluering af tab af smitsomhed
- Bestemmelse af CIT50-værdier for at kvantificere CI-fald på grund af virusinducerede cytopatiske virkninger med CIT50-værdien .
- Klik på "Plot" og tilføj alle prøverne ved at klikke på "Tilføj alle". Eksporter resultaterne til et regneark ved at klikke på "Eksporter eksperimentinfo". Overvej indledende CI som cellulær impedansværdi målt 5 timer efter celleinfektion med eksponerede vira (dvs. 24 timer efter såning af MDCK-celler på mikrotiter E-pladen).
- Beregn CIT50-værdien svarende til den nødvendige tid til at måle et fald på 50% fra det oprindelige CI. For at beregne CIT50-værdien skal du notere CI-værdien ved 5 hpi for hver prøve. Find derefter det tidspunkt, hvor CI-værdien er lig med halvdelen af CI-værdien ved 5 hpi ved hjælp af indeks- og matchfunktionerne i regnearket.
- Beregning af den gennemsnitlige inaktiveringshældning
- Bestem CIT50-værdier for hver eksponeret viral suspension på forskellige eksponeringstider (i dage).
- Beregn en lineær regressionshældning ud fra CIT50 plottede værdier, kaldet inaktiveringshældningen og udtrykt i CIT50.day-1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Rådata opnået efter 120 timer med forskellige koncentrationer af MDCK-celler, fra 15.000 til 120.000 celler pr. brønd, er vist i figur 1. Efter 24 timer viser CI-målinger, at celler i brønde podet med 30.000 celler stadig var i den eksponentielle vækstfase, og denne cellekoncentration blev brugt til yderligere eksperimenter. Figur 2 illustrerer den lineære korrelation mellem CIT50-værdier og den indledende infektionsmultiplicitet. MDCK-celler dyrkes i 24 timer og inficeres derefter med A/Paris/2590/2009 H1N1-virusstamme ved en anden infektionsdifiditet. Indledende CI måles 5 timer efter infektion.
Figur 3 illustrerer den eksperimentelle procedure, der anvendes i vores eksperimenter (panel A). Typiske resultater, der viser CI-fald på grund af virusinduceret cytopatisk effekt, er vist på panel B. Disse er rådata opnået efter at være blevet behandlet af softwaren. CIT50-værdier blev beregnet ved hjælp af regnearket efter eksport af dataene. Efter beregning af CIT50-værdier på forskellige tidspunkter tillod en lineær regressionsanalyse bestemmelse af hældningen (panel C). Virale inaktiveringshældninger blev således opnået for hver virus i hver tilstand og blev derefter sammenlignet med at identificere vira, der havde den største stabilitet i det undersøgte miljø.
Figur 4 viser inaktiveringshældninger af IAV-rekombinante vira, der bærer en genetisk rygrad, der tilhører A/WSN/1933 H1N1-virusstammen og en HA og NA fra A/Ny Kaledonien/20/1999 H1N1-virus (HA-NA/NC99). Ikke-synonyme mutationer i HA blev introduceret for at undersøge virkningen på viruspartikelpersistens uden for værten i saltvand.
Ved at sammenligne gennemsnitlige inaktiveringshældninger fra forskellige eksperimenter udført i tre eksemplarer var vi i stand til at identificere aminosyrer i HA, der var tilstrækkelige til at påvirke viral persistens uden for værten. Jo lavere inaktiveringshældningen er, desto mere stabil er virussen. Eksempelvis inducerede HA/F453Y-substitutionen eller HA::K147-indsættelsen i HA af HA-NA/NC99-virus en signifikant stigning i den gennemsnitlige inaktiveringshældning til henholdsvis 9,8 CIT50/dag og 9,9 CIT50/dag sammenlignet med vildtype HA (med en gennemsnitlig inaktiveringshældning på 4,85 CIT50/dag), hvilket genererede meget ustabile mutanter. I modsætning hertil påvirkede HA/T327A-substitutionen ikke virusstabiliteten ved 35 °C i saltvand (gennemsnitlig inaktiveringshældning på 6,6 CIT50/dag). Metoden var således kraftig nok til at identificere aminosyrerester i HA-glycoproteinet, der var involveret i IAV-overlevelse uden for værten.
Figur 1: Celletitrering i mikrotiter E-plade.
Serielle fortyndinger af MDCK-celler blev podet på mikrotiter E-plader, og cellevækst blev overvåget i op til 100 timer (200 fejninger hvert 30. minut). Grå prikker repræsenterer standardafvigelserne for CI målt i to eksemplarer. Den lodrette linje ved 24 timer fremhæver, at under de beskrevne betingelser tillod indledende såning af 3 x 104 celler / brønd en kultur på omkring 70% sammenløb på infektionstidspunktet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Lineær regression mellem CIT50-værdier og indledende multiplicitet af infektion.
Hvert punkt angiver CIT50-værdien beregnet for infektion af celler med forskellige multiplikaliteter af infektion. Den faste linje repræsenterer den lineære regressionshældning (R2 = 0,99), og stiplede linjer repræsenterer 95% konfidensintervallerne. Dette tal er ændret i forbindelse med en tidligere publikation21. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Bestemmelse af inaktiveringshældning.
(A) Virale partikler blev fortyndet i saltvand ved 35 °C i 0, 1 eller 2 dage, og CI blev overvåget kontinuerligt og afbildet som celleindeks. B) CI-fald kvantificeret med CIT50-værdierne , som er repræsenteret manuelt på rådata af lodrette stiplede linjer. Hver kurve repræsenterer udviklingen af celleimpedans efter infektion med vira, der blev udsat for saltvand i stigende tider (rød: ikke-eksponeret virus, gul: 24 timers eksponering, grøn: 48 timers eksponering, mørk: mock-inficerede celler). Indledende CI blev målt 5 timer efter infektion (C) Lineær regression af CIT50-værdier , der blev brugt til at beregne inaktiveringshældningen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Virkningen af ikke-synonyme mutationer i HA på IAV-persistens i saltvand.
Inaktiveringsskråninger af reassortantvirus, der bærer en HA fra A/Ny Kaledonien/20/1999 H1N1-virus med (substitution eller indsættelse) eller uden mutation (HAWT). Boxplots viste fordelingen af enkelte inaktiveringshældninger (seks eller otte afhængigt af virussen, beregnet ud fra forskellige uafhængige eksperimenter) opnået for hver eksponeret virus omkring gennemsnittet (vandrette linjer). Gennemsnitlige inaktiveringshældninger blev sammenlignet ved hjælp af en ANOVA-test (ns, p > 0,05, ****p < 0,0001). Ref svarer til den reassortantvirus, der bærer vildtype HA, som andre vira sammenlignes med. Dette tal er ændret i forbindelse med en tidligere publikation21. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
RTCA er en impedansbaseret teknologi, der i stigende grad bruges til realtidsovervågning af celleegenskaber, såsom celleoverholdelse, proliferation, migration og cytotoksicitet. I denne undersøgelse demonstreres denne teknologis evne til at vurdere IAV-overlevelse uden for værten ved at måle virusinaktiveringshældning. Kræsne teknikker som TCID50 og plaque assays erstattes af objektiv realtidsvurdering af cellelevedygtighed, hvilket afspejler cytopatiske virkninger induceret af virussen. I lighed med TCID50 eller plakdannende enhed (pfu) er CIT50 også lineært korreleret med infektionsmultipliciteten (figur 2). Blandt begrænsningerne ved denne tilgang undlader denne metode præcist at overvåge celler inficeret med ikke-cytopatogen virus.
Som et eksempel kan introduktion af ny mutation i det virale genom kraftigt dæmpe en virus og mindske dens cytopatogenicitet. I modsætning hertil er inaktiveringshældningen, der beregnes her, uafhængig af virusreplikation og en potentiel virusdæmpning, da denne hældning er afledt af CIT50-værdier målt efter forskellige tidspunkter for inaktivering af den samme virus. Her antages det således, at virale partikler, der stadig er i stand til at inficere en celle efter denne inaktiveringsprotokol, deler den samme replikationsfænotype som vira før inaktiveringen.
På trods af højere omkostninger reduceres arbejdsbyrden ved hjælp af denne tilgang betydeligt, hvilket er fordelagtigt, når et projekt kræver udførelse af kinetik, med måling af hyppige tidspunkter og over en lang periode. Som i enhver protokol er nogle trin kritiske, og manipulationer skal udføres med omhu og præcision. Omvendt pipettering er et afgørende skridt for at sikre præcis dispensering af medierne, og der skal lægges særlig vægt på at undgå forurening. Ligeledes skal den oprindelige cellemængde være den samme mellem hvert eksperiment og skal vurderes ved hjælp af en automatiseret celletæller med trypanblå farvning. Under apparatets overvågning af CI bør åbningen af inkubatoren begrænses så meget som muligt.
Hvis der gives omhu og opmærksomhed under forsøget med begrænset bevægelse, bliver forureningsrisikoen lav, og resultaterne er meget reproducerbare. Fordelingen af inaktiveringsskråninger mellem forskellige vira er signifikant forskellig, så en ikke-parametrisk statistisk test bruges til at sammenligne viruspersistens. Gennemsnitlige inaktiveringsskråninger kan beregnes for alle vira, der producerer cytopatiske virkninger i cellekultur, såsom enteriske vira, ebolavirus eller coronavirus, hvis vedholdenhed i miljøforhold i øjeblikket undersøges (og sandsynligvis ved hjælp af traditionelle virologimetoder). I fremtiden kan denne metode også bruges til at sammenligne replikationen af forskellige vira, undersøge virustropisme for flere cellelinjer på samme tid og studere specifikke trin i viruscyklussen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25%Trypsin | ThermoFisher | 25200056 | |
| 75 cm2 tissue culture flask | Falcon | 430641U | |
| E-Plate 16 (6 plates) | ACEA Biosciences, Inc | 5469830001 | E-plates are avalible in different packaging |
| FCS | Life technologies (gibco) | 10270-106 | |
| MEM 1X | Life technologies (gibco) | 31095029 | |
| PBS 1X | Life technologies (gibco) | 14040091 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life technologies (gibco) | 11548876 | |
| TPCK-Trypsin | Worthington | LS003740 | |
| xCELLigence Real-Time Cell Analysis Instrument S16 | ACEA Biosciences, Inc | 380601310 | The xCELLigence RTCA S16 instruments are available in different formats (16-well, 96-well, single or multi-plate) |
References
- Killingley, B., Nguyen-Van-Tam, J.
- Sooryanarain, H., Elankumaran, S. Environmental Role in Influenza Virus Outbreaks. Annual Review of Animal Biosciences. 3 (1), 347-373 (2015).
- Keeler, S. P., Dalton, M. S., Cressler, A. M., Berghaus, R. D., Stallknecht, D. E. Abiotic factors affecting the persistence of avian influenza virus in surface waters of waterfowl habitats. Applied and Environmental Microbiology. 80 (9), 2910-2917 (2014).
- Stallknecht, D. E., Kearney, M. T., Shane, S. M., Zwank, P. J. Effects of pH, temperature, and salinity on persistence of avian influenza viruses in water. Avian Diseases. 34 (2), 412-418 (1990).
- Poulson, R. L., Tompkins, S. M., Berghaus, R. D., Brown, J. D., Stallknecht, D. E. Environmental Stability of Swine and Human Pandemic Influenza Viruses in Water under Variable Conditions of Temperature, Salinity, and pH. Applied and Environmental Microbiology. 82 (13), 3721-3726 (2016).
- Zhang, G., et al. Evidence of influenza A virus RNA in Siberian lake ice. Journal of Virology. 80 (24), 12229-12235 (2006).
- Nazir, J., et al. Long-Term Study on Tenacity of Avian Influenza Viruses in Water (Distilled Water, Normal Saline, and Surface Water) at Different Temperatures. Avian Diseases. 54 (1), 720-724 (2010).
- Brown, J. D., Swayne, D. E., Cooper, R. J., Burns, R. E., Stallknecht, D. E. Persistence of H5 and H7 avian influenza viruses in water. Avian Diseases. 51, 1 Suppl 285-289 (2007).
- Dublineau, A., et al. Persistence of the 2009 pandemic influenza A (H1N1) virus in water and on non-porous surface. PLoS ONE. 6 (11), 28043 (2011).
- Titration of Influenza Viruses. Springer Nature Experiments. , Available from: https://experiments.springernature.com/articles/10.1007/978-1-4939-8678-1_4 (2020).
- Szretter, K. J., Balish, A. L., Katz, J. M. Influenza: Propagation, Quantification, and Storage. Current Protocols in Microbiology. 3 (1), 1-22 (2006).
- Gaush, C. R., Smith, T. F. Replication and Plaque Assay of Influenza Virus in an Established Line of Canine Kidney Cells. Applied Microbiology. 16 (4), 588-594 (1968).
- Witkowski, P. T., et al. Cellular impedance measurement as a new tool for poxvirus titration, antibody neutralization testing and evaluation of antiviral substances. Biochemical and Biophysical Research Communications. 401 (1), 37-41 (2010).
- Lebourgeois, S., et al. Development of a Real-Time Cell Analysis (RTCA) Method as a Fast and Accurate Method for Detecting Infectious Particles of the Adapted Strain of Hepatitis A Virus. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 335 (2018).
- Teng, Z., Kuang, X., Wang, J., Zhang, X. Real-time cell analysis--a new method for dynamic, quantitative measurement of infectious viruses and antiserum neutralizing activity. Journal of Virological Methods. 193 (2), 364-370 (2013).
- Fang, Y., Ye, P., Wang, X., Xu, X., Reisen, W. Real-time monitoring of flavivirus induced cytopathogenesis using cell electric impedance technology. Journal of Virological Methods. 173 (2), 251-258 (2011).
- Charretier, C., et al. Robust real-time cell analysis method for determining viral infectious titers during development of a viral vaccine production process. Journal of Virological Methods. 252, 57-64 (2018).
- Tian, D., et al. Real-Time Cell Analysis for Measuring Viral Cytopathogenesis and the Efficacy of Neutralizing Antibodies to the 2009 Influenza A (H1N1) Virus. PLoS ONE. 7 (2), 31965 (2012).
- Teng, Z., Kuang, X., Wang, J., Zhang, X. Real-time cell analysis--a new method for dynamic, quantitative measurement of infectious viruses and antiserum neutralizing activity. Journal of Virological Methods. 193 (2), 364-370 (2013).
- Thieulent, C. J., et al. Screening and evaluation of antiviral compounds against Equid alpha-herpesviruses using an impedance-based cellular assay. Virology. 526, 105-116 (2019).
- Labadie, T., Batéjat, C., Manuguerra, J. -C., Leclercq, I. Influenza Virus Segment Composition Influences Viral Stability in the Environment. Frontiers in Microbiology. 9, 1496 (2018).
- Wiley, D. C., Skehel, J. J. The structure and function of the hemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus. Annual Review of Biochemistry. 56, 365-394 (1987).
