Summary
Rapporteras här är ett protokoll för kvantifiering av infektiösa viruspartiklar med hjälp av realtidsövervakning av elektrisk impedans av infekterade celler. En praktisk tillämpning av denna metod presenteras genom kvantifiering av influensa A virus sönderfall under olika fysikalisk-kemiska parametrar som efterliknar miljöförhållanden.
Abstract
Metoder för viruspartikelkvantifiering utgör en kritisk aspekt av många virologistudier. Även om det finns flera tillförlitliga tekniker är de antingen tidskrävande eller oförmögna att upptäcka små variationer. Presenteras här är ett protokoll för exakt kvantifiering av viral titer genom att analysera elektriska impedans variationer av infekterade celler i realtid. Cellulär impedans mäts genom guldmikroelektrodbiosensorer som ligger under cellerna i mikroplattor, där storleken beror på antalet celler samt deras storlek och form. Detta protokoll möjliggör realtidsanalys av cellproliferation, livskraft, morfologi och migrering med förbättrad känslighet. Det finns också ett exempel på en praktisk tillämpning genom att kvantifiera sönderfallet av influensa A-virus (IAV) som lämnas in till olika fysikalisk-kemiska parametrar som påverkar virusinfektiviteten över tid (dvs. temperatur, salthalt och pH). För sådana program minskar protokollet den arbets belastning som behövs samtidigt som det genererar exakta kvantifieringsdata för infektiösa viruspartiklar. Det gör det möjligt att jämföra inaktiveringsbackar mellan olika IAV, vilket återspeglar deras förmåga att kvarstå i en given miljö. Detta protokoll är lätt att utföra, är mycket reproducerbart och kan tillämpas på alla virus som producerar cytopatiska effekter i cellkulturen.
Introduction
Överföringen av ett virus beror på kombinationen av flera faktorer. För ett virus som utsöndras i miljön beror dess överföring också på förmågan att kvarstå under förhållanden utanför värden. Att studera viral inaktivering i allmänhet är därför ett avgörande steg för att hjälpa nationella hälsomyndigheter och beslutsfattare att genomföra kontroll- och biosäkerhetsåtgärder.
Kunskapen om virusbeständighet i naturliga och laboratoriemiljöer har ökat avsevärt under det senaste decenniet. När det gäller influensa A-virus (IAV) förs deras överföringsvägar in till viruspartiklar under en rad olika miljöförhållanden. Specifikt kan de överföras via 1) fekal-orala vägar genom vatten (dvs. fågelvirus) eller 2) direkt eller indirekt kontakt med förorenade fomiter, liksom aerosoler och andningsdroppar (dvs. fjäderfä- och däggdjursvirus)1. I vilket fall som helst underkastas IAV olika fysikalisk-kemiska parametrar (dvs. pH, salthalt, temperatur och fuktighet), som mer eller mindre snabbt påverkar deras smittsamhet2,3,4,5,6,7,8,9. Det är av stor betydelse, särskilt när det gäller zoonotiska virus och pandemiska virus, att bedöma miljöfaktorernas potential att påverka virusdynamiken och riskerna för exponering och överföring av arter.
Hittills har traditionella virologitekniker (dvs. viral titerbestämning genom plackanalyser eller 50% vävnadskultur infectious dos estimation) använts för att bedöma IAV-infektionsförmåga över tid; men dessa tekniker är tidskrävande och kräver många förnödenheter10,11,12. Mätning av infekterade celler impedans över tid med mikroelektroder fungerar som ett användbart verktyg för att övervaka IAV överlevnad under olika miljöförhållanden, liksom viral inaktivering i allmänhet. Denna metod ger objektiva realtidsdata som ersätter subjektiv mänsklig observation av cytopatiska effekter. Det kan användas för att bestämma virustitrering, vilket ersätter traditionella mätningar med lägre konfidensintervall och undviker arbetsintensiva slutpunkter analyser.
Det finns en linjär korrelation mellan titreringsresultat som erhålls genom mätning av cellimpedans och genom klassisk plackanalys eller TCID50-metoder. Därför kan data som erhållits med den impedansbaserade titreringsmetoden enkelt omvandlas i TCID50- eller pfu-värden genom att skapa en standardkurva med seriell utspädning av viruset13,14,15,16,17. Detektion, kvantifiering och effekt av neutraliserande antikroppar som finns i serumprover kan också uppnås med detta experimentella tillvägagångssätt18,19. På senare tid har impedansbaserade cellulära analyser använts för att screena och utvärdera antivirala föreningar mot Equid alphaherpesvirus20.
Denna teknik har använts för att utvärdera persistensen av IAV i saltvatten vid olika temperaturer och för att identifiera mutationer i IAV:s hemagglutinin som ökar eller minskar IAV-persistensen i miljön21. En sådan screening skulle kräva omfattande arbete om man använde traditionella titreringsmetoder. Den här metoden kan dock användas för alla virus som påverkar cellmorfologi, cellnummer och cellytans fäststyrka. Det kan också användas för att övervaka persistens under olika miljöförhållanden (dvs. i luften, i vatten eller på ytor).
Protokollet som beskrivs här tillämpar IAV överlevnad i vatten som ett exempel. Humana influensavirus utsätts för olika fysikalisk-kemiska parametrar under längre perioder. Saltvatten (35 g/L NaCl) vid 35 °C valdes som miljömodell baserat på tidigare resultat9. Kvarvarande infektionsförmåga hos exponerade virus kvantifieras vid olika tidpunkter genom cellinfektion. MDCK-celler, referenscelltypen för IAV-förstärkning, sås på 16 väl mikrotiterplattor belagda med mikroelektrodsensorer och infekterade av exponerade virus 24 timmar senare. Cellimpedansen mäts var 15:e minut och uttrycks som en godtycklig enhet som kallas cellindex (CI). Cytopatiska effekter som framkallas av influensaviruset, vars debutfrekvens direkt beror på antalet infektiösa viruspartiklar som inokuleras till cellkulturen, leder till CI-minskning, som därefter kvantifieras som CIT50-värdet . Detta värde motsvarar den tid som krävs för att mäta en 50% minskning från den ursprungliga CI (dvs. före virustillskott). CIT50-värden som beräknats för flera miljöexponeringstider gör det möjligt att göra avdrag för ett viruss inaktiveringsslutning efter linjär regression av CIT50-värden .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hantera alla influensavirus enligt lämpliga krav på biosäkerhetsnivå (BSL-2 eller högre beroende på undertyp). Använd IAV-stammar med låg passagehistorik (mindre än 5x på MDCK-celler) för att försäkra låg variation mellan experiment.
1. Beredning av reagenser och utgångsmaterial
- Beredning av MDCK-celler och sterilt cellodlingsmedium
- Odla Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) celler i modifierade Eagles medium (MEM) kompletterat med 10% värme inaktiverat fetala kalvserum (FCS) och antibiotika (100 enheter/ ml penicillin, 100 mg/mL streptomycin).
- Efter upptining, passage MDCK celler minst 2x innan du infekterar dem för att säkerställa fullständig återhämtning (men mindre än 30 passager för att undvika drift i cellfenotyper).
- Frö 75 cm2 vävnadsodlingskolvar som innehåller 30 ml steril 1x MEM med 7,5 x 106 MDCK-celler och inkubera vid 37 °C i fuktad inkubator på 5 % CO2 .
- Förberedelse av utrustning för övervakning av impedans
- Placera instrumentet i inkubatorn vid 35 °C och låt det värmas upp i minst 2 timmar.
- Anslut den till styrenheten som är placerad utanför inkubatorn.
- Fortsätt med rengöringsprocedurer som rekommenderas av tillverkaren innan du påbörjar resten av experimentet.
- Produktion av IAV-lager på MDCK-celler
- För att föröka och förstärka H1N1-virus, frö 7,5 x 106 MDCK-celler på två 75 cm2 vävnadskulturkolvar och inkubera i 24 timmar vid 37 °C för att nå 90%-100% sammanflöde.
- Dekantera cellodlingsmediet från cellmonolayern i 75 cm2 flaskor. Tvätta cellerna med 5 ml steril 1x PBS.
- Ta bort PBS och tillsätt 5 ml 1x PBS för att tvätta cellerna igen.
- Märk en kolv som kontroll och ta bort PBS innan du lägger till 15 ml virusutbredningsmedium (1x MEM med 0% FCS) försiktigt på monolagret. Inkubera kolven i en inkubator vid 35 °C med 5 % CO2. Använd den för jämförelse efter 3 dagars förökning.
- Tina en flaska IAV-buljong vid RT. Späd ut viruset till lämplig koncentration i ett 1,5 ml-rör som innehåller virusutbredningsmedium (1x MEM med 0% FCS).
- Ta bort 1x PBS från 75 cm2-kolven och infektera MDCK-celler vid en multiplicitet av infektion (MOI) på 1 x 10-3 eller 1 x 10-4 plackbildande enheter per cell (pfu/cell) genom att tillsätta 1 ml av det utspädda viruset till cellmonolagret.
- Adsorb virus till MDCK celler i 45 min på RT genom att röra kolven regelbundet var 15: e minut.
- Ta försiktigt bort inokulat och tillsätt 15 ml virusutbredningsmedium per kolv som innehåller 1 μg/mL TPCK-trypsin (trypsin/L-1-tosylamide-2-fenylethylkloretylketon), för att klyva virala hemagglutinin HA0 i HA1 och HA2-underenheterna (en händelse som krävs för HA fusion med endoksommembranet.
- Inkubera kolvarna vid 35 °C och 5 % CO2 i minst 3 dagar för att återskapa viruset.
- Observera MDCK-celler under ett mikroskop vid 40x förstoring och leta efter cytopatiska effekter (CPE) på cellerna (genom att jämföra med cellkontrollkolven). Om CPE inte är fullständig (dvs. cirka 80% av cellerna lossnar från substratet), sätt tillbaka kolvarna i inkubatorn i ytterligare 24 timmar.
- När CPE är klar, dekantera cellkulturens supernatant och centrifugera vid 300 x g i 10 minuter för att pelletera cellskräpet.
- Överför det klarnade supernatanten till ett 15 ml rör och alikvot avkomma virus till engångs sterila kryogena injektionsflaska. Placera omedelbart kryotuberna vid -80 °C för att frysa och lagra virus.
2. Bestämning av lämplig cellkvantitet för att infektera celler
OBS: Under alla experiment, håll plattorna på icke-elektrostatiska ytor hela tiden, till exempel pappersfolien från förpackningen. Följ avsnitt 2 nedan för att bestämma den lämpligaste koncentrationen av celler som ska sås i den elektroniska mikrotiterplattan (utformad som E-plate).
- Förbered MDCK-celler i 75 cm2 flaskor för att få nysplittringsceller (cirka 80 % sammanflöde) 24 timmar före försöket.
- Tvätta cellerna med 5 ml 1x PBS och lossa dem genom att tillsätta 3 ml trypsin-EDTA-lösning.
- Tillsätt 7 ml färskt cellodlingsmedium och räkna celler med en automatiserad cellräknare med trypanblå färgning.
- Justera cellkoncentrationen till 400 000 celler/ml med cellodlingsmedier. Utför tvåfaldiga seriella utspädningar i ytterligare rör för att erhålla celltätheter på 200 000; 100,000; 50,000; 25,000; 12,500; och 6 250 celler/ml. Justera cellernas utspädningsområde efter celltyp och deras tillväxtbeteende.
- Lämna E-plattan (Materialtabellen) på RT i flera minuter och tillsätt 100 μL cellodlingsmedium till varje brunn med hjälp av en flerkanalig pipett. Rör inte vid elektroderna på E-plattan.
- Lås upp vaggarna och för in plattans främre ände i vaggan på impedansmätinstrumentet (Materialbord). Stäng dörren till inkubatorn.
- Öppna programvaran.
- I "Standardinställningar för experimentmönster" väljer du de valda vaggarna och dubbelklickar på den översta sidan och anger sedan namnet på experimentet. Klicka på "Layout" och ange nödvändig exempelinformation för varje vald brunn på plattan. Klicka sedan på "Verkställ" när du är klar. Klicka på "Schema" | "Steg" | "Lägg till ett steg". Programvaran lägger automatiskt till ett steg på 1 s för att mäta bakgrundsimpedansen (CI).
- Klicka på "Start/Fortsätt" på fliken "Kör". Klicka på "Plot", lägg till alla prover genom att välja lämpliga brunnar och se till att CI är mellan -0,1 och 0,1 innan du går vidare till nästa steg.
- Ta bort plattan från vaggan.
- Tillsätt 100 μL av varje cellfjädring från steg 2.4 i duplicering till lämpliga brunnar och 100 μL cellmedium i brunnar som används som kontroller. Lämna E-plattan i den laminära flödeshuven i 30 min på RT för att möjliggöra en enhetlig fördelning av cellerna längst ner i brunnarna.
- För in E-plattan i vaggans ficka. Klicka på "Schema" | "Lägg till steg" i programvaran och ange värden för att övervaka celler var 30: e minut för 200 repetitioner. Välj sedan "Start/Fortsätt".
- Kontrollera och plotta CI-data genom att klicka på knappen "Plot" i programvaran. Välj koncentrationen av celler som ligger strax före den stationära fas 24 h efter sådd på plattan, för att få celler som fortfarande är i en växande fas under virusinfektion. Stationär fas uppnås när CI är som maximal.
3. Korrelation mellan CIT50-värden och multiplicitet av infektion
- Tillsätt 100 μL sterilt 1x MEM-odlingsmedium i varje brunn på E-plattan. Sätt in E-plattan i instrumentets vagga ficka vid 35 °C. Mät bakgrunden enligt beskrivningen i steg 2.7.
- Ta bort E-plattan från vaggan.
- Frö 3 x 104 av nysplittrade MDCK-celler på varje brunn på den elektroniska mikrotiterplattan och odla dem i 24 h vid 35 °C med 5% CO2 så att de är i en replikativ fas under IAV-infektion.
- Infektera MDCK-celler med olika 10-faldiga utspädningar av en känd 6 log10 TCID50/ml titer av H1N1-virus, med hjälp av omvänd pipettering för reproducerbarhet genom att följa stegen nedan:
- Skölj MDCK-cellerna 2x med 100 μL MEM utan FCS (virusutbredningsmedium). Var medveten om att ta bort alla medier efter den andra tvätten för att undvika ytterligare utspädning av inokulat.
- Tillsätt 100 μL virusfjädring i varje brunn med enkanalig pipett. För att undvika kontaminering, fortsätt genom att börja från vänster till höger och sedan uppifrån och ner i plattan, samtidigt som du täcker de återstående brunnarna med locket.
- För in plattan i instrumentets vagga ficka vid 35 °C. Var försiktig för att undvika plötsliga rörelser som kan leda till föroreningar.
- Börja övervaka cellimpedansen var 15:e minut under minst 100 timmar enligt beskrivningen i steg 2.10.
- Efter de två mätcyklerna (dvs. 30 min) pausar du apparaten genom att klicka på "Pausa" på fliken "Utför" och ta bort E-plattan från vaggan.
- Tillsätt 1 μg/mL TPCK-trypsin till virusutbredningsmediet för att klyva det virala hemagglutinin.
- Tillsätt 100 μL virusutbredningsmedium som innehåller TPCK-trypsin i varje brunn och för in E-plattan i vaggans ficka.
- Klicka på "Starta/fortsätt" på fliken "Kör".
OBS: Glöm inte att skapa en negativ kontroll som motsvarar mock-infekterade celler genom att ersätta virus suspension med virusspridningsmedier.
4. IAV överlevnad kinetik
- Exponera IAV för saltlösningsdestillerat vatten vid 35 °C och testa deras smittsamhet över tid genom att mäta cellimpedansminskning.
- Förbered saltlösningsdestillerat vatten genom att tillsätta NaCl till en slutlig koncentration på 35 g/l i destillerat vatten. Tillsätt 900 μL saltvatten i 2 ml kryorör.
- Tillsätt 100 μL virusbuljong i saltvatten och placera kryotuberna i en inkubator (35 °C, 5% CO2) i 1 h, 24 timmar eller 48 timmar.
- Frö 100 μL (innehållande 3 x 104) nysplittring av MDCK-celler på en 16-brunns mikrotiterplatta och växer i 24 timmar vid 37 °C och 5% CO2.
- Infektera celler med 100 μL exponerade virus (tidigare utspädda 10x i odlingsmedier) med omvänd pipetteringsmetod för reproducerbarhet genom att upprepa avsnitt 3.4.
- Övervaka cellimpedansen var 15:e minut i minst 100 timmar.
5. Utvärdering av förlust av smittsamhet
- Bestämning av CIT50-värden för att kvantifiera CI-minskning på grund av virusinducerade cytopatiska effekter med CIT50-värdet .
- Klicka på "Rita" och lägg till alla exempel genom att klicka på "Lägg till alla". Exportera resultaten till ett kalkylblad genom att klicka på "Exportera experimentinformation". Betrakta initial CI som cellulär impedansvärde mätt 5 h efter cellinfektion av exponerade virus (dvs. 24 h efter sådd av MDCK-celler på mikrotiter-plattan).
- Beräkna CIT50-värdet motsvarande den tid som krävs för att mäta en minskning med 50 % från den ursprungliga KI. Om du vill beräkna CIT50-värdet noterar du CI-värdet till 5 hki för varje prov. Leta sedan reda på den tidpunkt då CI-värdet är lika med hälften av CI-värdet på 5 hki med hjälp av index- och matchningsfunktionerna i kalkylbladet.
- Beräkning av medelvärdet av inaktiveringsbacken
- Bestäm CIT50-värden för varje exponerad virusuppskov vid olika exponeringstider (i dagar).
- Beräkna en linjär regressionslutning från CIT50 ritade värden, så kallade inaktiveringslutningen och uttryckt i CIT50.day-1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Rådata som erhållits efter 120 timmar med olika koncentrationer av MDCK-celler, från 15 000 till 120 000 celler per brunn, visas i figur 1. Efter 24 timmar visar CI-mått att celler i brunnar sådda med 30 000 celler fortfarande var i den exponentiella tillväxtfasen, och denna cellkoncentration användes för ytterligare experiment. Figur 2 illustrerar den linjära korrelationen mellan CIT50-värden och den ursprungliga multipliciteten av infektion. MDCK-celler odlas i 24 timmar och infekteras sedan med A/Paris/2590/2009 H1N1 virusstam vid en annan multiplicitet av infektion. Initial CI mäts 5 h efter infektion.
Figur 3 illustrerar det experimentella förfarande som används i våra experiment (panel A). Typiska resultat som visar CI-minskning på grund av virusinducerad cytopatisk effekt visas på panel B. Dessa är rådata som erhålls efter att ha bearbetats av programvaran. CIT50-värden beräknades med hjälp av kalkylbladet efter att data exporterats. Efter beräkning av CIT50-värden vid olika tidpunkter tillät en linjär regressionsanalys bestämning av lutningen (panel C). Viral inaktiveringsbackar erhölls således för varje virus i varje tillstånd, sedan jämfördes med att identifiera virus som hade störst stabilitet i den studerade miljön.
Figur 4 visar inaktiveringssluttningar av IAV-rekombinanta virus med en genetisk ryggrad som tillhör virusstammen A/WSN/1933 H1N1 och en HA och NA från A/Nya Kaledonien/20/1999 H1N1-virus (HA-NA/NC99). Icke-synonyma mutationer i HA introducerades för att studera effekten på viruspartikel persistens utanför värden i saltlösning vatten.
Genom att jämföra genomsnittliga inaktiveringsbackar från olika experiment som utförts i tre exemplar kunde vi identifiera aminosyror i HA som var tillräckliga för att påverka viral persistens utanför värden. Ju lägre inaktiveringssluttning, desto stabilare är viruset. Ha/F453Y substitution eller HA::K147 införande i HA av HA-NA/NC99 virus inducerade en betydande ökning av den genomsnittliga inaktivering sluttning till 9,8 CIT50/dag respektive 9,9 CIT50/dag, jämfört med vilda ha (med en genomsnittlig inaktivering sluttning på 4,85 CIT50/dag), vilket genererar mycket instabila mutanter. Däremot påverkade HA/T327A-substitutionen inte virusstabiliteten vid 35 °C i saltvatten (genomsnittlig inaktiveringssluttning på 6,6 CIT50/dag). Metoden var således tillräckligt kraftfull för att identifiera aminosyrarester i HA-glykoproteinet som var involverade i IAV överlevnad utanför värden.
Bild 1: Celltitrering i mikrotiter E-plattan.
Seriella utspädningar av MDCK-celler såddes på mikrotiter E-plattor, och celltillväxten övervakades i upp till 100 h (200 svep var 30: e minut). Grå prickar representerar standardavvikelserna för CI mätt i duplikat. Den vertikala linjen vid 24 h belyser att i de beskrivna förhållandena, inledande sådd av 3 x 104 celler/väl tillåtet en kultur på cirka 70% sammanflöde vid tidpunkten för infektionen. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Linjär regression mellan CIT50-värden och den initiala multipliciteten av infektion.
Varje punkt anger CIT50-värdet beräknat för infektion av celler med olika infektionsfördror. Heldragen linje representerar den linjära regressionslutningen (R2 = 0,99) och streckade linjer representerar konfidensintervallen 95 %. Denna siffra har ändrats från en tidigare publikation21. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: Bestämning av inaktiveringslutning.
(A) Viruspartiklar späddes ut i saltvatten vid 35 °C i 0, 1 eller 2 dagar, och CI övervakades kontinuerligt och ritades som cellindex. B) CI-minskning kvantifierad med CIT50-värdena , som representeras manuellt på rådata med vertikala streckade linjer. Varje kurva representerar utvecklingen av cellimpedans efter infektion med virus som utsattes för saltlösningsvatten för ökande tider (röd: icke-exponerat virus, gul: 24 h exponering, grön: 48 h exponering, mörk: mock-infekterade celler). Initial CI mättes 5 h efter infektion (C) Linjär regression av CIT50 värden som används för att beräkna inaktiveringssluttningen. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 4: Inverkan av icke-synonyma mutationer i HA på IAV persistens i saltlösning vatten.
Inaktiveringssluttningar av reassortantvirus med ha från A/Nya Kaledonien/20/1999 H1N1-virus med (substitution eller införande) eller utan mutation (HAWT). Boxplots visade fördelningen av enstaka inaktiveringsbackar (sex eller åtta beroende på viruset, beräknat från olika oberoende experiment) som erhållits för varje exponerat virus runt medelvärdet (horisontella linjer). Medelinaktiveringsbackar jämfördes med hjälp av ett ANOVA-test (ns, p > 0,05, ****p < 0,0001). Ref motsvarar det reassortanta viruset med wildtype HA, mot vilket andra virus jämförs. Denna siffra har ändrats från en tidigare publikation21. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
RTCA är en impedansbaserad teknik som i allt högre grad används för realtidsövervakning av cellegenskaper, såsom cellefterlevnad, spridning, migration och cytotoxicitet. I denna studie demonstreras denna tekniks förmåga att bedöma IAV-överlevnad utanför värden genom att mäta virusinaktiveringslutning. Kräsna tekniker som TCID50 och plack analyser ersätts av objektiv realtidsbedömning av cellens livskraft, vilket återspeglar cytopatiska effekter som orsakas av viruset. I likhet med TCID50 - eller plackformningsenheten (pfu) är CIT50 också linjärt korrelerad med infektionens mångfald (figur 2). Bland begränsningarna i detta tillvägagångssätt misslyckas denna metod med att exakt övervaka celler infekterade med icke-cytopatogent virus.
Som ett exempel kan införandet av ny mutation i virala genomet starkt dämpa ett virus och minska dess cytopatogenicitet. Däremot är inaktiveringsbacken som beräknas här oberoende av virusreplikation och en potentiell virusdämpning, eftersom denna lutning härleds från CIT50-värden som mäts efter olika tidpunkter för inaktivering av samma virus. Här antas det således att viruspartiklar som fortfarande kan infektera en cell efter detta inaktiveringsprotokoll delar samma replikationsfenotyp som virus före inaktiveringen.
Trots högre kostnader minskas arbets belastningen med den här metoden avsevärt, vilket är fördelaktigt när ett projekt kräver kinetik, med mått frekventa tidpunkter och under en lång tidsperiod. Som i alla protokoll är vissa steg kritiska, och manipuleringar måste utföras med försiktighet och precision. Omvänd pipettering är ett avgörande steg för att säkerställa exakt dispensering av mediet, och särskild uppmärksamhet måste ägnas åt att undvika kontaminering. På samma sätt måste den ursprungliga cellkvantiteten vara densamma mellan varje experiment och måste bedömas med hjälp av en automatiserad cellräknare med trypanblå färgning. Under apparatens övervakning av gemenskapsindustrin bör inkubatorns öppning begränsas så mycket som möjligt.
Om vård och uppmärksamhet ges under experimentet med begränsad rörelse blir föroreningsrisken låg och resultaten är mycket reproducerbara. Fördelningen av inaktiveringsbackar mellan olika virus är betydligt annorlunda, så ett icke-parametriskt statistiskt test används för att jämföra virusbeständighet. Medelinaktiveringssluttningar kan beräknas för alla virus som producerar cytopatiska effekter i cellkulturen, såsom enteriska virus, ebolavirus eller coronavirus, vars persistens i miljöförhållanden för närvarande studeras (och sannolikt med traditionella virologimetoder). I framtiden kan denna metod också användas för att jämföra replikering av olika virus, undersöka virustropism för flera cellinjer samtidigt och studera specifika steg i viruscykeln.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25%Trypsin | ThermoFisher | 25200056 | |
| 75 cm2 tissue culture flask | Falcon | 430641U | |
| E-Plate 16 (6 plates) | ACEA Biosciences, Inc | 5469830001 | E-plates are avalible in different packaging |
| FCS | Life technologies (gibco) | 10270-106 | |
| MEM 1X | Life technologies (gibco) | 31095029 | |
| PBS 1X | Life technologies (gibco) | 14040091 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life technologies (gibco) | 11548876 | |
| TPCK-Trypsin | Worthington | LS003740 | |
| xCELLigence Real-Time Cell Analysis Instrument S16 | ACEA Biosciences, Inc | 380601310 | The xCELLigence RTCA S16 instruments are available in different formats (16-well, 96-well, single or multi-plate) |
References
- Killingley, B., Nguyen-Van-Tam, J.
- Sooryanarain, H., Elankumaran, S. Environmental Role in Influenza Virus Outbreaks. Annual Review of Animal Biosciences. 3 (1), 347-373 (2015).
- Keeler, S. P., Dalton, M. S., Cressler, A. M., Berghaus, R. D., Stallknecht, D. E. Abiotic factors affecting the persistence of avian influenza virus in surface waters of waterfowl habitats. Applied and Environmental Microbiology. 80 (9), 2910-2917 (2014).
- Stallknecht, D. E., Kearney, M. T., Shane, S. M., Zwank, P. J. Effects of pH, temperature, and salinity on persistence of avian influenza viruses in water. Avian Diseases. 34 (2), 412-418 (1990).
- Poulson, R. L., Tompkins, S. M., Berghaus, R. D., Brown, J. D., Stallknecht, D. E. Environmental Stability of Swine and Human Pandemic Influenza Viruses in Water under Variable Conditions of Temperature, Salinity, and pH. Applied and Environmental Microbiology. 82 (13), 3721-3726 (2016).
- Zhang, G., et al. Evidence of influenza A virus RNA in Siberian lake ice. Journal of Virology. 80 (24), 12229-12235 (2006).
- Nazir, J., et al. Long-Term Study on Tenacity of Avian Influenza Viruses in Water (Distilled Water, Normal Saline, and Surface Water) at Different Temperatures. Avian Diseases. 54 (1), 720-724 (2010).
- Brown, J. D., Swayne, D. E., Cooper, R. J., Burns, R. E., Stallknecht, D. E. Persistence of H5 and H7 avian influenza viruses in water. Avian Diseases. 51, 1 Suppl 285-289 (2007).
- Dublineau, A., et al. Persistence of the 2009 pandemic influenza A (H1N1) virus in water and on non-porous surface. PLoS ONE. 6 (11), 28043 (2011).
- Titration of Influenza Viruses. Springer Nature Experiments. , Available from: https://experiments.springernature.com/articles/10.1007/978-1-4939-8678-1_4 (2020).
- Szretter, K. J., Balish, A. L., Katz, J. M. Influenza: Propagation, Quantification, and Storage. Current Protocols in Microbiology. 3 (1), 1-22 (2006).
- Gaush, C. R., Smith, T. F. Replication and Plaque Assay of Influenza Virus in an Established Line of Canine Kidney Cells. Applied Microbiology. 16 (4), 588-594 (1968).
- Witkowski, P. T., et al. Cellular impedance measurement as a new tool for poxvirus titration, antibody neutralization testing and evaluation of antiviral substances. Biochemical and Biophysical Research Communications. 401 (1), 37-41 (2010).
- Lebourgeois, S., et al. Development of a Real-Time Cell Analysis (RTCA) Method as a Fast and Accurate Method for Detecting Infectious Particles of the Adapted Strain of Hepatitis A Virus. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 335 (2018).
- Teng, Z., Kuang, X., Wang, J., Zhang, X. Real-time cell analysis--a new method for dynamic, quantitative measurement of infectious viruses and antiserum neutralizing activity. Journal of Virological Methods. 193 (2), 364-370 (2013).
- Fang, Y., Ye, P., Wang, X., Xu, X., Reisen, W. Real-time monitoring of flavivirus induced cytopathogenesis using cell electric impedance technology. Journal of Virological Methods. 173 (2), 251-258 (2011).
- Charretier, C., et al. Robust real-time cell analysis method for determining viral infectious titers during development of a viral vaccine production process. Journal of Virological Methods. 252, 57-64 (2018).
- Tian, D., et al. Real-Time Cell Analysis for Measuring Viral Cytopathogenesis and the Efficacy of Neutralizing Antibodies to the 2009 Influenza A (H1N1) Virus. PLoS ONE. 7 (2), 31965 (2012).
- Teng, Z., Kuang, X., Wang, J., Zhang, X. Real-time cell analysis--a new method for dynamic, quantitative measurement of infectious viruses and antiserum neutralizing activity. Journal of Virological Methods. 193 (2), 364-370 (2013).
- Thieulent, C. J., et al. Screening and evaluation of antiviral compounds against Equid alpha-herpesviruses using an impedance-based cellular assay. Virology. 526, 105-116 (2019).
- Labadie, T., Batéjat, C., Manuguerra, J. -C., Leclercq, I. Influenza Virus Segment Composition Influences Viral Stability in the Environment. Frontiers in Microbiology. 9, 1496 (2018).
- Wiley, D. C., Skehel, J. J. The structure and function of the hemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus. Annual Review of Biochemistry. 56, 365-394 (1987).
