Summary
Hier is een protocol gerapporteerd voor de kwantificering van infectieuze virale deeltjes met behulp van real-time monitoring van elektrische impedantie van geïnfecteerde cellen. Een praktische toepassing van deze methode wordt gepresenteerd door het kwantificeren van influenza A-virusverval onder verschillende fysisch-chemische parameters die omgevingsomstandigheden nabootsen.
Abstract
Methoden voor het kwantificeren van virusdeeltjes vormen een cruciaal aspect van veel virologische studies. Hoewel er verschillende betrouwbare technieken bestaan, zijn ze tijdrovend of niet in staat om kleine variaties te detecteren. Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de nauwkeurige kwantificering van virale titer door elektrische impedantievariaties van geïnfecteerde cellen in realtime te analyseren. Cellulaire impedantie wordt gemeten door middel van gouden micro-elektrode biosensoren onder de cellen in microplaten, waarbij de grootte afhangt van het aantal cellen en hun grootte en vorm. Dit protocol maakt real-time analyse van celproliferatie, levensvatbaarheid, morfologie en migratie mogelijk met verbeterde gevoeligheid. Ook wordt een voorbeeld gegeven van een praktische toepassing door het kwantificeren van het verval van influenza A-virus (IAV) onderworpen aan verschillende fysisch-chemische parameters die de virale infectiviteit in de loop van de tijd beïnvloeden (d.w.z. temperatuur, zoutgehalte en pH). Voor dergelijke toepassingen vermindert het protocol de benodigde werklast en genereert het ook nauwkeurige kwantificeringsgegevens van infectieuze virusdeeltjes. Het maakt de vergelijking van inactiveringshellingen tussen verschillende IAV's mogelijk, wat hun vermogen weerspiegelt om in een bepaalde omgeving te blijven bestaan. Dit protocol is gemakkelijk uit te voeren, is zeer reproduceerbaar en kan worden toegepast op elk virus dat cytopathische effecten in celkweek produceert.
Introduction
De overdracht van een virus is afhankelijk van de combinatie van verschillende factoren. Voor een virus dat in de omgeving wordt uitgescheiden, hangt de overdracht ervan ook af van het vermogen om te volharden in omstandigheden buiten de gastheer. Het bestuderen van virale inactivatie in het algemeen is daarom een cruciale stap in het helpen van nationale gezondheidsautoriteiten en beleidsmakers bij het implementeren van controle- en bioveiligheidsmaatregelen.
De kennis over de persistentie van virussen in natuurlijke en laboratoriumomgevingen is de afgelopen tien jaar aanzienlijk toegenomen. In het geval van influenza A-virussen (IAV) onderwerpen hun transmissieroutes virale deeltjes aan een breed scala aan omgevingsomstandigheden. In het bijzonder kunnen ze worden overgedragen via 1) fecaal-orale routes door water (d.w.z. vogelvirussen), of 2) direct of indirect contact door besmette fomites, evenals aerosolen en ademhalingsdruppels (d.w.z. pluimvee- en zoogdiervirussen)1. In elk geval worden IAV onderworpen aan verschillende fysisch-chemische parameters (d.w.z. pH, zoutgehalte, temperatuur en vochtigheid), die min of meer snel hun infectiviteit beïnvloeden2,3,4,5,6,7,8,9. Het is van groot belang, met name met betrekking tot zoönotische en pandemische virussen, om het potentieel van omgevingsfactoren te beoordelen om de virusdynamiek en de risico's van blootstelling en overdracht tussen soorten te beïnvloeden.
Tot nu toe zijn traditionele virologische technieken (d.w.z. virale titerbepaling door middel van plaquetests of 50% weefselkweek infectieuze dosisschatting) gebruikt om de IAV-infectiviteit in de loop van de tijd te beoordelen; maar deze technieken zijn tijdrovend en vereisen veel benodigdheden10,11,12. Het meten van de impedantie van geïnfecteerde cellen in de loop van de tijd met micro-elektroden dient als een nuttig hulpmiddel om de IAV-overleving in verschillende omgevingsomstandigheden te volgen, evenals virale inactivatie in het algemeen. Deze methode biedt objectieve, real-time gegevens die subjectieve menselijke observatie van cytopathische effecten vervangen. Het kan worden gebruikt om virustitratie te bepalen, waardoor traditionele metingen worden vervangen door lagere betrouwbaarheidsintervallen en arbeidsintensieve eindpunttests worden vermeden.
Er bestaat een lineaire correlatie tussen titratieresultaten verkregen door meting van celimpedantie en door klassieke plaquetest of TCID50-methoden. Daarom kunnen gegevens verkregen met de op impedantie gebaseerde titratiemethode eenvoudig worden omgezet in TCID50- of pfu-waarden door een standaardcurve te maken met seriële verdunning van het virus13,14,15,16,17. Detectie, kwantificering en werkzaamheid van neutraliserende antilichamen in serummonsters kunnen ook worden bereikt met behulp van deze experimentele benadering18,19. Meer recent zijn op impedantie gebaseerde cellulaire assays gebruikt om antivirale verbindingen tegen Equid alphaherpesvirussen20 te screenen en te evalueren.
Deze technologie is gebruikt om de persistentie van IAV's in zout water bij verschillende temperaturen te evalueren en om mutaties in het hemagglutinine van IAV te identificeren die de IAV-persistentie in de omgeving verhogen of verlagen21. Een dergelijke screening zou uitgebreid werk vereisen als traditionele titratiemethoden worden gebruikt. Deze methodologie kan echter worden gebruikt voor elk virus dat van invloed is op de celmorfologie, het celnummer en de hechtingssterkte van het celoppervlak. Het kan ook worden gebruikt om persistentie in verschillende omgevingsomstandigheden (d.w.z. in de lucht, in water of op oppervlakken) te controleren.
Het hier beschreven protocol past IAV-overleving in water toe als voorbeeld. Menselijke influenzavirussen worden gedurende langere perioden blootgesteld aan verschillende fysisch-chemische parameters. Zout water (35 g/L NaCl) bij 35 °C werd gekozen als milieumodel op basis van eerdere resultaten9. Resterende infectiviteit van blootgestelde virussen wordt gekwantificeerd op verschillende tijdstippen door celinfectie. MDCK-cellen, het referentieceltype voor IAV-amplificatie, worden gezaaid op 16 goed microtiterplaten bedekt met micro-elektrodesensoren en 24 uur later geïnfecteerd door blootgestelde virussen. Celimpedantie wordt elke 15 minuten gemeten en uitgedrukt als een willekeurige eenheid die de celindex (CI) wordt genoemd. Cytopathische effecten geïnduceerd door het influenzavirus, waarvan de snelheid van aanvang direct afhangt van het aantal infectieuze virale deeltjes dat in de celkweek wordt geënt, leidt tot CI-afname, die vervolgens wordt gekwantificeerd als de CIT50-waarde . Deze waarde komt overeen met de tijd die nodig is om een reductie van 50% ten opzichte van het initiële CI te meten (d.w.z. vóór virustoevoeging). CIT50-waarden berekend voor verschillende omgevingsblootstellingstijden maken het mogelijk om de inactiveringshelling van een virus af te trekken na lineaire regressie van CIT50-waarden .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Behandel alle influenzavirussen volgens de juiste vereisten voor het bioveiligheidsniveau (BSL-2 of hoger, afhankelijk van het subtype). Gebruik IAV-stammen met een lage passagegeschiedenis (minder dan 5x op MDCK-cellen) om een lage variatie tussen experimenten te verzekeren.
1. Bereiding van reagentia en grondstoffen
- Bereiding van MDCK-cellen en steriel celkweekmedium
- Cultiveer Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cellen in gemodificeerd Eagle's medium (MEM) aangevuld met 10% warmte geïnactiveerd foetaal kalfsserum (FCS) en antibiotica (100 eenheden / ml penicilline, 100 mg / ml streptomycine).
- Na het ontdooien passeren MDCK-cellen minstens 2x voordat ze worden geïnfecteerd om volledig herstel te garanderen (maar minder dan 30 passages om drift in celfenotypen te voorkomen).
- Zaad 75 cm2 weefselkweekkolf(en) met 30 ml steriele 1x MEM met 7,5 x 106 MDCK-cellen en incubeer bij 37 °C in een bevochtigde 5% CO2-incubator .
- Voorbereiding van impedantiebewakingsapparatuur
- Plaats het instrument in de couveuse bij 35 °C en laat het ten minste 2 uur opwarmen.
- Sluit het aan op de besturingseenheid die buiten de incubator is geplaatst.
- Ga verder met reinigingsprocedures zoals aanbevolen door de fabrikant voordat u met de rest van het experiment begint.
- Productie van IAV-voorraden op MDCK-cellen
- Om H1N1-virussen te verspreiden en te versterken, zaait u 7,5 x 106 MDCK-cellen op twee weefselkweekkolven van 75 cm2 en incubeert u gedurende 24 uur bij 37 °C om 90% -100% confluentie te bereiken.
- Decanteer het celkweekmedium uit de celmonolaag in kolven van 75 cm2 . Was de cellen met 5 ml steriele 1x PBS.
- Verwijder PBS en voeg 5 ml 1x PBS toe om de cellen opnieuw te wassen.
- Label één kolf als de controle en verwijder PBS voordat u 15 ml viruspropagatiemedia (1x MEM met 0% FCS) voorzichtig op de monolaag toevoegt. Incubeer deze kolf in een incubator op 35 °C met 5% CO2. Gebruik het ter vergelijking na 3 dagen vermeerdering.
- Ontdooi één injectieflacon IAV-bouillon bij RT. Verdun het virus tot de juiste concentratie in een buis van 1,5 ml met viruspropagatiemedia (1x MEM met 0% FCS).
- Verwijder 1x PBS uit de kolf van 75 cm2 en infecteer MDCK-cellen bij een multipliciteit van infectie (MOI) van 1 x 10-3 of 1 x 10-4 plaquevormende eenheden per cel (pfu /cel) door 1 ml van het verdunde virus toe te voegen aan de celmonolaag.
- Adsorbeer het virus gedurende 45 minuten bij RT aan MDCK-cellen door de kolf regelmatig om de 15 minuten te roeren.
- Verwijder voorzichtig het entmateriaal en voeg 15 ml viruspropagatiemedia per kolf toe die 1 μg/ml TPCK-trypsine (trypsine/L-1-tosylamide-2-fenylethylchlorofylketon) bevatten om het virale hemagglutinine HA0 te splitsen in HA1- en HA2-subeenheden (een gebeurtenis die nodig is voor HA-fusie met het endosomale membraan en afgifte van het virale genoom)22.
- Incubeer de kolven bij 35 °C en 5% CO2 gedurende ten minste 3 dagen om het virus te repliceren.
- Observeer MDCK-cellen onder een microscoop bij 40x vergroting en zoek naar cytopathische effecten (CPE) op de cellen (door te vergelijken met de celcontrolekolf). Als cpe niet compleet is (d.w.z. ongeveer 80% van de cellen is losgemaakt van het substraat), plaats de kolven dan nog eens 24 uur terug in de incubator.
- Wanneer CPE is voltooid, decanteert u het celkweeksupernatant en centrifugeert u gedurende 10 minuten bij 300 x g om het cellulaire puin te pelleteren.
- Breng het geklaarde supernatant over in een buis van 15 ml en aliquote nageslachtsvirussen in steriele cryogene injectieflacons voor eenmalig gebruik. Plaats de cryobuizen onmiddellijk op -80 °C om virussen in te vriezen en op te slaan.
2. Bepaling van de juiste celhoeveelheid voor infecterende cellen
OPMERKING: Houd de platen tijdens alle experimenten te allen tijde op niet-elektrostatische oppervlakken, zoals de papieren wikkels van de verpakking. Volg sectie 2 hieronder om de meest geschikte concentratie van cellen te bepalen die in de elektronische microtiterplaat (ontworpen als E-plaat) moet worden gezaaid.
- Bereid MDCK-cellen in kolven van 75 cm2 om 24 uur voor het experiment vers gesplitste cellen (ongeveer 80% confluentie) te verkrijgen.
- Was cellen met 5 ml 1x PBS en maak ze los door 3 ml 0,25% Trypsine-EDTA-oplossing toe te voegen.
- Voeg 7 ml vers celkweekmedium toe en tel cellen met behulp van een geautomatiseerde celteller met trypanblauwe kleuring.
- Pas de celconcentratie aan tot 400.000 cellen/ml met celkweekmedia. Voer tweevoudige seriële verdunningen uit in extra buizen om celdichtheden van 200.000 te verkrijgen; 100,000; 50,000; 25,000; 12,500; en 6.250 cellen/ml. Pas het verdunningsbereik van de cellen aan op basis van het celtype en hun groeigedrag.
- Laat de E-plaat (Table of Materials) enkele minuten bij RT staan en voeg 100 μL celkweekmedia toe aan elke put met behulp van een meerkanaalspipet. Raak de elektroden van de E-plaat niet aan.
- Ontgrendel de houders en steek de voorkant van de plaat in het houdervak van het impedantiemeetinstrument (Materiaaltabel). Sluit de deur van de couveuse.
- Open de software.
- Kies in "Standaard experimentpatroon instellen" de geselecteerde houder(s) en dubbelklik op de bovenste pagina en voer vervolgens de naam van het experiment in. Klik op "Lay-out" en voer de benodigde voorbeeldinformatie in voor elke geselecteerde put van de plaat; klik vervolgens op "Toepassen" wanneer u klaar bent. Klik op "Schema" | | "Stappen" "Voeg een stap toe". De software voegt automatisch een stap van 1 s toe om de achtergrondimpedantie (CI) te meten.
- Klik op "Start/Continue" op het tabblad "Uitvoeren". Klik op "Plot", voeg alle monsters toe door de juiste putten te selecteren en zorg ervoor dat CI tussen -0.1 en 0.1 ligt voordat u doorgaat naar de volgende stap.
- Haal de plaat uit de houder.
- Voeg 100 μL van elke celsuspensie vanaf stap 2.4 in tweevoud toe aan de juiste putten en 100 μL celmedia in putten die als controle worden gebruikt. Laat de E-plaat 30 minuten in de laminaire stroomkap bij RT om een gelijkmatige verdeling van de cellen aan de onderkant van de putten mogelijk te maken.
- Steek de E-plaat in de houderzak. Klik op "Schema" | "Stap toevoegen" in de software en waarden invoeren om cellen elke 30 minuten te controleren voor 200 herhalingen. Selecteer vervolgens "Start / Doorgaan".
- Controleer en plot de CI-gegevens door op de knop "Plot" in de software te klikken. Selecteer de concentratie cellen die net voor de stationaire fase 24 uur na het zaaien op de plaat zijn, om cellen te verkrijgen die zich nog in een groeifase bevinden tijdens virale infectie. De stationaire fase wordt bereikt wanneer het CI op zijn maximum is.
3. Correlatie tussen CIT50-waarden en de veelheid van infectie
- Voeg 100 μL steriel 1x MEM kweekmedium toe in elke put van de E-plaat. Steek de E-plaat bij 35 °C in de houderzak van het instrument. Meet de achtergrond zoals beschreven in stap 2.7.
- Haal de E-plaat uit de houder.
- Zaai 3 x 104 vers gesplitste MDCK-cellen op elke put van de elektronische microtiterplaat en laat ze 24 uur groeien bij 35 °C met 5% CO2 , zodat ze zich in een replicatieve fase bevinden tijdens IAV-infectie.
- Infecteer MDCK-cellen met verschillende 10-voudige verdunningen van een bekende 6 log10 TCID50 / ml titer van het H1N1-virus, met behulp van omgekeerd pipetteren voor reproduceerbaarheid door de onderstaande stappen te volgen:
- Spoel MDCK-cellen 2x met 100 μL MEM zonder FCS (virus propagatiemedia). Houd er rekening mee dat u alle media na de tweede wasbeurt verwijdert om verdere verdunning van het entmateriaal te voorkomen.
- Voeg 100 μL virale suspensie toe in elke put met behulp van een eenkanaalspipet. Om besmetting te voorkomen, gaat u verder door van links naar rechts te beginnen en vervolgens van boven naar beneden in de plaat, terwijl u de resterende putten met het deksel bedekt.
- Steek de plaat bij 35 °C in de houderzak van het instrument. Wees voorzichtig om plotselinge bewegingen te voorkomen die mogelijk tot besmettingen leiden.
- Begin met het controleren van de celimpedantie om de 15 minuten gedurende ten minste 100 uur zoals beschreven in stap 2.10.
- Na de twee meetcycli (d.w.z. 30 min) pauzeert u het apparaat door op "Pauzeren" te klikken in het tabblad "Uitvoeren" en de E-plaat uit de houder te verwijderen.
- Voeg 1 μg/ml TPCK-trypsine toe aan de viruspropagatiemedia om het virale hemagglutinine te splitsen.
- Voeg 100 μL viruspropagatiemedia met TPCK-trypsine toe aan elke put en steek de E-plaat in de houderzak.
- Klik op "Start/Continue" op het tabblad "Uitvoeren".
OPMERKING: Vergeet niet om een negatieve controle te creëren die overeenkomt met nep-geïnfecteerde cellen door virale suspensie te vervangen door viruspropagatiemedia.
4. IAV overlevingskinetiek
- Stel IAV bloot aan zout gedestilleerd water bij 35 °C en test op hun infectiviteit in de loop van de tijd door de afname van de celimpedantie te meten.
- Bereid zout gedestilleerd water door NaCl toe te voegen aan een eindconcentratie van 35 g/l in gedestilleerd water. Voeg 900 μL zout water toe aan cryobuizen van 2 ml.
- Voeg 100 μL virale bouillon toe in zout water en plaats de cryobuizen in een incubator (35 °C, 5% CO2) gedurende 1 uur, 24 uur of 48 uur.
- Zaad 100 μL (met 3 x 104) vers gesplitste MDCK-cellen op een 16 well microtiter plaat en groei gedurende 24 uur bij 37 °C en 5% CO2.
- Infecteer cellen met 100 μL blootgestelde virussen (eerder 10x verdund in kweekmedia) met behulp van omgekeerde pipetteermethode voor reproduceerbaarheid door sectie 3.4 te herhalen.
- Controleer de celimpedantie elke 15 minuten gedurende ten minste 100 uur.
5. Evaluatie van het verlies van infectiviteit
- Bepaling van CIT50-waarden om CI-afname te kwantificeren als gevolg van virus-geïnduceerde cytopathische effecten met de CIT50-waarde .
- Klik op "Plot" en voeg alle voorbeelden toe door op "Alles toevoegen" te klikken. Exporteer de resultaten naar een spreadsheet door op "Experimentinfo exporteren" te klikken. Beschouw initiële CI als cellulaire impedantiewaarde gemeten 5 uur na celinfectie door blootgestelde virussen (d.w.z. 24 uur na zaaien van MDCK-cellen op de microtiter E-plaat).
- Bereken de CIT50-waarde die overeenkomt met de benodigde tijd om een afname van 50% ten opzichte van het initiële CI te meten. Om de CIT50-waarde te berekenen, noteert u de CI-waarde op 5 hpi voor elk monster. Zoek vervolgens het tijdspunt waarop de CI-waarde gelijk is aan de helft van de CI-waarde bij 5 hpi met behulp van de index- en matchfuncties in de spreadsheet.
- Berekening van de gemiddelde inactiveringshelling
- Bepaal CIT50-waarden voor elke blootgestelde virale suspensie, op verschillende blootstellingstijden (in dagen).
- Bereken een lineaire regressiehelling op basis van cit50-uitgezette waarden, aangeduid als de inactivatiehelling en uitgedrukt in CIT50.day-1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ruwe gegevens verkregen na 120 uur met verschillende concentraties MDCK-cellen, van 15.000 tot 120.000 cellen per put, zijn weergegeven in figuur 1. Na 24 uur tonen CI-metingen aan dat cellen in putten met 30.000 cellen zich nog steeds in de exponentiële groeifase bevonden en deze celconcentratie werd gebruikt voor verdere experimenten. Figuur 2 illustreert de lineaire correlatie tussen CIT50-waarden en de initiële veelheid van infectie. MDCK-cellen worden gedurende 24 uur gekweekt en vervolgens geïnfecteerd met A/Paris/2590/2009 H1N1 virale stam bij een andere veelheid van infectie. Initieel CI wordt 5 uur na infectie gemeten.
Figuur 3 illustreert de experimentele procedure die in onze experimenten is gebruikt (panel A). Typische resultaten die een afname van CI laten zien als gevolg van virusgeïnduceerd cytopathisch effect worden weergegeven op paneel B. Dit zijn ruwe gegevens die worden verkregen nadat ze door de software zijn verwerkt. CIT50-waarden werden berekend met behulp van de spreadsheet na het exporteren van de gegevens. Na berekening van CIT50-waarden op verschillende tijdstippen, maakte een lineaire regressieanalyse het mogelijk om de helling te bepalen (paneel C). Virale inactivatiehellingen werden dus verkregen voor elk virus in elke toestand en vervolgens vergeleken om virussen te identificeren die de grootste stabiliteit hadden in de bestudeerde omgeving.
Figuur 4 toont inactivatiehellingen van IAV-recombinante virussen met een genetische ruggengraat die behoort tot de A/WSN/1933 H1N1-virusstam en een HA en NA van A/Nieuw-Caledonië/20/1999 H1N1-virus (HA-NA/NC99). Niet-synonieme mutaties in de HA werden geïntroduceerd om de impact op de persistentie van virusdeeltjes buiten de gastheer in zout water te bestuderen.
Door gemiddelde inactivatiehellingen van verschillende experimenten uitgevoerd in drievoud te vergelijken, konden we aminozuren in de HA identificeren die voldoende waren om de virale persistentie buiten de gastheer te beïnvloeden. Hoe lager de inactiveringshelling, hoe stabieler het virus. Als voorbeeld veroorzaakte de HA/F453Y-substitutie of HA::K147-insertie in de HA van het HA-NA/NC99-virus een significante toename van de gemiddelde inactivatiehelling tot respectievelijk 9,8 CIT50/dag en 9,9 CIT50/dag, vergeleken met wild-type HA (met een gemiddelde inactiveringshelling van 4,85 CIT50/dag), waardoor zeer onstabiele mutanten werden gegenereerd. Daarentegen had de HA/T327A-substitutie geen invloed op de virale stabiliteit bij 35 °C in zout water (gemiddelde inactivatiehelling van 6,6 CIT50/dag). De methodologie was dus krachtig genoeg om aminozuurresiduen in het HA-glycoproteïne te identificeren die betrokken waren bij IAV-overleving buiten de gastheer.
Figuur 1: Celtitratie in microtiter E-plaat.
Seriële verdunningen van MDCK-cellen werden gezaaid op microtiter E-platen en de celgroei werd gecontroleerd gedurende maximaal 100 uur (200 vegen om de 30 minuten). Grijze stippen vertegenwoordigen de standaarddeviaties van CI gemeten in tweevoud. De verticale lijn op 24 uur benadrukt dat in de beschreven omstandigheden het initiële zaaien van 3 x 104 cellen / put een cultuur van ongeveer 70% samenvloeiing mogelijk maakte op het moment van de infectie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Lineaire regressie tussen CIT50-waarden en initiële multipliciteit van infectie.
Elk punt geeft de CIT50-waarde aan die is berekend voor infectie van cellen met verschillende toxiciteiten van infectie. De ononderbroken lijn vertegenwoordigt de lineaire regressiehelling (R2 = 0,99) en stippellijnen vertegenwoordigen de 95% betrouwbaarheidsintervallen. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van een eerdere publicatie21. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Bepaling van de inactiveringshelling.
(A) Virale deeltjes werden gedurende 0, 1 of 2 dagen verdund in zout water bij 35 °C en CI werd continu gecontroleerd en uitgezet als celindex. (B) Ci-afname gekwantificeerd met de CIT50-waarden , die handmatig op de ruwe gegevens worden weergegeven door verticale stippellijnen. Elke curve vertegenwoordigt de evolutie van celimpedantie na infectie met virussen die gedurende toenemende tijden werden blootgesteld aan zout water (rood: niet-blootgesteld virus, geel: 24 uur blootstelling, groen: 48 uur blootstelling, donker: nep-geïnfecteerde cellen). Initieel CI werd gemeten 5 uur na infectie (C) Lineaire regressie van CIT50-waarden die werden gebruikt om de inactivatiehelling te berekenen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Impact van niet-synonieme mutaties in de HA op IAV-persistentie in zout water.
Inactiveringshellingen van reassortante virussen met een HA uit A/Nieuw-Caledonië/20/1999 H1N1-virus met (substitutie of insertie) of zonder mutatie (HAWT). Boxplots toonden de verdeling van enkele inactiveringshellingen (zes of acht afhankelijk van het virus, berekend uit verschillende onafhankelijke experimenten) verkregen voor elk blootgesteld virus rond het gemiddelde (horizontale lijnen). De gemiddelde inactiveringshellingen werden vergeleken met behulp van een ANOVA-test (ns, p > 0,05, ****p < 0,0001). Ref komt overeen met het reassortante virus met wildtype HA, waarmee andere virussen worden vergeleken. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van een eerdere publicatie21. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
RTCA is een op impedantie gebaseerde technologie die steeds vaker wordt gebruikt voor real-time monitoring van celeigenschappen, zoals celtrouw, proliferatie, migratie en cytotoxiciteit. In deze studie wordt het vermogen van deze technologie om de IAV-overleving buiten de gastheer te beoordelen aangetoond door de virusinactivatiehelling te meten. Kieskeurige technieken zoals TCID50 en plaque-assays worden vervangen door objectieve real-time beoordeling van de levensvatbaarheid van cellen, waardoor cytopathische effecten worden weerspiegeld die door het virus worden geïnduceerd. Net als de TCID50 of plaquevormende eenheid (pfu), is de CIT50 ook lineair gecorreleerd met de veelheid van infectie (figuur 2). Een van de beperkingen van deze aanpak is dat deze methode er niet in slaagt om cellen die zijn geïnfecteerd met een niet-cytopathogeen virus nauwkeurig te controleren.
De introductie van een nieuwe mutatie in het virale genoom kan bijvoorbeeld een virus sterk verzwakken en de cytopathogeniteit ervan verminderen. De hier berekende inactivatiehelling is daarentegen onafhankelijk van virusreplicatie en een potentiële virusverzwakking, omdat deze helling is afgeleid van CIT50-waarden die zijn gemeten na verschillende tijdspunten van inactivatie van hetzelfde virus. Hier wordt dus aangenomen dat virale deeltjes die na dit inactivatieprotocol nog in staat zijn om een cel te infecteren, hetzelfde replicatiefenotype delen als virussen vóór de inactivatie.
Ondanks hogere kosten wordt de werklast met behulp van deze aanpak aanzienlijk verminderd, wat voordelig is wanneer een project kinetiekprestaties vereist, met meten frequente tijdspunten en over een lange periode. Zoals in elk protocol zijn sommige stappen van cruciaal belang en moeten manipulaties met zorg en precisie worden uitgevoerd. Omgekeerd pipetteren is een cruciale stap om een nauwkeurige afgifte van de media te garanderen, en er moet speciale aandacht worden besteed aan het voorkomen van verontreiniging. Evenzo moet de initiële celhoeveelheid tussen elk experiment hetzelfde zijn en moet deze worden beoordeeld met behulp van een geautomatiseerde celteller met trypanblauwe kleuring. Tijdens de controle van het CI door het apparaat moet de opening van de incubator zoveel mogelijk worden beperkt.
Als er tijdens het experiment met beperkte beweging zorg en aandacht wordt geboden, wordt het besmettingsrisico laag en zijn de resultaten zeer reproduceerbaar. De verdeling van inactivatiehellingen over verschillende virussen is significant verschillend, dus een niet-parametrische statistische test wordt gebruikt om viruspersistentie te vergelijken. Gemiddelde inactivatiehellingen kunnen worden berekend voor virussen die cytopathische effecten in celkweek produceren, zoals enterische virussen, ebolavirus of coronavirussen, waarvan de persistentie in omgevingsomstandigheden momenteel wordt bestudeerd (en waarschijnlijk met behulp van traditionele virologische methoden). In de toekomst kan deze methode ook worden gebruikt om de replicatie van verschillende virussen te vergelijken, virustropisme voor meerdere cellijnen tegelijkertijd te onderzoeken en specifieke stappen van de viruscyclus te bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25%Trypsin | ThermoFisher | 25200056 | |
| 75 cm2 tissue culture flask | Falcon | 430641U | |
| E-Plate 16 (6 plates) | ACEA Biosciences, Inc | 5469830001 | E-plates are avalible in different packaging |
| FCS | Life technologies (gibco) | 10270-106 | |
| MEM 1X | Life technologies (gibco) | 31095029 | |
| PBS 1X | Life technologies (gibco) | 14040091 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life technologies (gibco) | 11548876 | |
| TPCK-Trypsin | Worthington | LS003740 | |
| xCELLigence Real-Time Cell Analysis Instrument S16 | ACEA Biosciences, Inc | 380601310 | The xCELLigence RTCA S16 instruments are available in different formats (16-well, 96-well, single or multi-plate) |
References
- Killingley, B., Nguyen-Van-Tam, J.
- Sooryanarain, H., Elankumaran, S. Environmental Role in Influenza Virus Outbreaks. Annual Review of Animal Biosciences. 3 (1), 347-373 (2015).
- Keeler, S. P., Dalton, M. S., Cressler, A. M., Berghaus, R. D., Stallknecht, D. E. Abiotic factors affecting the persistence of avian influenza virus in surface waters of waterfowl habitats. Applied and Environmental Microbiology. 80 (9), 2910-2917 (2014).
- Stallknecht, D. E., Kearney, M. T., Shane, S. M., Zwank, P. J. Effects of pH, temperature, and salinity on persistence of avian influenza viruses in water. Avian Diseases. 34 (2), 412-418 (1990).
- Poulson, R. L., Tompkins, S. M., Berghaus, R. D., Brown, J. D., Stallknecht, D. E. Environmental Stability of Swine and Human Pandemic Influenza Viruses in Water under Variable Conditions of Temperature, Salinity, and pH. Applied and Environmental Microbiology. 82 (13), 3721-3726 (2016).
- Zhang, G., et al. Evidence of influenza A virus RNA in Siberian lake ice. Journal of Virology. 80 (24), 12229-12235 (2006).
- Nazir, J., et al. Long-Term Study on Tenacity of Avian Influenza Viruses in Water (Distilled Water, Normal Saline, and Surface Water) at Different Temperatures. Avian Diseases. 54 (1), 720-724 (2010).
- Brown, J. D., Swayne, D. E., Cooper, R. J., Burns, R. E., Stallknecht, D. E. Persistence of H5 and H7 avian influenza viruses in water. Avian Diseases. 51, 1 Suppl 285-289 (2007).
- Dublineau, A., et al. Persistence of the 2009 pandemic influenza A (H1N1) virus in water and on non-porous surface. PLoS ONE. 6 (11), 28043 (2011).
- Titration of Influenza Viruses. Springer Nature Experiments. , Available from: https://experiments.springernature.com/articles/10.1007/978-1-4939-8678-1_4 (2020).
- Szretter, K. J., Balish, A. L., Katz, J. M. Influenza: Propagation, Quantification, and Storage. Current Protocols in Microbiology. 3 (1), 1-22 (2006).
- Gaush, C. R., Smith, T. F. Replication and Plaque Assay of Influenza Virus in an Established Line of Canine Kidney Cells. Applied Microbiology. 16 (4), 588-594 (1968).
- Witkowski, P. T., et al. Cellular impedance measurement as a new tool for poxvirus titration, antibody neutralization testing and evaluation of antiviral substances. Biochemical and Biophysical Research Communications. 401 (1), 37-41 (2010).
- Lebourgeois, S., et al. Development of a Real-Time Cell Analysis (RTCA) Method as a Fast and Accurate Method for Detecting Infectious Particles of the Adapted Strain of Hepatitis A Virus. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 335 (2018).
- Teng, Z., Kuang, X., Wang, J., Zhang, X. Real-time cell analysis--a new method for dynamic, quantitative measurement of infectious viruses and antiserum neutralizing activity. Journal of Virological Methods. 193 (2), 364-370 (2013).
- Fang, Y., Ye, P., Wang, X., Xu, X., Reisen, W. Real-time monitoring of flavivirus induced cytopathogenesis using cell electric impedance technology. Journal of Virological Methods. 173 (2), 251-258 (2011).
- Charretier, C., et al. Robust real-time cell analysis method for determining viral infectious titers during development of a viral vaccine production process. Journal of Virological Methods. 252, 57-64 (2018).
- Tian, D., et al. Real-Time Cell Analysis for Measuring Viral Cytopathogenesis and the Efficacy of Neutralizing Antibodies to the 2009 Influenza A (H1N1) Virus. PLoS ONE. 7 (2), 31965 (2012).
- Teng, Z., Kuang, X., Wang, J., Zhang, X. Real-time cell analysis--a new method for dynamic, quantitative measurement of infectious viruses and antiserum neutralizing activity. Journal of Virological Methods. 193 (2), 364-370 (2013).
- Thieulent, C. J., et al. Screening and evaluation of antiviral compounds against Equid alpha-herpesviruses using an impedance-based cellular assay. Virology. 526, 105-116 (2019).
- Labadie, T., Batéjat, C., Manuguerra, J. -C., Leclercq, I. Influenza Virus Segment Composition Influences Viral Stability in the Environment. Frontiers in Microbiology. 9, 1496 (2018).
- Wiley, D. C., Skehel, J. J. The structure and function of the hemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus. Annual Review of Biochemistry. 56, 365-394 (1987).
