Summary
여기에 보고된 감염한 세포의 전기 임피던스 에 대한 실시간 모니터링을 이용한 전염성 바이러스 입자의 정량화를 위한 프로토콜이 있다. 이 방법의 실용적인 적용은 환경 조건을 모방하는 다른 물리화학 적 매개 변수하에서 인플루엔자 A 바이러스 부패를 정량화하여 제시된다.
Abstract
바이러스 입자 정량화에 대한 방법은 많은 바이러스학 연구의 중요한 측면을 나타냅니다. 몇 가지 신뢰할 수 있는 기술이 존재하지만 시간이 많이 걸리거나 작은 변형을 감지할 수 없습니다. 여기에 제출된 것은 감염된 세포의 전기임피던스 변이를 실시간으로 분석하여 바이러스 성 티터의 정확한 정량화를 위한 프로토콜이다. 세포 임피던스는 마이크로 플레이트의 세포 아래에 위치한 금 마이크로 전기 전전자 바이오 센서를 통해 측정되며, 크기는 세포의 수와 크기와 모양에 따라 달라집니다. 이 프로토콜을 사용하면 향상된 감도로 세포 증식, 생존 가능성, 형태 학 및 마이그레이션을 실시간으로 분석할 수 있습니다. 또한 시간이 지남에 따라 바이러스 감염에 영향을 미치는 다양한 물리화학 적 매개 변수 (즉, 온도, 염도 및 pH)에 제출 된 인플루엔자 A 바이러스 (IAV)의 부패를 정량화하여 실용적인 응용 프로그램의 예가 제공됩니다. 이러한 응용 프로그램의 경우 프로토콜은 전염성 바이러스 입자의 정확한 정량화 데이터를 생성하는 동시에 필요한 워크로드를 줄입니다. 그것은 주어진 환경에서 지속 할 수있는 용량을 반영하는 다른 IAV 사이의 불활성화 슬로프의 비교를 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 수행하기 쉽고, 매우 재현 가능하며, 세포 배양에서 세포 병증 효과를 생성하는 모든 바이러스에 적용 될 수 있습니다.
Introduction
바이러스의 전송은 몇몇 요인의 조합에 의존합니다. 환경에서 분비된 바이러스의 경우, 전송은 호스트 외부의 조건에서 지속되는 능력에 따라 달라집니다. 일반적으로 바이러스 성 불활성화를 연구하는 것은, 그러므로, 국가 보건 당국과 정책 입안자가 통제 및 생물 안전 조치를 실행하는 것을 돕는 중요한 단계입니다.
자연 및 실험실 설정에서 바이러스 지속성에 대 한 지식은 지난 10 년 동안 상당히 증가 했다. 인플루엔자 A 바이러스(IAV)의 경우, 이들의 전송 경로는 광범위한 환경 조건에 바이러스 입자를 제출합니다. 구체적으로, 1) 배설구 경로를 통해 물(즉, 조류 바이러스) 또는 2) 오염된 포미트뿐만 아니라 에어로졸 및 호흡기 방울(즉, 가금류 및 포유류 바이러스)에 의한 직접 또는 간접 접촉을 통해 전달될 수 있다. 어쨌든, IAV는 다양한 물리화학적 매개변수(즉, pH, 염분, 온도 및 습도)에 제출되며, 이는 감염성에 다소 빠르게 영향을 미칩니다2,3,4,5,6,7,8,9. 특히 동물노닉 및 전염병 바이러스에 관한 매우 중요하며, 바이러스 역학에 영향을 미치는 환경 요인의 잠재력과 노출 및 종 간 전염의 위험을 평가하는 것이 매우 중요합니다.
지금까지, 전통적인 바이러스학 기술 (즉, 플라크 애스터또는 50% 조직 배양 전염성 용량 추정을 통해 바이러스 성 titer 결정) 시간이 지남에 따라 IAV 감염성을 평가하는 데 사용되었습니다; 그러나 이러한 기술은 시간이 많이 소요되며 많은 공급이 필요합니다10,11,12. 감염된 세포를 마이크로 전극으로 시간이 지남에 따라 임피던드를 측정하는 것은 일반적으로 바이러스 성 불활성화뿐만 아니라 다른 환경 조건에서 IAV 생존을 모니터링하는 유용한 도구역할을합니다. 이 방법은 세포 병증 효과의 주관적인 인간 관찰을 대체하는 객관적인 실시간 데이터를 제공합니다. 그것은 바이러스 적정을 결정하는 데 사용할 수 있습니다, 따라서 낮은 신뢰 간격으로 기존의 측정을 대체하고 노동 집약적 인 엔드 포인트 측정을 피할 수 있습니다.
선형 상관 관계는 세포 임피던드의 측정과 고전적인 플라크 분석또는 TCID50 방법에 의해 얻어진 적정 결과 사이에 존재한다. 따라서, 임피던스 기반 적정 법으로 얻은 데이터는 바이러스의 직렬 희석을 이용한 표준 곡선을 생성하여 TCID50 또는 pfu 값에서 쉽게 변형될 수 있다13,14,15,16,17. 혈청 시료에 존재하는 항체중화의 검출, 정량화 및 효능또한 이러한 실험접근법18,19를 사용하여 달성될 수 있다. 최근에는 임피던스 기반 세포 소가 Equid alphaherpesviruses20에 대한 항바이러스 화합물을 선별하고 평가하는 데 사용되었습니다.
이 기술은 다른 온도에서 식염수에서 IAV의 지속성을 평가하고 환경에서 IAV 지속성을 증가또는 감소IAV의 헤마글루티닌에서 돌연변이를 식별하는 데 사용되었습니다21. 이러한 심사는 전통적인 적정 방법을 사용하는 경우 광범위한 작업이 필요합니다. 그러나, 이 방법론은 세포 형태, 세포 수 및 세포 표면 부착 강도에 영향을 미치는 모든 바이러스에 사용될 수 있다. 또한 다양한 환경 조건(예: 공기, 물 또는 표면)에서 지속성을 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다.
여기에 설명된 프로토콜은 물에 IAV 생존을 예로 적용합니다. 인간 인플루엔자 바이러스는 장기간 다른 물리화학 적 매개 변수에 노출됩니다. 식염수(35g/L NaCl)의 35°C에서 의 물은 이전 결과에 기초하여 환경 모델로 선택되었다9. 노출된 바이러스의 잔류 감염성은 세포 감염을 통해 상이한 시점에서 정량화된다. IAV 증폭을 위한 기준 세포 형인 MDCK 세포는 마이크로 전광제 센서로 코팅된 16개의 잘 된 마이크로티터 플레이트에 시드되고 24시간 후에 노출된 바이러스에 의해 감염된다. 세포 임피던스는 매 15분마다 측정되고 세포 지수(CI)라고 불리는 임의단위로 표현된다. 인플루엔자 바이러스에 의해 유도된 세포요법 효과는, 그 개시의 비율은 세포 배양에 접종된 전염하는 바이러스성 입자의 수에 직접적으로 의존합니다, CI 감소로 이끌어 내고, 이는 그 후에 CIT50 값으로 정량화됩니다. 이 값은 초기 CI(즉, 바이러스 첨가 전)로부터 50% 감소를 측정하는 데 필요한 시간에 해당합니다. 여러 환경 노출 시간에 대해 계산된 CIT50 값은 CIT50 값의 선형 회귀 후 바이러스의 불활성화 경사를 공제할 수 있습니다.
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Protocol
적절한 생체 안전 수준 요구 사항 (BSL-2 이상 하위 유형에 따라) 모든 인플루엔자 바이러스를 처리하십시오. 낮은 통로 기록 (MDCK 세포에 5 배 미만)을 가진 IAV 균주를 사용하여 실험 사이의 낮은 변화를 보장하십시오.
1. 시약 및 시작 재료의 준비
- MDCK 세포 및 멸균 세포 배양 배지의 준비
- 10% 열 불활성 태아 종아리 혈청(FCS) 및 항생제(100단위/mL 페니실린, 100 mg/mL 연쇄절제술)로 보충된 변형 독수리 의 매체(MEM)에서 Madin-Darby Canine 신장(MDCK) 세포를 육성합니다.
- 해동 후, MDCK 세포를 감염시키기 전에 적어도 2배 이상 완전한 회복을 보장합니다(그러나 세포 표현형의 드리프트를 피하기 위해 30개 미만의 통로).
- 종자 75cm2 조직 배양 플라스크(s)는 7.5 x 106 MDCK 세포와 함께 멸균 1x MEM30mL을 함유하고 가습 5% CO2 인큐베이터에서 37°C에서 배양한다.
- 임피던스 모니터링 장비 준비
- 인큐베이터에 계측기를 35°C로 놓고 2시간 이상 따뜻하게 해보도록 합니다.
- 인큐베이터 외부에 배치된 제어 장치에 연결합니다.
- 실험의 나머지 부분을 시작하기 전에 제조업체에서 권장하는 대로 세척 절차를 진행합니다.
- MDCK 셀에 IAV 주식 생산
- H1N1 바이러스를 전파하고 증폭하기 위해, 종자 7.5 x 106 MDCK 세포는 75cm2 조직 배양 플라스크에 24시간 동안 37°C에서 24시간 동안 배양하여 90%-100% 합류에 도달한다.
- 75cm2 플라스크에서 세포 단층으로부터 세포 배양 배지를 데산한다. 멸균 1x PBS의 5mL로 세포를 씻으시다.
- PBS를 제거하고 1x PBS5mL을 추가하여 세포를 다시 세척합니다.
- 단일 레이어에 15mL의 바이러스 전파 매체(0% FCS가 있는 1x MEM)를 추가하기 전에 한 플라스크를 컨트롤로 표시하고 PBS를 제거합니다. 인큐베이터에서 이 플라스크를 5% CO2로 35°C로 유지하여 배양합니다. 3일간의 전파 후 비교에 사용하십시오.
- RT에서 IAV 주식의 1유리병을 해동하여 바이러스 전파 매체를 포함하는 1.5mL 튜브(0% FCS를 가진 1x MEM)에서 적절한 농도로 바이러스를 희석시희석한다.
- 75cm2 플라스크에서 1x PBS를 제거하고 세포 단층층에 희석 바이러스의 1mL을 추가하여 세포당 1 x 10-3 또는 1 x 10-4 플라크 형성 단위의 감염(MOI)의 복합성에서 MDCK 세포를 감염시 감염(MOI)을 감염시 감염시 감염(MOI)을 감염시 1mL를 첨가한다.
- 15분마다 정기적으로 플라스크를 교반하여 RT에서 45분 동안 MDCK 세포에 흡착 바이러스를 흡착합니다.
- 무분뇨를 부드럽게 제거하고 1 μg /mL TPCK-trypsin (트립신 / L-1 - 토실아미드 - 2-페닐을 포함하는 플라스크 당 바이러스 전파 매체의 15 mL을 추가 아틸 클로로메틸 케톤), 바이러스 헤마글루티닌 HA0을 HA1 및 HA2 서브유닛으로 절단하기 위해(내도막과 HA 융합에 필요한 이벤트 및 바이러스 게놈의 방출)22.
- 플라스크를 35°C 및 5% CO2 에서 바이러스를 복제하기 위해 적어도 3일 동안 배양한다.
- 40x 배율에서 현미경하에서 MDCK 세포를 관찰하고 세포에 세포 병증 효과 (CPE)를 찾습니다 (세포 제어 플라스크와 비교하여). CPE가 완전하지 않은 경우(즉, 세포의 약 80%가 기판에서 분리됨), 플라스크를 인큐베이터에 다시 넣어 24시간 추가로 한다.
- CPE가 완료되면 세포 배양 상류체 및 원심분리기를 300 x g 에서 10분 동안 셀룰러 이물질을 펠릿으로 장식합니다.
- 15mL 튜브 및 알리쿼트 자손 바이러스를 일회용 멸균 극저온 바이알로 분리한다. 동결 및 재고 바이러스를 위해 즉시 냉동 튜브를 -80 °C에 놓습니다.
2. 세포 감염에 적합한 세포 수량 의 결정
참고: 모든 실험 에서 포장에서 종이 랩과 같이 항상 정전기가 아닌 표면에 플레이트를 유지합니다. 전자 마이크로티터 플레이트(E-Plate로 설계)에서 종향되는 세포의 가장 적절한 농도를 결정하기 위해 아래 섹션 2를 따르십시오.
- 75cm2 플라스크에서 MDCK 세포를 준비하여 실험 전에 24시간 신선하게 분할된 세포(약 80%의 합류)를 얻습니다.
- 1x PBS5mL로 셀을 세척하고 0.25% 트립신-EDTA 용액의 3mL를 추가하여 분리합니다.
- 7mL의 신선한 세포 배양 배지를 추가하고 trypan blue 염색기능이 있는 자동 셀 카운터를 사용하여 셀을 계산합니다.
- 세포 배양 배지로 세포 농도를 400,000 세포/mL로 조정합니다. 200,000의 세포 밀도를 얻기 위하여 추가 관에 있는 2 배 직렬 희석을 수행합니다; 100,000; 50,000; 25,000; 12,500; 및 6,250 세포 /mL. 세포 유형 및 성장 거동에 따라 세포의 희석 범위를 조정합니다.
- 전자 플레이트(재료 표)를 RT에 몇 분 간 두고 다중 채널 파이펫을 사용하여 각 웰에 100 μL의 세포 배양 매체를 추가합니다. 전자 플레이트의 전극을 만지지 마십시오.
- 요람의 잠금을 해제하고 임피던스 측정 기기 (재료의 표)의 요람 주머니에 플레이트 프론트 엔드를 삽입합니다. 인큐베이터의 문을 닫습니다.
- 소프트웨어를 엽니다.
- "기본 실험 패턴 설정"에서 선택한 요람을 선택하고 상단 페이지에서 두 번 클릭한 다음 실험 이름을 입력합니다. "레이아웃"을 클릭하고 플레이트의 각 선택 된 우물에 필요한 샘플 정보를 입력; 그런 다음 완료되면 "적용"을 클릭합니다. "일정" | 클릭 "단계" | "단계 추가". 이 소프트웨어는 자동으로 배경 임피던스 (CI)를 측정하기 위해 1의 단계를 추가합니다.
- "실행" 탭에서 "시작/계속"을 클릭합니다. "플롯"을 클릭하고, 적절한 우물을 선택하여 모든 샘플을 추가하고 CI가 -0.1에서 0.1 사이인지 확인한 후 다음 단계로 진행합니다.
- 요람에서 접시를 제거합니다.
- 각 셀 현탁액의 100 μL을 2.4 단계에서 복제하여 적절한 우물과 100 μL의 세포 매체를 대조군으로 사용한다. 우물 의 바닥에 세포의 균일 한 분포를 허용하기 위해 RT에서 30 분 동안 라미나르 흐름 후드에 E 플레이트를 둡니다.
- E 플레이트를 요람 주머니에 넣습니다. "일정" | 클릭 소프트웨어에서 "단계 추가"를 입력하고 값을 입력하여 200회 반복을 위해 30분마다 셀을 모니터링합니다. 그런 다음 "시작/계속"을 선택합니다.
- 소프트웨어의 "플롯" 버튼을 클릭하여 CI 데이터를 확인하고 플롯합니다. 바이러스 감염 중 성장 단계에 있는 세포를 얻기 위하여, 플레이트에 파종 한 후 정지 단계 24 h 직전에 세포의 농도를 선택합니다. CI가 최대일 때 고정 단계에 도달합니다.
3. CIT50 값과 감염의 복합성 사이의 상관 관계
- E 플레이트의 각 웰에 멸균 1x MEM 배양 배지 100 μL을 추가합니다. 35°C에서 기기의 요람 주머니에 E 플레이트를 삽입합니다. 2.7 단계에서 설명된 대로 배경을 측정합니다.
- 요람에서 E 플레이트를 제거합니다.
- 종자 3 x 104 전자 마이크로티터 플레이트의 각 웰에 갓 분할 MDCK 세포와 IAV 감염 중 복제 단계에 있도록 5 % CO2 와 35 ° C에서 24 시간 동안 성장.
- H1N1 바이러스의 알려진 6 log10 TCID50/mL 티터의 다른 10배 희석제로 MDCK 세포를 감염시키고, 아래 단계를 수행하여 재현성을 위해 역피팅을 사용하십시오.
- FCS가 없는 MEM의 100 μL을 가진 MDCK 세포 2x를 헹구는 (바이러스 전파 매체). 접종의 추가 희석을 피하기 위해 두 번째 세척 후 모든 미디어를 제거하십시오.
- 단일 채널 파이펫을 사용하여 각 웰에 100 μL의 바이러스 현탁액을 추가합니다. 오염을 방지하려면 왼쪽에서 오른쪽으로 시작한 다음 플레이트의 위쪽에서 아래쪽으로 진행하면서 나머지 우물을 뚜껑으로 덮습니다.
- 35°C에서 기기의 요람 주머니에 플레이트를 삽입합니다. 오염으로 이어질 가능성이 있는 갑작스런 움직임을 피하기 위해 부드럽게 하십시오.
- 2.10 단계에서 설명된 바와 같이 적어도 100시간 동안 15분마다 세포 임피던드를 모니터링하기 시작합니다.
- 측정의 두 주기 후 (즉, 30 분), "실행"탭에서 "일시 중지"를 클릭하여 장치를 일시 중지하고 요람에서 전자 플레이트를 제거합니다.
- 바이러스 전파 매체에 1 μg/mL TPCK-트립신을 추가하여 바이러스 헤마글루티닌을 절단합니다.
- TPCK-트립신이 들어있는 바이러스 전파 매체 100μL을 각 우물에 넣고 전자 플레이트를 요람 주머니에 삽입합니다.
- "실행" 탭에서 "시작/계속"을 클릭합니다.
참고: 바이러스 성 현탁액을 바이러스 전파 매체로 대체하여 모의 감염 세포에 해당하는 부정적인 제어를 만드는 것을 잊지 마십시오.
4. IAV 생존 운동
- IAV를 35°C에서 식염수에 노출시키고 세포 임피던스 감소를 측정하여 시간이 지남에 따라 감염성을 테스트합니다.
- 증류수에 35g/L의 최종 농도에 NaCl을 추가하여 식염수 증류수를 준비합니다. 식염수 900μL을 2mL 냉동튜브에 넣습니다.
- 식염수에 바이러스 성 육수 100 μL을 추가하고 1 시간, 24 시간 또는 48 h에 대한 인큐베이터 (35 ° C, 5 % CO2)에 냉동 튜브를 배치합니다.
- 16개의 잘 미세화판에 갓 분할된 MDCK 세포의 100 μL(3 x 104 함유)을 종자 100 μL(3x 104 함유)으로 37°C 및 5% CO2에서 24시간 동안 자랍니다.
- 3.4항을 반복하여 재현성을 위한 역피 파이펫팅 방법을 사용하여 노출된 바이러스(배양 매체에서 이전에 희석된 10배)의 100μL를 가진 세포를 감염시보라고 한다.
- 적어도 100 시간 동안 15 분마다 세포 임피던드를 모니터링하십시오.
5. 감염손실 평가
- CIT50 값을 가진 바이러스 유발 세포 요법 효과로 인해 CI 감소를 정량화하기 위한 CIT50 값의 결정.
- "플롯"을 클릭하고 "모두 추가"를 클릭하여 모든 샘플을 추가합니다. "실험 정보 내보내기"를 클릭하여 결과를 스프레드시트로 내보냅니다. 초기 CI를 노출된 바이러스에 의해 세포 감염 후 5시간 측정된 세포 임피던스 값으로 고려하십시오(즉, 마이크로티터 E 플레이트에 MDCK 세포를 파종한 후 24시간).
- 초기 CI에서 50 % 감소를 측정하는 데 필요한 시간에 해당하는 CIT50 값을 계산합니다. CIT50 값을 계산하려면 각 샘플에 대해 CI 값을 5hpi로 기록합니다. 그런 다음 스프레드시트에서 인덱스 및 일치 함수를 사용하여 CI 값이 5hpi에서 CI 값의 절반과 동일한 시간점을 찾습니다.
- 평균 불활성화 경사 계산
- 노출된 각 바이러스 현탁액에 대한 CIT50 값을 서로 다른 노출 시간(일)에 결정합니다.
- CIT50 플롯값에서 선형 회귀 경사를 계산하여 비활성화 경사라고 하며 CIT50.day-1로 표현됩니다.
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Representative Results
MDCK 세포의 상이한 농도를 가진 120시간 후에 얻어진 원시 데이터는, 15,000에서 120,000세포당, 도 1에 도시된다. 24시간 후, CI 측정은 30,000개의 세포로 시드된 우물의 세포가 여전히 기하급수적인 성장 단계에 있었으며, 이 세포 농도가 추가 실험을 위해 사용되었다는 것을 보여준다. 도 2 는 CIT50 값과 초기 감염 복합성 사이의 선형 상관관계를 보여 줍니다. MDCK 세포는 24시간 동안 배양된 다음 A/Paris/2590/2009 H1N1 바이러스 균주에 감염된 다른 복합성감염으로 감염됩니다. 초기 CI는 감염 후 5시간 측정됩니다.
도 3 은 실험(패널 A)에 사용되는 실험 절차를 보여 줍니다. 바이러스 유발 세포병증 효과로 인해 CI 감소를 나타내는 전형적인 결과는 패널 B에 도시된다. 이들은 소프트웨어에 의해 처리 된 후 얻은 원시 데이터입니다. CIT50 값은 데이터를 내보낸 후 스프레드시트를 사용하여 계산되었습니다. 서로 다른 시점에서 CIT50 값을 계산한 후 선형 회귀 해석을 통해 경사(Panel C)를 결정할 수 있었습니다. 바이러스 불활성화 슬로프는 따라서 각 조건에서 각 바이러스에 대해 수득되었다, 다음 연구 환경에서 가장 큰 안정성을 가진 바이러스를 식별하기 위해 비교되었다.
도 4 는 A/WSN/1933 H1N1 바이러스 균주와 A/뉴 칼레도니아/1999 H1N1 바이러스(HA-NA/NC99)로부터 HA 및 NA에 속하는 유전적 백본을 베어링하는 IAV 재조합 바이러스의 불활성화 경사를 나타낸다. HA에 있는 비 동의명 돌연변이는 식염수에 있는 호스트 외부 바이러스 입자 지속성에 충격을 연구하기 위하여 소개되었습니다.
삼중에서 수행 된 다른 실험에서 평균 불활성화 슬로프를 비교하여, 우리는 호스트 외부 바이러스 지속성에 영향을 미치기에 충분했다 HA에서 아미노산을 식별 할 수 있었다. 불활성화 경사가 낮을수록 바이러스가 더 안정적입니다. 예를 들어, HA/F453Y 대체 또는 HA::K147 하-NA/NC99 바이러스의 HA에 삽입된 경우 평균 불활성화 경사면에서 각각 9.8°CIT50/day, 9.9 CIT50/day로 크게 증가하여 야생형 HA(4.85°C)를 발생시킨다. 대조적으로, HA/T327A 대체는 식염수에서 35°C에서 바이러스 안정성에 영향을 미치지 않았다(하루 6.6°C의 비활성화 경사). 방법론은 이렇게 충분히 강력하 고 호스트 외부 IAV 생존에 관여 했다 HA 당단백질에 아미노산 잔류물을 식별 하기 위해.
그림 1: 마이크로티터 E 플레이트의 세포 적정.
MDCK 세포의 직렬 희석은 마이크로티터 E 플레이트에 시드되었고, 세포 성장은 최대 100h (200 매 30 분마다 스윕)에 대해 모니터링되었다. 회색 점은 중복으로 측정된 CI의 표준 편차를 나타냅니다. 24h의 수직 선은 설명된 조건에서 3 x 104 세포의 초기 파종이 감염 시 약 70%의 결합을 허용한 것을 강조합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: CIT50 값과 초기 감염 복합성 간의 선형 회귀.
각 점은 감염의 다른 복합성 세포의 감염을 위해 계산된 CIT50 값을 나타냅니다. 단선은 선형 회귀 경사(R2 = 0.99)를 나타내고, 파선선은 95% 신뢰구간을 나타냅니다. 이 그림은 이전 간행물21에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 비활성화 경사 측정.
(A) 바이러스 입자는 0, 1 또는 2일 동안 35°C에서 식염수에서 희석되었고, CI는 연속적으로 모니터링되고 세포 지수로 플롯되었다. (B) CI는 수직 파선으로 원시 데이터에 수동으로 표시되는 CIT50 값으로 정량화된 CI 감소입니다. 각 곡선은 증가 시간 동안 식염수에 노출 된 바이러스감염 후 세포 임피던스의 진화를 나타냅니다 (빨간색 : 노출되지 않은 바이러스, 노란색 : 24 시간 노출, 녹색 : 48 h 노출, 어두운 : 모의 감염 세포). 초기 CI는 불활성화 경사를 계산하는 데 사용되는 CIT50 값의 감염(C) 선형 회귀 후 5h를 측정하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 식염수의 IAV 지속성에 HA에 있는 비 동의어 돌연변이의 충격.
A/뉴 칼레도니아/20/1999 H1N1 바이러스(대체 또는 삽입) 또는 돌연변이(HAWT)로부터 HA를 베어링하는 재분류 바이러스의 불활성화 경사. Boxplots는 평균(수평 선)에 대해 노출된 각 바이러스에 대해 얻은 단일 불활성화 슬로프(바이러스에 따라 6~8개)의 분포를 표시하였다. 평균 불활성화 슬로프는 ANOVA 테스트(ns, p > 0.05, ****p < 0.0001)를 사용하여 비교하였다. Ref는 다른 바이러스를 비교하는 야생형 HA를 베어링하는 재분류 바이러스에 해당합니다. 이 그림은 이전 간행물21에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
RTCA는 세포 준수, 증식, 마이그레이션 및 세포 독성과 같은 세포 특성의 실시간 모니터링에 점점 더 많이 사용되는 임피던스 기반 기술입니다. 이 연구에서는, 호스트 외부의 IAV 생존을 평가하는 이 기술의 능력은 바이러스 불활성화 경사를 측정하여 입증된다. TCID50 및 플라크 애세와 같은 까다로운 기술은 세포 생존가능성에 대한 객관적인 실시간 평가로 대체되므로 바이러스에 의해 유발된 세포병증 효과를 반영합니다. TCID50 또는 플라크 성형 유닛(pfu)과 유사하게, CIT50 은 또한 감염의 복합성(도 2)과 선형적으로 상관관계가 있다. 이 접근법의 한계 중, 이 방법은 비 세포 병원성 바이러스에 감염된 세포를 정확하게 감시하지 못합니다.
예를 들어, 바이러스 게놈으로 새로운 돌연변이의 도입은 바이러스를 강하게 감쇠시키고 그것의 세포 병원성 감소시킬 수 있습니다. 대조적으로, 여기서 계산된 불활성화 경사는 바이러스 복제 및 잠재적 바이러스 감쇠와 무관하며, 이 경사는 동일한 바이러스의 다른 시점 후에 측정된 CIT50 값에서 파생됩니다. 여기서, 따라서 이 비활성화 프로토콜 이후에 세포를 감염시킬 수 있는 바이러스 입자가 불활성화 전에 바이러스와 동일한 복제 표현형을 공유한다고 가정한다.
비용이 높음에도 불구하고 이 방법을 사용하는 워크로드가 상당히 감소하므로 프로젝트가 빈번한 시간점과 오랜 기간 동안 운동 성능이 필요한 경우에 유리합니다. 모든 프로토콜과 마찬가지로 몇 가지 단계가 중요하며 조작은 주의와 정밀도로 수행해야 합니다. 역배 파이프팅은 미디어의 정확한 분배를 보장하는 중요한 단계이며 오염을 피하기 위해 특별한 주의를 기울여야 합니다. 마찬가지로, 초기 세포 수량은 각 실험 사이에 동일해야 하며 trypan blue 염색을 사용한 자동화된 셀 카운터를 사용하여 평가되어야 합니다. 장치에 의한 CI를 모니터링하는 동안 인큐베이터의 개방은 가능한 한 제한되어야 한다.
제한된 움직임을 가진 실험 중에 주의와 주의가 제공되면 오염 위험이 낮아지고 결과는 매우 재현할 수 있습니다. 다른 바이러스 중 불활성화 경사의 분포는 크게 다르므로 비 파라메트릭 통계 테스트가 바이러스 지속성을 비교하는 데 사용됩니다. 평균 불활성화 슬로프는 장내 바이러스, 에볼라 바이러스 또는 코로나바이러스와 같은 세포 배양에서 세포 병증 효과를 생성하는 바이러스에 대해 계산될 수 있으며, 환경 조건에서 지속성이 현재 연구되고 있습니다 (그리고 전통적인 바이러스학 방법을 사용하여 가능성이 있음). 미래에, 이 방법은 또한 다른 바이러스의 복제를 비교하고, 동시에 여러 세포주에 대한 바이러스 트로피즘을 조사하고, 바이러스 주기의 특정 단계를 연구하는 데 사용될 수 있다.
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Disclosures
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25%Trypsin | ThermoFisher | 25200056 | |
| 75 cm2 tissue culture flask | Falcon | 430641U | |
| E-Plate 16 (6 plates) | ACEA Biosciences, Inc | 5469830001 | E-plates are avalible in different packaging |
| FCS | Life technologies (gibco) | 10270-106 | |
| MEM 1X | Life technologies (gibco) | 31095029 | |
| PBS 1X | Life technologies (gibco) | 14040091 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life technologies (gibco) | 11548876 | |
| TPCK-Trypsin | Worthington | LS003740 | |
| xCELLigence Real-Time Cell Analysis Instrument S16 | ACEA Biosciences, Inc | 380601310 | The xCELLigence RTCA S16 instruments are available in different formats (16-well, 96-well, single or multi-plate) |
References
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