Summary
Relatado aqui é um protocolo para a quantificação de partículas virais infecciosas usando monitoramento em tempo real da impedância elétrica de células infectadas. Uma aplicação prática deste método é apresentada quantificando a decadência do vírus influenza A sob diferentes parâmetros físico-químicos imitando condições ambientais.
Abstract
Os métodos de quantificação de partículas de vírus representam um aspecto crítico de muitos estudos de virologia. Embora existam várias técnicas confiáveis, elas são demoradas ou incapazes de detectar pequenas variações. Apresentado aqui é um protocolo para a quantificação precisa do titer viral, analisando variações de impedância elétrica de células infectadas em tempo real. A impedância celular é medida através de biosensores de microeletrodos de ouro localizados sob as células em microplacos, nos quais a magnitude depende do número de células, bem como de seu tamanho e forma. Este protocolo permite a análise em tempo real da proliferação celular, viabilidade, morfologia e migração com maior sensibilidade. Também é fornecido um exemplo de uma aplicação prática quantificando a decadência do vírus influenza A (IAV) submetido a vários parâmetros físico-químicos que afetam a infectividade viral ao longo do tempo (ou seja, temperatura, salinidade e pH). Para tais aplicações, o protocolo reduz a carga de trabalho necessária, ao mesmo tempo em que gera dados precisos de quantificação de partículas infecciosas do vírus. Permite a comparação de encostas de inativação entre diferentes IAV, o que reflete sua capacidade de persistir em determinado ambiente. Este protocolo é fácil de executar, é altamente reprodutível, e pode ser aplicado a qualquer vírus que produz efeitos citopáticos na cultura celular.
Introduction
A transmissão de um vírus depende da combinação de vários fatores. Para um vírus secretado no ambiente, sua transmissão também depende da capacidade de persistir em condições fora do hospedeiro. Estudar a inativação viral em geral é, portanto, um passo crucial para ajudar as autoridades nacionais de saúde e os formuladores de políticas a implementar medidas de controle e biossegurança.
O conhecimento sobre a persistência do vírus em ambientes naturais e laboratoriais aumentou consideravelmente na última década. No caso dos vírus influenza A (IAV), suas rotas de transmissão submetem partículas virais a uma ampla gama de condições ambientais. Especificamente, podem ser transmitidas através de 1) rotas fecais-orais através da água (ou seja, vírus aviários), ou 2) contato direto ou indireto por fomitas contaminadas, bem como aerossóis e gotículas respiratórias (ou seja, vírus avícolas e mamíferos)1. De qualquer forma, o IAV é submetido a vários parâmetros físico-químicos (ou seja, pH, salinidade, temperatura e umidade), o que afeta mais ou menos rapidamente sua infectividade2,3,4,5,6,7,8,9. É de grande importância, especialmente no que diz respeito aos vírus zoonóticos e pandemias, avaliar o potencial dos fatores ambientais para afetar a dinâmica do vírus e os riscos de exposição e transmissão de espécies cruzadas.
Até agora, técnicas tradicionais de virologia (ou seja, determinação de titer viral através de ensaios de placa ou 50% de estimativa de dose infecciosa da cultura tecidual) têm sido utilizadas para avaliar a infectividade do IAV ao longo do tempo; mas essas técnicas são demoradas e requerem muitos suprimentos10,11,12. Medir a impedância de células infectadas ao longo do tempo com microeletrodos serve como uma ferramenta útil para monitorar a sobrevivência do IAV em diferentes condições ambientais, bem como a inativação viral em geral. Este método fornece dados objetivos em tempo real que substituem a observação humana subjetiva dos efeitos citopáticos. Pode ser usado para determinar a titulação do vírus, substituindo as medidas tradicionais por intervalos de confiança mais baixos e evitando ensaios de pontos finais intensivos em mão-de-obra.
Existe uma correlação linear entre os resultados de titulação obtidos pela medição da impedância celular e pelos métodos de ensaio de placa clássica ou TCID50. Portanto, os dados obtidos com o método de titulação baseado em impedância podem ser facilmente transformados em valores TCID50 ou pfu, criando uma curva padrão com diluição serial do vírus13,14,15,16,17. A detecção, quantificação e eficácia dos anticorpos neutralizantes presentes em amostras de soro também podem ser alcançadas usando essa abordagem experimental18,19. Mais recentemente, ensaios celulares baseados em impedância têm sido usados para tela e avaliação de compostos antivirais contra equid alphaherpesviruses20.
Esta tecnologia tem sido usada para avaliar a persistência de IAVs em água salina em diferentes temperaturas e identificar mutações na hemaglutina do IAV que aumentam ou diminuem a persistência do IAV no ambiente21. Tal triagem exigiria um trabalho extensivo se utilizasse métodos tradicionais de titulação. No entanto, essa metodologia pode ser usada para qualquer vírus que tenha um impacto na morfologia celular, número celular e força de apego da superfície celular. Também pode ser usado para monitorar a persistência em várias condições ambientais (ou seja, no ar, na água ou em superfícies).
O protocolo aqui descrito aplica a sobrevivência do IAV na água como exemplo. Os vírus da gripe humana são expostos a diferentes parâmetros físico-químicos durante longos períodos. A água salina (35 g/L NaCl) a 35 °C foi escolhida como modelo ambiental com base em resultados anteriores9. A infectividade residual de vírus expostos é quantificada em diferentes momentos através da infecção celular. As células MDCK, o tipo de célula de referência para amplificação do IAV, são semeadas em 16 placas de microtiter bem revestidas com sensores de microeletrodos e infectadas por vírus expostos 24 horas depois. A impedância celular é medida a cada 15 minutos e expressa como uma unidade arbitrária chamada índice celular (IC). Os efeitos citopáticos induzidos pelo vírus da gripe, cuja taxa de início depende diretamente do número de partículas virais infecciosas inoculadas na cultura das células, leva à diminuição da IC, que é posteriormente quantificada como o valor cit50 . Esse valor corresponde ao tempo necessário para medir uma redução de 50% em relação à CI inicial (ou seja, antes da adição do vírus). Os valores CIT50 calculados para vários tempos de exposição ambiental permitem a dedução da inclinação de inativação de um vírus após a regressão linear dos valores cit50 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Manuseie todos os vírus da gripe de acordo com os requisitos adequados de nível de biossegurança (BSL-2 ou superior, dependendo do subtipo). Use cepas IAV com um baixo histórico de passagem (menos de 5x em células MDCK) para garantir baixa variação entre os experimentos.
1. Preparação de reagentes e materiais de partida
- Preparação de células MDCK e meio de cultura celular estéril
- Cultivar células do Rim Canino De Madin-Darby (MDCK) no meio de Eagle modificado (MEM) suplementado com soro de bezerro fetal inativado de 10% (FCS) e antibióticos (100 unidades/penicilina mL, estreptomicina de 100 mg/mL).
- Após o descongelamento, as células MDCK de passagem pelo menos 2x antes de infectá-las para garantir a recuperação completa (mas menos de 30 passagens para evitar qualquer deriva nos fenótipos celulares).
- Semente 75 cm2 cultura de tecido esfolando(s) contendo 30 mL de 1x MEM estéril com células 7,5 x 106 MDCK e incubar a 37 °C na incubadora umidificada de 5% de CO2 .
- Elaboração de equipamentos de monitoramento de impedância
- Coloque o instrumento na incubadora a 35 °C e deixe aquecer por pelo menos 2 h.
- Conecte-o à unidade de controle colocada fora da incubadora.
- Prossiga para os procedimentos de limpeza conforme recomendado pelo fabricante antes de iniciar o restante do experimento.
- Produção de estoques de IAV em células MDCK
- Para propagar e amplificar os vírus H1N1, semente 7,5 x 106 células MDCK em dois frascos de cultura tecidual de 75 cm2 e incubar por 24 h a 37 °C para atingir 90%-100% de confluência.
- Decantar o meio de cultura celular da monocamada celular em frascos de 75 cm2 . Lave as células com 5 mL de 1x PBS estéreis.
- Remova o PBS e adicione 5 mL de 1x PBS para lavar as células novamente.
- Rotule um frasco como controle e remova PBS antes de adicionar 15 mL de mídia de propagação de vírus (1x MEM com 0% de FCS) cuidadosamente na monocamada. Incubar este frasco em uma incubadora mantida a 35 °C com 5% de CO2. Use-o para comparação após 3 dias de propagação.
- Descongele um frasco de estoque de IAV na RT. Diluir o vírus para a concentração apropriada em um tubo de 1,5 mL contendo mídia de propagação de vírus (1x MEM com 0% de FCS).
- Remova 1x PBS do frasco de 75 cm2 e infecte células MDCK em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 1 x 10-3 ou 1 x 10-4 unidades formando unidades por célula (pfu/célula) adicionando 1 mL do vírus diluído à monocamada celular.
- Vírus adsorb para células MDCK por 45 min no RT, mexendo o frasco regularmente a cada 15 minutos.
- Remova suavemente o inóculo e adicione 15 mL de mídia de propagação de vírus por frasco contendo 1 μg/mL TPCK-trypsin (trypsin/L-1-tosylamide-2-cetona de clorometilo de feniltil), para cortar a hemaglutinina viral HA0 em subunidades HA1 e HA2 (evento que é necessário para a fusão ha com a membrana endossomal e liberação do genoma viral)22.
- Incubar os frascos a 35 °C e 5% de CO2 por pelo menos 3 dias para replicar o vírus.
- Observe as células MDCK sob um microscópio a 40x de ampliação e procure efeitos citopáticos (CPE) nas células (comparando com o frasco de controle celular). Se o CPE não estiver completo (ou seja, cerca de 80% das células são separadas do substrato), coloque os frascos de volta na incubadora por mais 24 h.
- Quando o CPE estiver completo, decante a cultura celular supernadente e centrífuga a 300 x g por 10 min para pelotar os detritos celulares.
- Transfira o supernatante esclarecido para um tubo de 15 mL e vírus de progênero aliquot para frascos criogênicos estéreis de uso único. Coloque imediatamente os criobotos a -80 °C para congelar e estocar vírus.
2. Determinação da quantidade celular adequada para infectar células
NOTA: Durante todos os experimentos, mantenha as placas em superfícies não eletrostáticas o tempo todo, como os envoltórios de papel da embalagem. Siga a seção 2 abaixo para determinar a concentração mais adequada de células a serem semeadas na placa de microtiter eletrônico (projetada como E-Plate).
- Prepare células MDCK em frascos de 75 cm2 para obter células recém-divididas (aproximadamente 80% de confluência) 24 h antes do experimento.
- Lave as células com 5 mL de 1x PBS e desvincule-as adicionando 3 mL de solução Trypsin-EDTA de 0,25%.
- Adicione 7 mL de cultura celular fresca e conte células usando um contador automático de células com coloração azul trypan.
- Ajuste a concentração celular para 400.000 células/mL com mídia de cultura celular. Realizar diluições seriais duplas em tubos adicionais para obter densidades celulares de 200.000; 100,000; 50,000; 25,000; 12,500; e 6.250 células/mL. Ajuste a faixa de diluição das células de acordo com o tipo celular e seu comportamento de crescimento.
- Deixe a placa E (Tabela de Materiais) na RT por vários minutos e adicione 100 μL de mídia de cultura celular a cada poço usando uma pipeta multicanal. Não toque nos eletrodos da Placa E.
- Desbloqueie os berços e insira a parte dianteira da placa no bolso do berço do instrumento de medição de impedância (Tabela de Materiais). Feche a porta da incubadora.
- Abra o software.
- Em "Configuração padrão do padrão de padrão de testes", escolha o (s) de berço selecionado e clique duas vezes na página superior e digite o nome do experimento. Clique em "Layout" e digite as informações necessárias para cada poço selecionado da placa; em seguida, clique em "Aplicar" quando terminar. Clique em "Agendar" | "Passos" | "Adicione um passo". O software adiciona automaticamente uma etapa de 1 s para medir a impedância de fundo (CI).
- Clique em "Iniciar/Continuar" na guia "Executar". Clique em "Plot", adicione todas as amostras selecionando os poços apropriados e garanta que a CI esteja entre -0,1 e 0,1 antes de prosseguir para a próxima etapa.
- Retire a placa do berço.
- Adicione 100 μL de cada suspensão celular da etapa 2.4 em duplicata aos poços apropriados e 100 μL de mídia celular em poços usados como controles. Deixe a placa E na coifa de fluxo laminar por 30 minutos em RT para permitir a distribuição uniforme das células na parte inferior dos poços.
- Insira a placa E no bolso do berço. Clique em "Agendar" | "Adicionar etapa" no software e inserir valores para monitorar células a cada 30 minutos para 200 repetições. Em seguida, selecione "Iniciar/Continuar".
- Verifique e plote os dados de CI clicando no botão "Plot" no software. Selecione a concentração de células que estão pouco antes da fase estacionária 24 h após a semeadura na placa, a fim de obter células que ainda estão em fase de crescimento durante a infecção viral. A fase estacionária é atingida quando a IC está no seu máximo.
3. Correlação entre valores CIT50 e multiplicidade de infecção
- Adicione 100 μL de meio de cultura MEM estéril de 1x em cada poço da placa E. Insira placa E no bolso do berço do instrumento a 35 °C. Meça o fundo conforme descrito na etapa 2.7.
- Retire a placa E do berço.
- Semente 3 x 104 de células MDCK recém-divididas em cada poço da placa de microtíter eletrônico e cultivá-las por 24 h a 35 °C com 5% de CO2 para que estejam em uma fase replicativa durante a infecção pelo IAV.
- Infectar células MDCK com diferentes diluições de 10 vezes de um conhecido 6 log10 TCID50/mL do vírus H1N1, usando tubulação reversa para reprodutibilidade seguindo as etapas abaixo:
- Enxágüe células MDCK 2x com 100 μL de MEM sem FCS (mídia de propagação de vírus). Esteja ciente de remover todos os meios de comunicação após a segunda lavagem para evitar uma diluição adicional do inóculo.
- Adicione 100 μL de suspensão viral em cada poço usando pipeta de canal único. Para evitar contaminação, proceda da esquerda para a direita e, em seguida, de cima para baixo na placa, enquanto cobre os poços restantes com a tampa.
- Insira a placa no bolso do berço do instrumento a 35 °C. Seja gentil para evitar movimentos repentinos potencialmente levando a contaminações.
- Comece a monitorar a impedância celular a cada 15 minutos durante pelo menos 100 h, conforme descrito na etapa 2.10.
- Após os dois ciclos de medições (ou seja, 30 min), pausa o aparelho clicando em "Pausa" na aba "Executar" e remova a placa E do berço.
- Adicione 1 μg/mL TPCK-trypsin à mídia de propagação do vírus para cortar a hemaglutinina viral.
- Adicione 100 μL de mídia de propagação de vírus contendo trippsina TPCK em cada poço e insira a placa E no bolso do berço.
- Clique em "Iniciar/Continuar" na guia "Executar".
NOTA: Não se esqueça de criar um controle negativo correspondente às células infectadas por simulação, substituindo a suspensão viral por mídia de propagação de vírus.
4. Cinética de sobrevivência do IAV
- Exponha o IAV à água salina destilada a 35 °C e teste sua infectividade ao longo do tempo medindo a diminuição da impedância celular.
- Prepare a água salina destilada adicionando NaCl a uma concentração final de 35 g/L em água destilada. Adicione 900 μL de água salina em criotubos de 2 mL.
- Adicione 100 μL de caldo viral em água salina e coloque os criobotos em uma incubadora (35 °C, 5% DE CO2) por 1 h, 24 h ou 48 h.
- Semente 100 μL (contendo 3 x 104) de células MDCK recém-divididas em uma placa de microtiter de 16 poços e crescer por 24 h a 37 °C e 5% de CO2.
- Infectar células com 100 μL de vírus expostos (anteriormente diluídos 10x em mídia de cultura) usando método de pipetagem reversa para reprodutibilidade repetindo a seção 3.4.
- Metamedância celular a cada 15 minutos por pelo menos 100 h.
5. Avaliação da perda de infectividade
- Determinação dos valores CIT50 para quantificar a diminuição da CI devido a efeitos citopáticos induzidos pelo vírus com o valor CIT50 .
- Clique em "Plot" e adicione todas as amostras clicando em "Adicionar tudo". Exporte os resultados para uma planilha clicando em "Export Experiment Info". Considere a CI inicial como valor de impedância celular medido 5 h após infecção celular por vírus expostos (ou seja, 24 h após a semeadura de células MDCK na placa E do microtiter).
- Calcule o valor CIT50 correspondente ao tempo necessário para medir uma redução de 50% em relação à CI inicial. Para calcular o valor CIT50 , observe o valor de CI em 5 hpi para cada amostra. Em seguida, encontre o ponto de tempo no qual o valor de CI é igual a metade do valor de CI em 5 hpi usando o índice e as funções de correspondência na planilha.
- Cálculo da inclinação média de inativação
- Determine os valores cit50 para cada suspensão viral exposta, em diferentes momentos de exposição (em dias).
- Calcule uma inclinação de regressão linear a partir de valores plotados CIT50, referido como a inclinação de inativação e expressa em CIT50.day-1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dados brutos obtidos após 120 h com diferentes concentrações de células MDCK, de 15.000 a 120.000 células por poço, são mostrados na Figura 1. Após 24 h, as medidas de IC mostram que as células em poços semeados com 30.000 células ainda estavam na fase exponencial do crescimento, e essa concentração celular foi usada para outros experimentos. A Figura 2 ilustra a correlação linear entre os valores cit50 e a multiplicidade inicial de infecção. As células MDCK são cultivadas por 24 h, depois infectadas com a cepa viral A/Paris/2590/2009 H1N1 em uma multiplicidade diferente de infecção. A IC inicial é medida 5 h após a infecção.
A Figura 3 ilustra o procedimento experimental utilizado em nossos experimentos (painel A). Resultados típicos que mostram diminuição da IC devido ao efeito citopático induzido pelo vírus são mostrados no painel B. Estes são dados brutos obtidos após serem processados pelo software. Os valores cit50 foram calculados utilizando-se a planilha após a exportação dos dados. Após o cálculo dos valores CIT50 em diferentes momentos, uma análise de regressão linear permitiu a determinação da inclinação (Painel C). As encostas de inativação viral foram obtidas para cada vírus em cada condição, em seguida, foram comparadas a identificar vírus que apresentaram maior estabilidade no ambiente estudado.
A Figura 4 mostra inclinações de inativação de vírus recombinantes do IAV portadores de uma espinha dorsal genética pertencente ao vírus A/WSN/1933 H1N1 e um HA e NA de A/New Caledonia/20/1999 H1N1 vírus (HA-NA/NC99). Mutações não sinônimos no HA foram introduzidas para estudar o impacto na persistência de partículas do vírus fora do hospedeiro em água salina.
Comparando as encostas médias de inativação de diferentes experimentos realizados em triplicado, conseguimos identificar aminoácidos no HA que foram suficientes para afetar a persistência viral fora do hospedeiro. Quanto menor a inclinação de inativação, mais estável é o vírus. Como exemplo, a substituição HA/F453Y ou inserção HA::K147 no vírus HA-NA/NC99 induziu um aumento significativo na inclinação média de inativação para 9,8 CIT50/dia e 9,9 CIT50/dia, respectivamente, em comparação com ha tipo selvagem (com uma inclinação média de inativação de 4,85 CIT50/dia), gerando mutantes muito instáveis. Em contrapartida, a substituição HA/T327A não afetou a estabilidade viral a 35 °C em água salina (inclinação média de inativação de 6,6 CIT50/dia). A metodologia foi, portanto, poderosa o suficiente para identificar resíduos de aminoácidos na glicoproteína HA que estavam envolvidos na sobrevivência do IAV fora do hospedeiro.
Figura 1: Titulação celular em microtiter E-plate.
Diluições seriais de células MDCK foram semeadas em placas E microtiter, e o crescimento celular foi monitorado por até 100 h (200 varreduras a cada 30 minutos). Os pontos cinzentos representam os desvios padrão de IC medidos em duplicata. A linha vertical em 24h destaca que, nas condições descritas, a semeadura inicial de 3 x 104 células/bem permitiu uma cultura de cerca de 70% de confluência no momento da infecção. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Regressão linear entre valores CIT50 e multiplicidade inicial de infecção.
Cada ponto indica o valor CIT50 calculado para infecção de células com diferentes multiplicidades de infecção. A linha sólida representa a inclinação de regressão linear (R2 = 0,99), e as linhas tracejadas representam os intervalos de confiança de 95%. Este valor foi modificado de uma publicação anterior21. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Determinação da inclinação de inativação.
(A) As partículas virais foram diluídas em água salina a 35 °C por 0, 1 ou 2 dias, e a IC foi monitorada continuamente e traçada como índice celular. (B) Diminuição da IC quantificada com os valores CIT50 , que são representados manualmente nos dados brutos por linhas retais. Cada curva representa a evolução da impedância celular após infecção por vírus expostos à água salina para o aumento dos tempos (vermelho: vírus não exposto, amarelo: 24h de exposição, verde: 48h de exposição, escuro: células infectadas por simulação). A CI inicial foi medida 5 h após a infecção (C) Regressão linear dos valores cit50 utilizados para calcular a inclinação de inativação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Impacto de mutações não sinônimos no HA sobre persistência do IAV na água salina.
Encostas de inativação de vírus reassortantes portadores de ha a partir de A/New Caledonia/20/1999 H1N1 vírus com (substituição ou inserção) ou sem mutação (HAWT). Os boxplots apresentaram a distribuição de encostas únicas de inativação (seis ou oito dependendo do vírus, calculadas a partir de diferentes experimentos independentes) obtidas para cada vírus exposto ao redor da média (linhas horizontais). As inclinações médias de inativação foram comparadas utilizando-se um teste ANOVA (ns, p > 0,05, ****p < 0,0001). O árbitro corresponde ao vírus reassortante com o tipo HA selvagem, contra o qual outros vírus são comparados. Este valor foi modificado de uma publicação anterior21. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
O RTCA é uma tecnologia baseada em impedância que é cada vez mais utilizada para o monitoramento em tempo real de propriedades celulares, como adesão celular, proliferação, migração e citotoxicidade. Neste estudo, a capacidade dessa tecnologia para avaliar a sobrevivência do IAV fora do hospedeiro é demonstrada pela medição da inclinação de inativação do vírus. Técnicas meticulosas como TCID50 e ensaios de placa são substituídas por avaliação objetiva em tempo real da viabilidade celular, refletindo assim efeitos citopáticos induzidos pelo vírus. Semelhante à unidade de formação de placas (pfu), o CIT50 também está linearmente correlacionado com a multiplicidade de infecção (Figura 2). Entre as limitações dessa abordagem, este método não consegue monitorar precisamente as células infectadas pelo vírus não citopatogênico.
Como exemplo, a introdução de uma nova mutação no genoma viral pode atenuar fortemente um vírus e diminuir sua citopatogenicidade. Em contraste, a inclinação de inativação calculada aqui é independente da replicação do vírus e de uma atenuação potencial do vírus, uma vez que essa inclinação é derivada de valores CIT50 medidos após diferentes pontos de tempo de inativação do mesmo vírus. Aqui, presume-se, portanto, que partículas virais que ainda são capazes de infectar uma célula após este protocolo de inativação compartilham o mesmo fenótipo de replicação que os vírus antes da inativação.
Apesar dos custos mais elevados, a carga de trabalho que utiliza essa abordagem é consideravelmente reduzida, o que é vantajoso quando um projeto requer desempenho de cinética, com mensuração de tempos frequentes e durante um longo período de tempo. Como em todos os protocolos, alguns passos são críticos, e as manipulações devem ser realizadas com cuidado e precisão. A tubulação reversa é um passo crucial para garantir a dispensa precisa da mídia, e deve-se prestar atenção especial para evitar qualquer contaminação. Da mesma forma, a quantidade celular inicial deve ser a mesma entre cada experimento e deve ser avaliada usando um contador celular automatizado com coloração azul trypan. Durante o monitoramento da CI pelo aparelho, a abertura da incubadora deve ser limitada o máximo possível.
Se o cuidado e a atenção são prestados durante o experimento com movimento limitado, então o risco de contaminação se torna baixo, e os resultados são altamente reprodutíveis. A distribuição de encostas de inativação entre diferentes vírus são significativamente diferentes, por isso um teste estatístico não paramétrico é usado para comparar a persistência do vírus. As inclinações médias de inativação podem ser calculadas para quaisquer vírus que produzam efeitos citopáticos na cultura celular, como vírus entéricos, ebolavírus ou coronavírus, cuja persistência em condições ambientais está sendo estudada atualmente (e provavelmente usando métodos tradicionais de virologia). No futuro, este método também pode ser usado para comparar a replicação de diferentes vírus, investigar o tropismo do vírus para várias linhas celulares ao mesmo tempo e estudar etapas específicas do ciclo do vírus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25%Trypsin | ThermoFisher | 25200056 | |
| 75 cm2 tissue culture flask | Falcon | 430641U | |
| E-Plate 16 (6 plates) | ACEA Biosciences, Inc | 5469830001 | E-plates are avalible in different packaging |
| FCS | Life technologies (gibco) | 10270-106 | |
| MEM 1X | Life technologies (gibco) | 31095029 | |
| PBS 1X | Life technologies (gibco) | 14040091 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life technologies (gibco) | 11548876 | |
| TPCK-Trypsin | Worthington | LS003740 | |
| xCELLigence Real-Time Cell Analysis Instrument S16 | ACEA Biosciences, Inc | 380601310 | The xCELLigence RTCA S16 instruments are available in different formats (16-well, 96-well, single or multi-plate) |
References
- Killingley, B., Nguyen-Van-Tam, J.
- Sooryanarain, H., Elankumaran, S. Environmental Role in Influenza Virus Outbreaks. Annual Review of Animal Biosciences. 3 (1), 347-373 (2015).
- Keeler, S. P., Dalton, M. S., Cressler, A. M., Berghaus, R. D., Stallknecht, D. E. Abiotic factors affecting the persistence of avian influenza virus in surface waters of waterfowl habitats. Applied and Environmental Microbiology. 80 (9), 2910-2917 (2014).
- Stallknecht, D. E., Kearney, M. T., Shane, S. M., Zwank, P. J. Effects of pH, temperature, and salinity on persistence of avian influenza viruses in water. Avian Diseases. 34 (2), 412-418 (1990).
- Poulson, R. L., Tompkins, S. M., Berghaus, R. D., Brown, J. D., Stallknecht, D. E. Environmental Stability of Swine and Human Pandemic Influenza Viruses in Water under Variable Conditions of Temperature, Salinity, and pH. Applied and Environmental Microbiology. 82 (13), 3721-3726 (2016).
- Zhang, G., et al. Evidence of influenza A virus RNA in Siberian lake ice. Journal of Virology. 80 (24), 12229-12235 (2006).
- Nazir, J., et al. Long-Term Study on Tenacity of Avian Influenza Viruses in Water (Distilled Water, Normal Saline, and Surface Water) at Different Temperatures. Avian Diseases. 54 (1), 720-724 (2010).
- Brown, J. D., Swayne, D. E., Cooper, R. J., Burns, R. E., Stallknecht, D. E. Persistence of H5 and H7 avian influenza viruses in water. Avian Diseases. 51, 1 Suppl 285-289 (2007).
- Dublineau, A., et al. Persistence of the 2009 pandemic influenza A (H1N1) virus in water and on non-porous surface. PLoS ONE. 6 (11), 28043 (2011).
- Titration of Influenza Viruses. Springer Nature Experiments. , Available from: https://experiments.springernature.com/articles/10.1007/978-1-4939-8678-1_4 (2020).
- Szretter, K. J., Balish, A. L., Katz, J. M. Influenza: Propagation, Quantification, and Storage. Current Protocols in Microbiology. 3 (1), 1-22 (2006).
- Gaush, C. R., Smith, T. F. Replication and Plaque Assay of Influenza Virus in an Established Line of Canine Kidney Cells. Applied Microbiology. 16 (4), 588-594 (1968).
- Witkowski, P. T., et al. Cellular impedance measurement as a new tool for poxvirus titration, antibody neutralization testing and evaluation of antiviral substances. Biochemical and Biophysical Research Communications. 401 (1), 37-41 (2010).
- Lebourgeois, S., et al. Development of a Real-Time Cell Analysis (RTCA) Method as a Fast and Accurate Method for Detecting Infectious Particles of the Adapted Strain of Hepatitis A Virus. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 335 (2018).
- Teng, Z., Kuang, X., Wang, J., Zhang, X. Real-time cell analysis--a new method for dynamic, quantitative measurement of infectious viruses and antiserum neutralizing activity. Journal of Virological Methods. 193 (2), 364-370 (2013).
- Fang, Y., Ye, P., Wang, X., Xu, X., Reisen, W. Real-time monitoring of flavivirus induced cytopathogenesis using cell electric impedance technology. Journal of Virological Methods. 173 (2), 251-258 (2011).
- Charretier, C., et al. Robust real-time cell analysis method for determining viral infectious titers during development of a viral vaccine production process. Journal of Virological Methods. 252, 57-64 (2018).
- Tian, D., et al. Real-Time Cell Analysis for Measuring Viral Cytopathogenesis and the Efficacy of Neutralizing Antibodies to the 2009 Influenza A (H1N1) Virus. PLoS ONE. 7 (2), 31965 (2012).
- Teng, Z., Kuang, X., Wang, J., Zhang, X. Real-time cell analysis--a new method for dynamic, quantitative measurement of infectious viruses and antiserum neutralizing activity. Journal of Virological Methods. 193 (2), 364-370 (2013).
- Thieulent, C. J., et al. Screening and evaluation of antiviral compounds against Equid alpha-herpesviruses using an impedance-based cellular assay. Virology. 526, 105-116 (2019).
- Labadie, T., Batéjat, C., Manuguerra, J. -C., Leclercq, I. Influenza Virus Segment Composition Influences Viral Stability in the Environment. Frontiers in Microbiology. 9, 1496 (2018).
- Wiley, D. C., Skehel, J. J. The structure and function of the hemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus. Annual Review of Biochemistry. 56, 365-394 (1987).
