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Immunology and Infection

रियल-टाइम सेल विश्लेषण का उपयोग करके मेजबान के बाहर इन्फ्लूएंजा वायरस उत्तरजीविता की निगरानी

Published: February 20, 2021 doi: 10.3791/61133
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 2,3
1Department of Infection Biology, London School of Hygiene and Tropical Medicine, 2Institut Pasteur, Unité Environnement et Risques Infectieux, Cellule d'Intervention Biologique d'Urgence (CIBU), 3Cellule Pasteur, Université de Paris

Summary

यहां रिपोर्ट की गई है संक्रमित कोशिकाओं के विद्युत प्रतिबाधा की वास्तविक समय की निगरानी का उपयोग करके संक्रामक वायरल कणों के परिमाणीकरण के लिए एक प्रोटोकॉल। इस विधि का एक व्यावहारिक अनुप्रयोग पर्यावरणीय परिस्थितियों की नकल करने वाले विभिन्न भौतिक-रासायनिक मापदंडों के तहत इन्फ्लूएंजा ए वायरस क्षय को परिमाणित करके प्रस्तुत किया जाता है।

Abstract

वायरस कण परिमाणीकरण के लिए तरीके कई विषाणु विज्ञान अध्ययनों के एक महत्वपूर्ण पहलू का प्रतिनिधित्व करते हैं। यद्यपि कई विश्वसनीय तकनीकें मौजूद हैं, वे या तो समय लेने वाली हैं या छोटी विविधताओं का पता लगाने में असमर्थ हैं। यहां प्रस्तुत वास्तविक समय में संक्रमित कोशिकाओं की विद्युत प्रतिबाधा विविधताओं का विश्लेषण करके वायरल टिटर के सटीक परिमाणीकरण के लिए एक प्रोटोकॉल है। सेलुलर प्रतिबाधा को माइक्रोप्लेट में कोशिकाओं के नीचे स्थित सोने के माइक्रोइलेक्ट्रोड बायोसेंसर के माध्यम से मापा जाता है, जिसमें परिमाण कोशिकाओं की संख्या के साथ-साथ उनके आकार और आकार पर निर्भर करता है। यह प्रोटोकॉल बढ़ी हुई संवेदनशीलता के साथ सेल प्रसार, व्यवहार्यता, आकृति विज्ञान और प्रवास के वास्तविक समय के विश्लेषण की अनुमति देता है। इसके अलावा प्रदान किया गया इन्फ्लूएंजा ए वायरस (आईएवी) के क्षय को निर्धारित करके एक व्यावहारिक अनुप्रयोग का एक उदाहरण है जो समय के साथ वायरल संक्रामकता को प्रभावित करने वाले विभिन्न भौतिक-रासायनिक मापदंडों (यानी, तापमान, लवणता और पीएच) को प्रभावित करता है। इस तरह के अनुप्रयोगों के लिए, प्रोटोकॉल आवश्यक कार्यभार को कम करता है, जबकि संक्रामक वायरस कणों के सटीक परिमाणीकरण डेटा भी उत्पन्न करता है। यह विभिन्न आईएवी के बीच निष्क्रियता ढलानों की तुलना की अनुमति देता है, जो दिए गए वातावरण में बने रहने की उनकी क्षमता को दर्शाता है। यह प्रोटोकॉल करना आसान है, अत्यधिक पुन: प्रस्तुत करने योग्य है, और सेल संस्कृति में साइटोपैथिक प्रभाव पैदा करने वाले किसी भी वायरस पर लागू किया जा सकता है।

Introduction

एक वायरस का संचरण कई कारकों के संयोजन पर निर्भर करता है। पर्यावरण में स्रावित वायरस के लिए, इसका संचरण मेजबान के बाहर की स्थितियों में बने रहने की क्षमता पर भी निर्भर करता है। सामान्य रूप से वायरल निष्क्रियता का अध्ययन करना, इसलिए, राष्ट्रीय स्वास्थ्य अधिकारियों और नीति निर्माताओं को नियंत्रण और जैव सुरक्षा उपायों को लागू करने में मदद करने में एक महत्वपूर्ण कदम है।

प्राकृतिक और प्रयोगशाला सेटिंग्स में वायरस दृढ़ता के बारे में ज्ञान पिछले दशक में काफी बढ़ गया है। इन्फ्लूएंजा ए वायरस (आईएवी) के मामले में, उनके संचरण मार्ग पर्यावरणीय स्थितियों की एक विस्तृत श्रृंखला में वायरल कणों को प्रस्तुत करते हैं। विशेष रूप से, उन्हें 1) पानी (यानी, एवियन वायरस) के माध्यम से फेकल-मौखिक मार्गों के माध्यम से प्रेषित किया जा सकता है, या 2) दूषित फोमाइट्स द्वारा प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष संपर्क, साथ ही साथ एरोसोल और श्वसन बूंदों (यानी, पोल्ट्री और स्तनधारी वायरस)1। किसी भी मामले में, आईएवी को विभिन्न भौतिक-रासायनिक मापदंडों (यानी, पीएच, लवणता, तापमान और आर्द्रता) के लिए प्रस्तुत किया जाता है, जो कमोबेश तेजी से उनकी संक्रामकता को प्रभावित करता है2,3,4,5,6,7,8,9। यह बहुत महत्वपूर्ण है, विशेष रूप से जूनोटिक और महामारी वायरस के बारे में, वायरस की गतिशीलता को प्रभावित करने के लिए पर्यावरणीय कारकों की क्षमता और जोखिम और क्रॉस-प्रजाति संचरण के जोखिमों का आकलन करने के लिए।

अब तक, पारंपरिक विषाणु विज्ञान तकनीकों (यानी, पट्टिका assays या 50% ऊतक संस्कृति संक्रामक खुराक अनुमान के माध्यम से वायरल टिटर निर्धारण) का उपयोग समय के साथ आईएवी संक्रामकता का आकलन करने के लिए किया गया है; लेकिन इन तकनीकों में समय लेने वाली हैं और कई आपूर्ति की आवश्यकता होती है10,11,12. माइक्रोइलेक्ट्रोड्स के साथ समय के साथ संक्रमित कोशिकाओं की प्रतिबाधा को मापना विभिन्न पर्यावरणीय स्थितियों में आईएवी अस्तित्व की निगरानी करने के लिए एक उपयोगी उपकरण के रूप में कार्य करता है, साथ ही साथ सामान्य रूप से वायरल निष्क्रियता भी। यह विधि उद्देश्य, वास्तविक समय डेटा प्रदान करती है जो साइटोपैथिक प्रभावों के व्यक्तिपरक मानव अवलोकन को प्रतिस्थापित करती है। इसका उपयोग वायरस अनुमापन को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है, इस प्रकार पारंपरिक मापों को कम आत्मविश्वास अंतराल के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है और श्रम-गहन समापन बिंदु से बचा जा सकता है।

एक रैखिक सहसंबंध सेल प्रतिबाधा के माप और शास्त्रीय पट्टिका परख या TCID50 विधियों द्वारा प्राप्त अनुमापन परिणामों के बीच मौजूद है। इसलिए, प्रतिबाधा-आधारित अनुमापन विधि के साथ प्राप्त डेटा को आसानी से TCID50 या pfu मानों में वायरस 13,14,15,16,17 के सीरियल कमजोर पड़ने के साथ एक मानक वक्र बनाकर परिवर्तित किया जा सकता है। सीरम नमूनों में मौजूद एंटीबॉडी को बेअसर करने की पहचान, परिमाणीकरण और प्रभावकारिता भी इस प्रयोगात्मक दृष्टिकोण 18,19 का उपयोग करके प्राप्त की जा सकती है। हाल ही में, प्रतिबाधा-आधारित सेलुलर assays का उपयोग Equid alphaherpesviruses20 के खिलाफ एंटीवायरल यौगिकों को स्क्रीन और मूल्यांकन करने के लिए किया गया है।

इस तकनीक का उपयोग विभिन्न तापमानों पर खारे पानी में आईएवी की दृढ़ता का मूल्यांकन करने और आईएवी के हेमाग्लूटीनिन में उत्परिवर्तन की पहचान करने के लिए किया गया है जो पर्यावरण में आईएवी दृढ़ता को बढ़ाते हैं या कम करते हैं। पारंपरिक अनुमापन विधियों का उपयोग करते समय इस तरह की स्क्रीनिंग को व्यापक काम की आवश्यकता होगी। हालांकि, इस पद्धति का उपयोग किसी भी वायरस के लिए किया जा सकता है जिसका सेल आकृति विज्ञान, सेल नंबर और सेल सतह अनुलग्नक शक्ति पर प्रभाव पड़ता है। इसका उपयोग विभिन्न पर्यावरणीय स्थितियों (यानी, हवा में, पानी में, या सतहों पर) में दृढ़ता की निगरानी करने के लिए भी किया जा सकता है।

यहां वर्णित प्रोटोकॉल एक उदाहरण के रूप में पानी में आईएवी अस्तित्व को लागू करता है। मानव इन्फ्लूएंजा वायरस विस्तारित अवधि के दौरान विभिन्न भौतिक-रासायनिक मापदंडों के संपर्क में आते हैं। 35 डिग्री सेल्सियस पर खारा (35 ग्राम / एल NaCl) पानी को पिछले परिणामों के आधार पर पर्यावरण मॉडल के रूप में चुना गया था। उजागर वायरस की अवशिष्ट संक्रामकता को सेल संक्रमण के माध्यम से अलग-अलग समय बिंदुओं पर परिमाणित किया जाता है। MDCK कोशिकाओं, IAV प्रवर्धन के लिए संदर्भ सेल प्रकार, माइक्रोइलेक्ट्रोड सेंसर के साथ लेपित 16 अच्छी तरह से माइक्रोटिटर प्लेटों पर बीज दिया जाता है और 24 घंटे बाद उजागर वायरस द्वारा संक्रमित होता है। सेल प्रतिबाधा को हर 15 मिनट में मापा जाता है और सेल इंडेक्स (सीआई) नामक एक मनमानी इकाई के रूप में व्यक्त किया जाता है। इन्फ्लूएंजा वायरस द्वारा प्रेरित साइटोपैथिक प्रभाव, जिसकी शुरुआत की दर सीधे कोशिकाओं की संस्कृति के लिए संक्रमित संक्रामक वायरल कणों की संख्या पर निर्भर करती है, सीआई में कमी की ओर ले जाती है, जिसे बाद में सीआईटी 50 मूल्य के रूप में परिमाणित किया जाता है। यह मान प्रारंभिक सीआई से 50% की कमी को मापने के लिए आवश्यक समय से मेल खाता है (यानी, वायरस जोड़ने से पहले)। कई पर्यावरणीय एक्सपोज़र बार के लिए परिकलित CIT50 मानCIT50 मानों के रैखिक प्रतिगमन के बाद वायरस की निष्क्रियता ढलान की कटौती के लिए अनुमति देते हैं।

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Protocol

उपयुक्त जैव सुरक्षा स्तर की आवश्यकताओं (बीएसएल -2 या उपप्रकार के आधार पर उच्चतर) के अनुसार सभी इन्फ्लूएंजा वायरस को संभालें। प्रयोगों के बीच कम भिन्नता का बीमा करने के लिए कम मार्ग इतिहास (एमडीसीके कोशिकाओं पर 5x से कम) के साथ आईएवी उपभेदों का उपयोग करें।

1. अभिकर्मकों और शुरुआती सामग्री की तैयारी

  1. MDCK कोशिकाओं और बाँझ सेल संस्कृति माध्यम की तैयारी
    1. संशोधित ईगल के माध्यम (एमईएम) में मैडिन-डार्बी कैनाइन किडनी (एमडीसीके) कोशिकाओं की खेती करें, जो 10% गर्मी निष्क्रिय भ्रूण बछड़े सीरम (एफसीएस) और एंटीबायोटिक दवाओं (100 इकाइयों / एमएल पेनिसिलिन, 100 मिलीग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन) के साथ पूरक हैं।
    2. पिघलने के बाद, एमडीसीके कोशिकाओं को पूर्ण वसूली सुनिश्चित करने के लिए उन्हें संक्रमित करने से पहले कम से कम 2x पारित करना (लेकिन सेल फेनोटाइप में किसी भी बहाव से बचने के लिए 30 से कम मार्ग)।
    3. बीज 75 सेमी 2 ऊतक संस्कृति फ्लास्क (एस) जिसमें 7.5 x 106 एमडीसीके कोशिकाओं के साथ 30 मिलीलीटर बाँझ 1x एमईएम होता है और ह्यूमिडिफाइड 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट होता है।
  2. प्रतिबाधा निगरानी उपकरण तैयार करना
    1. उपकरण को इनक्यूबेटर में 35 डिग्री सेल्सियस पर रखें और इसे कम से कम 2 घंटे के लिए गर्म होने दें।
    2. इसे इनक्यूबेटर के बाहर रखी गई नियंत्रण इकाई से कनेक्ट करें।
    3. प्रयोग के शेष शुरू करने से पहले निर्माता द्वारा अनुशंसित के रूप में सफाई प्रक्रियाओं के लिए आगे बढ़ें।
  3. MDCK कोशिकाओं पर IAV स्टॉक का उत्पादन
    1. H1N1 वायरस को प्रचारित और बढ़ाने के लिए, दो 75 सेमी 2 ऊतक संस्कृति फ्लास्क पर 7.5 x 106 एमडीसीके कोशिकाओं को बीज और 90% -100% संगम तक पहुंचने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    2. 75 सेमी 2 फ्लास्क में सेल मोनोलेयर से सेल संस्कृति माध्यम को डिकेंट करें। बाँझ 1x PBS के 5 mL के साथ कोशिकाओं को धोएं।
    3. पीबीएस निकालें और कोशिकाओं को फिर से धोने के लिए 1x पीबीएस के 5 एमएल जोड़ें।
    4. नियंत्रण के रूप में एक फ्लास्क लेबल और वायरस प्रसार मीडिया के 15 मिलीलीटर (0% FCS के साथ 1x MEM) को जोड़ने से पहले PBS को हटाने के लिए ध्यान से monolayer पर. 5% CO2 के साथ 35 °C पर बनाए रखा एक इनक्यूबेटर में इस फ्लास्क incubate. प्रसार के 3 दिनों के बाद तुलना के लिए इसका उपयोग करें।
    5. RT पर IAV स्टॉक की एक शीशी को पिघलाएं। वायरस को 1.5 mL ट्यूब में उपयुक्त सांद्रता में पतला करें जिसमें वायरस प्रोपेगेशन मीडिया (0% FCS के साथ 1x MEM) होता है।
    6. 75 सेमी 2 फ्लास्क से 1x PBS निकालें और 1 x 10-3 या 1 x 10-4 पट्टिका प्रति सेल (pfu / सेल) के संक्रमण (MOI) की बहुलता पर MDCK कोशिकाओं को संक्रमित करें, सेल मोनोलेयर में पतला वायरस के 1 एमएल जोड़कर प्रति सेल (pfu / सेल) बनाने वाली इकाइयां।
    7. हर 15 मिनट में नियमित रूप से फ्लास्क को हिलाकर आरटी में 45 मिनट के लिए एमडीसीके कोशिकाओं के लिए वायरस को adsorb करें।
    8. धीरे से इनोकुलम को हटा दें और 15 मिलीलीटर वायरस प्रसार मीडिया प्रति फ्लास्क जोड़ें जिसमें 1 μg / mL TPCK-ट्रिप्सिन (ट्रिप्सिन / एल -1-टोसिलामाइड-2-फेनिलेथिल क्लोरोमिथाइल कीटोन) शामिल है, ताकि वायरल हेमाग्लूटिनिन एचए0 को एचए 1 और एचए 2 सबयूनिट्स में क्लीव किया जा सके (एक घटना जो एंडोसोमल झिल्ली और वायरल जीनोम की रिहाई के साथ एचए संलयन के लिए आवश्यक है)22।
    9. वायरस को दोहराने के लिए कम से कम 3 दिनों के लिए 35 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर फ्लास्क को इनक्यूबेट करें।
    10. 40x आवर्धन पर माइक्रोस्कोप के तहत MDCK कोशिकाओं का निरीक्षण करें और कोशिकाओं पर साइटोपैथिक प्रभाव (सीपीई) की तलाश करें (सेल नियंत्रण फ्लास्क की तुलना करके)। यदि सीपीई पूरा नहीं हुआ है (यानी, लगभग 80% कोशिकाएं सब्सट्रेट से अलग हो जाती हैं), तो फ्लास्क को अतिरिक्त 24 घंटे के लिए इनक्यूबेटर में वापस रखें।
    11. जब सीपीई पूरा हो जाता है, तो सेलुलर मलबे को गोली मारने के लिए 10 मिनट के लिए 300 x g पर सेल संस्कृति supernatant और centrifuge decant।
    12. एक 15 मिलीलीटर ट्यूब और एलीकोट संतान वायरस के लिए स्पष्ट supernatant हस्तांतरण एकल उपयोग बाँझ क्रायोजेनिक शीशियों के लिए. तुरंत क्रायोट्यूब को -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज और स्टॉक वायरस के लिए रखें।

2. कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए उपयुक्त सेल मात्रा का निर्धारण

नोट: सभी प्रयोगों के दौरान, प्लेटों को हर समय गैर-इलेक्ट्रोस्टैटिक सतहों पर रखें, जैसे कि पैकेजिंग से पेपर रैप। इलेक्ट्रॉनिक माइक्रोटिटर प्लेट (ई-प्लेट के रूप में डिज़ाइन किया गया) में सीड होने वाली कोशिकाओं की सबसे उपयुक्त एकाग्रता निर्धारित करने के लिए नीचे दिए गए अनुभाग 2 का पालन करें।

  1. प्रयोग से 24 घंटे पहले ताजा विभाजित कोशिकाओं (लगभग 80% संगम) प्राप्त करने के लिए 75 सेमी 2 फ्लास्क में एमडीसीके कोशिकाओं को तैयार करें।
  2. 1x PBS के 5 mL के साथ कोशिकाओं को धोएं और 0.25% ट्रिप्सिन-ईडीटीए समाधान के 3 मिलीलीटर जोड़कर उन्हें अलग करें।
  3. ताजा सेल संस्कृति माध्यम के 7 मिलीलीटर जोड़ें और trypan नीले दाग के साथ एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग कर कोशिकाओं की गिनती।
  4. सेल एकाग्रता को सेल संस्कृति मीडिया के साथ 400,000 कक्षों / एमएल में समायोजित करें। 200,000 के सेल घनत्व प्राप्त करने के लिए अतिरिक्त ट्यूबों में दो गुना सीरियल dilutions प्रदर्शन; 100,000; 50,000; 25,000; 12,500; और 6,250 कोशिकाओं / एमएल। कक्ष प्रकार और उनके विकास व्यवहार के अनुसार कक्षों की तनुकरण श्रेणी समायोजित करें.
  5. कई मिनटों के लिए आरटी पर ई-प्लेट (सामग्री की तालिका) को छोड़ दें और एक बहु-चैनल पिपेट का उपयोग करके प्रत्येक अच्छी तरह से सेल संस्कृति मीडिया के 100 μL जोड़ें। ई-प्लेट के इलेक्ट्रोड को न छुएं।
  6. पालने अनलॉक और प्रतिबाधा मापने उपकरण (सामग्री की तालिका) के पालना जेब में प्लेट सामने अंत डालें। इनक्यूबेटर का दरवाजा बंद कर दें।
  7. सॉफ़्टवेयर खोलें.
    1. "डिफ़ॉल्ट प्रयोग पैटर्न सेटअप" में, चयनित पालना (ओं) का चयन करें और शीर्ष पृष्ठ पर डबल-क्लिक करें, फिर प्रयोग का नाम दर्ज करें। "लेआउट" पर क्लिक करें और प्लेट के प्रत्येक चयनित कुएं के लिए आवश्यक नमूना जानकारी दर्ज करें; फिर, समाप्त होने पर "लागू करें" पर क्लिक करें। "शेड्यूल" | पर क्लिक करें "कदम" | "एक कदम जोड़ें". सॉफ़्टवेयर स्वचालित रूप से पृष्ठभूमि प्रतिबाधा (सीआई) को मापने के लिए 1 एस का एक चरण जोड़ता है।
    2. "Execute" टैब में "Start/Continue" पर क्लिक करें। "प्लॉट" पर क्लिक करें, विनियोजित कुओं का चयन करके सभी नमूने जोड़ें, और सुनिश्चित करें कि अगले चरण पर आगे बढ़ने से पहले सीआई -0.1 और 0.1 के बीच है।
  8. थाली को पालने से हटा दें।
  9. उपयुक्त कुओं के लिए डुप्लिकेट में चरण 2.4 से प्रत्येक सेल निलंबन का 100 μL जोड़ें और नियंत्रण के रूप में उपयोग किए जाने वाले कुओं में सेल मीडिया के 100 μL जोड़ें। ई-प्लेट को आरटी पर 30 मिनट के लिए लैमिनर फ्लो हुड में छोड़ दें ताकि कुओं के निचले हिस्से में कोशिकाओं के समान वितरण की अनुमति मिल सके।
  10. पालने की जेब में ई-प्लेट डालें। "शेड्यूल" | पर क्लिक करें सॉफ़्टवेयर में "चरण जोड़ें" और 200 repetitions के लिए हर 30 मिनट में कोशिकाओं की निगरानी करने के लिए मान दर्ज करें। फिर, "प्रारंभ / जारी रखें" का चयन करें।
  11. सॉफ़्टवेयर में "प्लॉट" बटन पर क्लिक करके CI डेटा की जाँच करें और प्लॉट करें। उन कोशिकाओं की एकाग्रता का चयन करें जो प्लेट पर सीडिंग के बाद स्थिर चरण 24 घंटे से ठीक पहले हैं, ताकि उन कोशिकाओं को प्राप्त किया जा सके जो अभी भी वायरल संक्रमण के दौरान बढ़ते चरण में हैं। स्थिर चरण तक पहुंच जाता है जब सीआई अपने अधिकतम पर होता है।

3. CIT50 मूल्यों और संक्रमण की बहुलता के बीच सहसंबंध

  1. ई-प्लेट के प्रत्येक कुएं में बाँझ 1x एमईएम संस्कृति माध्यम के 100 μL जोड़ें। 35 डिग्री सेल्सियस पर उपकरण के पालने की जेब में ई-प्लेट डालें। चरण 2.7 में वर्णित पृष्ठभूमि को मापें।
  2. पालने से ई-प्लेट निकालें।
  3. इलेक्ट्रॉनिक माइक्रोटिटर प्लेट के प्रत्येक कुएं पर ताजा विभाजित MDCK कोशिकाओं के बीज 3 x 104 और उन्हें 5% CO2 के साथ 35 °C पर 24 घंटे के लिए उगाते हैं ताकि वे आईएवी संक्रमण के दौरान एक प्रतिकृति चरण में हों।
  4. MDCK कोशिकाओं को एक ज्ञात 6 log10 TCID50 / mL H1N1 वायरस के टिटर के विभिन्न 10 गुना dilutions के साथ संक्रमित, नीचे दिए गए चरणों का पालन करके reproducibility के लिए रिवर्स pipetting का उपयोग कर:
    1. कोई FCS (वायरस प्रसार मीडिया) के साथ एमईएम के 100 μL के साथ MDCK कोशिकाओं 2x कुल्ला. इनोकुलम के आगे कमजोर पड़ने से बचने के लिए दूसरे धोने के बाद सभी मीडिया को हटाने के बारे में जागरूक रहें।
    2. एकल चैनल पिपेट का उपयोग करके प्रत्येक अच्छी तरह से वायरल निलंबन के 100 μL जोड़ें। संदूषण से बचने के लिए, बाएं से दाएं फिर प्लेट में ऊपर से नीचे तक शुरू करके आगे बढ़ें, जबकि ढक्कन के साथ शेष कुओं को कवर करें।
    3. 35 डिग्री सेल्सियस पर उपकरण के पालने की जेब में प्लेट डालें। अचानक आंदोलनों से बचने के लिए कोमल रहें जो संभावित रूप से संदूषण के लिए अग्रणी हैं।
    4. चरण 2.10 में वर्णित के रूप में कम से कम 100 घंटे के दौरान हर 15 मिनट में सेल प्रतिबाधा की निगरानी करना शुरू करें।
    5. माप के दो चक्रों (यानी, 30 मिनट) के बाद, "निष्पादित करें" टैब में "रोकें" पर क्लिक करके उपकरण को रोकें और पालने से ई-प्लेट को हटा दें।
    6. वायरल हेमाग्लूटीनिन को क्लीव करने के लिए वायरस प्रसार मीडिया में 1 μg / mL TPCK-ट्रिप्सिन जोड़ें।
    7. प्रत्येक अच्छी तरह से TPCK-ट्रिप्सिन युक्त वायरस प्रसार मीडिया के 100 μL जोड़ें और पालना जेब में ई प्लेट डालें।
    8. "निष्पादित करें" टैब में "प्रारंभ/जारी रखें" क्लिक करें.
      नोट:: वायरस प्रोपेगेशन मीडिया के साथ वायरल निलंबन को प्रतिस्थापित करके मॉक-संक्रमित कोशिकाओं के लिए संगत एक नकारात्मक नियंत्रण बनाने के लिए मत भूलना।

4. IAV अस्तित्व कैनेटीक्स

  1. 35 डिग्री सेल्सियस पर खारा आसुत पानी के लिए आईएवी को बेनकाब करें और सेल प्रतिबाधा में कमी को मापकर समय के साथ उनकी संक्रामकता के लिए परीक्षण करें।
    1. आसुत जल में 35 ग्राम/एल की अंतिम सांद्रता में NaCl जोड़कर खारा आसुत जल तैयार करें। 2 एमएल क्रायोट्यूब में 900 μL खारे पानी जोड़ें।
    2. खारे पानी में वायरल स्टॉक के 100 μL जोड़ें और क्रायोट्यूब को एक इनक्यूबेटर (35 °C, 5% CO2) में 1 h, 24 h, या 48 h के लिए रखें।
    3. बीज 100 μL (3 x 104 युक्त) एक 16 अच्छी तरह से माइक्रोटिटर प्लेट पर ताजा विभाजित MDCK कोशिकाओं के और 37 डिग्री सेल्सियस और 5% CO2 पर 24 घंटे के लिए बढ़ते हैं।
    4. उजागर वायरस के 100 μL के साथ कोशिकाओं को संक्रमित (पहले संस्कृति मीडिया में पतला 10x) अनुभाग 3.4 दोहराने से reproducibility के लिए रिवर्स pipetting विधि का उपयोग कर.
  2. मॉनिटर सेल प्रतिबाधा कम से कम 100 घंटे के लिए हर 15 मिनट.

5. infectivity के नुकसान का मूल्यांकन

  1. CIT50 मानों का निर्धारण CIT50 मान के साथ वायरस-प्रेरित साइटोपैथिक प्रभावों के कारण CI में कमी को मापने के लिए।
    1. "प्लॉट" पर क्लिक करें और "सभी जोड़ें" पर क्लिक करके सभी नमूने जोड़ें। "निर्यात प्रयोग जानकारी" पर क्लिक करके परिणामों को स्प्रेडशीट में निर्यात करें. प्रारंभिक सीआई को सेलुलर प्रतिबाधा मूल्य के रूप में माना जाता है जो उजागर वायरस द्वारा सेल संक्रमण के बाद 5 घंटे मापा जाता है (यानी, माइक्रोटाइटर ई-प्लेट पर एमडीसीके कोशिकाओं के सीडिंग के बाद 24 घंटे)।
    2. प्रारंभिक CI से 50 % की कमी को मापने के लिए आवश्यक समय के अनुरूप CIT50 मान की गणना करें। CIT50 मान की गणना करने के लिए, प्रत्येक नमूने के लिए 5 hpi पर CI मान नोट करें। उसके बाद, वह समयबिंदु ढूँढें जिस पर CI मान 5 hpi पर अनुक्रमणिका का उपयोग करके CI मान के आधे के बराबर है और स्प्रेडशीट में फ़ंक्शंस का मिलान करता है.
  2. माध्य निष्क्रियता ढलान की गणना
    1. प्रत्येक उजागर वायरल निलंबन के लिए CIT50 मान निर्धारित करें, अलग-अलग एक्सपोज़र समय (दिनों में) पर।
    2. CIT50 प्लॉट किए गए मानों से एक रैखिक प्रतिगमन ढलान की गणना करें, जिसे निष्क्रियता ढलान के रूप में संदर्भित किया जाता है और CIT50.day-1 में व्यक्त किया जाता है।

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Representative Results

MDCK कोशिकाओं की विभिन्न सांद्रता के साथ 120 घंटे के बाद प्राप्त कच्चे डेटा, 15,000 से 120,000 कोशिकाओं प्रति अच्छी तरह से, चित्र 1 में दिखाया गया है। 24 घंटे के बाद, सीआई उपायों से पता चलता है कि 30,000 कोशिकाओं के साथ बीज वाले कुओं में कोशिकाएं अभी भी विकास के घातीय चरण में थीं, और इस सेल एकाग्रता का उपयोग आगे के प्रयोगों के लिए किया गया था। चित्रा 2 CIT50 मानों और संक्रमण की प्रारंभिक बहुलता के बीच रैखिक सहसंबंध को दर्शाता है। एमडीसीके कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए सुसंस्कृत किया जाता है, फिर संक्रमण की एक अलग बहुलता पर ए / पेरिस / 2590 / 2009 एच 1 एन 1 वायरल तनाव से संक्रमित होता है। प्रारंभिक सीआई को संक्रमण के 5 घंटे बाद मापा जाता है।

चित्रा 3 हमारे प्रयोगों (पैनल ए) में उपयोग की जाने वाली प्रयोगात्मक प्रक्रिया को दर्शाता है। वायरस-प्रेरित साइटोपैथिक प्रभाव के कारण सीआई की कमी दिखाने वाले विशिष्ट परिणाम पैनल बी पर दिखाए गए हैं। ये सॉफ्टवेयर द्वारा संसाधित किए जाने के बाद प्राप्त कच्चे डेटा हैं। CIT50 मानों की गणना डेटा के निर्यात के बाद स्प्रेडशीट का उपयोग करके की गई थी। अलग-अलग टाइमपॉइंट्स पर CIT50 मानों की गणना के बाद, एक रैखिक प्रतिगमन विश्लेषण ने ढलान (पैनल सी) के निर्धारण की अनुमति दी। इस प्रकार प्रत्येक स्थिति में प्रत्येक वायरस के लिए वायरल निष्क्रियता ढलानों को प्राप्त किया गया था, फिर उन वायरस की पहचान करने के लिए तुलना की गई थी जिनके पास अध्ययन किए गए वातावरण में सबसे बड़ी स्थिरता थी।

चित्रा 4 IAV पुनः संयोजक वायरस की निष्क्रियता ढलानों को दर्शाता है जो A/WSN/1933 H1N1 वायरस स्ट्रेन से संबंधित एक आनुवंशिक रीढ़ की हड्डी और A/New Caledonia/20/1999 H1N1 वायरस (HA-NA/NC99) से एक HA और NA को सहन करता है। एचए में गैर-पर्यायवाची उत्परिवर्तन को खारे पानी में मेजबान के बाहर वायरस कण दृढ़ता पर प्रभाव का अध्ययन करने के लिए पेश किया गया था।

तीन बार में किए गए विभिन्न प्रयोगों से माध्य निष्क्रियता ढलानों की तुलना करके, हम एचए में अमीनो एसिड की पहचान करने में सक्षम थे जो मेजबान के बाहर वायरल दृढ़ता को प्रभावित करने के लिए पर्याप्त थे। निष्क्रियता ढलान जितना कम होगा, वायरस उतना ही स्थिर होगा। एक उदाहरण के रूप में, HA/F453Y प्रतिस्थापन या HA::K147 सम्मिलन HA-NA/NC99 वायरस के HA में क्रमशः 9.8 CIT50/day और 9.9 CIT50/day के लिए औसत निष्क्रियता ढलान में एक महत्वपूर्ण वृद्धि को प्रेरित करता है, जंगली-प्रकार HA (4.85 CIT50/day की औसत निष्क्रियता ढलान के साथ) की तुलना में, इस प्रकार बहुत अस्थिर उत्परिवर्ती उत्पन्न करता है। इसके विपरीत, एचए / टी 327 ए प्रतिस्थापन ने खारे पानी में 35 डिग्री सेल्सियस पर वायरल स्थिरता को प्रभावित नहीं किया (6.6 सीआईटी 50 / दिन की निष्क्रियता ढलान का मतलब है)। इस प्रकार पद्धति एचए ग्लाइकोप्रोटीन में अमीनो-एसिड अवशेषों की पहचान करने के लिए पर्याप्त शक्तिशाली थी जो मेजबान के बाहर आईएवी अस्तित्व में शामिल थे।

Figure 1
चित्रा 1: माइक्रोटिटर ई-प्लेट में सेल अनुमापन।
एमडीसीके कोशिकाओं के सीरियल dilutions को माइक्रोटिटर ई-प्लेटों पर सीड किया गया था, और सेल विकास को 100 घंटे (हर 30 मिनट में 200 स्वीप) तक मॉनिटर किया गया था। ग्रे डॉट्स डुप्लिकेट में मापा गया सीआई के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं। 24 घंटे में ऊर्ध्वाधर रेखा इस बात पर प्रकाश डालती है कि वर्णित परिस्थितियों में, 3 x 104 कोशिकाओं की प्रारंभिक सीडिंग / अच्छी तरह से संक्रमण के समय लगभग 70% confluency की संस्कृति की अनुमति दी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: CIT50 मानों और संक्रमण की प्रारंभिक बहुलता के बीच रैखिक प्रतिगमन।
प्रत्येक बिंदु CIT50 मान को इंगित करता है जो संक्रमण की विभिन्न बहुलताओं के साथ कोशिकाओं के संक्रमण के लिए गणना की जाती है। ठोस रेखा रैखिक प्रतिगमन ढलान (R2 = 0.99) का प्रतिनिधित्व करती है, और धराशायी रेखाएं 95% आत्मविश्वास अंतराल का प्रतिनिधित्व करती हैं। यह आंकड़ा पिछले प्रकाशन 21 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: निष्क्रियता ढलान का निर्धारण।
(ए) वायरल कणों को 0, 1, या 2 दिनों के लिए 35 डिग्री सेल्सियस पर खारे पानी में पतला किया गया था, और सीआई को लगातार निगरानी की गई थी और सेल इंडेक्स के रूप में प्लॉट किया गया था। (बी) सीआई CIT50 मानों के साथ परिमाणित कमी, जो ऊर्ध्वाधर धराशायी लाइनों द्वारा कच्चे डेटा पर मैन्युअल रूप से प्रतिनिधित्व कर रहे हैं। प्रत्येक वक्र वायरस के साथ संक्रमण के बाद सेल प्रतिबाधा के विकास का प्रतिनिधित्व करता है जो बढ़ते समय के लिए खारे पानी के संपर्क में थे (लाल: गैर-उजागर वायरस, पीला: 24 घंटे एक्सपोजर, हरा: 48 एच एक्सपोजर, अंधेरा: नकली संक्रमित कोशिकाएं)। प्रारंभिक सीआई को संक्रमण के बाद 5 घंटे मापा गया था (सी) निष्क्रियता ढलान की गणना करने के लिए उपयोग किए जाने वाले सीआईटी 50 मानों के रैखिक प्रतिगमन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: खारे पानी में आईएवी दृढ़ता पर एचए में गैर-पर्यायवाची उत्परिवर्तन का प्रभाव।
A/New Caledonia/20/1999 H1N1 वायरस से (प्रतिस्थापन या सम्मिलन) या उत्परिवर्तन (HAWT) के बिना एक HA वाले reassortant वायरस की निष्क्रियता ढलानों। Boxplots एकल inactivation ढलानों (वायरस के आधार पर छह या आठ, विभिन्न स्वतंत्र प्रयोगों से गणना) माध्य (क्षैतिज रेखाओं) के आसपास प्रत्येक उजागर वायरस के लिए प्राप्त के वितरण प्रदर्शित किया। माध्य निष्क्रियता ढलानों की तुलना एनोवा परीक्षण (एनएस, पी > 0.05, ******* पी < 0.0001) का उपयोग करके की गई थी। रेफरी वाइल्डटाइप एचए वाले पुन: संबद्ध वायरस से मेल खाती है, जिसके खिलाफ अन्य वायरस की तुलना की जाती है। यह आंकड़ा पिछले प्रकाशन 21 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

RTCA एक प्रतिबाधा-आधारित तकनीक है जिसका उपयोग सेल गुणों की वास्तविक समय की निगरानी के लिए तेजी से किया जाता है, जैसे कि सेल पालन, प्रसार, प्रवास और साइटोटॉक्सिसिटी। इस अध्ययन में, मेजबान के बाहर आईएवी अस्तित्व का आकलन करने के लिए इस तकनीक की क्षमता को वायरस निष्क्रियता ढलान को मापकर प्रदर्शित किया जाता है। TCID50 और पट्टिका assays जैसे Fastidious तकनीकों को सेल व्यवहार्यता के उद्देश्य वास्तविक समय के मूल्यांकन द्वारा प्रतिस्थापित किया जाता है, इस प्रकार वायरस द्वारा प्रेरित साइटोपैथिक प्रभावों को दर्शाता है। TCID50 या पट्टिका बनाने वाली इकाई (pfu) के समान, CIT50 भी संक्रमण की बहुलता (चित्रा 2) के साथ रैखिक रूप से सहसंबद्ध है। इस दृष्टिकोण की सीमाओं के बीच, यह विधि गैर-साइटोपैथोजेनिक वायरस से संक्रमित कोशिकाओं की सटीक निगरानी करने में विफल रहती है।

एक उदाहरण के रूप में, वायरल जीनोम में नए उत्परिवर्तन की शुरूआत एक वायरस को दृढ़ता से क्षीण कर सकती है और इसकी साइटोपैथोजेनिकता को कम कर सकती है। इसके विपरीत, यहां गणना की गई निष्क्रियता ढलान वायरस प्रतिकृति और एक संभावित वायरस क्षीणन से स्वतंत्र है, क्योंकि यह ढलान एक ही वायरस की निष्क्रियता के विभिन्न टाइमपॉइंट्स के बाद मापा गया सीआईटी 50 मूल्यों से प्राप्त होता है। यहां, इस प्रकार यह माना जाता है कि वायरल कण जो अभी भी इस निष्क्रियता प्रोटोकॉल के बाद एक सेल को संक्रमित करने में सक्षम हैं, निष्क्रियता से पहले वायरस के समान प्रतिकृति फेनोटाइप साझा करते हैं।

उच्च लागत के बावजूद, इस दृष्टिकोण का उपयोग करके कार्यभार काफी कम हो जाता है, जो लाभप्रद होता है जब किसी परियोजना को कैनेटीक्स के प्रदर्शन की आवश्यकता होती है, जिसमें लगातार टाइमपॉइंट्स और लंबे समय तक माप की आवश्यकता होती है। हर प्रोटोकॉल के रूप में, कुछ कदम महत्वपूर्ण हैं, और जोड़तोड़ को देखभाल और सटीकता के साथ किया जाना चाहिए। रिवर्स पिपेटिंग मीडिया के सटीक वितरण को सुनिश्चित करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है, और किसी भी संदूषण से बचने के लिए विशेष ध्यान दिया जाना चाहिए। इसी तरह, प्रारंभिक सेल मात्रा प्रत्येक प्रयोग के बीच समान होनी चाहिए और ट्राइपैन ब्लू स्टेनिंग के साथ एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करके मूल्यांकन किया जाना चाहिए। उपकरण द्वारा सीआई की निगरानी के दौरान, इनक्यूबेटर के उद्घाटन को जितना संभव हो उतना सीमित किया जाना चाहिए।

यदि सीमित आंदोलन के साथ प्रयोग के दौरान देखभाल और ध्यान प्रदान किया जाता है, तो संदूषण जोखिम कम हो जाता है, और परिणाम अत्यधिक पुन: प्रस्तुत करने योग्य होते हैं। विभिन्न वायरसों के बीच निष्क्रियता ढलानों का वितरण काफी अलग है, इसलिए वायरस दृढ़ता की तुलना करने के लिए एक गैर-पैरामीट्रिक सांख्यिकीय परीक्षण का उपयोग किया जाता है। माध्य निष्क्रियता ढलानों की गणना सेल संस्कृति में साइटोपैथिक प्रभाव पैदा करने वाले किसी भी वायरस के लिए की जा सकती है, जैसे कि एंटरिक वायरस, इबोलावायरस, या कोरोनोवायरस, जिनकी पर्यावरणीय स्थितियों में दृढ़ता का वर्तमान में अध्ययन किया जा रहा है (और संभवतः पारंपरिक वायरोलॉजी विधियों का उपयोग करके)। भविष्य में, इस विधि का उपयोग विभिन्न वायरसों की प्रतिकृति की तुलना करने, एक ही समय में कई सेल लाइनों के लिए वायरस ट्रोपिज़्म की जांच करने और वायरस चक्र के विशिष्ट चरणों का अध्ययन करने के लिए भी किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25%Trypsin ThermoFisher 25200056
75 cm2 tissue culture flask Falcon 430641U
E-Plate 16 (6 plates) ACEA Biosciences, Inc 5469830001 E-plates are avalible in different packaging
FCS Life technologies (gibco) 10270-106
MEM 1X Life technologies (gibco) 31095029
PBS 1X Life technologies (gibco) 14040091
Penicillin-Streptomycin Life technologies (gibco) 11548876
TPCK-Trypsin Worthington LS003740
xCELLigence Real-Time Cell Analysis Instrument S16 ACEA Biosciences, Inc 380601310 The xCELLigence RTCA S16 instruments are available in different formats (16-well, 96-well, single or multi-plate)

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 168 इन्फ्लूएंजा ए वायरस दृढ़ता वास्तविक समय सेल विश्लेषण वायरल निष्क्रियता सेल रोगजनक प्रभाव वायरल परिमाणीकरण
रियल-टाइम सेल विश्लेषण का उपयोग करके मेजबान के बाहर इन्फ्लूएंजा वायरस उत्तरजीविता की निगरानी
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Labadie, T., Grassin, Q., Batéjat, C., Manuguerra, J. C., Leclercq, I. Monitoring Influenza Virus Survival Outside the Host Using Real-Time Cell Analysis. J. Vis. Exp. (168), e61133, doi:10.3791/61133 (2021).

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