Summary
ここで報告されるのは、感染細胞の電気インピーダンスのリアルタイムモニタリングを用いた感染性ウイルス粒子の定量化のためのプロトコルである。この方法の実用的な応用は、環境条件を模倣する異なる物理化学的パラメータ下でのインフルエンザA型ウイルス崩壊を定量化することによって提示される。
Abstract
ウイルス粒子定量のための方法は、多くのウイルス学研究の重要な側面を表しています。いくつかの信頼できる手法が存在しますが、時間がかかるか、小さな変動を検出できません。ここでは、感染細胞の電気インピーダンス変動をリアルタイムで分析することにより、ウイルス力価を正確に定量化するためのプロトコルを紹介します。細胞インピーダンスは、マイクロプレートの細胞の下に位置する金の微小電極バイオセンサを介して測定され、その大きさは細胞の数およびそのサイズおよび形状に依存する。このプロトコルにより、細胞増殖、生存率、形態、および遊走のリアルタイム分析が高感度で可能になります。また、ウイルス感染力に経時的に影響を与える様々な物理化学的パラメータ(すなわち、温度、塩分濃度、pH)に服従するインフルエンザA型ウイルス(IAV)の崩壊を定量化することによって、実用化の例を提供する。このようなアプリケーションの場合、このプロトコルは必要な作業負荷を軽減しながら、感染性ウイルス粒子の正確な定量データを生成します。これにより、異なるIAV間の不活性化スロープの比較が可能になり、特定の環境で持続する能力が反映されます。このプロトコルは、実行が容易であり、再現性が高く、細胞培養において細胞変性効果を産生するあらゆるウイルスに適用することができる。
Introduction
ウイルスの伝播は、いくつかの要因の組み合わせに依存します。環境内で分泌されるウイルスの場合、その感染は、宿主外の条件下で持続する能力にも依存します。したがって、ウイルスの不活性化全般を研究することは、国家保健当局や政策立案者が管理およびバイオセーフティ対策を実施するのに役立つ重要なステップです。
自然環境および実験室環境におけるウイルスの持続性に関する知識は、過去10年間で大幅に増加しました。インフルエンザA型ウイルス(IAV)の場合、その感染経路はウイルス粒子を広範囲の環境条件に服従させる。具体的には、それらは、1)水(すなわち、鳥ウイルス)を通る糞便 - 経口経路、または2)汚染されたフォマイト、ならびにエアロゾルおよび呼吸飛沫(すなわち、家禽および哺乳動物ウイルス)による直接的または間接的な接触を介して伝達され得る1。いずれにせよ、IAVは様々な物理化学的パラメータ(すなわち、pH、塩分濃度、温度、湿度)に服従し、それらは多かれ少なかれそれらの感染力に急速に影響する2、3、4、5、6、7、8、9。特に人獣共通感染症ウイルスやパンデミックウイルスに関しては、ウイルスの動態に影響を与える環境要因の可能性、曝露および種間伝播のリスクを評価することが非常に重要です。
これまでのところ、従来のウイルス学技術(すなわち、プラークアッセイまたは50%組織培養感染用量推定によるウイルス力価決定)は、IAV感染力を経時的に評価するために使用されてきた。しかし、これらの技術は時間がかかり、多くの消耗品を必要とします10,11,12。微小電極を用いて感染細胞のインピーダンスを経時的に測定することは、さまざまな環境条件下でのIAV生存、および一般的なウイルス不活性化を監視するための有用なツールとして役立ちます。この方法は、細胞変性効果の主観的なヒト観察に代わる客観的でリアルタイムのデータを提供する。ウイルス滴定の決定に使用できるため、従来の測定を低い信頼区間に置き換え、労働集約的なエンドポイントアッセイを回避できます。
細胞インピーダンスの測定と古典的なプラークアッセイまたはTCID50法によって得られた滴定結果との間には線形相関が存在する。したがって、インピーダンスベースの滴定法で得られたデータは、ウイルスの段階希釈による標準曲線を作成することでTCID50またはpfu値に容易に変換することができます13,14,15,16,17。血清サンプル中に存在する中和抗体の検出、定量、および有効性も、この実験的アプローチを用いて達成することができる18,19。最近では、インピーダンスベースの細胞アッセイが、Equid alphaherpesvirus20に対する抗ウイルス化合物のスクリーニングおよび評価に使用されています。
この技術は、異なる温度での生理食塩水中のIAVの持続性を評価し、環境中のIAVの持続性を増減させるIAVのヘマグルチニンの変異を特定するために使用されてきました21。このようなスクリーニングは、従来の滴定法を使用する場合、広範な作業を必要とするであろう。しかし、この方法論は、細胞形態、細胞数、および細胞表面付着強度に影響を与える任意のウイルスに使用することができる。また、さまざまな環境条件(空気中、水中、または表面)での持続性を監視するためにも使用できます。
ここで説明するプロトコルは、例として水中でのIAV生存を適用します。ヒトインフルエンザウイルスは、長期間にわたって異なる物理化学的パラメータに曝露される。35°Cの生理食塩水(35g/L NaCl)を環境モデルとして選定した9。暴露されたウイルスの残留感染力は、細胞感染を介して異なる時点で定量化される。IAV増幅の基準細胞型であるMDCK細胞を、マイクロ電極センサーでコーティングした16ウェルマイクロタイタープレート上に播種し、24時間後に暴露されたウイルスに感染させた。セルインピーダンスは15分ごとに測定され、セルインデックス(CI)と呼ばれる任意の単位として表されます。インフルエンザウイルスによって誘導される細胞変性効果は、その発症速度が細胞培養物に接種された感染性ウイルス粒子の数に直接依存し、CI減少をもたらし、続いてCIT50値として定量化される。この値は、初期CIからの50%の減少を測定するのに必要な時間(すなわち、ウイルス添加前)に対応する。いくつかの環境暴露時間について計算されたCIT50値は、CIT50値の線形回帰後のウイルスの不活性化傾きの控除を可能にする。
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Protocol
すべてのインフルエンザウイルスを適切なバイオセーフティレベルの要件(サブタイプに応じてBSL-2以上)に従って処理します。継代履歴が低いIAV株(MDCK細胞では5倍未満)を使用して、実験間の変動が少ないことを保証します。
1. 試薬および出発物質の調製
- MDCK細胞及び滅菌細胞培養培地の調製
- 10%熱不活化ウシ胎児血清(FCS)および抗生物質(100単位/mLペニシリン、100mg/mLストレプトマイシン)を添加した改変イーグル培地(MEM)でマディン・ダービー犬腎臓(MDCK)細胞を培養する。
- 解凍後、MDCK細胞に感染する前に少なくとも2倍の継代を行い、完全な回復を確実にする(ただし、細胞表現型のドリフトを避けるために30回未満の継代)。
- 7.5 x 106 MDCK細胞を含む滅菌1x MEMの30 mLを含む種子75 cm2組織培養フラスコを、加湿した5%CO2インキュベーター内で37°Cでインキュベートする。
- インピーダンス監視装置の準備
- 器具を35°Cのインキュベーターに入れ、少なくとも2時間ウォームアップさせます。
- インキュベーターの外側に配置されたコントロールユニットに接続します。
- 実験の残りの部分を開始する前に、製造元の推奨に従ってクリーニング手順に進みます。
- MDCK細胞におけるIAVストックの生産
- H1N1ウイルスを増殖および増幅するには、75 cm2組織培養フラスコに7.5 x 106 MDCK細胞をシードし、37°Cで24時間インキュベートして90%~100%のコンフルエントに達する。
- 細胞培養培地を細胞単層から75cm2フラスコにデカントする。5mLの滅菌1x PBSで細胞を洗浄する。
- PBSを除去し、5mLの1x PBSを加えて細胞を再び洗浄する。
- 1つのフラスコにコントロールとしてラベルを付け、PBSを除去してから、15mLのウイルス伝播培地(0%FCSで1x MEM)を単層に注意深く加える。このフラスコを、5%CO2で35°Cに維持したインキュベーター内でインキュベートする。伝播の3日後の比較に使用します。
- IAVストックのバイアル1本をRTで解凍し、ウイルス伝播培地(0%FCSで1x MEM)を含む1.5mLチューブでウイルスを適切な濃度に希釈します。
- 75 cm2 フラスコから 1x PBS を取り出し、希釈したウイルスを細胞単層に 1 mL 添加して、細胞あたり 1 x 10-3 または 1 x 10-4 プラーク形成単位 (pfu/細胞) の感染多重度 (MOI) で MDCK 細胞に感染させます。
- フラスコ内を15分毎に定期的に撹拌することにより、RTで45分間MDCK細胞にウイルスを吸着させる。
- 接種物を静かに除去し、1μg/mLのTPCK-トリプシン(トリプシン/L-1-トシルアミド-2-フェニルエチルクロロメチルケトン)を含むフラスコあたり15mLのウイルス増殖培地を添加し、ウイルスヘマグルチニンHA0をHA1およびHA2サブユニットに切断する(エンドソーム膜とのHA融合およびウイルスゲノムの放出に必要な事象)22。
- フラスコを35°Cおよび5%CO2 で少なくとも3日間インキュベートして、ウイルスを複製する。
- MDCK細胞を顕微鏡下で40倍の倍率で観察し、細胞に対する細胞変性効果(CPE)を探す(細胞対照フラスコと比較することによって)。CPEが完全でない場合(すなわち、細胞の約80%が基質から剥離している場合)、フラスコをさらに24時間インキュベーターに戻します。
- CPEが完了したら、細胞培養上清をデカントし、300 x g で10分間遠心分離して細胞破片をペレット化する。
- 清澄化した上清を15mLチューブに移し、アリコート後代ウイルスを使い捨ての滅菌極低温バイアルに移す。直ちにクライオチューブを-80°Cに置き、ウイルスを凍結させてストックする。
2. 細胞感染に適した細胞量の決定
注:すべての実験中、プレートは、パッケージの紙ラップなど、常に非静電的な面に保管してください。以下のセクション2に従って、電子マイクロタイタープレート(E-Plateとして設計)に播種する細胞の最も適切な濃度を決定します。
- MDCK細胞を75cm2フラスコに調製し、実験の24時間前に新たに分裂した細胞(約80%コンフルエント)を得た。
- 5 mL の 1x PBS で細胞を洗浄し、3 mL の 0.25% トリプシン-EDTA 溶液を加えて細胞を剥離します。
- 7 mLの新鮮な細胞培養培地を加え、トリパンブルー染色による自動細胞カウンターを用いて細胞を計数する。
- 細胞培養培地で細胞濃度を400,000細胞/mLに調整します。追加のチューブで2倍の段階希釈を行い、200,000の細胞密度を得る。100,000;50,000;25,000;12,500;6,250細胞/mLを有する。細胞の種類や増殖挙動に応じて細胞の希釈範囲を調整します。
- Eプレート(材料表)をRTで数分間放置し、マルチチャンネルピペットを使用して各ウェルに100μLの細胞培養培地を加えます。Eプレートの電極には触れないでください。
- クレードルのロックを解除し、プレートフロントエンドをインピーダンス測定器のクレードルポケットに挿入します(材料表)。インキュベーターのドアを閉めます。
- ソフトウェアを開きます。
- 「実験パターンのデフォルト設定」で、選択したクレードルを選択し、トップページをダブルクリックし、実験名を入力します。「レイアウト」をクリックし、プレートの選択した各ウェルに必要なサンプル情報を入力します。終了したら、「適用」をクリックします。「スケジュール」 | をクリックします。「ステップ」 | 「ステップを追加」。ソフトウェアは、バックグラウンドインピーダンス(CI)を測定するために1秒のステップを自動的に追加します。
- 「実行」タブの「開始/続行」をクリックします。「プロット」をクリックし、適切なウェルを選択してすべてのサンプルを追加し、次のステップに進む前にCIが-0.1~0.1であることを確認します。
- クレードルからプレートを取り外します。
- ステップ2.4の各細胞懸濁液を100 μLを重複して適切なウェルに加え、コントロールとして使用したウェルに100 μLの細胞培地を加える。E プレートを層流フードに RT で 30 分間放置して、ウェルの底部での細胞の均一な分布を可能にします。
- Eプレートをクレードルポケットに挿入します。「スケジュール」 | をクリックします。ソフトウェアに「ステップを追加」し、30分ごとに200回の繰り返しでセルを監視する値を入力します。次に、「開始/続行」を選択します。
- ソフトウェアの「プロット」ボタンをクリックして、CIデータを確認してプロットします。ウイルス感染中にまだ成長期にある細胞を得るために、プレート上に播種後24時間で静止期直前にある細胞の濃度を選択する。静止位相は、CIが最大になったときに達する。
3. CIT50 値と感染多重度の相関
- Eプレートの各ウェルに滅菌1x MEM培養培地100 μLを加える。Eプレートを35°Cで機器のクレードルポケットに挿入します。 手順 2.7 で説明したように背景を測定します。
- E プレートをクレードルから取り外します。
- 電子マイクロタイタープレートの各ウェルに新たに分割されたMDCK 細胞を3 x 104個シードし、IAV感染中に複製段階になるように、5%CO2で35°Cで24 時間増殖させる。
- MDCK細胞に、既知の6 log10 TCID50/mLの力価のH1N1ウイルスの異なる10倍希釈液を感染させ、再現性のために逆ピペッティングを使用して、以下の手順に従います。
- MDCK細胞2xをFCS(ウイルス増殖培地)を含まない100μLのMEMですすいでください。接種剤のさらなる希釈を避けるために、2回目の洗浄後にすべての培地を除去することに注意してください。
- シングルチャンネルピペットを使用して各ウェルに100 μLのウイルス懸濁液を追加します。汚染を避けるために、プレート内の左から右へ、そして上から下へ、残りのウェルを蓋で覆いながら進めます。
- プレートを35°Cで器具のクレードルポケットに挿入します。 汚染につながる可能性のある突然の動きを避けるために、優しくしてください。
- ステップ 2.10 で説明したように、少なくとも 100 時間の間、15 分ごとにセルのインピーダンスの監視を開始します。
- 測定の2サイクル(すなわち、30分)の後、「実行」タブの「一時停止」をクリックして装置を一時停止し、クレードルからEプレートを取り外します。
- 1 μg/mL の TPCK-トリプシンをウイルス増殖培地に加え、ウイルス性ヘマグルチニンを切断します。
- TPCK-トリプシンを含むウイルス増殖培地100 μLを各ウェルに加え、Eプレートをクレードルポケットに挿入します。
- 「実行」タブの「開始/続行」をクリックします。
注:ウイルス懸濁液をウイルス増殖培地に置き換えて、偽感染細胞に対応する陰性対照を作成することを忘れないでください。
4. IAV生存動態
- IAVを35°Cの生理食塩水蒸留水にさらし、細胞インピーダンス低下を測定することによって経時的な感染価を試験する。
- 蒸留水にNaClを終濃度35g/Lとなるように添加して蒸留水を調製する。900 μL の生理食塩水を 2 mL のクライオチューブに加えます。
- 生理食塩水に100 μLのウイルスストックを加え、クライオチューブをインキュベーター(35°C、5%CO2)に1時間、24時間、または48時間置きます。
- 16ウェルマイクロタイタープレート上に新たに分割したMDCK細胞100 μL(3 x 104を含む)をシードし、37°Cおよび5%CO2で24時間増殖させる。
- 逆ピペッティング法を用いて、100 μLの暴露されたウイルス(予め培養培地で10倍に希釈した)で細胞に感染させ、セクション3.4を繰り返して再現性を高める。
- セルインピーダンスを15分ごとに少なくとも100時間監視します。
5. 感染力低下の評価
- CIT50値の決定は、CIT50 値を有するウイルス誘発性細胞変性効果に起因するCI減少を定量化する。
- 「プロット」をクリックし、「すべて追加」をクリックしてすべてのサンプルを追加します。「実験情報のエクスポート」をクリックして、結果をスプレッドシートにエクスポートします。初期CIを、ばく露されたウイルスによる細胞感染の5時間後(すなわち、マイクロタイターEプレート上のMDCK細胞の播種後24時間)に測定された細胞インピーダンス値として考える。
- 初期CIからの50 %の減少を測定するのに必要な時間に対応するCIT50値を計算する。CIT50値 を計算するには、各サンプルの5hpiのCI値に注意してください。次に、スプレッドシートのインデックス関数と一致関数を使用して、CI 値が 5 hpi の CI 値の半分に等しい時点を見つけます。
- 平均不活性化傾きの計算
- 各曝露ウイルス懸濁液のCIT50 値を、異なる曝露時間(日数)で決定する。
- CIT50プロット値から線形回帰勾配を計算し、不活性化勾配と呼ばれ、CIT50.day-1で表します。
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Representative Results
異なる濃度のMDCK細胞を用いて120時間後に得られた生データを、ウェル当たり15,000〜120,000細胞から、 図1に示す。24時間後、CI測定は、30,000個の細胞を播種したウェル内の細胞がまだ増殖の指数関数的な段階にあり、この細胞濃度をさらなる実験に使用したことを示している。 図2 は、CIT50 値と感染の初期多重度との間の線形相関を示す。MDCK細胞を24時間培養し、その後、A/Paris/2590/2009 H1N1ウイルス株に異なる感染倍数で感染させる。初期CIは、感染の5時間後に測定される。
図3 は、我々の実験で用いた実験手順を示す(パネルA)。ウイルス誘発性細胞変性効果によるCI減少を示す典型的な結果をパネルBに示す。これらは、ソフトウェアによって処理された後に取得される生データです。CIT50値は 、データのエクスポート後にスプレッドシートを使用して計算されました。異なる時点でのCIT50 値の計算後、線形回帰分析により傾きの決定が可能となった(パネルC)。このようにして、各条件における各ウイルスについてウイルス不活化勾配が得られ、次いで、研究された環境において最大の安定性を有するウイルスを同定するために比較された。
図4 は、A/WSN/1933 H1N1ウイルス株に属する遺伝的骨格を有するIAV組換えウイルスと、A/New Caledonia/20/1999 H1N1ウイルス(HA-NA/NC99)のHAおよびNAの不活化勾配を示す。HAにおける非同義変異を導入して、生理食塩水中の宿主外でのウイルス粒子持続性への影響を研究した。
3連で実施された異なる実験からの平均不活化勾配を比較することによって、宿主外でのウイルス持続性に影響を及ぼすのに十分であったHA中のアミノ酸を同定することができた。不活化の傾きが低いほど、ウイルスはより安定します。一例として、HA-NA/NC99ウイルスのHAにおけるHA/F453Y置換またはHA::K147挿入は、野生型HA(平均不活化勾配が4.85CIT50/日)と比較して、平均不活化勾配をそれぞれ9.8CIT50/日および9.9CIT50/日に有意に増加させ、非常に不安定な変異体を生成した。対照的に、HA/T327A置換は、生理食塩水中の35°Cにおけるウイルス安定性に影響を及ぼさなかった(平均不活化勾配は6.6CIT50/日)。したがって、この方法論は、宿主外でのIAV生存に関与するHA糖タンパク質中のアミノ酸残基を同定するのに十分強力であった。
図1:マイクロタイターEプレートにおける細胞滴定。
MDCK細胞の段階希釈物をマイクロタイターEプレートに播種し、細胞増殖を最大100時間(30分ごとに200スイープ)モニターした。灰色の点は、重複して測定されたCIの標準偏差を表す。24時間の縦線は、記載された条件下で、3 x 104 細胞/ウェルの初期播種が感染時に約70%のコンフルエント性の培養を可能にしたことを強調している。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:CIT50値と感染の初期多重度との間の線形回帰。
各点は、感染の異なる倍数を有する細胞の感染について計算されたCIT50 値を示す。実線は線形回帰の傾き(R2 = 0.99)を表し、破線は95%信頼区間を表します。この図は、以前の出版物から修正されています21。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:不活性化勾配の決定
(a)ウイルス粒子を生理食塩水で35°Cで0、1、または2日間希釈し、CIを連続的にモニターし、細胞指数としてプロットした。(B)CIT50値を用いて定量化されたCI減少は、生データ上で垂直破線で手動で表される。各曲線は、生理食塩水に長時間曝露されたウイルスに感染した後の細胞インピーダンスの進化を表す(赤:非曝露ウイルス、黄色:24時間曝露、緑:48時間曝露、暗:偽感染細胞)。感染後5時間後に測定した初期CI(C)不活化勾配を計算するために用いたCIT50値の線形回帰。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:生理食塩水中のIAV持続性に対するHAの非同義変異の影響。
A/New Caledonia/20/1999 H1N1ウイルス由来のHAを有する再集合ウイルスの不活化勾配(置換または挿入)または変異なし(HAWT)。箱ひげ図は、平均(水平線)を中心として、暴露された各ウイルスについて得られた単一の不活化勾配(ウイルスに応じて6つまたは8つ、異なる独立した実験から計算される)の分布を示した。平均不活化勾配は、分散分析検定を用いて比較した(ns, p > 0.05, ****p < 0.0001)。Ref は、野生型 HA を持つ再集合体ウイルスに対応し、これに対して他のウイルスが比較されます。この図は、以前の出版物から修正されています21。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
RTCAはインピーダンスベースの技術で、細胞の接着、増殖、遊走、細胞毒性などの細胞特性のリアルタイムモニタリングにますます使用されています。本研究では、宿主外でのIAV生存率を評価するこの技術の能力は、ウイルスの不活化勾配を測定することによって実証される。TCID50やプラークアッセイなどの厳格な技術は、細胞生存率の客観的なリアルタイム評価に置き換えられ、ウイルスによって誘導される細胞変性効果を反映します。TCID50またはプラーク形成ユニット(pfu)と同様に、CIT50も感染の多重度と直線的に相関しています(図2)。このアプローチの限界の中で、この方法は、非細胞病原性ウイルスに感染した細胞を正確に監視することができない。
一例として、ウイルスゲノムへの新しい変異の導入は、ウイルスを強く減弱させ、その細胞病原性を低下させる可能性がある。対照的に、ここで計算された不活化の傾きは、ウイルス複製および潜在的なウイルス減衰とは無関係であり、この傾きは、同じウイルスの不活性化の異なる時点の後に測定されたCIT50 値に由来する。したがって、この不活性化プロトコルの後も細胞に感染することができるウイルス粒子は、不活性化前のウイルスと同じ複製表現型を共有すると仮定される。
コストが高いにもかかわらず、このアプローチを使用するワークロードは大幅に削減され、プロジェクトがキネティクスのパフォーマンスを必要とし、頻繁にタイムポイントを測定し、長期間にわたって行う場合に有利です。すべてのプロトコルと同様に、いくつかのステップは重要であり、操作は注意と精度で実行する必要があります。逆ピペッティングは、媒体の正確な分配を確実にするための重要なステップであり、汚染を避けるために特別な注意を払う必要があります。同様に、初期細胞量は各実験間で同じでなければならず、トリパンブルー染色による自動細胞カウンターを使用して評価されなければならない。装置によるCIのモニタリングの間、インキュベーターの開口部は可能な限り制限されるべきである。
実験中に動きが制限された状態で注意と注意が払われると、汚染リスクが低くなり、再現性が高くなります。異なるウイルス間での不活化の傾きの分布は有意に異なるため、ノンパラメトリック統計検定を使用してウイルスの持続性を比較します。平均不活化勾配は、腸溶性ウイルス、エボラウイルス、またはコロナウイルスなど、細胞培養において細胞変性効果を生じるウイルスについて計算することができ、そのウイルスは、環境条件下での持続性が現在研究されている(そしておそらく従来のウイルス学的方法を使用する)。将来的には、この方法は、異なるウイルスの複製を比較し、同時に複数の細胞株のウイルス指向性を調査し、ウイルスサイクルの特定のステップを研究するためにも使用することができる。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25%Trypsin | ThermoFisher | 25200056 | |
| 75 cm2 tissue culture flask | Falcon | 430641U | |
| E-Plate 16 (6 plates) | ACEA Biosciences, Inc | 5469830001 | E-plates are avalible in different packaging |
| FCS | Life technologies (gibco) | 10270-106 | |
| MEM 1X | Life technologies (gibco) | 31095029 | |
| PBS 1X | Life technologies (gibco) | 14040091 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life technologies (gibco) | 11548876 | |
| TPCK-Trypsin | Worthington | LS003740 | |
| xCELLigence Real-Time Cell Analysis Instrument S16 | ACEA Biosciences, Inc | 380601310 | The xCELLigence RTCA S16 instruments are available in different formats (16-well, 96-well, single or multi-plate) |
References
- Killingley, B., Nguyen-Van-Tam, J. Routes of influenza transmission. Influenza and Other Respiratory Viruses. 7, Suppl 2 42-51 (2013).
- Sooryanarain, H., Elankumaran, S. Environmental Role in Influenza Virus Outbreaks. Annual Review of Animal Biosciences. 3 (1), 347-373 (2015).
- Keeler, S. P., Dalton, M. S., Cressler, A. M., Berghaus, R. D., Stallknecht, D. E. Abiotic factors affecting the persistence of avian influenza virus in surface waters of waterfowl habitats. Applied and Environmental Microbiology. 80 (9), 2910-2917 (2014).
- Stallknecht, D. E., Kearney, M. T., Shane, S. M., Zwank, P. J. Effects of pH, temperature, and salinity on persistence of avian influenza viruses in water. Avian Diseases. 34 (2), 412-418 (1990).
- Poulson, R. L., Tompkins, S. M., Berghaus, R. D., Brown, J. D., Stallknecht, D. E. Environmental Stability of Swine and Human Pandemic Influenza Viruses in Water under Variable Conditions of Temperature, Salinity, and pH. Applied and Environmental Microbiology. 82 (13), 3721-3726 (2016).
- Zhang, G., et al. Evidence of influenza A virus RNA in Siberian lake ice. Journal of Virology. 80 (24), 12229-12235 (2006).
- Nazir, J., et al. Long-Term Study on Tenacity of Avian Influenza Viruses in Water (Distilled Water, Normal Saline, and Surface Water) at Different Temperatures. Avian Diseases. 54 (1), 720-724 (2010).
- Brown, J. D., Swayne, D. E., Cooper, R. J., Burns, R. E., Stallknecht, D. E. Persistence of H5 and H7 avian influenza viruses in water. Avian Diseases. 51, 1 Suppl 285-289 (2007).
- Dublineau, A., et al. Persistence of the 2009 pandemic influenza A (H1N1) virus in water and on non-porous surface. PLoS ONE. 6 (11), 28043 (2011).
- Titration of Influenza Viruses. Springer Nature Experiments. , Available from: https://experiments.springernature.com/articles/10.1007/978-1-4939-8678-1_4 (2020).
- Szretter, K. J., Balish, A. L., Katz, J. M. Influenza: Propagation, Quantification, and Storage. Current Protocols in Microbiology. 3 (1), 1-22 (2006).
- Gaush, C. R., Smith, T. F. Replication and Plaque Assay of Influenza Virus in an Established Line of Canine Kidney Cells. Applied Microbiology. 16 (4), 588-594 (1968).
- Witkowski, P. T., et al. Cellular impedance measurement as a new tool for poxvirus titration, antibody neutralization testing and evaluation of antiviral substances. Biochemical and Biophysical Research Communications. 401 (1), 37-41 (2010).
- Lebourgeois, S., et al. Development of a Real-Time Cell Analysis (RTCA) Method as a Fast and Accurate Method for Detecting Infectious Particles of the Adapted Strain of Hepatitis A Virus. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 335 (2018).
- Teng, Z., Kuang, X., Wang, J., Zhang, X. Real-time cell analysis--a new method for dynamic, quantitative measurement of infectious viruses and antiserum neutralizing activity. Journal of Virological Methods. 193 (2), 364-370 (2013).
- Fang, Y., Ye, P., Wang, X., Xu, X., Reisen, W. Real-time monitoring of flavivirus induced cytopathogenesis using cell electric impedance technology. Journal of Virological Methods. 173 (2), 251-258 (2011).
- Charretier, C., et al. Robust real-time cell analysis method for determining viral infectious titers during development of a viral vaccine production process. Journal of Virological Methods. 252, 57-64 (2018).
- Tian, D., et al. Real-Time Cell Analysis for Measuring Viral Cytopathogenesis and the Efficacy of Neutralizing Antibodies to the 2009 Influenza A (H1N1) Virus. PLoS ONE. 7 (2), 31965 (2012).
- Teng, Z., Kuang, X., Wang, J., Zhang, X. Real-time cell analysis--a new method for dynamic, quantitative measurement of infectious viruses and antiserum neutralizing activity. Journal of Virological Methods. 193 (2), 364-370 (2013).
- Thieulent, C. J., et al. Screening and evaluation of antiviral compounds against Equid alpha-herpesviruses using an impedance-based cellular assay. Virology. 526, 105-116 (2019).
- Labadie, T., Batéjat, C., Manuguerra, J. -C., Leclercq, I. Influenza Virus Segment Composition Influences Viral Stability in the Environment. Frontiers in Microbiology. 9, 1496 (2018).
- Wiley, D. C., Skehel, J. J. The structure and function of the hemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus. Annual Review of Biochemistry. 56, 365-394 (1987).
