Summary
Dit protocol beschrijft een dynamisch cultuursysteem om gecontroleerde grootteaggregaten van menselijke pluripotente stamcellen te produceren en differentiatie in cerebellar organoïden verder te stimuleren onder chemisch gedefinieerde en feedervrije omstandigheden met behulp van een bioreactor voor eenmalig gebruik.
Abstract
Het cerebellum speelt een cruciale rol in het onderhoud van evenwicht en motorische coördinatie, en een functioneel defect in verschillende cerebellar neuronen kan leiden tot cerebellar disfunctie. Het grootste deel van de huidige kennis over ziekte-gerelateerde neuronale fenotypes is gebaseerd op postmortem weefsels, waardoor het begrijpen van de progressie van de ziekte en ontwikkeling moeilijk. Dierlijke modellen en vereeuwigde cellijnen zijn ook gebruikt als modellen voor neurodegeneratieve aandoeningen. Ze vatten echter niet volledig de menselijke ziekte samen. Door de mens veroorzaakte pluripotente stamcellen (iPSC's) hebben een groot potentieel voor ziektemodellering en vormen een waardevolle bron voor regeneratieve benaderingen. In de afgelopen jaren verbeterde de generatie van cerebrale organoïden uit door patiënten afgeleide iPSC's de vooruitzichten voor neurodegeneratieve ziektemodellering. Echter, protocollen die grote aantallen organoïden produceren en een hoge opbrengst van volwassen neuronen in 3D-cultuursystemen ontbreken. Het gepresenteerde protocol is een nieuwe aanpak voor reproduceerbare en schaalbare generatie van menselijke iPSC-afgeleide organoïden onder chemisch gedefinieerde omstandigheden met behulp van schaalbare bioreactoren voor eenmalig gebruik, waarin organoïden een cerebellaire identiteit verwerven. De gegenereerde organoïden worden gekenmerkt door de expressie van specifieke markers op zowel mRNA- als eiwitniveau. De analyse van specifieke groepen eiwitten maakt de detectie van verschillende cerebellar celpopulaties mogelijk, waarvan de lokalisatie belangrijk is voor de evaluatie van de organoïde structuur. Organoïde cryosectioning en verdere immunostaining van organoïde plakjes worden gebruikt om de aanwezigheid van specifieke cerebellar celpopulaties en hun ruimtelijke organisatie te evalueren.
Introduction
De opkomst van menselijke pluripotente stamcellen (PSC's) is een uitstekend hulpmiddel voor regeneratieve geneeskunde en ziektemodellering, omdat deze cellen kunnen worden onderscheiden in de meeste cellijnen van het menselijk lichaam1,2. Sinds hun ontdekking is psc-differentiatie met behulp van verschillende benaderingen gemeld om verschillende ziekten te modelleren, waaronder neurodegeneratieve aandoeningen3,4,5,6.
Onlangs zijn er meldingen van 3D-culturen afgeleid van PSC's die lijken op menselijke hersenstructuren; deze worden hersenorganoïden3,7,8genoemd. De generatie van deze structuren van zowel gezonde als patiëntspecifieke PSC's biedt een waardevolle kans om menselijke ontwikkeling en neuroontwikkelingsstoornissen te modelleren. Echter, de methoden die worden gebruikt om deze goed georganiseerde cerebrale structuren te genereren zijn moeilijk toe te passen voor hun grootschalige productie. Om structuren te produceren die groot genoeg zijn om weefselmorfogenese samen te vatten zonder necrose in de organoïden, zijn protocollen afhankelijk van de initiële neurale inzet in statische omstandigheden, gevolgd door inkapseling in hydrogels en de daaropvolgende cultuur in dynamische systemen3. Dergelijke benaderingen kunnen echter de potentiële opschaaring van de organoïdeproductie beperken. Hoewel er inspanningen zijn geleverd om psc-differentiatie rechtstreeks naar specifieke regio's van het centrale zenuwstelsel, met inbegrip van corticale, striatale, midbrain, en ruggenmerg neuronen9,10,11,12, de generatie van specifieke hersengebieden in dynamische omstandigheden is nog steeds een uitdaging. In het bijzonder, de generatie van volwassen cerebellar neuronen in 3D-structuren moet nog worden beschreven. Muguruma et al. pionierde de generatie van cultuuromstandigheden die vroege cerebellar ontwikkeling13 recapituleren en rapporteerde onlangs een protocol dat het mogelijk maakt voor menselijke embryonale stamcellen om een gepolariseerde structuur die doet denken aan het eerste trimester cerebellum7te genereren. Echter, de rijping van cerebellar neuronen in de gerapporteerde studies vereist de dissociatie van de organoïden, sorteren van cerebellar voorlopers, en cocultuur met feeder cellen in een monolaag cultuursysteem7,14,15,16. Daarom is de reproduceerbare generatie van de gewenste cerebellar organoïden voor ziektemodellering onder bepaalde omstandigheden nog steeds een uitdaging in verband met cultuur en feeder bron variabiliteit.
Dit protocol biedt optimale kweekomstandigheden voor 3D-expansie en efficiënte differentiatie van menselijke PSC's in cerebellar neuronen met behulp van verticale wielbioreactoren voor eenmalig gebruik (zie tabel van materialen voor specificaties), hierna bioreactoren genoemd. Bioreactoren zijn uitgerust met een grote verticale waaier, die in combinatie met een U-vormige bodem zorgt voor een meer homogene schuifverdeling in het vat, waardoor zachte, uniforme meng- en deeltjessuspensie mogelijk is met lagere agitatiesnelheden17. Met dit systeem kunnen vorm- en groottegecontroleerde celaggregaten worden verkregen, wat belangrijk is voor een meer homogene en efficiënte differentiatie. Bovendien kan een groter aantal iPSC-afgeleide organoïden op een minder moeizame manier worden gegenereerd.
Het belangrijkste kenmerk van de organoïden, die 3D meercellige structuren meestal gevormd uit stamcellen, is de zelforganisatie van verschillende celtypes die specifieke vormen vormen zoals die gezien in de menselijke morfogenese18,19,20. Daarom is organoïde morfologie een belangrijk criterium dat tijdens het differentiatieproces moet worden geëvalueerd. Cryosectioning van organoïden en verdere immunostaining van organoïde plakjes met een specifieke set antilichamen zorgen voor de ruimtelijke visualisatie van moleculaire markers om celproliferatie, differentiatie, celpopulatieidentiteit en apoptose te analyseren. Met dit protocol, door het immunostaineren van organoïde cryosections, wordt een eerste efficiënte neurale inzet waargenomen door de7e dag van differentiatie. Tijdens differentiatie worden verschillende celpopulaties met cerebellar-identiteit waargenomen. Na 35 dagen in dit dynamische systeem organiseert het cerebellar neuroepithelium zich langs een apicobasale as, met een apicale laag prolifererende voorouders en basaal gelegen postmitotische neuronen. Tijdens het rijpingsproces, van dagen 35-90 van differentiatie, kunnen verschillende soorten cerebellar neuronen worden gezien, waaronder Purkinje cellen (Calbindin+), granulecellen (PAX6+/MAP2+), Golgi cellen (Neurogranin+), unipolaire borstelcellen (TBR2+), en diepe cerebellar kernprojectie neuronen (TBR1+). Ook wordt een niet-significante hoeveelheid celdood waargenomen in de gegenereerde cerebellaire organoïden na 90 dagen in cultuur.
In dit systeem, menselijke iPSC-afgeleide organoïden rijpen in verschillende cerebellar neuronen en overleven voor maximaal 3 maanden zonder de noodzaak van dissociatie en feeder cocultuur, het verstrekken van een bron van menselijke cerebellar neuronen voor ziekte modellering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Doorgeven en onderhouden van menselijke IPSCs in monolaagcultuur
- Bereiding van platen
- Ontdooi de keldermembraanmatrix (zie Tabel van Materialen)voorraad bij 4 °C en bereid 60 μL aliquots voor. Vries de aliquots op -20 °C.
- Om de putten van een 6 putplaat te coaten, ontdooi je een aliquot van de keldermembraanmatrix op ijs. Eenmaal ontdooid voeg 60 μL toe aan 6 mL DMEM-F12. Voorzichtig resuspend door pipetting op en neer.
- Voeg 1 mL verdunde keldermembraanmatrijsoplossing toe aan elke put van een 6 putplaat en broed gedurende ten minste 1 uur bij RT voordat u passeert of bewaar maximaal 1 week bij 4 °C.
- Doorgeven van iPSC kolonies met EDTA
- Onderhoud iPSC's in monolaagcultuur in 6 putplaten in de couveuse bij 37 °C, 95% luchtvochtigheid en 5% CO2.
OPMERKING: In dit protocol werden drie verschillende menselijke iPSC-lijnen gebruikt: F002.1A.1321, menselijke episomaal iPSC-lijn (iPSC6.2)22, en commercieel verkregen iPS-DF6-9-9T.B (zie tabel met materialen). - Voordat u gaat, 15 minuten de opgeslagen platen (stap 1.1) bij kamertemperatuur (RT) uitbroeden en het mTesR1-medium(tabel 1)voorbereiden.
- Spoel de oplossing van de plaat met behulp van een serologische pipet en voeg onmiddellijk 0,5 mL mTeSR1 medium aan elke put.
- Aspirate het gebruikte medium uit de put met iPSCs en was eenmaal met behulp van 1 mL van 0,5 mM EDTA per put.
- Voeg 1 mL van 0,5 mM EDTA toe aan elke put en incubbate bij RT gedurende 5 minuten.
- Aspirate EDTA en verwijder de cellen uit de putten door voorzichtig toe te voegen mTeSR1 medium en pipetting de kolonies met behulp van een P1000 micropipet. Verzamel de cellen in een conische buis.
LET OP: Niet pipette cellen op en neer meer dan 3x. - Voeg 1 mL celsuspensie (verdund 1:4) toe aan elke put, zodat elke put 1,5 mL medium bevat nadat de celsuspensie is toegevoegd. Breng cellen terug naar de couveuse bij 5% CO2, 37 °C.
- Vervang het gemiddelde dagelijks en passage elke 3 dagen wanneer 75%-80% samenvloeiing wordt bereikt.
- Onderhoud iPSC's in monolaagcultuur in 6 putplaten in de couveuse bij 37 °C, 95% luchtvochtigheid en 5% CO2.
2. Zaaien van menselijke IPSCs in de bioreactor
- Incubate iPSCs gekweekt als monolagen in mTeSR1 aangevuld met 10 μM ROCK-remmer Y-27632 (ROCKi). Voeg 1 mL van het aangevulde medium toe aan elke put van een 6 goed weefselkweekplaat en broeder gedurende 1 uur bij 37 °C, 95% luchtvochtigheid en 5% CO2.
OPMERKING: ROCKi wordt gebruikt om gescheiden iPSC's te beschermen tegen apoptose23. - Na 1 uur incubatie, aspirate het gebruikte medium van elke put en was 1x met 1 mL van 1× PBS per put.
- Voeg 1 mL van het cellossend medium (zie Tabel van materialen)toe aan elke put van een 6 putplaat en broed gedurende 7 minuten bij 37 °C tot de cellen gemakkelijk loskomen van de putten met zacht schudden.
- Pipette het cellossingsmedium op en neer met een P1000 micropipet totdat de cellen loskomen en scheiden in enkele cellen. Voeg 2 mL van volledige celcultuurmedium aan elke put toe om enzymatische spijsvertering te inactiveren en pipette de cellen zacht in een steriele kegelbuis.
- Centrifuge op 210 × g gedurende 3 min en verwijder de supernatant.
- Resuspend de celpellet in kweekmedium (d.w.z., mTeSR1 aangevuld met 10 μM ROCKi) en tel de iPSCs met een hemocytometer met behulp van trypan blauwe kleurstof.
- Zaad 15 × 106 enkele cellen in de bioreactor (maximaal volume van 100 mL) met 60 mL mTeSR1 aangevuld met 10 μM ROCKi bij een uiteindelijke celdichtheid van 250.000 cellen/mL.
- Plaats het vat met de iPSC's in de universele basiseenheid die in de couveuse is geplaatst bij 37 °C, 95% luchtvochtigheid en 5% CO2.
OPMERKING: Het roeren van de bioreactor wordt 24 uur gehandhaafd door de universele basiseenheidsregeling in te stellen op 27 rpm om iPSC-aggregatie te bevorderen.
3. Differentiatie en rijping van door menselijke iPSC afgeleide aggregaten in cerebellaire organoïden
- Definieer de dag van het zaaien van één cel als dag 0.
- Verzamel op dag 1 1 mL van het iPSC-aggregaatmonster met behulp van een serologische pipet. Houd de bioreactor onder agitatie zoals voorheen door de universele basiseenheid bij de bioreactor te plaatsen die de aggregaten in een steriele stroom bevat voordat het monster wordt verzameld. Plaats de celsuspensie in een ultralaag bevestigingsbord 24 putplaat. Controleer of iPSC-afgeleide aggregaten worden gevormd.
- Verwerf afbeeldingen met een optische microscoop met behulp van een totale vergroting van 40x of 100x om de geaggregeerde diameter te meten.
- Meet het gebied van de aggregaten in elke afbeelding met fiji-software.
- Selecteren |Analyze Stel Metingenin op de menubalk en klik op "Gebied" en "OK".
- Selecteer "Bestand | Open" vanaf de menubalk om een opgeslagen afbeeldingsbestand te openen. Selecteer het gereedschap Lijnselectie dat in de gereedschapsbalk wordt weergegeven en maak een rechte lijn over de schaalbalk die in de afbeelding wordt weergegeven. Selecteren| Schaal instellen" vanuit de menubalk.
- Voeg in 'Bekende afstand'de uitgestrektheid van de schaalbalk van de afbeelding toe in μm. Definieer de "Eenheid van lengte" als μm. Klik op "Global" om de instellingen te behouden en "OK". Selecteer Ovale selectie op de gereedschapsbalk.
- Voor elk aggregaat het gebied afbakenen met het ovale gereedschap. Selecteren| Maatregel". Bereken hun diameter op basis van het gemeten gebied, gezien het feit dat aggregaten ongeveer bolvormig zijn met behulp van
met A als het gebied van het aggregaat.
- Wanneer de gemiddelde diameter van de aggregaten 100 μm is, vervangt u 80% van het verbruikte medium door verse mTeSR1 zonder ROCKi. Wanneer aggregaten een diameter van 200-250 μm bereiken, vervang dan al het verbruikte medium door gfCDM (tabel 1),zodat de organoïden zich onderaan de bioreactor kunnen nestelen.
OPMERKING: Als de gemiddelde totale diameter hoger is dan 350 μm, start dan niet met het differentiatieprotocol. Herhaal het zaaien van enkele cellen. Over het algemeen duurt het ongeveer 1 dag voordat het aggregaat een gemiddelde diameter van 100 μm bereikt. - Plaats de bioreactor met de aggregaten in de universele basiseenheid die in de couveuse wordt geplaatst bij 37 °C, 95% luchtvochtigheid en 5% CO2.
- Verlaag de bioreactor agitatie tot 25 rpm.
- Herhaal op dag 2 de stappen 3.2, 3.3 en 3.4 om de geaggregeerde diameter te evalueren. Voeg 30 μL FGF2 (eindconcentratie, 50 ng/mL) en 60 μL SB431542 (eindconcentratie, 10 μM) toe aan 60 mL gfCDM-differentiatiemedium (tabel 1). Vervang alle gebruikte medium uit de bioreactor door de aanvullende gfCDM. Herhaal stap 3.6.
OPMERKING: SB431542 is cruciaal om mesendodermale differentiatie te remmen, waardoor neurale differentiatie24 wordt induceren. FGF2 wordt gebruikt om de caudalisatie van het neuroepitheliale weefsel25te bevorderen. - Herhaal op dag 5 de stappen 3.2, 3.3, 3.4 en 3.8.
OPMERKING: De totale grootte moet toenemen tijdens het differentiatieprotocol. De diameter is echter alleen kritiek wanneer de differentiatie begint, omdat deze parameter de werkzaamheid van differentiatie kan beïnvloeden. - Herhaal op dag 7 de stappen 3.2, 3.3 en 3.4. Verdun FGF2 en SB431542 tot 2/3: Voeg 20 μL FGF2 en 40 μL SB431542 toe tot 60 mL gfCDM-differentiatiemedium. Vervang alle gebruikte medium uit de bioreactor door aangevuld gfCDM. Herhaal stap 3.6 en verhoog de agitatie van de bioreactor tot 30 rpm.
- Herhaal op dag 14 de stappen 3.2, 3.3 en 3.4. Voeg 60 μL FGF19 (uiteindelijke concentratie, 100 ng/mL) toe aan 60 mL gfCDM-differentiatiemedium. Vervang alle gebruikte medium uit de bioreactor door gfCDM aangevuld met FGF19. Herhaal stap 3.6.
OPMERKING: FGF19 wordt gebruikt om polarisatie van midden-achterhersenenstructuren te bevorderen26. - Herhaal op dag 18 de stappen 3.2, 3.3, 3.4 en 3.11.
- Herhaal op dag 21 de stappen 3.2, 3.3 en 3.4. Vervang alle gebruikte medium uit de bioreactor door volledig neurobasaal medium(tabel 1). Herhaal stap 3.6.
OPMERKING: Neurobasaal medium is een basaal medium dat wordt gebruikt om de neuronale celpopulatie binnen de organoïde7te behouden. - Herhaal op dag 28 de stappen 3.2, 3.3 en 3.4. Voeg 180 μL SDF1 (uiteindelijke concentratie, 300 ng/mL) toe aan 60 mL volledig neurobasaal medium. Vervang alle gebruikte medium uit de bioreactor door volledig neurobasaal medium aangevuld met SDF1. Herhaal stap 3.6.
OPMERKING: SDF1 wordt gebruikt om de organisatie van afzonderlijke cellagen27te vergemakkelijken. - Herhaal op dag 35 de stappen 3.2, 3.3 en 3.4. Vervang alle gebruikte medium uit de bioreactor door volledig BrainPhys medium(tabel 1). Herhaal stap 3.6.
OPMERKING: BrainPhys is een neuronaal medium dat synaptisch actieve neuronenondersteunt 28. - Vervang 1/3 van het totale volume om de 3 dagen door volledige BrainPhys medium tot dag 90 van differentiatie.
4. Voorbereiding van organoïden voor cryosectioning en immunohistochemie
- Verzameling van organoïden voor immunostinding
- Verzamel 1 mL monster van medium bevattende organoïden met een serologische pipet uit de bioreactor tot een conische buis van 15 mL.
OPMERKING: Organoïden moeten op verschillende tijdpunten worden verzameld om de werkzaamheid van differentiatie te evalueren, waaronder de dagen 7, 14, 21, 35, 56, 70, 80 en 90. - Verwijder de supernatant en was één keer met 1 mL van 1× PBS.
LET OP: Centrifugeer de organoïden niet. Laat de organoïden zich op de bodem van de buis vestigen door de zwaartekracht. - Verwijder de supernatant en voeg 1 mL van 4% paraformaldehyde (PFA). Incubeer bij 4 °C gedurende 30 minuten. Verwijder de verbruikte PFA en voeg 1 mL van 1× PBS toe.
- Bewaar de organoïden in 1 mL van 1× PBS bij 4 °C tot de verwerking voor cryosectioning.
LET OP: Bewaar de organoïden in 1x PBS voor niet meer dan 1 week na fixatie.
- Verzamel 1 mL monster van medium bevattende organoïden met een serologische pipet uit de bioreactor tot een conische buis van 15 mL.
- Bereiding van organoïden voor cryosectioning
- Verwijder de supernatant uit de opgeslagen organoïden. Voeg 1 mL van 15% sacharose (w/v, verdund in 1× PBS), meng goed door zachte wervelingen en incubeer 's nachts bij 4 °C.
- Bereid een oplossing voor van 15% sacharose/7,5% gelatine (Tabel 2) en houd tijdens de voorbereiding op 37 °C om te voorkomen dat gelatine stolt.
- Verwijder de 15% sacharoseoplossing, voeg 1 mL van 15% sacharose/7,5% gelatine toe aan de organoïden en meng snel door zachte wervelingen. Incubeer bij 37 °C gedurende 1 uur.
- Voeg 15% sacharose/7,5% gelatineoplossing toe aan een plastic container tot de helft van het volume. Wacht op stolling bij RT.
- Na een incubatie van 1 uur plaatst u voorzichtig een sacharose/gelatinedruppel met de organoïden op de gestolde gelatine met een Pasteurpipet. Laat stollen op RT voor ongeveer 15 minuten. Zorg ervoor dat belvorming te voorkomen.
- Plaats 15% sacharose/7,5% gelatine bovenop de organoïden totdat de container gevuld is. Wacht op volledige stolling bij RT.
- Na stolling, incubeer 20 min bij 4 °C.
- Snijd de gelatine in een kubus met daarin de organoïden in het midden en bevestig de gelatine kubus op een stuk karton met een druppel O.C.T. verbinding.
- Plaats 250 mL isopentane in een beker van 500 mL en vul een geschikte container met vloeibare stikstof. Plaats met behulp van tangen en dikke handschoenen de beker met isopentane voorzichtig op het oppervlak van vloeibare stikstof en koel de isopentane af tot -80 °C.
- Wanneer -80 °C is bereikt, plaatst u de gelatinekubus in de beker met isopentane totdat deze bevriest, waarbij de temperatuur op -80 °C blijft. Afhankelijk van de grootte van de kubus kan het 1-2 min duren.
OPMERKING: Vermijd temperaturen onder -80 °C of overmatige vriestijd, omdat dit kan leiden tot scheuren van de kubus. - Wanneer u bevroren bent, slaat u de gelatinekubus snel op -80 °C en bewaar u tot cryosectioning.
- Cryosectioning van organoïden
- Zet de cryostat aan en definieer beide temperaturen van het monster (OT) en de cryochambertemperaturen (CT) bij -25 °C.
- Wanneer beide temperaturen stabiliseren, bevestig de gelatine kubus met de organoïden op het monster met behulp van O.C.T. verbinding.
- Definieer de sectiedikte op 12 μm.
- Snijd de kubus en verzamel 3-4 plakjes op adhesiemicroscoopdia's (zie Tabel met materialen).
- Bewaar op -20 °C tot gebruik.
- Immunostaining van organoïdenplakjes
- Plaats de microscoopdia's met organoïde secties in een copling pot met 50 mL van voorverwarmde 1x PBS, met maximaal 10 dia's back-to-back.
LET OP: Alle organoïde secties moeten worden ondergedompeld met vloeistof. - Incubeer gedurende 45 minuten bij 37 °C om dia's te degelatiniseren.
- Was 1x met 50 mL van 1× PBS gedurende 5 minuten bij RT: Breng de glijbanen over op een copling pot met verse 1× PBS.
- Breng de glijbanen over op een coplingpot met 50 mL vers bereide glycine(tabel 2) en incubbate gedurende 10 minuten bij RT.
- Breng de dia's over op een copling pot met 50 mL van 0,1% triton (Tabel 2) en permeabiliseren gedurende 10 min bij RT.
- Was met 1× PBS gedurende 5 min 2x.
- Bereid de immunostaining schotel met 3 mm papier gedrenkt in 1× PBS. Droge glijbanen met een weefsel rondom de plakjes en leg ze op 3 mm papier. Bedek met een Pasteur pipet het hele oppervlak van de glijbanen met blokkeringsoplossing(tabel 2) met ~0,5 mL per dia. Incubeer voor 30 minuten bij RT.
- Verwijder overtollige blokkeren oplossing en droog de dia's met een weefsel rondom de plakjes. Plaats 50 μL van het primaire antilichaam (Tabel 3) verdund in blokkering oplossing over de secties en bedek met de coverslips. Plaats de plakjes in een eerder bereide immunostaining schotel. Incubeer 's nachts bij 4 °C.
- Breng de dia's naar een copling pot met 50 mL tbs (Tabel 2), laat de coverslips vallen, en wassen met TBST voor 5 min 3x.
- Plaats 50 μL van het secundaire antilichaam verdund in blokkerende oplossing over de secties en bedek met de coverslips. Plaats de plakjes in het eerder bereide immunostaining gerecht. Incubeer gedurende 30 minuten bij RT, beschermd tegen licht.
- Breng de dia's weer naar een copling pot en wassen met 50 mL tbs voor 5 min 3x.
- Droog de glijbanen met een weefsel rondom de plakjes en plaats de plakjes in een eerder bereide immunostaining schotel. Voeg 0,5 mL DAPI-oplossing toe over het hele oppervlak van de glijbanen met een Pasteur pipet. Incubeer voor 5 minuten op RT.
- Herhaal stap 4.4.9.
- Droog de glijbanen voorzichtig met een tissue. Voeg 50 μL montagemedium druppel voor druppel langs de glijbaan toe en laat vervolgens voorzichtig een afdekplaat op elke dia zakken, iets buigen om bellen te voorkomen.
- Plaats de microscoopdia's met organoïde secties in een copling pot met 50 mL van voorverwarmde 1x PBS, met maximaal 10 dia's back-to-back.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het protocol werd geïnitieerd door celaggregatie te bevorderen met behulp van de 0,1 L bioreactoren (figuur 1A). Eencellige inenting van de iPSCs werd uitgevoerd, met 250.000 cellen/mL gezaaid in 60 mL van medium met een agitatiesnelheid van 27 rpm. Dit werd gedefinieerd als dag 0. Na 24 uur vormden de cellen efficiënt sferoïde-vormige aggregaten (dag 1, figuur 1B),en de morfologie werd goed onderhouden tot dag 5, met een geleidelijke toename in grootte, waaruit een hoge mate van homogeniteit in aggregaatmorfologie en grootte in de tijd aantoonde. (Figuur 1B). Een kwantitatieve analyse per microscopie bracht ook een normale verdeling van de geaggregeerde afmetingen per dag 1(figuur 1C )aan het licht . De geaggregeerde grootte is een belangrijke fysische parameter die de cellen kan aanzetten om zich te onderscheiden naar verschillende afstammingen29,30. Om deze reden, op basis van de geaggregeerde grootte gemeld in eerdere studies om een efficiënte neurale31,,32 en cerebellar inzet21induceren , de gegenereerde aggregaten werden gehandhaafd in mTeSR1 medium op 25 rpm totdat ze de gewenste diameter bereikt voordat u differentiatie (~ 200 μm). Op dag 2 bedroeg de gemiddelde diameter 221,0 ± 54,4 μm (gemiddelde ± SD) voor de F002.1A.13-cellijn en 212,1 ± 42,1 μm voor de iPSC6.2-cellijn. Als zodanig bereikten beide cellijnen de optimale geaggregeerde grootte op dit momentpunt(figuur 1C).
Het definiëren van de dag waarop het zaaien van iPSCs werd uitgevoerd als dag 0, op dag 2, na het bereiken van de gewenste geaggregeerde diameter, neurale inzet werd geïnduceerd door gelijktijdig gebruik van SB431542, FGF2, en insuline, het bevorderen van neuroectodermale differentiatie, evenals een matige caudalisatie die nodig is voor mid-hindbrain patroon. Daarna werden FGF19 en SDF1 toegevoegd aan de cultuur op respectievelijk dagen 14 en 28, om de generatie van verschillende cerebellar progenators te bevorderen. Voor de eerste dagen van neurale inductie werd een rotatiesnelheid van 25 rpm gebruikt, die na 7 dagen werd verhoogd tot 30 rpm om de accumulatie en samenklonteren van grotere aggregaten te voorkomen(figuur 2A). Tijdens differentiatie vertoonden organoïden een meer uitgesproken epithelisatie vergelijkbaar met neurale buisachtige structuren met luminale ruimte(figuur 2B). Bovendien toonde de evaluatie van de verdeling van de organoïdediameter een homogene grootteverdeling aan tijdens de initiële cerebellar-verbintenis tot dag 14 (figuur 2B).
Immunofluorescentieanalyse ondersteunt dat een efficiënte neurale inzet van de iPSC-afgeleide organoïden al bereikt is op dag 7 van differentiatie na toevoeging van FGF2 en SB431542. De cryosections van organoïden onthulden vele structuren die doen denken aan de neurale buiskleuring voor PAX6 en NESTIN, waarbij de meeste cellen in de organoïden die voorloperstenmerkten NESTIN uitdrukken op dag 7 en 14 van differentiatie(figuur 2C). Daarna bevorderden FGF19 en SDF1 de generatie van continu voortschlevende voorloperlagen (PAX6+) en werd een efficiënte neuronale differentiatie bereikt, zoals blijkt uit de expressie van TUJ1, neuron-specifieke klasse III bèta-tubuline, met dagen 21 en 35 (Figuur 2C). Bovendien werd ook een efficiënte cerebellar differentiatie waargenomen na 21 dagen in de 0.1 L VW bioreactoren, aangetoond door de aanwezigheid van twee verschillende celpopulaties: granulaatcelvererzettei (BARLH1+ cellen, figuur 3A), en Purkinje celvererverlopers (OLIG2+ cellen, figuur 3B). Na 35 dagen in cultuur, verschillende cel populaties binnen de organoïden bleek te zijn georganiseerd in verschillende lagen. Verschillende platte ovale structuren binnen de organoïden werden waargenomen met BARHL1+ dorsale cerebellar progenitors als een continue laag aan de oppervlakkige kant van de organoïde(figuur 3C,D) en SOX2+ in het luminale gebied van deze ovale structuren(Figuur 3D). Bovendien, TUJ1+ pasgeboren neuronen leek te migreren naar het oppervlak, het herstel van de radiale uitlijning op het buitenoppervlak van de organoïde (Figuur 3E).
Na de generatie cerebellar voorlopers werd verdere rijping bevorderd met BrainPhys medium28 aangevuld met neurotrofe factoren BDNF en GDNF. Immunofluorescentie kleuring van organoïde cryosections werd gebruikt om verschillende subtypes van cerebellar neuronen te detecteren. Purkinje cellen, GABAergic neuronen uitdrukken van de calcium-bindende eiwit calbindin (CALB, Figuur 3F), werden ontdekt in de cerebellaire organoïden na de rijping protocol. Bovendien werd een ander belangrijk cerebellar neuronale type, granulaatcellen, geïdentificeerd als een subset van cellen coexpressing PAX6 en MAP2 (Figuur 3G). Interessant is dat een pool van PAX6+ voorlopers die MAP2 niet uitdrukken, werd gehandhaafd tot 80 dagen van differentiatie. Andere soorten cerebellaire neuronen werden ook gedetecteerd, met inbegrip van unipolaire borstelcellen uitdrukken TBR2(Figuur 3H), en diepe cerebellar kernenprojectie neuronen uitdrukken TBR1 (Figuur 3I). Naast efficiënte cerebellaire differentiatie en rijping, dit 3D dynamische cultuursysteem met behulp van de PBS 0.1 L VW bioreactoren toegestaan organoïden levensvatbaar te blijven voor maximaal 90 dagen, zonder significante celdood en necrose (Figuur 3J).
Figuur 1: Generatie van aggregaten met groottegecontroleerde aggregaten met schaalbare bioreactoren. (A) Ontwerpkenmerken van de bioreactor. (B) Fotomicrograaf Brightfield met aggregaten van twee verschillende iPSC-lijnen op dag 1, 2 en 5. Schaalbalk = 100 μm. (C) De grootteverdeling van drijvende aggregaten van verschillende iPSC-lijnen in de bioreactoren. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Generatie van menselijke iPSC-afgeleide organoïden met behulp van 0,1 L bioreactoren. aA) Schematische representatie van de cultuurprocedure om differentiatie van iPSC's op cerebellaire organoïden te veroorzaken. Cellen werden gezaaid met een dichtheid van 250.000 cellen /mL en een agitatiesnelheid van 27 rpm werd gebruikt om celaggregatie te bevorderen. Tijdens de eerste dagen van differentiatie werden aggregaten gehandhaafd bij een agitatiesnelheid van 25 tpm. Daarna, om de accumulatie van grotere aggregaten te vermijden, werd de agitatiesnelheid verhoogd tot 30 tpm. (B) Karakterisering van organoïde vorm en grootte. Brightfield fotomicrografen met iPSC-afgeleide organoïden tijdens cerebellar differentiatie in de 0.1 L VW bioreactoren. Schaalbalk = 100 μm. De verdeling van organoïde diameters toont aan dat de cultuur homogene organoïden maten onderhouden langs de differentiatie protocol. (C) Efficiënte neurale inductie in iPSC-afgeleide organoïden. Immunofluorescentie voor NESTIN, PAX6 en TUJ1 tijdens cerebellar differentiatie. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Efficiënte cerebellaire differentiatie en rijping in menselijke iPSC-afgeleide organoïden. (A-E) Efficiënte cerebellar inzet. Immunostaining analyse voor BARHL1, SOX2, OLIG2, NCAD en TUJ1 markers op aangegeven tijdpunten van het cerebellar differentiatie protocol. (F-I) Efficiënte rijping van menselijke iPSC-afgeleide cerebellar organoïden. Immunofluorescentie met verschillende soorten cerebellaire neuronen, waaronder Purkinje cellen (CALB, F), granulecellen (PAX6 en MAP2, G), unipolaire borstelcellen (TBR2) en diepe cerebellaire kernenprojecties neuronen (TBR1). (J) Hoge cel levensvatbaarheid na cerebellar rijping. Levend/dood (calcein-AM, groene en propidium jodide, rode) kleuring van organoïden toonde een hoge cel levensvatbaarheid en geen bewijs van necrotische gebieden na 80 dagen in de bioreactoren. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Mediavoorbereiding |
mTeSR1 Eindvolume: 500 mL |
1. Dooi mTeSR1 5× supplement bij kamertemperatuur (RT) of bij 4 °C 's nachts en meng met basaal medium 2. Bewaar het volledige mTeSR1-medium tot 2 weken bij 4 °C of bereid 40 mL aliquots voor en bewaar bij -20 °C 3. Prewarm complete mTeSR1 bij RT voor gebruik |
|
gfCDM (groeifactorvrij chemisch gedefinieerd medium) Eindvolume: 60 mL |
30 mL Ham's F12 30 mL IMDM 600 μL chemisch gedefinieerd lipidenconcentraat (1 % v/v) 2,4 μL monothioglycerol (450 μM) 30 μL apo-transferrine (voorraadoplossing bij 30 mg/mL in water, eindconcentratie: 15 μg/mL) 300 mg kristallisatie-gezuiverde BSA (5 mg/mL) 42 μL insuline (voorraadconcentratie bij 10 mg/mL, eindconcentratie: 7 μg/mL) 300 μL P/S (0,5% v/v, 50 U/ml penicilline/50 μg/ml streptomycine) |
|
|
Neurobasaal Eindvolume: 60 mL |
60 mL neurobasaal medium 600 μL N2 supplement 600 μL Glutamax I 300 μL P/S (0,5 % v/v). |
|
|
Complete BrainPhys Eindvolume: 60 mL |
60mL BrainPhys 1.2 mL NeuroCult SM1 Neuronal Supplement 600 μL N2 Supplement 12 μL BDNF (eindconcentratie: 20 ng/mL) 12 μL GDNF (eindconcentratie: 20 ng/mL) 300 μL Dibutyryl-cAMP (voorraadconcentratie: 100 mg/mL in water, eindconcentratie: 1 mM) 42 μL ascorbinezuur (voorraadconcentratie: 50 μg/mL in water, eindconcentratie: 200 nM) |
|
| Voorraadoplossingen van groeifactoren en kleine moleculen |
Basisfiblastgroeifactor (bFGF/FGF2) Voorraadconcentratie: 100 μg/mL |
1. Reconstrueren in 5 mM Tris, pH 7.6, bij een concentratie van 10 mg/mL 2. Verdun met 0,1 % BSA in PBS (v/v) tot een eindvoorraadconcentratie van 100 μg/mL |
|
Stromal cel-afgeleide factor 1 (SDF1) Voorraadconcentratie: 100 μg/mL |
1. Reconstrueren in water bij een concentratie van 10 mg/mL 2. Verdun met 0,1 % BSA (v/v) in PBS tot een uiteindelijke voorraadconcentratie van 100 μg/mL. |
|
|
Hersenen afgeleide neurotrofe factor (BDNF) Voorraadconcentratie: 100 μg/mL |
||
|
Gliacel-afgeleide neurotrofe factor (GDNF) Voorraadconcentratie: 100 μg/mL |
||
|
Fibroblast groeifactor 19 (FGF19) Voorraadconcentratie: 100 μg/mL |
1. Reconstrueren in natriumfosfaat van 5 mM, pH 7.4, bij een concentratie van 10 mg/mL 2. Verdun met 0,1 % BSA in PBS (v/v) tot een eindvoorraadconcentratie van 100 μg/mL |
|
|
ROCK-remmer Y-27632 Voorraadconcentratie: 10mM |
Reconstitueer in DMSO bij een concentratie van 10 mM. | |
|
SB431542 Voorraadconcentratie: 10mM |
||
|
Insuline Voorraadconcentratie: 10 mg/mL |
1. Reconstrueren 10 mg insuline in 300 μL van 10 mM NaOH 2. Voeg voorzichtig 1 M NaOH toe totdat de oplossing duidelijk transparant wordt 3. Vul tot 1 mL met steriel water. |
Tabel 1: Voorraadoplossingen en mediavoorbereiding. Vermeld zijn alle componenten en volumes die worden gebruikt om media voor te bereiden op het iPSCs-onderhouds- en differentiatieprotocol, evenals voorraadoplossingen van groeifactoren en kleine moleculen. Voor voorraadoplossingen worden alle voorraadconcentratie en protocollen voor reconstitutie vermeld.
|
Gelatine/Sacharose Eindconcentratie: 7,5%/15% w/w |
1. Weeg 15 g sacharose en 7,5 g gelatine af in een steriele Schott-glazen fles en meng goed 2. Verwarm de PBS 1× voor op 65 °C 3. Voeg voorverwarmde PBS 1× toe aan een eindgewicht van 100 g en meng goed 4. Plaats de Schott Glasfles in een verwarmingsplaat op 65 °C en schud tot de gelatine smelt 5. Incubeer bij 37 °C totdat de oplossing stabiliseert |
|
Glycine Eindconcentratie: 0,1 M |
Voeg 0,37 g g glycine toe aan 50 mL vers bereide PBS 1×. |
|
Triton-oplossing Eindconcentratie: 0,1 % w/v |
1. Bereid een triton X-100-voorraad van 10 % voor: 5 g Triton X-100 in 50 mL PBS 1× 2. Voeg 0,5 mL Triton X-100-voorraad toe aan 50 mL PBS 1×. |
|
TBST 20 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 0,05 % w/v Tween-20 |
20 mL Tris 1 M 30 mL NaCl 5 M 5 mL Tween-20 (10 % voorraad: 5 g Tween-20 in 50 mL water) Vul tot 1 L met water. |
| Oplossing blokkeren | Voeg 5 mL foetaal runderserum (FBS, eindconcentratie: 10 % v/v) toe aan 50 mL tbs. |
| DAPI-oplossing | Voeg 15 μL DAPI-voorraadoplossing (1 mg/mL) toe aan 10 mL ontleest water |
| Mowiol Mowiol | 1. Voeg 2,4 g Mowiol toe aan 6 glycerol en schud gedurende 1 uur in een voorverwarmde plaat bij 50 °C 2. Voeg 6 mL gedestilleerd water toe en schud 2 uur 3. Voeg 12 mL Tris 200 mM (pH 8.5) toe en schud gedurende 10 minuten 4. Centrifuge op 5.000 × g gedurende 15 minuten 5. Aliquot en opslag bij -20 °C. |
Tabel 2: Oplossingen voor de bereiding van organoïden voor cryosectioning en immunostaining. Vermeld zijn alle componenten en volumes die worden gebruikt om de oplossingen voor te bereiden die worden gebruikt bij de bereiding van organoïden voor cryosectioning en immunostaining.
| Antilichaam | Gastsoorten | Verdunning |
| BARHL1 BARHL1 | Konijn | 1/500 |
| CALBINDIN CALBINDIN | Konijn | 1/500 |
| MAP2 | Muis | 1/1000 |
| N-CADHERIN | Muis | 1/1000 |
| NESTIN | Muis | 1/400 |
| OLIG2 OLIG2 | Konijn | 1/500 |
| PAX6 | Konijn | 1/400 |
| SOX2 | Muis | 1/200 |
| TBR1 TBR1 | Konijn | 1/200 |
| TBR2 TBR2 | Konijn | 1/200 |
| TUJ1 | Muis | 1/1000 |
Tabel 3: Primaire antilichamen. De primaire antilichamen, kloon en geoptimaliseerde verdunningen die worden gebruikt voor immunostaining worden vermeld.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De behoefte aan grote celaantallen en gedefinieerde kweekomstandigheden om specifieke celtypen te genereren voor toepassingen voor geneesmiddelenscreening en regeneratieve geneeskunde heeft de ontwikkeling van schaalbare cultuursystemen aanstuurd. In de afgelopen jaren hebben verschillende groepen gemeld de schaalbare generatie van neurale voorouders en functionele neuronen32,33,34, het verstrekken van aanzienlijke vooruitgang in de ontwikkeling van nieuwe modellen voor neurodegeneratieve aandoeningen. Niettemin ontbreekt de recapitulatie van enkele kritieke gebeurtenissen van de embryonale ontwikkeling nog steeds, en het behoud van de gegenereerde functionele neuronen in suspensie voor langere tijd is nog niet bereikt34. Hier gepresenteerd is een dynamisch 3D-cultuursysteem dat in staat is om iPSC-afgeleide neurale organoïden met cerebellar-identiteit te genereren en rijping verder te bevorderen in functionele cerebellarneuronen onder chemisch gedefinieerde en feedervrije omstandigheden in dynamische cultuur.
Voordat u begint met cerebellar differentiatie, is het van cruciaal belang om de kwaliteit van de menselijke iPSCs te behouden. Om de differentiatie niet in gevaar te brengen, mogen dus niet meer dan drie passages van iPSC's worden uitgevoerd, van ontdooiing tot inenting van bioreactoren. Een belangrijke stap in het differentiatieprotocol is het evalueren van de geaggregeerde grootte. De geaggregeerde grootte heeft een cruciale rol bij het induceren van differentiatie naar een specifieke cellijn29. Daarnaast is er een minimale groottedrempel die differentiatie35lijkt te bevorderen. Zoals reeds gemeld, is de optimale iPSC-afgeleide aggregaatdiameter ter bevordering van een efficiënte neurale verbintenis31,32 en cerebellardifferentiatie 21 een ~200 μm diameter.
Bovendien, in dit dynamische protocol, de agitatie snelheid gebruikt in de eerste dagen van de cultuur is van cruciaal belang om de totale diameter en neurale inductie controle. De cultuur begon bij 27 tpm, wat voldoende is om de aggregatie van iPSC's te bevorderen en de vorming van grotere aggregaten te voorkomen (diameters boven 350 μm moeten worden vermeden). De agitatie die wordt gebruikt om celaggregatie na eencellige zaaien te bevorderen, kan worden verhoogd tot 30 rpm zonder de levensvatbaarheid van de cel aan te tasten; hogere agitatiesnelheden zullen naar verwachting echter kleinere aggregaten produceren. Afhankelijk van de iPSC-lijn, 24 uur na celzaaien met 27 rpm, worden twee verschillende scenario's verwacht: de gevormde aggregaten vertonen kleinere diameters (<200 μm) of hebben een bereik van maten tussen 200-300 μm bereikt. Als aggregaten groter zijn dan 350 μm bij 24 uur na celzaaien, mag differentiatie niet worden uitgevoerd en moet het celzaaien worden herhaald, omdat de efficiëntie van de differentiatie zeer laag zal zijn. Als aggregaten kleiner zijn dan 200 μm, moet het verbruikte medium worden vervangen door iPSC-onderhoudsmedium en moet de roersnelheid worden verlaagd tot 25 rpm. Met deze aanpassing zal de totale diameter naar verwachting toenemen van dag 1 tot dag 2, waarschijnlijk als gevolg van het samenvoegen van individuele aggregaten die worden bevorderd door de afname van de agitatiesnelheid. In het geval van aggregaten met afmetingen tussen 200-300 μm moet het gebruikte medium worden vervangen door differentiatiemedium en moet neurale inductie met FGF2 worden gestart na 2 dagen in de cultuur. Op dit punt moet de agitatiesnelheid ook iets worden verminderd om overmatige celdood te voorkomen, omdat cellen gevoeliger zijn voor schuifspanning in aanwezigheid van differentiatiemedium. Bovendien kan de populatiehomogeniteit worden geanalyseerd met behulp van de variatiecoëfficiënt (CV), die de variabiliteit meet door de standaarddeviatie te correleren met het gemiddelde van de geaggregeerde diameters, volgens de vergelijking
waarin δ de standaarddeviatie van de geaggregeerde diameter en μ de gemiddelde diameter vertegenwoordigt. In dit dynamische systeem was het waargenomen gemiddelde CV 12,5 ± 3,3% (gemiddelde ± SD) voor de F002.1A.13 cellijn en 19,0 ± 0,37% voor de iPSC6.2-cellijn op dag 2. Zo moet in dit systeem een homogene groottepopulatie met een CV van minder dan 0,2 (< 20% van de variatie) worden verwacht. Na 7 dagen van differentiatie varieerde de gemiddelde totale diameter van 300-360 μm, en de agitatiesnelheid werd verhoogd tot 30 tpm om te voorkomen dat aggregaten zich aan de onderkant van de 0,1 L VW bioreactor zouden vestigen.
De differentiatie van cerebellaire organoïden tot dag 35 en de analyse van de geaggregeerde grootte in statische omstandigheden werden onlangs gemeld21. De auteurs toonden aan dat 3D-aggregaten gevormd en onderhouden in platen (bijvoorbeeld Aggrewell) tot dag 7 van differentiatie homogeen waren in grootte en vorm21. Echter, na de overdracht van de aggregaten naar ultra-lage bevestiging 6 goed cultuur platen, de aggregaten begon te variëren in grootte en morfologie21. Op dag 35 in statische omstandigheden bereikten sommige 3D-aggregaten 1.000 μm voor verschillende cellijnen, waardoor de verspreiding van voedingsstoffen en zuurstof werd beperkt. Met behulp van onze dynamische omstandigheden hebben aggregaten daarentegen niet meer dan 800 μm in diameter bereikt op dag 35, met een verbeterde massaoverdracht als gevolg van de constante agitatie van het medium dat door het verticale wiel wordt bevorderd. Bovendien werden de geaggregeerde maten gehandhaafd tot het einde van het rijpingsproces, met een geaggregeerde diameter van 646,6 ± 104,2 μm op dag 90, de langste cultuur die werd uitgevoerd in 0,1 L VW-bioreactoren.
Efficiënte cerebellar inductie werd veroorzaakt door sequentiële toevoeging van SB431542, FGF2, FGF19 en SDF1 in dit 3D dynamische systeem. Het protocol begint met de combinatie van SB431542, een transformerende groeifactor bèta (TGF-ß)-receptorblokker die mesendodermale differentiatie remt, en FGF2, wat een groot effect heeft op de caudalisatie van neuroepithelial weefsel25. Daarom is de toevoeging van deze twee moleculen tijdens de eerste dagen van de cultuur essentieel om de celdifferentiatie te bevorderen naar het midden van het achterbrein, het gebied dat aanleiding geeft tot het cerebellarweefsel. Na de eerste inductie naar mid-hindbrain weefsel, is het noodzakelijk om FGF19 toe te voegen voor het bevorderen van de spontane generatie van mid-hindbrain structuren met dorsale-ventrale polariteit, evenals de generatie van verschillende cerebellar progenitors36,26. SDF1 faciliteert de organisatie van verschillende lagen cerebellar progenators, zoals te zien in de ontwikkelingsfase waarin cerebellar neurogenese optreedt27. Tot dag 35 kunnen deze moleculen de organisatie bevorderen van cerebellar organoïden die de ontwikkeling van menselijke cerebellar kunnen recapituleren, wat overeenkomt met het eerste trimester cerebellum. Na de organisatie van cerebellar voorlopers in verschillende lagen, werd een gedefinieerd neuronaal medium gebruikt om hun rijping28te bevorderen. Andere media die worden gebruikt om neuronale cellen te behouden kunnen ook worden getest, maar lagere efficiëntie wordt verwacht. Dus, in dit protocol, BrainPhys werd gebruikt om de differentiatie van cerebellar-geëngageerde cellen in cerebellar neuronen te bevorderen, omdat het is gemeld om beter na te bootsen de gezonde neuronale omgeving en ter ondersteuning van neurofysiologische activiteit van de gegenereerde neuronen28.
Met behulp van deze dynamische omstandigheden kan een efficiëntere verspreiding van voedingsstoffen, zuurstof en groeifactoren worden bereikt. Sommige beperkingen worden echter geassocieerd met de agitatie die wordt gebruikt in het differentiatieprotocol. Sommige schuifspanning kan worden geïntroduceerd door het agitatieproces, dat de overleving, proliferatie en differentiatie van cellen kan beïnvloeden. Daarom moet tijdens de rijpingsstap, waarbij de cellen gevoeliger zijn, de cultuur zorgvuldig worden gecontroleerd.
De differentiatie van cerebellar organoïden die doen denken aan menselijke embryonale cerebellar ontwikkeling is al gemeld7. Echter, verdere rijping van deze embryonale cerebellar organoïden in cerebellar neuronen met behulp van 3D-culturen blijft een uitdaging. De generatie van functionele cerebellar neuronen werd alleen bereikt door coculturing met granulaatcellen uit verschillende bronnen4,,7,15. Dit protocol met succes opgeschaald cerebellar inzet van menselijke IPSCs; Bovendien is dit het eerste protocol voor de differentiatie van verschillende cerebellar neuronen in een 3D-kweeksysteem zonder te coculeren met feedercellen. Specifiek, de volgende celtypes kunnen worden geproduceerd in onze dynamische cultuur systeem: Purkinje cellen (Calbindin+), korrelcellen (PAX6+/ MAP2+), unipolaire borstelcellen (TBR2+), en diepe cerebellar kernenprojectie neuronen (TBR1+), die werden gehandhaafd in suspensie voor zo lang als 3 maanden.
De schaalbare generatie cerebellaire organoïden is een waardevol instrument voor het bestuderen van de embryonale ontwikkeling van het cerebellum en de pathologische paden die betrokken zijn bij de degeneratie van dit orgaan. Bovendien kan high-throughput screening op moleculen die de cerebellar-functie herstellen, worden uitgevoerd met behulp van organoïden die met dit schaalbare systeem zijn verkregen. Over het algemeen voldoet deze methode aan een onvervuld protocol voor het genereren van hoogwaardige cerebellaire organoïden die belangrijk kunnen zijn voor een verscheidenheid aan biomedische toepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Auteurs YH en SJ zijn medewerkers van PBS Biotech. De auteur BL is CEO en mede-oprichter van PBS Biotech, Inc. Deze samenwerkende auteurs namen deel aan de ontwikkeling van de bioreactoren die in het manuscript werden gebruikt. Dit verandert niets aan de naleving van alle beleidsmaatregelen van het tijdschrift voor het delen van gegevens en materialen. Alle andere auteurs verklaren geen belangenconflict.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), Portugal (UIDB/04565/2020 door Programa Operacional Regional de Lisboa 2020, Project N. 007317, PD/BD/105773/2014 naar T.P.S en PD/BD/128376/2017 naar D.E.S.N.), projecten medegefinancierd door FEDER (POR Lisboa 2020—Programa Operacional Regional de Lisboa PORTUGAL 2020) en FCT door subsidie PAC-PRECISE LISBOA-01-0145-FEDER-016394 en CEREBEX Generation of Cerebellar Organoids for Ataxia Research grant LISBOA-01-0145-FEDER-029298. Er werd ook financiering ontvangen van het Horizon 2020-programma voor onderzoek en innovatie van de Europese Unie, onder het grant agreement nummer 739572— het Discoveries Centre for Regeneratieve en Precision Medicine H2020-WIDESPREAD-01-2016-2017.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3MM paper | WHA3030861 | Merck | |
| Accutase | A6964 - 500mL | Sigma | cell detachment medium |
| Anti-BARHL1 Antibody | HPA004809 | Atlas Antibodies | |
| Anti-Calbindin D-28k Antibody | CB28 | Millipore | |
| Anti-MAP2 Antibody | M4403 | Sigma | |
| Anti-N-Cadherin Antibody | 610921 | BD Transduction | |
| Anti-NESTIN Antibody | MAB1259-SP | R&D | |
| Anti-OLIG2 Antibody | MABN50 | Millipore | |
| Anti-PAX6 Antibody | PRB-278P | Covance | |
| Anti-SOX2 Antibody | MAB2018 | R&D | |
| Anti-TBR1 Antibody | AB2261 | Millipore | |
| Anti-TBR2 Antibody | ab183991 | Abcam | |
| Anti-TUJ1 Antibody | 801213 | Biolegend | |
| Apo-transferrin | T1147 | Sigma | |
| BrainPhys Neuronal Medium N2-A & SM1 Kit | 5793 - 500mL | Stem cell tecnhnologies | |
| Chemically defined lipid concentrate | 11905031 | ThermoFisher | |
| Coverslips 24x60mm | 631-1575 | VWR | |
| Crystallization-purified BSA | 5470 | Sigma | |
| DAPI | 10236276001 | Sigma | |
| Dibutyryl cAMP | SC- 201567B -500mg | Frilabo | |
| DMEM-F12 | 32500-035 | ThermoFisher | |
| Fetal bovine serum | A3840001 | ThermoFisher | |
| Gelatin from bovine skin | G9391 | Sigma | |
| Glass Copling Jar | E94 | ThermoFisher | |
| Glutamax I | 10566-016 | ThermoFisher | |
| Glycine | MB014001 | NZYtech | |
| Ham’s F12 | 21765029 | ThermoFisher | |
| Human Episomal iPSC Line | A18945 | ThermoFisher | iPSC6.2 |
| IMDM | 12440046 | ThermoFisher | |
| Insulin | 91077C | Sigma | |
| iPS DF6-9-9T.B | WiCell | ||
| Iso-pentane | PHR1661-2ML | Sigma | |
| L-Ascorbic acid | A-92902 | Sigma | |
| Matrigel | 354230 | Corning | basement membrane matrix |
| Monothioglycerol | M6154 | Sigma | |
| Mowiol | 475904 | Millipore | mounting medium |
| mTeSR1 | 85850 -500ml | Stem cell technologies | |
| N2 supplement | 17502048 | ThermoFisher | |
| Neurobasal | 12348017 | ThermoFisher | |
| Paraformaldehyde | 158127 | Sigma | |
| PBS-0.1 Single-Use Vessel | SKU: IA-0.1-D-001 | PBS Biotech | |
| PBS-MINI MagDrive Base Unit | SKU: IA-UNI-B-501 | PBS Biotech | |
| Recombinant human BDNF | 450-02 | Peprotech | |
| Recombinant human bFGF/FGF2 | 100-18B | Peprotech | |
| Recombinant human FGF19 | 100-32 | Peprotech | |
| Recombinant human GDNF | 450-10 | Peprotech | |
| Recombinant human SDF1 | 300-28A | Peprotech | |
| ROCK inhibitor Y-27632 | 72302 | Stem cell technologies | |
| SB431542 | S4317 | Sigma | |
| Sucrose | S7903 | Sigma | |
| SuperFrost Microscope slides | 12372098 | ThermoFisher | adhesion microscope slides |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | 25608-930 | VWR | |
| Tris-HCL 1M | T3038-1L | Sigma | |
| Triton X-100 | 9002-93-1 | Sigma | |
| Tween-20 | P1379 | Sigma | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | 15575020 | ThermoFisher |
References
- Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Thomson, J. A. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Ishida, Y., et al. Vulnerability of Purkinje Cells Generated from Spinocerebellar Ataxia Type 6 Patient-Derived iPSCs. Cell Reports. 17 (6), 1482-1490 (2016).
- Liu, Y., Zhang, S. C. Human stem cells as a model of motoneuron development and diseases. Annals of the New York Academy of Sciences. 1198, 192-200 (2010).
- Mariani, J., Coppola, G., Pelphrey, K. A., Howe, J. R., Vaccarino, F. M. FOXG1-Dependent Dysregulation of GABA/ Glutamate Neuron Differentiation in Autism Spectrum Disorders. Cell. 162 (2), 375-390 (2015).
- Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. Self-Organization of Polarized Cerebellar Tissue in 3D Culture of Human Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).
- Qian, X., et al. Generation of human brain region-specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor. Nature Protocols. 13 (3), 565-580 (2018).
- Aubry, L., et al. Striatal progenitors derived from human ES cells mature into DARPP32 neurons in vitro and in quinolinic acid-lesioned rats. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (43), 16707-16712 (2008).
- Gunhanlar, N., et al. A simplified protocol for differentiation of electrophysiologically mature neuronal networks from human induced pluripotent stem cells. Molecular Psychiatry. 23 (5), 1336-1344 (2018).
- Hu, B. Y., Zhang, S. C. Differentiation of spinal motor neurons from pluripotent human stem cells. Nature Protocols. 4 (9), 1295-1304 (2009).
- Jo, J., et al. Midbrain-like Organoids from Human Pluripotent Stem Cells Contain Functional Dopaminergic and Neuromelanin-Producing Neurons. Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).
- Muguruma, K., et al. Ontogeny-recapitulating generation and tissue integration of ES cell-derived Purkinje cells. Nature Neurosciences. 13 (10), 1171-1180 (2010).
- Watson, L. M., Wong, M. M. K., Vowles, J., Cowley, S. A., Becker, E. B. E. A Simplified Method for Generating Purkinje Cells from Human-Induced Pluripotent Stem Cells. The Cerebellum. 17 (4), 419-427 (2018).
- Wang, S., et al. Differentiation of human induced pluripotent stem cells to mature functional Purkinje neurons. Science Reports. 5, 9232 (2015).
- Tao, O., et al. Efficient generation of mature cerebellar Purkinje cells from mouse embryonic stem cells. Journal of Neuroscience Research. 88 (2), 234-247 (2010).
- Croughan, M. S., Giroux, D., Fang, D., Lee, B. Novel Single-Use Bioreactors for Scale-Up of Anchorage-Dependent Cell Manufacturing for Cell Therapies. Stem Cell Manufacturing. , 105-139 (2016).
- Simunovic, M., Brivanlou, A. H. Embryoids, organoids and gastruloids: new approaches to understanding embryogenesis. Development. 144 (6), 976-985 (2017).
- Lou, Y. R., Leung, A. W. Next generation organoids for biomedical research and applications. Biotechnology Advances. 36 (1), 132-149 (2018).
- Silva, T. P., et al. Design Principles for Pluripotent Stem Cell-Derived Organoid Engineering. Stem Cells International. 2019, 1-17 (2019).
- Silva, T. P., et al. Maturation of human pluripotent stem cell-derived cerebellar neurons in the absence of co-culture. Frontiers of Bioengineering and Biotechnology. , (2020).
- Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PLoS One. 6 (4), 18293 (2011).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- Smith, J. R., et al. Inhibition of Activin/Nodal signaling promotes specification of human embryonic stem cells into neuroectoderm. Developmental Biology. 313 (1), 107-117 (2008).
- Yaguchi, Y., et al. Fibroblast growth factor (FGF) gene expression in the developing cerebellum suggests multiple roles for FGF signaling during cerebellar morphogenesis and development. Developmental Dynamics. 238 (8), 2058-2072 (2008).
- Fischer, T., et al. Fgf15-mediated control of neurogenic and proneural gene expression regulates dorsal midbrain neurogenesis. Developmental Biology. 350 (2), 496-510 (2011).
- Bagri, A., et al. The chemokine SDF1 regulates migration of dentate granule cells. Development. 129 (18), 4249-4260 (2002).
- Bardy, C., et al. Neuronal medium that supports basic synaptic functions and activity of human neurons in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (20), 2725-2734 (2015).
- Bauwens, C. L., et al. Control of Human Embryonic Stem Cell Colony and Aggregate Size Heterogeneity Influences Differentiation Trajectories. Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).
- Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., McDevitt, T. C. Engineering the embryoid body microenvironment to direct embryonic stem cell differentiation. Biotechnology Progress. 25 (1), 43-51 (2009).
- Miranda, C. C., et al. Spatial and temporal control of cell aggregation efficiently directs human pluripotent stem cells towards neural commitment. Biotechnology Journal. 10 (10), 1612-1624 (2015).
- Miranda, C. C., Fernandes, T. G., Diogo, M. M., Cabral, J. M. S. Scaling up a chemically-defined aggregate-based suspension culture system for neural commitment of human pluripotent stem cells. Biotechnology Journal. 11 (12), 1628-1638 (2016).
- Bardy, J., et al. Microcarrier Suspension Cultures for High-Density Expansion and Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Neural Progenitor Cells. Tissue Engineering Part C Methods. 19 (2), 166-180 (2013).
- Rigamonti, A., et al. Large-Scale Production of Mature Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Three-Dimensional Suspension Culture System. Stem Cell Reports. 6 (6), 993-1008 (2016).
- Arora, N., et al. A process engineering approach to increase organoid yield. Development. 144 (6), 1128-1136 (2017).
- Gimeno, L., Martinez, S. Expression of chick Fgf19 and mouse Fgf15 orthologs is regulated in the developing brain by Fgf8 and Shh. Developmental Dynamics. 236 (8), 2285-2297 (2007).
