يصف هذا البروتوكول نظامًا ديناميكيًا لثقافة إنتاج مجاميع حجم متحكم فيها للخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات وزيادة تحفيز التمايز في الأعضاء الدماغية في ظل ظروف محددة كيميائيًا وخالية من التغذية باستخدام مفاعل حيوي أحادي الاستخدام.
المخيخ يلعب دورا حاسما في الحفاظ على التوازن والتنسيق الحركي, وخلل وظيفي في الخلايا العصبية المخية المختلفة يمكن أن تؤدي إلى خلل cerebellar. معظم المعرفة الحالية حول الأنماط الظاهرية العصبية المرتبطة بالأمراض تستند إلى أنسجة ما بعد الوفاة ، مما يجعل فهم تطور المرض وتطوره صعبًا. كما استخدمت النماذج الحيوانية وخطوط الخلايا الخالدة كنماذج للاضطرابات العصبية. ومع ذلك ، فإنها لا تُكَلِم تماماً بمرض الإنسان. لدى الخلايا الجذعية المتعددة القدرات التي يسببها الإنسان إمكانات كبيرة في نمذجة الأمراض وتوفر مصدراً قيماً للنُهج التجديدية. في السنوات الأخيرة، جيل organoids الدماغي من iPSCs المستمدة من المريض تحسين آفاق النمذجة الأمراض العصبية. ومع ذلك، لا توجد بروتوكولات تنتج أعداداً كبيرة من الأعضاء وغلة عالية من الخلايا العصبية الناضجة في أنظمة الثقافة ثلاثية الأبعاد. البروتوكول المقدم هو نهج جديد لتوليد قابلة للتكرار وقابلة للتطوير من الأجهزة العضوية المشتقة من iPSC البشرية في ظل ظروف محددة كيميائيا باستخدام المفاعلات الحيوية القابلة للتطوير للاستخدام الواحد ، والتي تكتسب فيها الأجهزة هوية cerebellar. وتتميز organoids ولدت من خلال التعبير عن علامات محددة على حد سواء مرنا ومستوى البروتين. تحليل مجموعات محددة من البروتينات يسمح بالكشف عن مختلف مجموعات الخلايا المخية، التي توطين مهم لتقييم بنية organoid. يستخدم البكتات العضية والمزيد من الكبت المناعي لشرائح الأعضاء لتقييم وجود مجموعات محددة من خلايا المخيخ وتنظيمها المكاني.
يمثل ظهور الخلايا الجذعية البشرية المتعددة القدرات (PSCs) أداة ممتازة للطب التجديدي وطراز الأمراض ، لأن هذه الخلايا يمكن أن تختلف في معظم أنساب الخلايا في جسم الإنسان1،2. منذ اكتشافها، PSC التمايز باستخدام نهج متنوعة وقد أفيد عن نموذج الأمراض المختلفة، بما في ذلك الاضطرابات العصبية3،4،5،6.
وفي الآونة الأخيرة، وردت تقارير عن ثقافات ثلاثية الأبعاد مستمدة من الهياكل الدماغية البشرية التي تشبه الهياكل الدماغية البشرية؛ وتسمى هذه organoids الدماغ3،7،8. ويتيح توليد هذه الهياكل من كل من اللجان الصحية الصحية الصحية الصحية والصحية الخاصة بالمريض فرصة قيّمة لوضع نماذج للتنمية البشرية والاضطرابات العصبية النمائية. ومع ذلك، من الصعب تطبيق الأساليب المستخدمة لتوليد هذه الهياكل الدماغية منظمة تنظيما جيدا لإنتاجها على نطاق واسع. لإنتاج الهياكل التي هي كبيرة بما يكفي لتكليل تكوين الأنسجة دون نخر داخل العضوية، بروتوكولات تعتمد على الالتزام العصبي الأولي في ظروف ثابتة، تليها التغليف في الهيدروجيل والثقافة اللاحقة في النظم الديناميكية3. غير أن هذه النهوج قد تحد من إمكانية زيادة الإنتاج العضوي. على الرغم من الجهود التي بذلت لتوجيه التمايز PSC لمناطق محددة من الجهاز العصبي المركزي, بما في ذلك القشرية, سترياتال, منتصف القرنين, والخلايا العصبية الحبل الشوكي9,,10,,11,12, لا يزال يشكل تحدياً توليد مناطق معينة في الدماغ في ظروف ديناميكية. على وجه الخصوص, جيل الخلايا العصبية cerebellar ناضجة في هياكل 3D لم يتم وصفها بعد. موغوروما وآخرون رائدة في توليد الظروف الثقافية التي تُستخيخ تطور المخ القريب المبكر13، وأبلغ مؤخراً عن بروتوكول يسمح للخلايا الجذعية الجنينية البشرية بتوليد بنية مستقطبة تذكرنا بأول يخسم المخيخ7في الثلث الأول من الحمل . ومع ذلك، فإن نضوج الخلايا العصبية cerebellar في الدراسات المبلغ عنها يتطلب تفكك organoids، وفرز السلف cerebellar، وزراعة نقّة مع الخلايا المغذية في نظام ثقافة أحادية الطبقة7،14،15،16. ولذلك، فإن الجيل القابل للتكرار من الأعضاء cerebellar المطلوبة للأمراض النمذجة في ظل ظروف محددة لا يزال تحديا المرتبطة الثقافة وتغذية من مصادر التغير.
يقدم هذا البروتوكول ظروف الثقافة المثلى للتوسع ثلاثي الأبعاد والتمايز الفعال للأجهزة الخاصة بشرية في الخلايا العصبية cerebellar باستخدام المفاعلات الحيوية ذات العجلات الرأسية ذات الاستخدام الواحد (انظر جدول المواد للمواصفات)، وتسمى فيما يلي المفاعلات الحيوية. وقد تم تجهيز bioreactors مع المكره الرأسي الكبير، والتي في تركيبة مع أسفل على شكل حرف U، وتوفير توزيع القص أكثر تجانسا داخل السفينة، والسماح لطيف، خلط موحد وتعليق الجسيمات مع انخفاض سرعات الانفعالات17. مع هذا النظام، يمكن الحصول على مجاميع الخلايا التي تسيطر عليها الشكل والحجم، وهو أمر مهم لتمايز أكثر تجانسا وكفاءة. وعلاوة على ذلك، يمكن توليد عدد أكبر من الأعضاء المشتقة من iPSC بطريقة أقل جاهدية.
السمة الرئيسية للعضوية، والتي هي هياكل متعددة الخلايا 3D التي تتشكل عادة من الخلايا الجذعية، هو التنظيم الذاتي لأنواع الخلايا المختلفة التي تشكل أشكال محددة مثل تلك التي ينظر إليها في morphogenesis الإنسان18،19،20. ولذلك، مورفولوجيا الجهاز هو معيار مهم لتقييمها أثناء عملية التفريق. والتبريد من organoids والمزيد من المناعة من شرائح organoid مع مجموعة محددة من الأجسام المضادة تسمح للتصور المكاني للعلامات الجزيئية لتحليل انتشار الخلايا ، والتمايز ، والهوية السكانية الخلية ، و المبرمج. مع هذا البروتوكول ، عن طريق الكبتات العضية التي تحتوي على المناعة ، لوحظ التزام عصبي أولي فعال من قبلاليوم السابع للتمايز. أثناء التمايز، لوحظ عدد من مجموعات الخلايا ذات الهوية الدماغية. بعد 35 يوما في هذا النظام الديناميكي، وsyepithelium cerebellar ينظم على طول محور picobasal، مع طبقة apical من السلفاروس المتكاثرة والخلايا العصبية ما بعد الحركة. خلال عملية النضج، من أيام 35-90 من التمايز، يمكن رؤية أنواع متميزة من الخلايا العصبية cerebellar، بما في ذلك خلايا بوركينجي (كالبيندين+)، الخلايا الحبيبية (PAX6+/ MAP2+) ، خلايا غولجي (Neurogranin+) ، خلايا فرشاة أحادي القطب (TBR2+) ، والخلايا العصبية العميقة الإسقاط النوية cerebellar (TBR1+). أيضا، لوحظت كمية غير مُهَمِّة من موت الخلايا في الأعضاء المُنشأة في المخيخ بعد 90 يوماً في الثقافة.
في هذا النظام، تنضج الأجهزة المشتقة من iPSC البشرية إلى خلايا عصبية مختلفة من المخيخ والبقاء على قيد الحياة لمدة تصل إلى 3 أشهر دون الحاجة إلى الانفصام وتربية الحيوانات المغذية، مما يوفر مصدرًا للخلايا العصبية الدماغية البشرية لنم نمستر المرض.
وقد أدت الحاجة إلى أعداد كبيرة من الخلايا وكذلك الظروف الثقافية المحددة لتوليد أنواع محددة من الخلايا لفحص الأدوية وتطبيقات الطب التجديدي إلى تطوير نظم ثقافة قابلة للتطوير. في السنوات الأخيرة, وقد أبلغت عدة مجموعات جيل قابلة للتطوير من السلف العصبية والخلايا العصبية الوظيفية32<…
The authors have nothing to disclose.
وقد دعم هذا العمل Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT)، البرتغال (UIDB/04565/2020 من خلال Programa Operacional Regional de Lisboa 2020, Project N. 007317, PD/BD/105773/2014 إلى T.P.S و PD/BD/128376/2017 إلى D.E.S.N.)، وهي مشاريع يشارك في تمويلها فيدر (POR Lisboa 2020-Programa Operacional Regional de Lisboa PORTUGAL 2020) وFCT من خلال منحة PAC-PRECISE LISBOA-01-0145-FEDER-016394 وCEREBEX جيل من Organoids Cerebellar للأبحاث Ataxia منحة لشبونة-01-0145-فيدر-029298. كما تم تلقي التمويل من برنامج الاتحاد الأوروبي للبحوث والابتكار في أفق 2020، تحت رقم اتفاقية المنح 739572 – مركز الاكتشافات للطب التجديدي والدقة H2020-واسع الانتشار-01-2016-2017.
3MM paper | WHA3030861 | Merck | |
Accutase | A6964 – 500mL | Sigma | cell detachment medium |
Anti-BARHL1 Antibody | HPA004809 | Atlas Antibodies | |
Anti-Calbindin D-28k Antibody | CB28 | Millipore | |
Anti-MAP2 Antibody | M4403 | Sigma | |
Anti-N-Cadherin Antibody | 610921 | BD Transduction | |
Anti-NESTIN Antibody | MAB1259-SP | R&D | |
Anti-OLIG2 Antibody | MABN50 | Millipore | |
Anti-PAX6 Antibody | PRB-278P | Covance | |
Anti-SOX2 Antibody | MAB2018 | R&D | |
Anti-TBR1 Antibody | AB2261 | Millipore | |
Anti-TBR2 Antibody | ab183991 | Abcam | |
Anti-TUJ1 Antibody | 801213 | Biolegend | |
Apo-transferrin | T1147 | Sigma | |
BrainPhys Neuronal Medium N2-A & SM1 Kit | 5793 – 500mL | Stem cell tecnhnologies | |
Chemically defined lipid concentrate | 11905031 | ThermoFisher | |
Coverslips 24x60mm | 631-1575 | VWR | |
Crystallization-purified BSA | 5470 | Sigma | |
DAPI | 10236276001 | Sigma | |
Dibutyryl cAMP | SC- 201567B -500mg | Frilabo | |
DMEM-F12 | 32500-035 | ThermoFisher | |
Fetal bovine serum | A3840001 | ThermoFisher | |
Gelatin from bovine skin | G9391 | Sigma | |
Glass Copling Jar | E94 | ThermoFisher | |
Glutamax I | 10566-016 | ThermoFisher | |
Glycine | MB014001 | NZYtech | |
Ham’s F12 | 21765029 | ThermoFisher | |
Human Episomal iPSC Line | A18945 | ThermoFisher | iPSC6.2 |
IMDM | 12440046 | ThermoFisher | |
Insulin | 91077C | Sigma | |
iPS DF6-9-9T.B | WiCell | ||
Iso-pentane | PHR1661-2ML | Sigma | |
L-Ascorbic acid | A-92902 | Sigma | |
Matrigel | 354230 | Corning | basement membrane matrix |
Monothioglycerol | M6154 | Sigma | |
Mowiol | 475904 | Millipore | mounting medium |
mTeSR1 | 85850 -500ml | Stem cell technologies | |
N2 supplement | 17502048 | ThermoFisher | |
Neurobasal | 12348017 | ThermoFisher | |
Paraformaldehyde | 158127 | Sigma | |
PBS-0.1 Single-Use Vessel | SKU: IA-0.1-D-001 | PBS Biotech | |
PBS-MINI MagDrive Base Unit | SKU: IA-UNI-B-501 | PBS Biotech | |
Recombinant human BDNF | 450-02 | Peprotech | |
Recombinant human bFGF/FGF2 | 100-18B | Peprotech | |
Recombinant human FGF19 | 100-32 | Peprotech | |
Recombinant human GDNF | 450-10 | Peprotech | |
Recombinant human SDF1 | 300-28A | Peprotech | |
ROCK inhibitor Y-27632 | 72302 | Stem cell technologies | |
SB431542 | S4317 | Sigma | |
Sucrose | S7903 | Sigma | |
SuperFrost Microscope slides | 12372098 | ThermoFisher | adhesion microscope slides |
Tissue-Tek O.C.T. Compound | 25608-930 | VWR | |
Tris-HCL 1M | T3038-1L | Sigma | |
Triton X-100 | 9002-93-1 | Sigma | |
Tween-20 | P1379 | Sigma | |
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | 15575020 | ThermoFisher |