Summary
Dieses Protokoll beschreibt ein dynamisches Kultursystem zur Herstellung kontrollierter Größenaggregate menschlicher pluripotenter Stammzellen und zur weiteren Stimulierung der Differenzierung in Kleinhirnorganoiden unter chemisch definierten und feederfreien Bedingungen mit einem Einweg-Bioreaktor.
Abstract
Das Kleinhirn spielt eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung des Gleichgewichts und der motorischen Koordination, und ein funktioneller Defekt in verschiedenen Kleinhirnneuronen kann eine Hirnfallfunktionsstörung auslösen. Der größte Teil des aktuellen Wissens über krankheitsbedingte neuronale Phänotypen basiert auf postmortalen Geweben, was das Verständnis von Krankheitsprogression und Entwicklung erschwert. Tiermodelle und verewigte Zelllinien wurden auch als Modelle für neurodegenerative Erkrankungen verwendet. Sie rekapitulieren jedoch nicht vollständig menschliche Krankheiten. Humaninduzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) haben ein großes Potenzial für die Krankheitsmodellierung und bieten eine wertvolle Quelle für regenerative Ansätze. In den letzten Jahren verbesserte die Erzeugung von zerebralen Organoiden aus patientenabgeleiteten iPSCs die Aussichten für die Modellierung neurodegenerativer Erkrankungen. Es fehlen jedoch Protokolle, die eine große Anzahl von Organoiden und eine hohe Ausbeute an ausgereiften Neuronen in 3D-Kultursystemen produzieren. Das vorgestellte Protokoll ist ein neuer Ansatz für die reproduzierbare und skalierbare Erzeugung von humanen iPSC-abgeleiteten Organoiden unter chemisch definierten Bedingungen unter Verwendung skalierbarer Einweg-Bioreaktoren, bei denen Organoide die Kleinhirnidentität erlangen. Die erzeugten Organoide zeichnen sich durch die Expression spezifischer Marker sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene aus. Die Analyse spezifischer Gruppen von Proteinen ermöglicht den Nachweis verschiedener Kleinhirnzellpopulationen, deren Lokalisierung für die Bewertung der organoiden Struktur wichtig ist. Organoide Kryosektionen und weitere Immunostainierung von Organoidscheiben werden verwendet, um das Vorhandensein spezifischer Kleinhirnzellpopulationen und ihre räumliche Organisation zu bewerten.
Introduction
Die Entstehung menschlicher pluripotenter Stammzellen (PSCs) stellt ein ausgezeichnetes Werkzeug für die regenerative Medizin und Krankheitsmodellierung dar, da diese Zellen in die meisten Zelllinien des menschlichenKörpers1,2unterschieden werden können. Seit ihrer Entdeckung wurde berichtet, dass die PSC-Differenzierung mit verschiedenen Ansätzen verschiedene Krankheiten modelliert, einschließlich neurodegenerativer Erkrankungen3,4,5,6.
Kürzlich gab es Berichte über 3D-Kulturen, die von PSCs abgeleitet wurden, die menschlichen zerebralen Strukturen ähneln; Diese werden Gehirnorganoide3,7,8genannt. Die Erzeugung dieser Strukturen aus gesunden und patientenspezifischen PSCs bietet eine wertvolle Gelegenheit, menschliche Entwicklung und neuroentwicklungsbezogene Störungen zu modellieren. Die Methoden zur Erzeugung dieser gut organisierten Zerebralparese sind jedoch für ihre Großproduktion nur schwer anzuwenden. Um Strukturen zu erzeugen, die groß genug sind, um die Gewebemorphogenese ohne Nekrose innerhalb der Organoide zu rekapitulieren, stützen sich Protokolle auf die anfängliche neuronale Verpflichtung unter statischen Bedingungen, gefolgt von der Verkapselung in Hydrogelen und der nachfolgenden Kultur in dynamischen Systemen3. Solche Ansätze können jedoch den potenziellen Scale-up der organoiden Produktion einschränken. Obwohl Anstrengungen unternommen wurden, um die PSC-Differenzierung auf bestimmte Regionen des zentralen Nervensystems zu lenken, einschließlich kortikaler, striataler, Mittelhirn- und Rückenmarksneuronen9,10,11,12, ist die Erzeugung spezifischer Hirnregionen unter dynamischen Bedingungen immer noch eine Herausforderung. Insbesondere die Erzeugung von reifen Kleinhirnneuronen in 3D-Strukturen muss noch beschrieben werden. Muguruma et al. leisteten Pionierarbeit bei der Erzeugung von Kulturbedingungen, die die frühe Kleinhirnentwicklung13 rekapitulieren, und berichteten kürzlich über ein Protokoll, das es menschlichen embryonalen Stammzellen ermöglicht, eine polarisierte Struktur zu erzeugen, die an das erste Trimester-Kleinhirn7erinnert. Die Reifung von Kleinhirnneuronen in den gemeldeten Studien erfordert jedoch die Dissoziation der Organoide, die Sortierung von Kleinhirnvorläufern und die Kokultur mit Feederzellen in einem monolayern Kultursystem7,14,15,16. Daher ist die reproduzierbare Erzeugung der gewünschten Kleinhirn-Organoide zur Krankheitsmodellierung unter definierten Bedingungen immer noch eine Herausforderung, die mit der Variabilität der Kultur- und Feederquelle verbunden ist.
Dieses Protokoll stellt optimale Kulturbedingungen für die 3D-Erweiterung und die effiziente Differenzierung menschlicher PSCs in Kleinhirnneuronen mithilfe von einwegvertikalen Radbioreaktoren dar (siehe Materialtabelle für Spezifikationen), im Folgenden Bioreaktoren genannt. Bioreaktoren sind mit einem großen vertikalen Laufrad ausgestattet, das in Kombination mit einem U-förmigen Boden eine homogenere Scherverteilung im Inneren des Gefäßes ermöglicht und eine schonende, gleichmäßige Mischung und Partikelaufhängung mit reduzierten Rührgeschwindigkeiten17ermöglicht. Mit diesem System können Form- und größengesteuerte Zellaggregate gewonnen werden, was für eine homogenere und effizientere Differenzierung wichtig ist. Darüber hinaus kann eine größere Anzahl von iPSC-abgeleiteten Organoiden auf weniger mühsame Weise erzeugt werden.
Das Hauptmerkmal der Organoide, die 3D-Multizellstrukturen sind, die normalerweise aus Stammzellen gebildet werden, ist die Selbstorganisation verschiedener Zelltypen, die spezifische Formen bilden, wie sie bei der menschlichen Morphogenese18,19,20zu sehen sind. Daher ist die organoide Morphologie ein wichtiges Kriterium, das während des Differenzierungsprozesses bewertet werden muss. Die Kryosektion von Organoiden und die weitere Immunfärbung von Organoidscheiben mit einem bestimmten Satz von Antikörpern ermöglichen die räumliche Visualisierung molekularer Marker zur Analyse der Zellproliferation, Differenzierung, Zellpopulationsidentität und Apoptose. Mit diesem Protokoll wird durch immunstainierende organoide Kryosektionen eine anfängliche effiziente neuronale Bindung am7. Tag der Differenzierung beobachtet. Während der Differenzierung werden mehrere Zellpopulationen mit Kleinhirnidentität beobachtet. Nach 35 Tagen in diesem dynamischen System organisiert sich das Kleinhirn-Neuroepithel entlang einer apicobasalen Achse, mit einer apikalen Schicht aus sich ausbreitenden Vorläufern und basal gelegenen postmitotischen Neuronen. Während des Reifungsprozesses sind ab den Tagen 35 bis 90 der Differenzierung verschiedene Arten von Kleinhirnneuronen zu sehen, einschließlich Purkinje-Zellen (Calbindin+), Granulatzellen (PAX6+/MAP2+), Golgi-Zellen (Neurogranin+), unipolare Pinselzellen (TBR2+) und tiefe Kleinhirn-Nuklei-Projektionsneuronen (TBR1+). Auch wird eine nicht signifikante Menge des Zelltodes in den erzeugten Kleinhirn-Organoiden nach 90 Tagen in der Kultur beobachtet.
In diesem System reifen menschliche iPSC-abgeleitete Organoide zu verschiedenen Kleinhirnneuronen und überleben bis zu 3 Monate ohne die Notwendigkeit einer Dissoziation und Feeder-Cokultur, die eine Quelle menschlicher Kleinhirnneuronen für die Krankheitsmodellierung bietet.
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Protocol
1. Passage und Aufrechterhaltung menschlicher iPSCs in der Monolayer-Kultur
- Herstellung von Platten
- Die Kellermembranmatrix (siehe Materialtabelle)bei 4 °C auftauen und 60 L-Aliquots vorbereiten. Einfrieren der Aliquots bei -20 °C.
- Um die Brunnen einer 6-Well-Platte zu beschichten, tauen Sie ein Aliquot der Kellermembranmatrix auf Eis auf. Nach dem Auftauen 60 l zu 6 ml DMEM-F12 hinzufügen. Durch Pipettieren nach oben und unten.
- Fügen Sie 1 ml verdünnte Kellermembranmatrixlösung zu jedem Brunnen einer 6-Well-Platte hinzu und brüten bei RT mindestens 1 h vor dem Passieren oder lagern Sie bei 4 °C bis zu 1 Woche.
- Passage von iPSC-Kolonien mit EDTA
- IPSCs in Monolayer-Kultur in 6 Brunnenplatten im Inkubator bei 37 °C, 95% Luftfeuchtigkeit und 5%CO2 erhalten.
HINWEIS: In diesem Protokoll wurden drei verschiedene menschliche iPSC-Leitungen verwendet: F002.1A.1321, humane episomale iPSC-Linie (iPSC6.2)22und kommerziell erhaltene iPS-DF6-9-9T.B (siehe Tabelle der Materialien). - Vor der Passierung die gelagerten Platten (Schritt 1.1) bei Raumtemperatur (RT) 15 min inkubieren und das mTesR1 Medium vorbereiten (Tabelle 1).
- Die Lösung mit einer serologischen Pipette von der Platte absaugen und sofort 0,5 ml mTeSR1-Medium zu jedem Brunnen hinzufügen.
- Das verbrauchte Medium aus dem Brunnen, der iPSCs enthält, ansaugen und einmal mit 1 ml 0,5 ml EDTA pro Brunnen waschen.
- Fügen Sie 1 ml 0,5 mM EDTA zu jedem Brunnen hinzu und inkubieren Sie bei RT für 5 min.
- Aspirieren Sie EDTA und entfernen Sie die Zellen aus den Brunnen, indem Sie sanft mTeSR1 Medium hinzufügen und die Kolonien mit einer P1000-Mikropipette pipetieren. Sammeln Sie die Zellen in einem konischen Rohr.
HINWEIS: Pipette-Zellen nicht mehr als 3x nach oben und unten. - Fügen Sie 1 ml Zellsuspension (verdünnt 1:4) zu jedem Brunnen hinzu, so dass jeder Brunnen 1,5 ml Medium enthält, nachdem die Zellsuspension hinzugefügt wurde. Geben Sie die Zellen bei 5%CO2, 37 °C in den Inkubator zurück.
- Ersetzen Sie das verbrauchte Medium täglich und die Passage alle 3 Tage, wenn 75%–80% Zusammenfluss erreicht wird.
- IPSCs in Monolayer-Kultur in 6 Brunnenplatten im Inkubator bei 37 °C, 95% Luftfeuchtigkeit und 5%CO2 erhalten.
2. Aussaat menschlicher iPSCs im Bioreaktor
- Inkubieren Sie iPSCs, die als Monolayer in mTeSR1 angebaut werden, ergänzt durch 10 M ROCK-Hemmer Y-27632 (ROCKi). 1 ml zusätzliches Medium zu jedem Brunnen von einer 6 Brunnengewebekulturplatte hinzufügen und für 1 h bei 37 °C, 95% Luftfeuchtigkeit und 5%CO2 brüten.
HINWEIS: ROCKi wird verwendet, um dissoziierte iPSCs vor Apoptose23zu schützen. - Nach 1 h Inkubation das verbrauchte Medium aus jedem Brunnen ansaugen und 1x mit 1 ml 1× PBS pro Brunnen waschen.
- 1 ml des Zellablösungsmediums (siehe Materialtabelle)zu jedem Brunnen einer 6-Well-Platte geben und bei 37 °C 7 min brüten, bis sich die Zellen mit sanftem Schütteln leicht von den Brunnen lösen.
- Pipette die Zellablösung Medium nach oben und unten mit einer P1000 Mikropipette, bis die Zellen lösen und in einzelne Zellen zu dissoziieren. Fügen Sie jeweils 2 ml komplettes Zellkulturmedium zu jedem Brunnen hinzu, um die enzymatische Verdauung zu inaktivieren und die Zellen sanft in ein steriles konisches Rohr zu pipetten.
- Zentrifuge bei 210 × g für 3 min und entfernen Sie den Überstand.
- Setzen Sie das Zellpellet im Kulturmedium (d.h. mTeSR1 ergänzt durch 10 M ROCKi) wieder auf und zählen Sie die iPSCs mit einem Hämozytometer mit Trypan-Blaufarbstoff.
- Samen 15 × 106 Einzelzellen im Bioreaktor (maximales Volumen von 100 ml) mit 60 ml mTeSR1, ergänzt mit 10 m ROCKi bei einer endg.-Zelldichte von 250.000 Zellen/ml.
- Setzen Sie das Gefäß mit den iPSCs in die universelle Basiseinheit ein, die im Inkubator bei 37 °C, 95 % Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2 platziertist.
ANMERKUNG: Das Bioreaktorrühren wird für 24 h aufrechterhalten, indem die universelle Basiseinheitssteuerung auf 27 Rpm gesetzt wird, um die iPSC-Aggregation zu fördern.
3. Differenzierung und Reifung menschlicher iPSC-abgeleiteter Aggregate in Kleinhirnorganoiden
- Definieren Sie den Tag der Einzelzellsaatierung als Tag 0.
- Sammeln Sie am ersten Tag 1 ml der iPSC-Aggregateprobe mit einer serologischen Pipette. Halten Sie den Bioreaktor wie bisher unter Rührung, indem Sie die universelle Basiseinheit mit dem Bioreaktor, der die Aggregate enthält, vor dem Sammeln der Probe in einem sterilen Fluss platzieren. Die Zellaufhängung in einer ultraniedrigen Aufsatz 24 WellPlatte. Überprüfen Sie, ob iPSC-abgeleitete Aggregate gebildet werden.
- Erfassen Sie Bilder mit einem optischen Mikroskop mit einer Gesamtvergrößerung von 40x oder 100x, um den Aggregatdurchmesser zu messen.
- Messen Sie den Bereich der Aggregate in jedem Bild mit FIJI-Software.
- Wählen Sie "Analysieren | Stellen Sie Die Messungen" aus der Menüleiste fest und klicken Sie auf "Bereich" und "OK".
- Wählen Sie "Datei | Öffnen Sie" aus der Menüleiste, um eine gespeicherte Bilddatei zu öffnen. Wählen Sie das in der Werkzeugleiste angezeigte Linienauswahlwerkzeug aus, und erstellen Sie eine gerade Linie über der im Bild dargestellten Maßstabsleiste. Wählen Sie "Analysieren | Set scale" aus der Menüleiste.
- Fügen Sie in "Known distance"die Weite des Maßstabsbalkens des Bildes in 'm' hinzu. Definieren Sie die "Längeneinheit" als 'm. Klicken Sie auf "Global", um die Einstellungen beizubehalten und "OK". Wählen Sie Ovale Auswahl in der Werkzeugleiste aus.
- Für jedes Aggregat wird der Bereich mit dem ovalen Werkzeug abgrenzt. Wählen Sie "Analysieren | Maß". Berechnen Sie ihren Durchmesser basierend auf der gemessenen Fläche, wenn man bedenkt, dass Aggregate mit
mit A als Bereich des Aggregats.
- Wenn der durchschnittliche Durchmesser der Aggregate 100 m beträgt, ersetzen Sie 80 % des verbrauchten Mediums durch frischem mTeSR1 ohne ROCKi. Wenn die Aggregate einen Durchmesser von 200–250 m erreichen, ersetzen Sie das gesamte verbrauchte Medium durch gfCDM (Tabelle 1), sodass sich die Organoide am boden des Bioreaktors absetzen können.
HINWEIS: Wenn der durchschnittliche Aggregatdurchmesser 350 m überschreitet, starten Sie das Differenzierungsprotokoll nicht. Wiederholen Sie die Aussaat einzelner Zellen. Im Allgemeinen dauert es etwa 1 Tag, bis das Aggregat einen durchschnittlichen Durchmesser von 100 m erreicht. - Legen Sie den Bioreaktor, der die Aggregate enthält, in die universelle Basiseinheit ein, die im Inkubator bei 37 °C, 95 % Luftfeuchtigkeit und 5 %CO2platziert wird.
- Verringern Sie die Bioreaktor-Agitation auf 25 Rpm.
- Wiederholen Sie am 2. Tag die Schritte 3.2, 3.3 und 3.4, um den Aggregatdurchmesser zu bewerten. Fügen Sie 30 l FGF2 (Endkonzentration, 50 ng/ml) und 60 l SB431542 (Endkonzentration, 10 m) bis 60 ml gfCDM-Differenzierungsmedium hinzu (Tabelle 1). Ersetzen Sie das gesamte verbrauchte Medium aus dem Bioreaktor durch das ergänzte gfCDM. Wiederholen Sie Schritt 3.6.
HINWEIS: SB431542 ist entscheidend, um die mesendodermale Differenzierung zu hemmen und neuronale Differenzierung24zu induzieren. FGF2 wird verwendet, um die Kaudalisierung des neuroepithelialeGewebes zufördern 25 . - Wiederholen Sie am 5. Tag die Schritte 3.2, 3.3, 3.4 und 3.8.
HINWEIS: Die Aggregatgröße sollte während des Differenzierungsprotokolls erhöht werden. Der Durchmesser ist jedoch nur kritisch, wenn die Differenzierung beginnt, da dieser Parameter die Wirksamkeit der Differenzierung beeinflussen könnte. - Wiederholen Sie am 7. Tag die Schritte 3.2, 3.3 und 3.4. FGF2 und SB431542 auf 2/3 verdünnen: Fügen Sie 20 L FGF2 und 40 l SB431542 bis 60 ml gfCDM-Differenzierungsmedium hinzu. Ersetzen Sie alle verbrauchten Mittel aus dem Bioreaktor durch ergänztes gfCDM. Wiederholen Sie Schritt 3.6 und erhöhen Sie die Bioreaktor-Agitation auf 30 Rpm.
- Wiederholen Sie am 14. Tag die Schritte 3.2, 3.3 und 3.4. Fügen Sie 60 l FGF19 (Endkonzentration, 100 ng/ml) auf 60 ml gfCDM-Differenzierungsmedium hinzu. Ersetzen Sie alle verbrauchten Mittel aus dem Bioreaktor durch gfCDM, ergänzt durch FGF19. Wiederholen Sie Schritt 3.6.
HINWEIS: FGF19 wird verwendet, um die Polarisation von Mittel-Hinterhirnstrukturen zu fördern26. - Wiederholen Sie am 18. Tag die Schritte 3.2, 3.3, 3.4 und 3.11.
- Wiederholen Sie am 21. Tag die Schritte 3.2, 3.3 und 3.4. Ersetzen Sie das gesamte verbrauchte Medium aus dem Bioreaktor durch ein komplettes neurobasales Medium (Tabelle 1). Wiederholen Sie Schritt 3.6.
HINWEIS: Neurobasales Medium ist ein Basalmedium, das verwendet wird, um die neuronale Zellpopulation innerhalb des Organoids7aufrechtzuerhalten. - Wiederholen Sie am 28. Tag die Schritte 3.2, 3.3 und 3.4. Fügen Sie 180 l SDF1 (Endkonzentration, 300 ng/ml) zu 60 ml vollständiges neurobasales Medium hinzu. Ersetzen Sie alle verbrauchten Mittel aus dem Bioreaktor durch ein komplettes neurobasales Medium, das durch SDF1 ergänzt wird. Wiederholen Sie Schritt 3.6.
HINWEIS: SDF1 wird verwendet, um die Organisation von verschiedenen Zellschichten zu erleichtern27. - Wiederholen Sie am 35. Tag die Schritte 3.2, 3.3 und 3.4. Ersetzen Sie alle verbrauchten Mittel aus dem Bioreaktor durch kompletteBrainPhys Medium (Tabelle 1). Wiederholen Sie Schritt 3.6.
HINWEIS: BrainPhys ist ein neuronales Medium, das synaptisch aktive Neuronenunterstützt 28. - Ersetzen Sie 1/3 des Gesamtvolumens alle 3 Tage durch komplette BrainPhys Medium bis Tag 90 der Differenzierung.
4. Herstellung von Organoiden für Kryosektionundierung und Immunhistochemie
- Sammlung von Organoiden zur Immunfärbung
- Sammeln Sie 1 ml Probe von Medium, das Organoide enthält, mit einer serologischen Pipette aus dem Bioreaktor zu einem 15 ml konischen Rohr.
HINWEIS: Organoide sollten zu verschiedenen Zeitpunkten gesammelt werden, um die Wirksamkeit der Differenzierung zu bewerten, einschließlich der Tage 7, 14, 21, 35, 56, 70, 80 und 90. - Den Überstand entfernen und einmal mit 1 ml 1× PBS waschen.
HINWEIS: Zentrieren Sie die Organoide nicht. Lassen Sie die Organoide am Boden des Rohres durch Schwerkraft absetzen. - Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 1 ml 4% Paraformaldehyd (PFA) hinzu. Bei 4 °C 30 min inkubieren. Entfernen Sie die verbrauchte PFA, und fügen Sie 1 ml von 1× PBS hinzu.
- Die Organoide in 1 ml 1× PBS bei 4 °C bis zur Verarbeitung zum Kryosektionen aufbewahren.
HINWEIS: Bewahren Sie die Organoide in 1x PBS nicht mehr als 1 Woche nach der Fixierung auf.
- Sammeln Sie 1 ml Probe von Medium, das Organoide enthält, mit einer serologischen Pipette aus dem Bioreaktor zu einem 15 ml konischen Rohr.
- Zubereitung von Organoiden zur Kryosektion
- Entfernen Sie den Überstand aus den gespeicherten Organoiden. 1 ml 15% Saccharose hinzufügen (w/v, in 1× PBS verdünnt), durch sanftes Wirbeln gut mischen und über Nacht bei 4 °C brüten.
- Bereiten Sie eine Lösung von 15% Saccharose/7,5% Gelatine(Tabelle 2) vor und halten Sie sie während der Zubereitung bei 37 °C, um eine Verfestigung der Gelatine zu vermeiden.
- Entfernen Sie die 15% Saccharoselösung, fügen Sie 1 ml 15% Saccharose/7,5% Gelatine zu den Organoiden hinzu und mischen Sie schnell durch sanftes Wirbeln. Bei 37 °C für 1 h inkubieren.
- Fügen Sie 15% Saccharose/7,5% Gelatinelösung in einen Kunststoffbehälter bis zur Hälfte seines Volumens. Warten Sie auf die Erstarrung bei RT.
- Nach einer 1 h Inkubation vorsichtig einen Saccharose-/Gelatinetropfen mit den Organoiden auf die erstarrte Gelatine mit einer Pasteurpipette legen. Bei RT ca. 15 min erstarren lassen. Achten Sie darauf, Blasenbildung zu vermeiden.
- 15% Saccharose/7,5% Gelatine auf die Organoide legen, bis der Behälter gefüllt ist. Warten Sie auf die vollständige Erstarrung bei RT.
- Nach erstarren 20 min bei 4 °C inkubieren.
- Die Gelatine in einen Würfel schneiden, der die Organoide in der Mitte enthält, und den Gelatinewürfel auf einem Stück Pappe mit einem Tropfen O.C.T.-Verbindung fixieren.
- 250 ml Isopentan in einen 500 ml Becher geben und einen entsprechenden Behälter mit flüssigem Stickstoff füllen. Mit Zangen und dicken Handschuhen die Tasse mit Isopentan sorgfältig auf die Oberfläche von flüssigem Stickstoff legen und das Isopentan auf -80 °C abkühlen.
- Wenn -80 °C erreicht ist, legen Sie den Gelatinewürfel in den Becher mit Isopentan, bis er gefriert, wobei die Temperatur bei -80 °C bleibt. Je nach Größe des Würfels kann es 1–2 min dauern.
HINWEIS: Vermeiden Sie Temperaturen unter -80 °C oder übermäßige Gefrierzeit, da dies zu Rissen des Würfels führen kann. - Beim Einfrieren den Gelatinewürfel schnell bei -80 °C lagern und bis zum Kryosektionen aufbewahren.
- Kryosektionierung von Organoiden
- Schalten Sie den Kryostat ein und definieren Sie sowohl Probentemperaturen (OT) als auch Kryokammertemperaturen (CT) bei -25 °C.
- Wenn sich beide Temperaturen stabilisieren, fixieren Sie den Gelatinewürfel, der die Organoide auf der Probe enthält, mit O.C.T.-Verbindung.
- Definieren Sie die Schnittdicke bei 12 m.
- Schneiden Sie den Würfel und sammeln Sie 3–4 Scheiben auf Haftmikroskop-Dias (siehe Tabelle der Materialien).
- Bei -20 °C bis zur Verwendung lagern.
- Immunostainierung von Organoidscheiben
- Legen Sie die Mikroskopschlitten mit organoiden Abschnitten in ein Copling-Glas mit 50 ml vorgewärmten 1x PBS, die bis zu 10 Dias von hinten nach hinten halten.
HINWEIS: Alle organoiden Abschnitte sollten mit Flüssigkeit untergetaucht werden. - 45 min bei 37 °C inkubieren, um Dias zu degelatinisieren.
- 1x mit 50 ml 1× PBS für 5 min bei RT waschen: Die Dias in ein Copling-Glas mit frischem 1× PBS geben.
- Die Dias in ein Copling-Glas mit 50 ml frisch zubereitetem Glycin (Tabelle 2) geben und 10 min bei RT brüten.
- Die Dias in ein Copling-Glas mit 50 ml 0,1% Triton (Tabelle 2) übertragen und 10 min bei RT permeabilisieren.
- Waschen Sie mit 1× PBS für 5 min 2x.
- Bereiten Sie die Immunostaining Schale mit 3 mm Papier in 1× PBS getränkt. Trocknen Sie mit einem Gewebe um die Scheiben herum und legen Sie sie auf 3 mm Papier. Mit einer Pasteur-Pipette die gesamte Oberfläche der Dias mit einer Blockierlösung (Tabelle 2) mit 0,5 ml pro Schlitten abdecken. 30 min bei RT inkubieren.
- Entfernen Sie überschüssige Blockierlösung und trocknen Sie die Dias mit einem Gewebe um die Scheiben herum. Den primärantikörper (Tabelle 3) in einer Blockierlösung verdünnt über die Abschnitte legen und mit den Abdeckungen abdecken. Die Scheiben in eine zuvor vorbereitete Immunostaining-Schale geben. Über Nacht bei 4 °C inkubieren.
- Die Dias in ein Copling-Glas mit 50 ml TBST (Tabelle 2)geben, die Abdeckungen fallen lassen und mit TBST für 5 min 3x waschen.
- Legen Sie 50 l des sekundären Antikörpers in einer Blockierlösung über die Abschnitte und decken Sie mit den Abdeckungen ab. Die Scheiben in die zuvor vorbereitete Immunostaining-Schale geben. 30 min bei RT inkubieren, lichtgeschützt.
- Die Dias wieder in ein Copling-Glas geben und mit 50 ml TBST für 5 min 3x waschen.
- Trocknen Sie die Rutschen mit einem Gewebe um die Scheiben herum und legen Sie die Scheiben in eine zuvor vorbereitete Immunostaining-Schale. Fügen Sie 0,5 ml DAPI-Lösung über die gesamte Oberfläche der Dias mit einer Pasteur Pipette hinzu. 5 min bei RT inkubieren.
- Wiederholen Sie Schritt 4.4.9.
- Trocknen Sie die Dias vorsichtig mit einem Gewebe. Fügen Sie 50 l Montagemedium Tropfen für Tropfen entlang der Folie hinzu und senken Sie dann vorsichtig einen Deckelschlupf auf jeden Schlitten, wobei Sie ihn leicht biegen, um Blasen zu vermeiden.
- Legen Sie die Mikroskopschlitten mit organoiden Abschnitten in ein Copling-Glas mit 50 ml vorgewärmten 1x PBS, die bis zu 10 Dias von hinten nach hinten halten.
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Representative Results
Das Protokoll wurde durch Förderung der Zellaggregation mit den 0,1 L-Bioreaktoren initiiert (Abbildung 1A). Die Einzelzellimpfung der iPSCs wurde durchgeführt, wobei 250.000 Zellen/ml in 60 ml Medium mit einer Rührgeschwindigkeit von 27 R/min gesät wurden. Dies wurde als Tag 0 definiert. Nach 24 h bildeten die Zellen effizient sphäroidförmige Aggregate (Tag 1, Abbildung 1B), und die Morphologie war bis Tag 5 gut erhalten, mit einer allmählichen Vergrößerung, was einen hohen Grad an Homogenität in der aggregierten Morphologie und Größe im Laufe der Zeit zeigte. (Abbildung 1B). Eine quantitative Analyse durch Mikroskopie ergab auch eine normale Verteilung der Aggregatgrößen nach Tag 1 (Abbildung 1C). Die Aggregatgröße ist ein wichtiger physischer Parameter, der die Zellen dazu animieren kann, sich in Richtung verschiedener Linien zu differenzieren29,30. Aus diesem Grund wurden die erzeugten Aggregate auf der Grundlage der in früheren Studien berichteten Aggregatgröße, um eine effiziente neuronale31,,32 und Kleinhirnverpflichtung21zu induzieren, in mTeSR1-Medium bei 25 Umdrehungen pro Minute gehalten, bis sie den gewünschten Durchmesser erreichten, bevor sie mit der Differenzierung begannen (200 m). Am 2. Tag betrug der durchschnittliche Durchmesser 221,0 ± 54,4 m (mittelwert ± SD) für die F002.1A.13-Zelllinie und 212,1 ± 42,1 m für die iPSC6,2-Zelllinie. Daher erreichten beide Zelllinien zu diesem Zeitpunkt die optimale Aggregatgröße (Abbildung 1C).
Die Definition des Tages, an dem die Aussaat von iPSCs als Tag 0 durchgeführt wurde, an Tag 2, nach Erreichen des gewünschten Aggregatdurchmessers, wurde die neuronale Verpflichtung durch gleichzeitige Verwendung von SB431542, FGF2 und Insulin induziert, wodurch die neuroektodermale Differenzierung sowie eine moderate Kaudalisierung, die für die Mittel-Hinterdbrain-Musterung notwendig ist, gefördert wurden. Danach wurden FGF19 und SDF1 an den Tagen 14 bzw. 28 in die Kultur aufgenommen, um die Erzeugung verschiedener Kleinhirnvorläufer zu fördern. Für die ersten Tage der neuronalen Induktion wurde eine Rotationsgeschwindigkeit von 25 Rpm verwendet, die nach 7 Tagen auf 30 Rpm erhöht wurde, um die Anhäufung und Verklumpung größerer Aggregate zu vermeiden (Abbildung 2A). Während der Differenzierung zeigten Organoide eine ausgeprägtere Epithelisierung ähnlich wie neuralröhrenartige Strukturen mit luminalem Raum (Abbildung 2B). Darüber hinaus zeigte die Auswertung der Organoiddurchmesserverteilung eine homogene Größenverteilung während der anfänglichen Kleinhirnverpflichtung bis zum 14. Tag (Abbildung 2B).
Die Immunfluoreszenzanalyse unterstützt, dass eine effiziente neuronale Bindung der iPSC-abgeleiteten Organoide bereits am 7. Tag der Differenzierung nach Zugabe von FGF2 und SB431542 erreicht wird. Die Kryosektionen von Organoiden zeigten viele Strukturen, die an die Neuralrohrfärbung für PAX6 und NESTIN erinnerten, wobei die meisten Zellen innerhalb der Organoide den Vorläufermarker NESTIN an den Tagen 7 und 14 der Differenzierung ausdrückten (Abbildung 2C). Danach förderten FGF19 und SDF1 die Erzeugung von sich ständig wuchernden Vorläuferschichten (PAX6+) und es wurde eine effiziente neuronale Differenzierung erreicht, wie die Expression von TUJ1, neuronspezifischer Klasse III Beta-Tubulin, an den Tagen 21 und 35 zeigte (Abbildung 2C). Darüber hinaus wurde eine effiziente Zerebellardifferenzierung auch nach 21 Tagen in den 0,1 L VW Bioreaktoren beobachtet, die durch das Vorhandensein von zwei verschiedenen Zellpopulationen nachgewiesen wurde: Granulatzellvorläufer (BARLH1+ Zellen, Abbildung 3A) und Purkinje-Zellvorläufer (OLIG2+ Zellen, Abbildung 3B). Nach 35 Tagen in der Kultur schienen verschiedene Zellpopulationen innerhalb der Organoide in unterschiedliche Schichten organisiert zu sein. Verschiedene flach-ovale Strukturen innerhalb der Organoide wurden mit BARHL1+ dorsalen Kleinhirnvorläufern als kontinuierliche Schicht auf der oberflächlichen Seite des Organoids beobachtet (Abbildung 3C,D) und SOX2+ im luminalen Bereich dieser ovalen Strukturen (Abbildung 3D). Darüber hinaus schienen TUJ1+ neugeborene Neuronen zur Oberfläche zu wandern und die radiale Ausrichtung auf der Außenfläche des Organoids wiederherzustellen (Abbildung 3E).
Nach der Erzeugung von Kleinhirn-Vorläufern, weitere Reifung wurde mit BrainPhys Medium28 mit neurotrophen Faktoren BDNF und GDNF ergänzt gefördert. Immunfluoreszenzfärbung von organoiden Kryosektionen wurde verwendet, um verschiedene Subtypen von Kleinhirnneuronen zu erkennen. Purkinje-Zellen, GABAerge Neuronen, die das Kalzium-bindende Protein Calbindin (CALB, Abbildung 3F) exzessither exzessither, wurden nach dem Reifungsprotokoll in den Kleinhirnorganoiden nachgewiesen. Darüber hinaus wurde ein weiterer wichtiger kleinhirnbildender neuronaler Typ, Granulatzellen, als eine Teilmenge von Zellen identifiziert, die PAX6 und MAP2 koexzisieren (Abbildung 3G). Interessanterweise wurde ein Pool von PAX6+ Vorläufern, die MAP2 nicht ausdrücken, bis zu 80 Tagen der Differenzierung unterhalten. Andere Arten von Kleinhirnneuronen wurden ebenfalls nachgewiesen, einschließlich unipolarer Pinselzellen, die TBR2 exdrücken (Abbildung 3H), und tiefe Kleinhirnkerne-Projektionsneuronen, die TBR1 exdrücken (Abbildung 3I). Neben der effizienten Zederndifferenzierung und Reifung ermöglichte dieses dynamische 3D-Kultursystem mit den PBS 0.1 L VW Bioreaktoren, dass Organoide bis zu 90 Tage ohne signifikanten Zelltod und Nekrose lebensfähig blieben(Abbildung 3J).
Abbildung 1: Erzeugung größengesteuerter Aggregate mit skalierbaren Bioreaktoren. (A) Designmerkmale des Bioreaktors. (B) Brightfield Photomicrograph zeigt Aggregate aus zwei verschiedenen iPSC-Linien an den Tagen 1, 2 und 5. Skalenbalken = 100 m. (C) Die Größenverteilung von schwimmenden Aggregaten aus verschiedenen iPSC-Linien in den Bioreaktoren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Erzeugung von humanen iPSC-abgeleiteten Organoiden mit 0,1 L-Bioreaktoren. (A) Schematische Darstellung des Kulturverfahrens zur Induziert Differenzierung von iPSCs zu Kleinhirnorganoiden. Zellen wurden mit einer Dichte von 250.000 Zellen/ml gesät und eine Rührgeschwindigkeit von 27 Rpm wurde verwendet, um die Zellaggregation zu fördern. In den ersten Tagen der Differenzierung wurden die Aggregate mit einer Rührgeschwindigkeit von 25 Umdrehungen min. gehalten. Um die Anhäufung größerer Aggregate zu vermeiden, wurde die Rührgeschwindigkeit auf 30 Umdrehungen erhöht. (B) Charakterisierung der organoiden Form und Größe. Helle Photomikroskope zeigen iPSC-abgeleitete Organoide während der Kleinhirndifferenzierung in den 0,1 L VW Bioreaktoren. Skalenbalken = 100 m. Die Verteilung der Organoiddurchmesser zeigt, dass die Kultur homogene Organoidgrößen entlang des Differenzierungsprotokolls beibehielt. (C) Effiziente neuronale Induktion in iPSC-abgeleiteten Organoiden. Immunfluoreszenz für NESTIN, PAX6 und TUJ1 während der Kleinhirndifferenzierung. Skalenbalken = 50 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Effiziente Zerebellardifferenzierung und Reifung bei humanen iPSC-abgeleiteten Organoiden. (A-E) Effizientes Kleinhirn-Engagement. Immunostaining-Analyse für BARHL1-, SOX2-, OLIG2-, NCAD- und TUJ1-Marker zu angegebenen Zeitpunkten des Zerebellar-Differenzierungsprotokolls. (F-I) Effiziente Reifung menschlicher iPSC-abgeleiteter Kleinhirn-Organoide. Immunfluoreszenz zeigt verschiedene Arten von Kleinhirnneuronen, einschließlich Purkinje-Zellen (CALB, F), Granulatzellen (PAX6 und MAP2, G), unipolare Bürstenzellen (TBR2) und tiefe Kleinhirnkernprojektionen Neuronen (TBR1). (J) Hohe Zelllebensfähigkeit nach Kleinhirnreifung. Leben/Tot (Calcein-AM, grün und Propidiumiodid, rot) Färbung von Organoiden zeigte eine hohe Zelllebensfähigkeit und keine Hinweise auf nekrotische Bereiche nach 80 Tagen in den Bioreaktoren. Skalenbalken = 50 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Medienvorbereitung |
mTeSR1 Endvolumen: 500 ml |
1. Taum mTeSR1 5× Ergänzung bei Raumtemperatur (RT) oder bei 4 °C über Nacht und mischen sie mit Basalmedium 2. Komplettes mTeSR1-Medium bei 4 °C bis zu 2 Wochen aufbewahren oder 40 ml Aliquots zubereiten und bei -20 °C lagern 3. Vorwärmen komplette mTeSR1 bei RT vor Gebrauch |
|
gfCDM (wachstumsfaktorfreies chemisch definiertes Medium) Endvolumen: 60 ml |
30 ml Schinken F12 30 ml IMDM 600 l chemisch definiertes Lipidkonzentrat (1 % v/v) 2,4 l Monothioglycerol (450 m) 30 l Apo-Transferrin (Lagerlösung bei 30 mg/ml in Wasser, Endkonzentration: 15 g/ml) 300 mg kristallisationsgereinigtes BSA (5 mg/ml) 42 l Insulin (Lagerkonzentration bei 10 mg/ml, Endkonzentration: 7 g/ml) 300 l P/S (0,5% v/v, 50 U/ml Penicillin/50 g/ml Streptomycin) |
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Neurobasal Endvolumen: 60 ml |
60 ml neurobasales Medium 600 L N2 Ergänzung 600 l Glutamax I 300 l P/S (0,5 % v/v). |
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Komplette BrainPhys Endvolumen: 60 ml |
60ml BrainPhys 1,2 ml NeuroKult SM1 Neuronal Supplement 600 L N2 Ergänzung 12 l BDNF (Endkonzentration: 20 ng/ml) 12 l GDNF (Endkonzentration: 20 ng/ml) 300 l Dibutyryl-cAMP (Lagerkonzentration: 100 mg/ml in Wasser, Endkonzentration: 1 mM) 42 l Ascorbinsäure (Lagerkonzentration: 50 g/ml in Wasser, Endkonzentration: 200 nM) |
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| Bestandslösungen von Wachstumsfaktoren und kleinen Molekülen |
Grundlegender Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF/FGF2) Lagerkonzentration: 100 g/ml |
1. Rekonstituieren in 5 mM Tris, pH 7,6, bei einer Konzentration von 10 mg/ml 2. Mit 0,1 % BSA in PBS (v/v) auf eine Endlagerkonzentration von 100 g/ml verdünnen |
|
Stromalzell-abgeleiteter Faktor 1 (SDF1) Lagerkonzentration: 100 g/ml |
1. In Wasser in einer Konzentration von 10 mg/ml rekonstituieren 2. Mit 0,1 % BSA (v/v) in PBS auf eine Endlagerkonzentration von 100 g/ml verdünnen. |
|
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Neurotropher Faktor des Gehirns (BDNF) Lagerkonzentration: 100 g/ml |
||
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Glialzellabgeleiteter neurotropher Faktor (GDNF) Lagerkonzentration: 100 g/ml |
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Fibroblasten-Wachstumsfaktor 19 (FGF19) Lagerkonzentration: 100 g/ml |
1. Rekonstituieren in 5 mM Natriumphosphat, pH 7,4, in einer Konzentration von 10 mg/ml 2. Mit 0,1 % BSA in PBS (v/v) auf eine Endlagerkonzentration von 100 g/ml verdünnen |
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ROCK-Hemmer Y-27632 Lagerkonzentration: 10mM |
In DMSO in einer Konzentration von 10 mM rekonstituieren. | |
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SB431542 Lagerkonzentration: 10mM |
||
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Insulin Lagerkonzentration: 10 mg/ml |
1. Rekonstituieren Sie 10 mg Insulin in 300 l von 10 mM NaOH 2. 1 M NaOH vorsichtig hinzufügen, bis die Lösung klar-transparent wird 3. Auf 1 ml mit sterilem Wasser füllen. |
Tabelle 1: Lagerlösungen und Medienaufbereitung. Aufgeführt sind alle Komponenten und Volumina, die zur Vorbereitung von Medien für das iPSCs-Wartungs- und Differenzierungsprotokoll verwendet werden, sowie Bestandslösungen von Wachstumsfaktoren und kleinen Molekülen. Für Aktienlösungen sind alle Bestandskonzentrationen und Rekonstitutionsprotokolle aufgeführt.
|
Gelatine/Saccharose Endkonzentration: 7,5%/15% w/w |
1. 15 g Saccharose und 7,5 g Gelatine in einer sterilen Schott Glasflasche wiegen und gut vermischen 2. PBS 1× bei 65 °C vorheizen 3. Vorgewärmte PBS 1× auf ein Endgewicht von 100 g hinzufügen und gut mischen 4. Legen Sie die Schott Glasflasche bei 65 °C in eine Heizplatte und schütteln Sie, bis die Gelatine schmilzt 5. bei 37 °C inkubieren, bis sich die Lösung stabilisiert |
|
Glycin Endkonzentration: 0,1 M |
0,37 g Glycin auf 50 ml frisch zubereiteten PBS 1× geben. |
|
Triton-Lösung Endkonzentration: 0,1 % w/v |
1. Bereiten Sie einen 10 % Triton X-100 Bestand vor: 5 g Triton X-100 in 50 ml PBS 1× 2. Fügen Sie 0,5 ml Triton X-100 Lager auf 50 ml PBS 1×. |
|
Tbst 20 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,05 % mit Tween-20 |
20 ml Tris 1 M 30 mL NaCl 5 M 5 ml Tween-20 (10 % Vorrat: 5 g Tween-20 in 50 ml Wasser) Auf 1 L mit Wasser füllen. |
| Blockieren der Lösung | 5 ml fetales Rinderserum (FBS, Endkonzentration: 10 % v/v) auf 50 ml TBST geben. |
| DAPI-Lösung | 15 L DAPI-Stammlösung (1 mg/ml) zu 10 ml gedüngtem Wasser hinzufügen |
| Mowiol | 1. 2,4 g Mowiol auf 6 g Glycerin geben und 1 h in einer vorgewärmten Platte bei 50 °C schütteln 2. 6 ml destilliertes Wasser hinzufügen und 2 h schütteln 3. 12 ml Tris 200 mM (pH 8,5) hinzufügen und 10 min schütteln 4. Zentrifuge bei 5.000 × g für 15 min 5. Aliquot und bei -20 °C lagern. |
Tabelle 2: Lösungen zur Herstellung von Organoiden zur Kryosektionierung und Immunfärbung. Aufgelistet sind alle Komponenten und Volumina, die zur Herstellung der Lösungen verwendet werden, die bei der Herstellung von Organoiden für Kryosektionen und Immunfärbung verwendet werden.
| Antikörper | Wirtsarten | Verdünnung |
| BARHL1 | Kaninchen | 1/500 |
| CALBINDIN | Kaninchen | 1/500 |
| KARTE2 | Maus | 1/1000 |
| N-CADHERIN | Maus | 1/1000 |
| NESTIN | Maus | 1/400 |
| OLIG2 | Kaninchen | 1/500 |
| PAX6 | Kaninchen | 1/400 |
| SOX2 | Maus | 1/200 |
| TBR1 | Kaninchen | 1/200 |
| TBR2 | Kaninchen | 1/200 |
| TUJ1 | Maus | 1/1000 |
Tabelle 3: Primäre Antikörper. Die primären Antikörper, Klon- und optimierten Verdünnungen, die für die Immunfärbung verwendet werden, sind aufgeführt.
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Discussion
Der Bedarf an großen Zellzahlen sowie definierten Kulturbedingungen zur Generierung spezifischer Zelltypen für Arzneimittelscreenings und regenerative Medizinanwendungen hat die Entwicklung skalierbarer Kultursysteme vorangetrieben. In den letzten Jahren haben mehrere Gruppen die skalierbare Generation von neuronalen Vorläufern und funktionellen Neuronen32,33,34berichtet, was signifikante Fortschritte bei der Entwicklung neuer Modelle für neurodegenerative Erkrankungen bietet. Dennoch fehlt die Rekapitulation einiger kritischer Ereignisse der embryonalen Entwicklung noch, und die Aufrechterhaltung der erzeugten funktionellen Neuronen in Suspension für längere Zeit ist noch nicht erreicht34. Präsentiert wird hier ein dynamisches 3D-Kultursystem, das in der Lage ist, iPSC-abgeleitete neuronale Organoide mit kleinhirniger Identität zu erzeugen und die Reifung zu funktionellen Kleinhirnneuronen unter chemisch definierten und feederfreien Bedingungen in dynamischer Kultur weiter zu fördern.
Bevor die Kleinhirndifferenzierung beginnt, ist es wichtig, die Qualität der menschlichen iPSCs zu erhalten. Um die Differenzierung nicht zu gefährden, sollten also nicht mehr als drei Passagen von iPSCs vom Auftauen bis zur Bioreaktorimpfung durchgeführt werden. Ein wichtiger Schritt im Differenzierungsprotokoll besteht darin, die Aggregatgröße zu bewerten. Die Aggregatgröße spielt eine entscheidende Rolle bei der Differenzierung zu einer bestimmten Zelllinie29. Außerdem gibt es eine Mindestgrößenschwelle, die Differenzierung zu begünstigen scheint35. Wie bereits berichtet, beträgt der optimale iPSC-abgeleitete Aggregatdurchmesser, um eine effiziente neuronale Bindung zu fördern31,,32 und Kleinhirndifferenzierung21, einen Durchmesser von 200 m.
Darüber hinaus ist in diesem dynamischen Protokoll die in den ersten Tagen der Kultur verwendete Rührgeschwindigkeit entscheidend, um den Aggregatdurchmesser und die neuronale Induktion zu steuern. Die Kultur begann bei 27 Umdrehungen pro Minute, was ausreicht, um die iPSC-Aggregation zu fördern und die Bildung größerer Aggregate zu vermeiden (Durchmesser über 350 m sollten vermieden werden). Die Agitation, die zur Förderung der Zellaggregation nach der Einzelzellsaat verwendet wird, konnte auf 30 U/min erhöht werden, ohne die Zelllebensfähigkeit zu beeinträchtigen; Es wird jedoch erwartet, dass höhere Rührgeschwindigkeiten zu kleineren Aggregaten führen. Je nach iPSC-Leitung, 24 h nach der Zellaussaat mit 27 U/min, werden zwei verschiedene Szenarien erwartet: Die gebildeten Aggregate weisen kleinere Durchmesser (<200 m) auf oder haben einen Größenbereich zwischen 200 und 300 m erreicht. Wenn Die Aggregate nach der Zellaussaat größer als 350 m bei 24 h sind, sollte keine Differenzierung durchgeführt werden, und die Zellaussaat sollte wiederholt werden, da die Effizienz der Differenzierung sehr gering ist. Wenn die Aggregate kleiner als 200 m sind, sollte das verbrauchte Medium durch ein iPSC-Wartungsmedium ersetzt und die Rührgeschwindigkeit auf 25 Umdrehungen pro Minute reduziert werden. Mit dieser Anpassung wird erwartet, dass der Aggregatdurchmesser von Tag 1 auf Tag 2 ansteigt, wahrscheinlich aufgrund der Verschmelzung einzelner Aggregate, die durch die Abnahme der Rührgeschwindigkeit gefördert werden. Bei Aggregaten mit Größen zwischen 200 und 300 m sollte das verbrauchte Medium durch Differenzierungsmedium ersetzt werden, und die neuronale Induktion mit FGF2 sollte nach 2 Tagen in der Kultur begonnen werden. An dieser Stelle sollte die Rührgeschwindigkeit auch leicht reduziert werden, um einen übermäßigen Zelltod zu verhindern, da Zellen empfindlicher auf Scherspannung in Gegenwart von Differenzierungsmedium reagieren. Zusätzlich könnte die Homogenität der Grundgesamtheit anhand des Variationskoeffizienten (CV) analysiert werden, der die Variabilität misst, indem die Standardabweichung mit dem Mittelwert der Aggregatdurchmesser korreliert wird, gemäß der Gleichung
in dem δ die Standardabweichung des Aggregatdurchmessers darstellt und μ der durchschnittliche Durchmesser ist. In diesem dynamischen System betrug der beobachtete durchschnittliche Lebenslauf 12,5 ± 3,3% (Mittelwert ± SD) für die F002.1A.13-Zelllinie und 19,0 ± 0,37% für die iPSC6,2-Zelllinie am 2. Tag. Daher ist in diesem System mit einer homogenen Größenpopulation mit einem Lebenslauf von unter 0,2 (< 20% der Variation) zu rechnen. Nach 7 Tagen Differenzierung lag der durchschnittliche Aggregatdurchmesser zwischen 300 und 360 m, und die Rührgeschwindigkeit wurde auf 30 U/min erhöht, um zu verhindern, dass sich die Aggregate am unteren Rand des 0,1-Liter-VW-Bioreaktors absetzen.
Die Differenzierung der Kleinhirn-Organoide bis zum 35. Tag und die Analyse der Aggregatgröße bei statischen Bedingungen wurden kürzlich21berichtet. Die Autoren zeigten, dass 3D-Aggregate, die bis zum 7. Tag der Differenzierung in Platten (z.B. Aggrewell) gebildet und gehalten wurden, in Größe und Form21homogen waren. Nach der Übertragung der Aggregate auf ultra-niedrige Befestigung 6 Brunnenkulturplatten, begannen die Aggregate in Größe und Morphologie zu variieren21. An Tag 35 erreichten einige der 3D-Aggregate bei verschiedenen Zelllinien 1.000 m, was die Diffusion von Nährstoffen und Sauerstoff einschränkte. Im Gegensatz dazu erreichten die Aggregate unter Verwendung unserer dynamischen Bedingungen an Tag 35 nicht mehr als 800 m Durchmesser, wobei der Massentransfer durch die ständige Rührung des Mediums, das durch das vertikale Rad gefördert wird, verbessert wurde. Darüber hinaus wurden die Aggregatgrößen bis zum Ende des Reifungsprozesses beibehalten und zeigten einen Gesamtdurchmesser von 646,6 ± 104,2 m pro Tag 90, der längsten Kultur, die in 0,1 L VW-Bioreaktoren durchgeführt wurde.
Effiziente Kleinhirninduktion wurde durch sequenzielle Zugabe von SB431542, FGF2, FGF19 und SDF1 in diesem dynamischen 3D-System induziert. Das Protokoll beginnt mit der Kombination von SB431542, einem transformierenden Wachstumsfaktor Beta (TGF-ß)-Rezeptorblocker, der die mesendodermale Differenzierung hemmt, und FGF2, das einen großen Effekt bei der Kaudalisierung des neuroepitheliale Gewebes25hat. Daher ist die Zugabe dieser beiden Moleküle während der ersten Tage der Kultur wichtig, um die Zelldifferenzierung zum Mittel-Hinterhirn zu fördern, dem Gebiet, das das Kleinhirngewebe hervorruft. Nach der ersten Induktion in das Mittel-Hinterhirn-Gewebe, ist es notwendig, FGF19 zur Förderung der spontanen Erzeugung von Mittel-Hindbrain-Strukturen mit dorsal-ventraler Polarität, sowie die Erzeugung von verschiedenen Kleinhirnvorläufern36,26hinzuzufügen. SDF1 erleichtert die Organisation von unterschiedlichen Schichten von Kleinhirnvorläufern, wie in der Entwicklungsphase gesehen, in der Kleinhirnneurogenese auftritt27. Bis zum 35. Tag können diese Moleküle die Organisation von Kleinhirn-Organoiden fördern, die die menschliche Kleinhirnentwicklung rekapitulieren können, was dem ersten Trimester-Kleinhirn entspricht. Nach der Organisation von Kleinhirnvorläufern in verschiedene Schichten wurde ein definiertes neuronales Medium verwendet, um deren Reifung zu fördern28. Andere Medien, die zur Aufrechterhaltung neuronaler Zellen verwendet werden, könnten ebenfalls getestet werden, aber es werden niedrigere Effizienzen erwartet. So, in diesem Protokoll, BrainPhys wurde verwendet, um die Differenzierung der Kleinhirn-gebundenen Zellen in Kleinhirn-Neuronen zu fördern, weil es berichtet wurde, um besser die gesunde neuronale Umgebung zu imitieren und neurophysiologische Aktivität der erzeugten Neuronen zu unterstützen28.
Mit diesen dynamischen Bedingungen kann eine effizientere Diffusion von Nährstoffen, Sauerstoff und Wachstumsfaktoren erreicht werden. Einige Einschränkungen sind jedoch mit der Agitation verbunden, die im Differenzierungsprotokoll verwendet wird. Einige Scherspannung kann durch den Agitationsprozess eingeführt werden, die das Überleben beeinflussen kann, Proliferation, und Differenzierung der Zellen. Daher muss während des Reifungsschritts, in dem die Zellen empfindlicher sind, die Kultur sorgfältig überwacht werden.
Die Differenzierung von Kleinhirn-Organoiden, die an die entwicklung des menschlichen embryonalen Kleinhirns erinnern, wurde bereits berichtet7. Die weitere Reifung dieser embryonalen Kleinhirn-Organoide zu Kleinhirnneuronen mit 3D-Kulturen bleibt jedoch eine Herausforderung. Die Erzeugung funktioneller Kleinhirnneuronen wurde nur durch Kokultivierung mit Granulatzellen aus verschiedenen Quellenerreicht 4,7,15. Dieses Protokoll hat das kleinrebelläre Engagement menschlicher iPSCs erfolgreich erhöht; Darüber hinaus ist dies das erste Protokoll zur Differenzierung verschiedener Kleinhirnneuronen in einem 3D-Kultursystem ohne Kokultivierung mit Feederzellen. Insbesondere können in unserem dynamischen Kultursystem folgende Zelltypen produziert werden: Purkinje-Zellen (Calbindin+), Granulatzellen (PAX6+/MAP2+), unipolare Bürstenzellen (TBR2+) und tiefe Kleinhirnkerne (TBR1+), die bis zu 3 Monate in Suspension gehalten wurden.
Die skalierbare Erzeugung von Kleinhirnorganoiden stellt ein wertvolles Werkzeug dar, um die embryonale Entwicklung des Kleinhirns und die pathologischen Wege zu untersuchen, die an der Degeneration dieses Organs beteiligt sind. Darüber hinaus kann ein Hochdurchsatz-Screening für Moleküle, die die Kleinhirnfunktion wiederherstellen, mit Organoiden durchgeführt werden, die mit diesem skalierbaren System erhalten wurden. Insgesamt erfüllt diese Methode den unerfüllten Bedarf an einem skalierbaren Protokoll für die Erzeugung hochwertiger Kleinhirnorganoide, die für eine Vielzahl biomedizinischer Anwendungen wichtig sein können.
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Disclosures
Die Autoren YH und SJ sind Mitarbeiter von PBS Biotech. Der Autor BL ist CEO und Mitbegründer von PBS Biotech, Inc. Diese kooperierenden Autoren waren an der Entwicklung der im Manuskript verwendeten Bioreaktoren beteiligt. Dies ändert nichts an der Einhaltung aller Richtlinien der Zeitschrift für den Austausch von Daten und Materialien. Alle anderen Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde unterstützt von Fundaéo para a Ciéncia e a Tecnologia (FCT), Portugal (UIDB/04565/2020 durch Programa Operacional Regional de Lisboa 2020, Project N. 007317, PD/BD/105773/2014 an T.P.S und PD/BD/128376/2017 an D.E.S.N.), von FEDER kofinanzierte Projekte (POR Lisboa 2020—Programa Operacional Regional de Lisboa PORTUGAL 2020) und FCT durch Gewährung PAC-PRECISE LISBOA-01-0145-FEDER-016394 und CEREBEX Generation of Cerebellar Organoids for Ataxia Research grant LISBOA-01-0145-FEDER-029298. Außerdem wurden Mittel aus dem Forschungs- und Innovationsprogramm Horizont 2020 der Europäischen Union im Rahmen der Grant Agreement-Nummer 739572 – The Discoveries Centre for Regenerative and Precision Medicine H2020-WIDESPREAD-01-2016-2017 bereitgestellt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3MM paper | WHA3030861 | Merck | |
| Accutase | A6964 - 500mL | Sigma | cell detachment medium |
| Anti-BARHL1 Antibody | HPA004809 | Atlas Antibodies | |
| Anti-Calbindin D-28k Antibody | CB28 | Millipore | |
| Anti-MAP2 Antibody | M4403 | Sigma | |
| Anti-N-Cadherin Antibody | 610921 | BD Transduction | |
| Anti-NESTIN Antibody | MAB1259-SP | R&D | |
| Anti-OLIG2 Antibody | MABN50 | Millipore | |
| Anti-PAX6 Antibody | PRB-278P | Covance | |
| Anti-SOX2 Antibody | MAB2018 | R&D | |
| Anti-TBR1 Antibody | AB2261 | Millipore | |
| Anti-TBR2 Antibody | ab183991 | Abcam | |
| Anti-TUJ1 Antibody | 801213 | Biolegend | |
| Apo-transferrin | T1147 | Sigma | |
| BrainPhys Neuronal Medium N2-A & SM1 Kit | 5793 - 500mL | Stem cell tecnhnologies | |
| Chemically defined lipid concentrate | 11905031 | ThermoFisher | |
| Coverslips 24x60mm | 631-1575 | VWR | |
| Crystallization-purified BSA | 5470 | Sigma | |
| DAPI | 10236276001 | Sigma | |
| Dibutyryl cAMP | SC- 201567B -500mg | Frilabo | |
| DMEM-F12 | 32500-035 | ThermoFisher | |
| Fetal bovine serum | A3840001 | ThermoFisher | |
| Gelatin from bovine skin | G9391 | Sigma | |
| Glass Copling Jar | E94 | ThermoFisher | |
| Glutamax I | 10566-016 | ThermoFisher | |
| Glycine | MB014001 | NZYtech | |
| Ham’s F12 | 21765029 | ThermoFisher | |
| Human Episomal iPSC Line | A18945 | ThermoFisher | iPSC6.2 |
| IMDM | 12440046 | ThermoFisher | |
| Insulin | 91077C | Sigma | |
| iPS DF6-9-9T.B | WiCell | ||
| Iso-pentane | PHR1661-2ML | Sigma | |
| L-Ascorbic acid | A-92902 | Sigma | |
| Matrigel | 354230 | Corning | basement membrane matrix |
| Monothioglycerol | M6154 | Sigma | |
| Mowiol | 475904 | Millipore | mounting medium |
| mTeSR1 | 85850 -500ml | Stem cell technologies | |
| N2 supplement | 17502048 | ThermoFisher | |
| Neurobasal | 12348017 | ThermoFisher | |
| Paraformaldehyde | 158127 | Sigma | |
| PBS-0.1 Single-Use Vessel | SKU: IA-0.1-D-001 | PBS Biotech | |
| PBS-MINI MagDrive Base Unit | SKU: IA-UNI-B-501 | PBS Biotech | |
| Recombinant human BDNF | 450-02 | Peprotech | |
| Recombinant human bFGF/FGF2 | 100-18B | Peprotech | |
| Recombinant human FGF19 | 100-32 | Peprotech | |
| Recombinant human GDNF | 450-10 | Peprotech | |
| Recombinant human SDF1 | 300-28A | Peprotech | |
| ROCK inhibitor Y-27632 | 72302 | Stem cell technologies | |
| SB431542 | S4317 | Sigma | |
| Sucrose | S7903 | Sigma | |
| SuperFrost Microscope slides | 12372098 | ThermoFisher | adhesion microscope slides |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | 25608-930 | VWR | |
| Tris-HCL 1M | T3038-1L | Sigma | |
| Triton X-100 | 9002-93-1 | Sigma | |
| Tween-20 | P1379 | Sigma | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | 15575020 | ThermoFisher |
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