Summary
Detta protokoll beskriver ett dynamiskt odlingssystem för att producera kontrollerade storleksaggregat av mänskliga pluripotenta stamceller och ytterligare stimulera differentiering i cerebellar organoider under kemiskt definierade och feeder-fria förhållanden med hjälp av en engångsbioreaktor.
Abstract
Lillhjärnan spelar en avgörande roll i underhållet av balans och motorisk koordination, och en funktionell defekt i olika cerebellar nervceller kan utlösa cerebellar dysfunktion. De flesta av de nuvarande kunskaperna om sjukdomsrelaterade neuronala fenotyper är baserad på postmortem vävnader, vilket gör förståelsen av sjukdomsprogression och utveckling svårt. Djurmodeller och förevigade cellinjer har också använts som modeller för neurodegenerativa störningar. De rekapitulerar dock inte helt sjukdomar hos människor. Mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) har stor potential för sjukdomsmodellering och utgör en värdefull källa för regenerativa metoder. Under de senaste åren, generering av cerebrala organoider från patient-härledda iPSCs förbättrat utsikterna för neurodegenerativa sjukdom modellering. Men, protokoll som producerar ett stort antal organoider och en hög avkastning av mogna nervceller i 3D-kultursystem saknas. Det protokoll som presenteras är en ny metod för reproducerbara och skalbara generationen av mänskliga iPSC-härledda organoider under kemiskt definierade förhållanden med hjälp av skalbara engångsbioreaktorer, där organoider förvärva cerebellar identitet. De genererade organoiderna kännetecknas av uttryck av specifika markörer på både mRNA och proteinnivå. Analysen av specifika grupper av proteiner möjliggör detektion av olika cerebellarcellpopulationer, vars lokalisering är viktig för utvärdering av organoidstruktur. Organoid cryosectioning och ytterligare immunostaining av organoid skivor används för att utvärdera förekomsten av specifika cerebellar cell populationer och deras rumsliga organisation.
Introduction
Uppkomsten av mänskliga pluripotenta stamceller (PSC) utgör ett utmärkt verktyg för regenerativ medicin och sjukdom modellering, eftersom dessa celler kan differentieras till de flesta cell härstamningar av människokroppen1,2. Sedan upptäckten har PSC-differentiering med olika metoder rapporterats för att modellera olika sjukdomar, inklusive neurodegenerativa sjukdomar3,4,5,6.
Nyligen har det förekommit rapporter om 3D-kulturer som härrör från PSCS liknar mänskliga cerebrala strukturer; dessa kallas hjärnorganoider3,7,8. Genereringen av dessa strukturer från både friska och patientspecifika PSCs ger en värdefull möjlighet att modellera mänsklig utveckling och neuroutvecklingsstörningar. Men de metoder som används för att generera dessa välorganiserade cerebrala strukturer är svåra att tillämpa för sin storskaliga produktion. För att producera strukturer som är tillräckligt stora för att rekapitulera vävnadsmorkosogenes utan nekros inuti organoiderna, protokoll förlita sig på den inledande neurala engagemang i statiska förhållanden, följt av inkapsling i hydrogeler och efterföljande kultur i dynamiska system3. Sådana tillvägagångssätt kan dock begränsa den potentiella uppskalning av organoid produktion. Även om ansträngningar har gjorts för att direkt PSC differentiering till specifika regioner i centrala nervsystemet, inklusive kortikala, striatal, mellanhjärnan, och ryggmärgen nervceller9,10,11,12, är generering av specifika hjärnregioner i dynamiska förhållanden fortfarande en utmaning. I synnerhet har generationen av mogna cerebellar nervceller i 3D-strukturer ännu inte beskrivas. Muguruma et al. banat väg för generering av kultur villkor som rekapitulera tidigt cerebellar utveckling13 och nyligen rapporterade ett protokoll som gör det möjligt för mänskliga embryonala stamceller för att generera en polariserad struktur som påminner om den första trimestern lillhjärnan7. Dock kräver mognaden av cerebellar nervceller i de rapporterade studierna dissociation av de organoider, sortering av cerebellar progenitors, och kokultur med matarceller i en monolayer kultur system7,14,15,16. Därför är reproducerbara generationen av de önskade cerebellar organoider för sjukdom modellering under definierade förhållanden fortfarande en utmaning i samband med kultur och feeder källa variabilitet.
Detta protokoll presenterar optimala odlingsförhållanden för 3D-expansion och effektiv differentiering av mänskliga PSC till cerebellar nervceller med användning av engångsbruk vertikala hjul bioreaktorer (se Tabell över material för specifikationer), nedan kallade bioreaktorer. Bioreaktorer är utrustade med en stor vertikal pumphjul, som i kombination med en U-formad botten, ger en mer homogen skjuvning fördelning inuti kärlet, vilket möjliggör mild, enhetlig blandning och partikel suspension med minskad agitation hastigheter17. Med detta system kan man få form och storleksstyrda cellaggregat, vilket är viktigt för en mer homogen och effektiv differentiering. Dessutom kan ett större antal iPSC-härledda organoider genereras på ett mindre mödosamt sätt.
Det viktigaste inslaget i de organoider, som är 3D flercelliga strukturer som vanligtvis bildas från stamceller, är självorganisering av olika celltyper som bildar specifika former som de som ses i människans morfogenes18,19,20. Därför är organoid morfologi ett viktigt kriterium som ska utvärderas under differentieringsprocessen. Kryosektioner av organoider och ytterligare immunfärgning av organoidskivor med en specifik uppsättning antikroppar möjliggör den rumsliga visualiseringen av molekylära markörer för att analysera cellproliferation, differentiering, cellpopulationsidentitet och apoptos. Med detta protokoll, genom immunostaining organoid cryosections, en initial effektiv neurala engagemang observeras av den 7dagen av differentiering. Under differentiering observeras flera cellpopulationer med cerebellär identitet. Efter 35 dagar i detta dynamiska system, organiserar cerebellar neuroepithelium längs en apicobasal axel, med ett apikalt lager av proliferering progenitors och basally ligger postmitotiska nervceller. Under mognadsprocessen, från dagar 35–90 av differentiering, kan distinkta typer av cerebellär nervceller ses, inklusive Purkinje celler (Calbindin+), granulatceller (PAX6+/MAP2+), Golgi celler (Neurogranin+), unipolär pensel celler (TBR2+), och djupa cerebellar nukleiprojektion nervceller (TBR1+). Också observeras en icke obetydlig mängd celldöd i de genererade cerebellarorganoiderna efter 90 dagar i kultur.
I detta system mognar mänskliga iPSC-härledda organoider till olika cerebellar-nervceller och överlever i upp till 3 månader utan behov av dissociation och matarkokultur, vilket ger en källa till mänskliga cerebellära nervceller för sjukdomsmodellering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Passaging och underhåll av mänskliga iPSCs i monolayer kultur
- Beredning av plattor
- Tina källaren membranmatris (se Tabell över material) lager vid 4 °C och förbereda 60 μL alikvoter. Frys alikvoterna vid -20 °C.
- Att belägga brunnarna i en 6 brunnsplatta, tina en alikvot av källaren membranmatris på is. När tinas tillsätt 60 μL till 6 mL DMEM-F12. Försiktigt återanvänd genom pipettering upp och ner.
- Tillsätt 1 mL utspädd källarmembranmatrislösning till varje brunn av en 6 brunnsplatta och inkubera vid RT i minst 1 h före passaging eller förvara vid 4 °C i upp till 1 vecka.
- Passaging av iPSC-kolonier med EDTA
- Underhåll iPSC i monolayerkultur i 6 brunnsplattor i inkubatorn vid 37 °C, 95 % luftfuktighet och 5 % CO2.
OBS: I detta protokoll användes tre distinkta mänskliga iPSC-linjer: F002.1A.1321, human episomal iPSC-linje (iPSC6.2)22, och kommersiellt erhållen iPS-DF6-9-9T.B (se Table of Materials). - Innan du passarging, inkubera de lagrade plattorna (steg 1.1) vid rumstemperatur (RT) i 15 min och bereda mTesR1-mediumet (Tabell 1).
- Aspirera lösningen från plattan med hjälp av en serologisk pipett och tillsätt omedelbart 0,5 mL mTeSR1 medium till varje brunn.
- Aspirera det förbrukade mediet från brunnen som innehåller iPSCs och tvätta en gång med 1 mL på 0,5 mM EDTA per brunn.
- Tillsätt 1 mL på 0,5 mM EDTA till varje brunn och inkubera vid RT i 5 min.
- Aspirera EDTA och avlägsna cellerna från brunnarna genom att försiktigt tillsätta mTeSR1-medium och pipettera kolonierna med hjälp av en P1000-mikropipette. Samla in cellerna i ett koniskt rör.
OBS: Pipettceller upp och ner mer än 3x får inte. - Tillsätt 1 mL cellupphängning (utspädd 1:4) till varje brunn så att varje brunn innehåller 1,5 mL medium efter att cellupphängningen lagts till. Returnera celler till inkubatorn vid 5%CO 2, 37 °C.
- Byt ut det förbrukade mediet dagligen och passage var 3:e dag då 75%–80 % sammanflödet uppnås.
- Underhåll iPSC i monolayerkultur i 6 brunnsplattor i inkubatorn vid 37 °C, 95 % luftfuktighet och 5 % CO2.
2. Sådd av mänskliga iPSCs i bioreaktorn
- Inkubera iPSC som odlas som monolayers i mTeSR1 kompletterat med 10 μM av ROCK-hämmare Y-27632 (ROCKi). Tillsätt 1 mL kompletterat medium till varje brunn från en 6 väl vävnadsodlingsplatta och inkubera i 1 h vid 37 °C, 95% luftfuktighet, och 5% CO2.
OBS: ROCKi används för att skydda dissocierade iPSCs från apoptos23. - Efter 1 h inkubation, aspirera det förbrukade mediet från varje brunn och tvätta 1x med 1 mL av 1× PBS per brunn.
- Tillsätt 1 mL av cellavlossningsmediet (se Tabell av material) till varje brunn av en 6 brunnsplatta och inkubera vid 37 °C i 7 min tills cellerna lossnar lätt från brunnarna med skonsam skakning.
- Pipettera cellen lossnar medium upp och ner med en P1000 mikropipette tills cellerna lossnar och separeras i enstaka celler. Tillsätt 2 mL av komplett cellodlingsmedium till varje brunn för att inaktivera enzymatisk matsmältning och pipettera cellerna försiktigt i ett sterilt koniskt rör.
- Centrifugera vid 210 × g i 3 min och ta bort supernatanten.
- Resuspend cell pelleten i odlingsmedium (dvs. mTeSR1 kompletteras med 10 μM av ROCKi) och räkna iPSCs med en hemocytometer med hjälp trypan blå färgämne.
- Frö 15 × 106 enstaka celler i bioreaktorn (maximal volym på 100 mL) med 60 mL mTeSR1 kompletterat med 10 μM av ROCKi vid en slutlig celltäthet på 250 000 celler/mL.
- För in kärlet som innehåller iPSC:erna i den universella basenheten som placeras i inkubatorn vid 37 °C, 95 % luftfuktighet, och 5 % CO2.
OBS: Bioreaktorns omrörning bibehålls i 24 h genom att den universella basenhetens styrning sätts på 27 varv/min för att främja iPSC-aggregering.
3. Differentiering och mognad av aggregat av human iPSC-härledda i cerebellära organoider
- Definiera dagen för enkelcellssådd som dag 0.
- På dag 1, samla 1 mL av iPSC aggregaten provet med hjälp av en serologisk pipett. Underhåll bioreaktorn under agitation som tidigare genom att placera den universella basenheten med bioreaktorn som innehåller aggregaten i ett sterilt flöde innan provet samlas in. Plätera cellupphängningen i en ultralåg infästning 24 brunnsplatta. Kontrollera att iPSC-härledda aggregat bildas.
- Skaffa bilder med ett optiskt mikroskop med hjälp av en total förstoring på 40x eller 100x för att mäta aggregatet diameter.
- Mät området för aggregaten i varje bild med hjälp av FIJI programvara.
- Välj "Analysera | Ställ In Mått" från menyraden och klicka på "Area" och "OK".
- Välj "Fil | Öppna" från menyraden för att öppna en lagrad bildfil. Välj linjemarkeringsverktyget som presenteras i verktygsfältet och skapa en rak linje över skalstrecket som presenteras i bilden. Välj "Analysera | Ställ skala" från menyraden.
- I "Känt avstånd"lägg till vidden av bildens skalstreck i μm. Definiera "Enheten för längd" som μm. Klicka på "Global" för att behålla inställningarna och "OK". Välj Oval markering i verktygslisten.
- För varje aggregat avgränsa området med ovalverktyget. Välj "Analysera | Mät". Beräkna deras diameter baserat på uppmätt areal, med tanke på att aggregaten är ungefär sfäriska med hjälp av
med A som området för aggregatet.
- När aggregatens genomsnittliga diameter är 100 μm, ersätt 80% av det förbrukade mediet med färsk mTeSR1 utan ROCKi. När aggregaten når 200–250 μm i diameter, byt ut allt förbrukat medium med gfCDM (tabell 1), låta organoiderna bosätta sig i bottnen av bioreaktorn.
OBS: Om den genomsnittliga sammanlagda diametern överstiger 350 μm inte starta differentieringsprotokollet. Upprepa sådd av enstaka celler. Generellt tar det runt 1 dag för aggregatet att nå en genomsnittlig diameter på 100 μm. - Sätt in bioreaktorn som innehåller aggregaten i den universella basenheten som placeras i inkubatorn vid 37 °C, 95 % luftfuktighet, och 5 % CO2.
- Minska bioreaktor agitationen till 25 rpm.
- På dag 2 upprepar du steg 3.2, 3.3 och 3.4 för att utvärdera den sammanlagda diametern. Tillsätt 30 μL av FGF2 (slutkoncentration, 50 ng/mL) och 60 μL av SB431542 (slutkoncentration, 10 μM) till 60 mL gfCDM differentieringsmedium (Tabell 1). Ersätt alla förbrukade medium från bioreaktorn med den kompletterade gfCDM. Upprepa steg 3.6.
OBS: SB431542 är avgörande för att hämma mesendodermal differentiering, förmå neural differentiering24. FGF2 används för att främja caudalization av den neuroepithelialvävnaden 25. - På dag 5 upprepar du steg 3.2, 3.3, 3.4 och 3.8.
OBS: Aggregerad storlek bör öka under differentieringsprotokollet. Diametern är dock endast kritisk när differentieringen startar, eftersom denna parameter skulle kunna påverka effekten av differentiering. - På dag 7 upprepar du steg 3.2, 3.3 och 3.4. Späd FGF2 och SB431542 till 2/3: Tillsätt 20 μL FGF2 och 40 μL SB431542 till 60 mL gfCDM differentieringsmedium. Ersätt alla förbrukade medium från bioreaktorn med kompletterad gfCDM. Upprepa steg 3.6 och öka bioreaktor agitation till 30 rpm.
- På dag 14 upprepar du steg 3.2, 3.3 och 3.4. Tillsätt 60 μL FGF19 (slutkoncentration, 100 ng/mL) till 60 mL gfCDM-differentieringsmedium. Ersätt allt förbrukat medium från bioreaktorn med GFCDM kompletterat med FGF19. Upprepa steg 3.6.
OBS: FGF19 används för att främja polarisering av mitten av hindbrain strukturer26. - På dag 18 upprepar du steg 3.2, 3.3, 3.4 och 3.11.
- På dag 21 upprepar du steg 3.2, 3.3 och 3.4. Ersätt allt förbrukat medium från bioreaktorn med komplett neurobasalt medium (Tabell 1). Upprepa steg 3.6.
OBS: Neurobasal medium är ett basalt medium som används för att upprätthålla neuronala cellpopulationen inom organoid7. - På dag 28 upprepar du steg 3.2, 3.3 och 3.4. Tillsätt 180 μL SDF1 (slutkoncentration, 300 ng/mL) till 60 mL komplett neurobasalt medium. Ersätt alla förbrukade medium från bioreaktorn med komplett neurobasalt medium kompletterat med SDF1. Upprepa steg 3.6.
OBS: SDF1 används för att underlätta organisationen av distinkta cellskikt27. - På dag 35 upprepar du steg 3.2, 3.3 och 3.4. Ersätt allt förbrukat medium från bioreaktorn med komplett BrainPhys-medium (Tabell 1). Upprepa steg 3.6.
OBS: BrainPhys är ett neuronalt medium som stöder synaptically aktiva nervceller28. - Ersätt 1/3 av den totala volymen var 3 dagar med komplett BrainPhys medium fram till dag 90 av differentiering.
4. Beredning av organoider för kryosektion och immunohistokemi
- Insamling av organoider för immunfärgning
- Samla in 1 mL prov av medium innehållande organoider med en serologisk pipett från bioreaktorn till ett koniskt rör på 15 mL.
OBS: Organoider bör samlas in vid olika tidpunkter för att utvärdera effekten av differentiering, inklusive dag 7, 14, 21, 35, 56, 70, 80, och 90. - Ta bort supernatanten och tvätta en gång med 1 mL av 1× PBS.
OBS: Centrifugerna inte organoiderna. Låt organoiderna bosätta sig i botten av röret genom gravitation. - Ta bort supernatanten och tillsätt 1 mL av 4% paraformaldehyd (PFA). Inkubera vid 4 °C i 30 min. Ta bort den förbrukade PFA och lägg till 1 mL av 1× PBS.
- Förvara organoiderna i 1 mL av 1× PBS vid 4 °C tills bearbetning för kryosektionering.
OBS: Förvara organoiderna i 1x PBS i högst 1 vecka efter fixering.
- Samla in 1 mL prov av medium innehållande organoider med en serologisk pipett från bioreaktorn till ett koniskt rör på 15 mL.
- Beredning av organoider för kryosektionering
- Ta bort supernatanten från de lagrade organoiderna. Tillsätt 1 mL av 15% sackaros (w/ v, utspädd i 1× PBS), blanda väl genom skonsam virvlande, och inkubera över natten vid 4 °C.
- Bered en lösning på 15% sackaros/7,5% gelatin (Tabell 2) och underhåll vid 37 °C under beredningen för att undvika gelatin för att stelna.
- Ta bort 15% sackaroslösningen, tillsätt 1 mL av 15% sackaros/7,5% gelatin till organoiderna, och blanda snabbt genom skonsam virvlande. Inkubera vid 37 °C i 1 h.
- Tillsätt 15% sackaros/7,5% gelatinlösning till en plastbehållare upp till hälften av dess volym. Vänta på stelning vid RT.
- Efter en 1 h inkubation, placera försiktigt en sackaros/gelatin droppe som innehåller de organoider på stelnat gelatin med en Pasteur pipett. Låt stelna vid RT i ca 15 min. Se till att undvika bubbla bildning.
- Placera 15% sackaros/7,5% gelatin ovanpå organoiderna tills behållaren är fylld. Vänta på fullständig stelning vid RT.
- Efter stelning, inkubera 20 min vid 4 °C.
- Skär gelatinet i en kub som innehåller organoiderna i mitten och fixa gelatinkuben på en bit kartong med en droppe O.C.T. förening.
- Placera 250 mL isopentan i en 500 mL kopp och fyll en lämplig behållare med flytande kväve. Med hjälp av tång och tjocka handskar, placera försiktigt koppen som innehåller isopentan på ytan av flytande kväve och kyla isopentan till -80 °C.
- När -80 °C har uppnåtts, placera gelatinkuben i koppen som innehåller isopentan tills den fryser, och håll temperaturen vid -80 °C. Beroende på kubens storlek kan det ta 1–2 min.
OBS: Undvik temperaturer under -80 °C eller överdriven frysningstid, eftersom det kan orsaka sprickbildning av kuben. - När frysta, snabbt lagra gelatin kuben vid -80 °C och lagra tills cryosectioning.
- Kryosektion av organoider
- Slå på kryostaten och definiera både preparat (OT) och kryokammaren (CT) vid -25 °C.
- När båda temperaturerna stabiliseras, fixera gelatinkuben som innehåller organoiderna på preparatet genom att använda O.C.T. förening.
- Definiera sektionstjocklek vid 12 μm.
- Skär kuben och samla 3–4 skivor på vidhäftningsmikroskopsglas (se Table of Materials).
- Förvaras vid -20 °C tills användning.
- Immunfärgning av organoider skivor
- Placera mikroskopet diabilder som innehåller organoid sektioner i en copling burk med 50 mL förvärmda 1x PBS, hålla upp till 10 diabilder back-to-back.
OBS: Alla organoidsektioner bör vara nedsänkta med vätska. - Inkubera i 45 min vid 37 °C för att degelatinisera objektglas.
- Tvätta 1x med 50 mL av 1× PBS i 5 min vid RT: För över objektglasen till en coplingburk innehållande färsk 1× PBS.
- Överför objektglasen till en koplingburk innehållande 50 mL nyberedd glycin (Tabell 2) och inkubera i 10 min vid RT.
- Överför objektglasen till en koplingburk innehållande 50 mL av 0,1% triton (Tabell 2) och permeabilize i 10 min vid RT.
- Tvätta med 1× PBS i 5 min 2x.
- Förbered immunfärgningsfatet med 3 mm papper indränkt i 1× PBS. Torka diabilder med en vävnad runt skivorna och placera dem på 3 mm papper. Täck hela ytan på objektglasen med blockerande lösning ( Tabell2) med ~0,5 mL per objektglas. Inkubera i 30 min vid RT.
- Ta bort överflödig blockerande lösning och torka objektglasen med en vävnad runt skivorna. Placera 50 μL av den primära antikroppen (Tabell 3) utspädd i blockerande lösning över sektionerna och täck med täcklinerna. Placera skivorna i en tidigare beredd immunfärgningsrätt. Inkubera över natten vid 4 °C.
- Överför objektglasen till en koplingburk med 50 mL TBST (Tabell 2), låt täcken falla och tvätta med TBST i 5 min 3x.
- Placera 50 μL av den sekundära antikroppen utspädd i blockerande lösning över sektionerna och täck med täcklen. Placera skivorna i den tidigare beredda immunfärgningsskålen. Inkubera i 30 min vid RT, skyddad mot ljus.
- Överför objektglasen till en koplingburk igen och tvätta med 50 mL TBST i 5 min 3x.
- Torka diabilderna med en vävnad runt skivorna och placera skivorna i en tidigare beredd immunfärgningsrätt. Tillsätt 0,5 mL DAPI-lösning över hela ytan av objektglasen med en Pasteur-pipett. Inkubera i 5 min vid RT.
- Upprepa steg 4.4.9.
- Torka försiktigt objektglasen med en vävnad. Tillsätt 50 μL monteringsmeddropp för droppe längs rutschkanan och sänk sedan försiktigt ner en täckbild på varje objektglas, något böj den för att undvika bubblor.
- Placera mikroskopet diabilder som innehåller organoid sektioner i en copling burk med 50 mL förvärmda 1x PBS, hålla upp till 10 diabilder back-to-back.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollet initierades genom att man främjade cellaggregering med hjälp av bioreaktorerna 0,1 L (figur 1A). Single cell inympning av iPSCs utfördes, med 250.000 celler/mL seedade i 60 mL medium med en agitation hastighet på 27 rpm. Detta definierades som dag 0. Efter 24 h bildade cellerna effektivt sfäroidformade aggregat (dag 1, figur 1B), och morfologin var väl underhållen fram till dag 5, med en gradvis ökning i storlek, vilket visar en hög grad av homogenitet i samlad morfologi och storlek över tiden. (Figur 1B). En kvantitativ analys genom mikroskopi visade också normalfördelning av sammanlagda storlekar av dag 1 (Figur 1C). Den sammanlagda storleken är en viktig fysisk parameter som kan förmå cellerna att differentiera mot olika härstamningar29,30. Av denna anledning, baserat på den sammanlagda storleken rapporteras i tidigare studier för att inducera en effektiv neural31,32 ochcerebellar åtagande21, de genererade aggregaten bibehölls i mTeSR1 medium vid 25 rpm tills de nådde önskad diameter innan du börjar differentiering (~ 200 μm). Vid dag 2 var den genomsnittliga diametern 221,0 ± 54,4 μm (medelvärde ± SD) för celllinjen F002.1A.13 och 212,1 ± 42,1 μm för cellinjen IPSC6.2. Som sådan, båda cellinjerna uppnått den optimala sammanlagda storleken vid denna timepoint (Figur 1C).
Definiera dag då sådd av iPSCs utfördes som dag 0, vid dag 2, efter att ha uppnått den önskade aggregerade diametern, neurala engagemang inducerades genom samtidigt med hjälp av SB431542, FGF2 och insulin, främja neuroectodermal differentiering, samt en måttlig caudalization nödvändigt för mitten av hindbrain mönstring. Efteråt, FGF19 och SDF1 lades till kulturen på dag 14 och 28, respektive, att främja generering av olika cerebellar progenitors. För de första dagarna av neural induktion användes en rotationshastighet på 25 rpm, som ökades till 30 rpm efter 7 dagar för att undvika ackumulering och klumpar av större aggregat (Figur 2A). Under differentiering visade organoider en mer uttalad epithelisering som liknar neuralrörsliknande strukturer med luminalt utrymme (Figur 2B). Dessutom visade utvärderingen av organoid diameter fördelning en homogen storleksfördelning under den inledande cerebellar engagemang fram till dag 14 (Figur 2B).
Immunofluorescensanalys stöder att ett effektivt neuralt engagemang av de iPSC-härledda organoiderna redan uppnås av dag 7 av differentiering efter att ha lagt till FGF2 och SB431542. De kryosektioner av organoider avslöjade många strukturer som påminner om neuralröret färgning för PAX6 och NESTIN, med de flesta celler inom organoiderna uttrycker progenitor markör NESTIN vid dagar 7 och 14 av differentiering (Figur 2C). Efteråt, FGF19 och SDF1 främjas generering av kontinuerligt proliferator lager (PAX6+) och en effektiv neuronal differentiering uppnåddes, vilket framgår av uttrycket av TUJ1, neuron-specifika klass III beta-tubulin, av dagar 21 och 35 (Figur 2C). Dessutom observerades en effektiv cerebellar differentiering också efter 21 dagar i 0,1 L VW bioreaktorer, vilket framgår av förekomsten av två olika cellpopulationer: granulat cell progenitors (BARLH1+ celler, Figur 3A), och Purkinje cell progenitors (OLIG2+ celler, Figur 3B). Efter 35 dagar i kultur, olika cellpopulationer inom organoiderna verkade vara organiserade i distinkta lager. Olika flatolatiska strukturer inom organoiderna observerades med BARHL1+ dorsala cerebellar-progenitorer som ett kontinuerligt skikt på den ytliga sidan av organoiden (Figur 3C,D) och SOX2+ i luminalregionen för dessa ovala strukturer (Figur 3D). Dessutom, TUJ1+ nyfödda nervceller tycktes migrera mot ytan, återupprätta radial inriktningen på den yttre ytan av organoid (Figur 3E).
Efter generationen av cerebellar progenitors, ytterligare mognad främjades med hjälp av BrainPhys medium28 kompletteras med neurotrofa faktorer BDNF och GDNF. Immunofluorescens färgning av organoid cryosections användes för att upptäcka distinkta subtyper av cerebellar nervceller. Purkinje celler, GABAergic nervceller uttrycker kalcium-bindande protein calbindin (CALB, Figur 3F), upptäcktes i cerebellar organoider efter mognad protokollet. Dessutom identifierades en annan större cerebellär neuronal typ, granulat celler, som en delmängd av celler coexpressing PAX6 och MAP2 (Figur 3G). Intressant nog var en pool av PAX6+ progenitors inte uttrycker MAP2 bibehålls förrän 80 dagar av differentiering. Andra typer av cerebellar nervceller upptäcktes också, inklusive unipolär pensel celler uttrycker TBR2 (Figur 3H), och djupa cerebellar kärnor projektion nervceller uttrycker TBR1 (Figur 3I). Förutom effektiv cerebellar differentiering och mognad, detta 3D dynamiskt kultursystem med hjälp av PBS 0.1 L VW bioreaktorer får organoider att förbli livskraftiga i upp till 90 dagar, utan betydande celldöd och nekros (Figur 3J).
Figur 1: Generering av storleksstyrda aggregat med hjälp av skalbara bioreaktorer. (A) Bioreaktorns designdetaljer. (B) Brightfield fotomikrograf som visar aggregat från två olika iPSC-linjer på dag 1, 2, och 5. Skala bar = 100 μm. (C) Storleksfördelningen av flytande aggregat från olika iPSC-linjer i bioreaktorerna. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 2: Generering av mänskliga iPSC-härledda organoider med hjälp av 0,1 L bioreaktorer. (A) Schematisk representation av odlingsförfarandet för att inducera differentiering av iPSCs till cerebellära organoider. Celler var seedade vid en densitet av 250.000 celler/mL och en agitation hastighet på 27 rpm användes för att främja cell aggregering. Under de första dagarna av differentiering, aggregat bibehölls vid en agitation hastighet av 25 rpm. Efteråt, för att undvika ackumulering av större aggregat, ökades agitationhastigheten till 30 rpm. (B) Karakterisering av organoid form och storlek. Brightfield photomicrographs visar iPSC-härledda organoider under cerebellar differentiering i 0,1 L VW bioreaktorer. Skala bar = 100 μm. Fördelningen av organoid diametrar visar att kulturen upprätthålls homogena organoider storlekar längs differentiering protokollet. (C) Effektiv neural induktion i iPSC-härledda organoider. Immunofluorescens för NESTIN, PAX6 och TUJ1 under cerebellär differentiering. Skalstång = 50 μm. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 3: Effektiv cerebellär differentiering och mognad i mänskliga iPSC-härledda organoider. (A-E) Effektivt cerebellar engagemang. Immunostaining-analys för BARHL1- - SOX2-, OLIG2-, NCAD- och TUJ1-markörer vid indikerade tidspoäng för protokollet för cerebellar-differentiering. (F-I) Effektiv mognad av mänskliga iPSC-härledda cerebellära organoider. Immunofluorescens som visar olika typer av cerebellar nervceller, inklusive Purkinje celler (CALB, F), granulatceller (PAX6 och MAP2, G), unipolär pensel celler (TBR2), och djupa cerebellar kärnor prognoser nervceller (TBR1). (J) Hög cell livskraft efter cerebellärmognad. Levande/döda (calcein-AM, grön och propidium iodide, röd) färgning av organoids visade hög cell livskraft och inga bevis på necrotic områden efter 80 dagar i bioreaktorerna. Skalstång = 50 μm. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
| Media förberedelse |
mTeSR1 Slutlig volym: 500 mL |
1. Tina mTeSR1 5× tillägg vid rumstemperatur (RT) eller vid 4 °C över natten och blanda med basalt medium 2. Förvara komplett mTeSR1 medium vid 4 °C i upp till 2 veckor eller förbereda 40 mL alikvoter och förvara vid -20 °C 3. Förvarm komplett mTeSR1 vid RT före användning |
|
gfCDM (tillväxtfaktorfritt kemiskt definierat medium) Slutlig volym: 60 mL |
30 mL Hams F12 30 mL IMDM 600 μL kemiskt definierat lipidkoncentrat (1 % v/v) 2,4 μL monothioglycerol (450 μM) 30 μL apo-transferrin (stamlösning vid 30 mg/mL i vatten, slutkoncentration: 15 μg/mL) 300 mg kristallisation-renad BSA (5 mg/mL) 42 μL insulin (lagerkoncentration vid 10 mg/mL, slutkoncentration: 7 μg/mL) 300 μL P/S (0,5 % v/v, 50 U/ml penicillin/50 μg/ml streptomycin) |
|
|
Neurobasal Slutlig volym: 60 mL |
60 mL av Neurobasalt medel 600 μL N2-tillägg 600 μL Glutamax I 300 μL P/S (0,5 % v/v). |
|
|
Komplett BrainPhys Slutlig volym: 60 mL |
60mL av BrainPhys 1,2 mL NeuroKult SM1 neuronal tillägg 600 μL N2-tillägg 12 μL BDNF (slutkoncentration: 20 ng/mL) 12 μL GDNF (slutlig koncentration: 20 ng/mL) 300 μL Dibutyryl-cAMP (lagerkoncentration: 100 mg/mL i vatten, slutkoncentration: 1 mM) 42 μL askorbinsyra (lagerkoncentration: 50 μg/mL i vatten, slutkoncentration: 200 nM) |
|
| Stamlösningar av tillväxtfaktorer och små molekyler |
Grundläggande fibroblast tillväxtfaktor (bFGF/FGF2) Lagerkoncentration: 100 μg/mL |
1. Rekonstruera i 5 mM Tris, pH 7.6, vid en koncentration av 10 mg/mL 2. Späd med 0,1 % BSA i PBS (v/v) till en slutlig lagerkoncentration på 100 μg/mL |
|
Stromal cell-härledd faktor 1 (SDF1) Lagerkoncentration: 100 μg/mL |
1. Rekonstruera i vatten vid en koncentration av 10 mg/mL 2. Späd med 0,1 % BSA (v/v) i PBS till en slutlig lagerkoncentration på 100 μg/mL. |
|
|
Hjärn-härledda neurotrofa faktor (BDNF) Lagerkoncentration: 100 μg/mL |
||
|
Glial cell-härledda neurotrofa faktor (GDNF) Lagerkoncentration: 100 μg/mL |
||
|
Fibroblast tillväxtfaktor 19 (FGF19) Lagerkoncentration: 100 μg/mL |
1. Rekonstruera i 5 mM natriumfosfat, pH 7,4, vid en koncentration på 10 mg/mL 2. Späd med 0,1 % BSA i PBS (v/v) till en slutlig lagerkoncentration på 100 μg/mL |
|
|
ROCK-hämmare Y-27632 Lagerkoncentration: 10mM |
Rekonstruera i DMSO vid en koncentration av 10 mM. | |
|
SB431542 Lagerkoncentration: 10mM |
||
|
Insulin Lagerkoncentration: 10 mg/mL |
1. Rekonstruera 10 mg insulin i 300 μL av 10 mM NaOH 2. Tillsätt försiktigt 1 M NaOH tills lösningen blir klarö- 3. Fyll till 1 mL med sterilt vatten. |
Tabell 1: Aktielösningar och medieberedning. Listade är alla komponenter och volymer som används för att förbereda media för iPSCs underhåll och differentiering protokoll, samt stamlösningar av tillväxtfaktorer och små molekyler. För stamlösningar är alla lagerkoncentration och protokoll för rekonstitution noterade.
|
Gelatin/Sackaros Slutlig koncentration: 7,5 %/15 % w/w |
1. Väg 15 g sackaros och 7,5 g gelatin i en steril Schott GlassFlaska och blanda väl 2. Värm för varm PBS 1× vid 65 °C 3. Lägg till förvrevd PBS 1× till en slutvikt på 100 g och blanda väl 4. Placera Schott Glasflaskan i en värmeplatta vid 65 °C och skaka tills gelatinet smälter 5. Inkubera vid 37 °C tills lösningen stabiliseras |
|
Glycin Slutkoncentration: 0,1 M |
Tillsätt 0,37 g glycin till 50 mL nyberedda PBS 1×. |
|
Triton lösning Slutlig koncentration: 0,1 % w/v |
1. Bered ett 10 % Triton X-100-lager: 5 g Triton X-100 i 50 mL pbs 1× 2. Lägg till 0,5 mL Triton X-100 lager till 50 mL pbs 1×. |
|
TBST 20 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,05 % w/v Tween-20 |
20 mL Tris 1 M 30 mL NaCl 5 M 5 mL Tween-20 (10 % lager: 5 g Tween-20 i 50 mL vatten) Fyll till 1 L med vatten. |
| Blockerande lösning | Tillsätt 5 mL av fetalt bovint serum (FBS, slutkoncentration: 10 % v/v) till 50 mL TBST. |
| DAPI-lösning | Tillsätt 15 μL DAPI-stamlösning (1 mg/mL) till 10 mL destilat vatten |
| Mowiol | 1. Tillsätt 2,4 g Mowiol till 6 g glycerol och skaka i 1 h i en förvarad platta vid 50 °C 2. Tillsätt 6 mL destillerat vatten och skaka i 2 h 3. Tillsätt 12 mL tris 200 mM (pH 8,5) och skaka i 10 min 4. Centrifugera vid 5 000 × g i 15 min 5. Aliquot och förvara vid -20 °C. |
Tabell 2: Lösningar för beredning av organoider för kryosektionering och immunfärgning. Listade är alla de komponenter och volymer som används för att förbereda de lösningar som används vid beredning av organoider för kryosektioner och immunfärgning.
| Antikropp | Värdarter | Utspädning |
| BARHL1 | Kanin | 1/500 |
| CALBINDIN | Kanin | 1/500 |
| KARTA2 | Musen | 1/1000 |
| N-CADHERIN | Musen | 1/1000 |
| NESTIN | Musen | 1/400 |
| OLIG2 | Kanin | 1/500 |
| PAX6 | Kanin | 1/400 |
| SOX2 | Musen | 1/200 |
| TBR1 | Kanin | 1/200 |
| TBR2 | Kanin | 1/200 |
| TUJ1 | Musen | 1/1000 |
Tabell 3: Primära antikroppar. De primära antikroppar, klon och optimerade utspädningar som används för immunfärgning är listade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Behovet av stora cellnummer samt definierade odlingsförhållanden för att generera specifika celltyper för läkemedelsscreening och regenerativa medicintillämpningar har varit drivande i utvecklingen av skalbara odlingssystem. Under de senaste åren har flera grupper rapporterat skalbar generation av neurala progenitors och funktionella nervceller32,33,34, ger betydande framsteg i utvecklingen av nya modeller för neurodegenerativa sjukdomar. Icke desto mindre, rekapitulation av vissa kritiska händelser av embryonal utveckling saknas fortfarande, och upprätthållandet av de genererade funktionella nervceller i suspension under lång tid har ännu inte uppnåtts34. Presenteras här är en dynamisk 3D-kultur system kunna generera iPSC-härledda neurala organoider med cerebellar identitet, och att ytterligare främja mognad i funktionella cerebellar nervceller under kemiskt-definierade och feeder-fria förhållanden i dynamisk kultur.
Innan du börjar cerebellar differentiering, är det viktigt att upprätthålla kvaliteten på den mänskliga iPSCs. För att inte äventyra differentieringen bör alltså inte mer än tre passager av iPSCs utföras från upptining till bioreaktor inokulering. Ett viktigt steg i differentieringsprotokollet är att utvärdera den sammanlagda storleken. Den sammanlagda storleken har en avgörande roll för att förmå differentiering mot en specifik cellinje29. Förutom att, det finns en minsta storlek tröskel som verkar gynna differentiering35. Som redan rapporterats, den optimala iPSC-härledda sammanlagda diametern för att främja en effektiv neuralaengagemang 31,32 och cerebellar differentiering21 är en ~ 200 μm diameter.
Dessutom, i detta dynamiska protokoll, den agitation hastighet som används under de första dagarna av kultur är avgörande för att kontrollera den sammanlagda diametern och neuralinduktion. Kulturen började vid 27 varv/min, vilket är tillräckligt för att främja iPSCs aggregering och för att undvika bildandet av större aggregat (diametrar över 350 μm bör undvikas). Den agitation som används för att främja cellaggregering efter encellssådd kunde ökas till 30 rpm utan att påverka cellernas livskraft; högre agitationshastigheter förväntas dock ge mindre aggregat. Beroende på iPSC-linjen, 24 h efter cellsådd med 27 rpm, förväntas två olika scenarier: aggregaten som bildas presenterar mindre diametrar (<200 μm) eller har nått ett storleksintervall mellan 200–300 μm. Om aggregaten är större än 350 μm vid 24 h efter cellsådd bör differentiering inte utföras, och cellsådden bör upprepas, eftersom effektiviteten i differentieringen kommer att vara mycket låg. Om aggregaten är mindre än 200 μm, bör det förbrukade mediet bytas ut mot iPSC-underhållsmedium, och agitationshastigheten minskas till 25 rpm. Med denna justering förväntas den sammanlagda diametern öka från dag 1 till dag 2, troligen på grund av sammanslagningen av enskilda aggregat som främjas av minskningen av agitationshastigheten. Vid aggregat med storlekar mellan 200–300 μm, bör det förbrukade mediet bytas ut mot differentieringsmedium, och neural induktion med FGF2 ska startas efter 2 dagar i kultur. Vid denna punkt bör agitation hastigheten också minskas något för att förhindra överdriven celldöd, eftersom celler är mer känsliga för skjuvning stress i närvaro av differentiering medium. Dessutom kunde populationshomogeniteten analyseras med hjälp av variationskoefficienten (CV), som mäter variabiliteten genom att korrelera standardavvikelse med medelvärdet av aggregatdiametrar, enligt ekvationen
i vilket δ representerar standardavvikelsen för den sammanlagda diametern och μ är den genomsnittliga diametern. I detta dynamiska system var det observerade genomsnittliga CV:t 12,5 ± 3,3 % (genomsnittlig ± SD) för F002,1A.13-cellinjen och 19,0 ± 0,37 % för cellinjen iPSC6.2 vid dag 2. I detta system bör således en homogen storlekspopulation med ett CV under 0,2 (< 20 % av variationen) förväntas. Efter 7 dagars differentiering varierade den genomsnittliga sammanlagda diametern från 300–360 μm, och agitationshastigheten ökades till 30 varv/min för att förhindra att aggregaten skulle sätta sig i botten av 0,1 L VW-bioreaktorn.
Differentiering av cerebellära organoider fram till dag 35 och analysen av aggregerad storlek i statiska förhållanden rapporterades nyligen21. Författarna visade att 3D aggregat bildas och underhålls i plattor (t.ex., Aggrewell) fram till dag 7 av differentiering var homogena i storlek och form21. Men efter att ha överfört aggregaten till ultra-låg fastsättning 6 väl kultur plattor, aggregaten började variera i storlek och morfologi21. Dag 35 vid statiska förhållanden nådde några av 3D-aggregaten 1 000 μm för olika cellinjer, vilket begränsade diffusionen av näringsämnen och syre. Med hjälp av våra dynamiska förhållanden nådde aggregat däremot inte mer än 800 μm i diameter dag 35, med förbättrad massöverföring på grund av den konstanta agitationen av mediet som främjades av det vertikala hjulet. Vidare bibehölls de sammanlagda storlekarna fram till slutet av mognadsprocessen, vilket visade en samlad diameter på 646,6 ± 104,2 μm dag 90, den längsta odlingen som utfördes i 0,1 L VW bioreaktorer.
Effektiv cerebellar induktion var framkallas av sekventiella tillägg av SB431542, FGF2, FGF19 och SDF1 i detta 3D dynamiska system. Protokollet börjar med kombinationen av SB431542, som är en omvandlande tillväxtfaktor beta (TGF-ß)-receptorblockerare som hämmar mesendodermal differentiering, och FGF2, som har en stor effekt i caudalization av neuroepithelial vävnad25. Därför är tillsats av dessa två molekyler under de första kulturdagarna avgörande för att främja celldifferentieringen till mitten av hindbrain, det territorium som ger upphov till cerebellära vävnaden. Efter inledande induktion till mitten av hindbrain vävnad, är det nödvändigt att lägga till FGF19 för att främja den spontana generationen av mitten av hindbrain strukturer med dorsal-ventral polaritet, samt generering av olika cerebellar progenitors36,26. SDF1 underlättar organisationen av distinkta lager av cerebellar progenitors, som ses på utvecklingsstadiet där cerebellar neurogenessker 27. Fram till dag 35, dessa molekyler kan främja organisationen av cerebellära organoider som kan rekapitulera mänskliga cerebellar utveckling, vilket motsvarar den första trimestern lillhjärnan. Efter organisationen av cerebellar progenitors i olika lager, en definierad neuronal medium användes för att främja deras mognad28. Andra medier som används för att upprätthålla neuronala celler kan också testas, men lägre effektivitet förväntas. Således, i detta protokoll, BrainPhys användes för att främja differentiering av cerebellar-engagerade celler i cerebellar nervceller, eftersom det har rapporterats att bättre efterlikna den friska neuronala miljön och att stödja neurofysiologiska aktiviteten hos de genererade nervceller28.
Med hjälp av dessa dynamiska förhållanden, en effektivare diffusion av näringsämnen, syre, och tillväxtfaktorer kan uppnås. Vissa begränsningar är dock förknippade med den agitation som används i differentieringsprotokollet. Vissa skjuvning stress kan införas genom agitation processen, som kan påverka överlevnad, spridning, och differentiering av celler. Därför måste kulturen, under mognadssteget, där cellerna är känsligare, övervakas noggrant.
Differentiering av cerebellära organoider som påminner om mänskliga embryonala cerebellar utveckling har redan rapporterats7. Ytterligare mognad av dessa embryonala cerebellar organoider i cerebellar nervceller med hjälp av 3D kulturer är dock fortfarande en utmaning. Genereringen av funktionella cerebellar nervceller uppnåddes endast genom kokulerande med granulat cellerfrån olika källor 4,7,15. Detta protokoll framgångsrikt upscaled cerebellar engagemang av mänskliga iPSCs; dessutom är detta det första protokollet för differentiering av olika cerebellar nervceller i ett 3D-odlingssystem utan koculturing med feederceller. Specifikt kan följande celltyper produceras i vårt dynamiska odlingssystem: Purkinje-celler (Calbindin+), granulceller (PAX6+/MAP2+), unipolära penselceller (TBR2+), och djupa cerebellära kärnprojektionsnervceller (TBR1+), som bibehölls i suspension så länge som 3 månader.
Den skalbara generationen av cerebellar organoider utgör ett värdefullt verktyg för att studera den embryonala utvecklingen av lillhjärnan och de patologiska vägar som är involverade i degenerering av detta organ. Vidare kan screening med hög genomströmning för molekyler som återställer cerebellärfunktionen utföras med hjälp av organoider som erhållits med detta skalbara system. Sammantaget uppfyller denna metod ett otillfredsställt behov av ett skalbart protokoll för generering av högkvalitativa cerebellära organoider som kan vara viktiga för en mängd olika biomedicinska tillämpningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna YH och SJ är anställda hos PBS Biotech. Författaren BL är VD och medgrundare av PBS Biotech, Inc. Dessa samarbetande författare deltog i utvecklingen av de bioreaktorer som användes i manuskriptet. Detta ändrar inte författarnas anslutning till alla riktlinjer i tidskriften om att dela data och material. Alla andra författare förklarar ingen intressekonflikt.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), Portugal (UIDB/04565/2020 genom Programa Operacional Regional de Lisboa 2020, Project N. 007317, PD/BD/105773/2014 till T.P.S och PD/BD/128376/2017 till D.E.S.N.), projekt som samfinansieras av FEDER (POR Lisboa 2020—Programa Operacional Regional de Lisboa PORTUGAL 2020) och FCT genom bidrag PAC-PRECISE LISBOA-01-0145-FEDER-016394 och CEREBEX Generation av Cerebellar Organoider för Ataxia Research bevilja LISBOA-01-0145-FEDER-029298. Finansiering mottogs också från Europeiska unionens forsknings- och innovationsprogram Horisont 2020, inom ramen för bidragsavtalet nummer 739572—"The Discoveries Centre for Regenerative and Precision Medicine H2020-wideSPREAD-01–2016–2017".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3MM paper | WHA3030861 | Merck | |
| Accutase | A6964 - 500mL | Sigma | cell detachment medium |
| Anti-BARHL1 Antibody | HPA004809 | Atlas Antibodies | |
| Anti-Calbindin D-28k Antibody | CB28 | Millipore | |
| Anti-MAP2 Antibody | M4403 | Sigma | |
| Anti-N-Cadherin Antibody | 610921 | BD Transduction | |
| Anti-NESTIN Antibody | MAB1259-SP | R&D | |
| Anti-OLIG2 Antibody | MABN50 | Millipore | |
| Anti-PAX6 Antibody | PRB-278P | Covance | |
| Anti-SOX2 Antibody | MAB2018 | R&D | |
| Anti-TBR1 Antibody | AB2261 | Millipore | |
| Anti-TBR2 Antibody | ab183991 | Abcam | |
| Anti-TUJ1 Antibody | 801213 | Biolegend | |
| Apo-transferrin | T1147 | Sigma | |
| BrainPhys Neuronal Medium N2-A & SM1 Kit | 5793 - 500mL | Stem cell tecnhnologies | |
| Chemically defined lipid concentrate | 11905031 | ThermoFisher | |
| Coverslips 24x60mm | 631-1575 | VWR | |
| Crystallization-purified BSA | 5470 | Sigma | |
| DAPI | 10236276001 | Sigma | |
| Dibutyryl cAMP | SC- 201567B -500mg | Frilabo | |
| DMEM-F12 | 32500-035 | ThermoFisher | |
| Fetal bovine serum | A3840001 | ThermoFisher | |
| Gelatin from bovine skin | G9391 | Sigma | |
| Glass Copling Jar | E94 | ThermoFisher | |
| Glutamax I | 10566-016 | ThermoFisher | |
| Glycine | MB014001 | NZYtech | |
| Ham’s F12 | 21765029 | ThermoFisher | |
| Human Episomal iPSC Line | A18945 | ThermoFisher | iPSC6.2 |
| IMDM | 12440046 | ThermoFisher | |
| Insulin | 91077C | Sigma | |
| iPS DF6-9-9T.B | WiCell | ||
| Iso-pentane | PHR1661-2ML | Sigma | |
| L-Ascorbic acid | A-92902 | Sigma | |
| Matrigel | 354230 | Corning | basement membrane matrix |
| Monothioglycerol | M6154 | Sigma | |
| Mowiol | 475904 | Millipore | mounting medium |
| mTeSR1 | 85850 -500ml | Stem cell technologies | |
| N2 supplement | 17502048 | ThermoFisher | |
| Neurobasal | 12348017 | ThermoFisher | |
| Paraformaldehyde | 158127 | Sigma | |
| PBS-0.1 Single-Use Vessel | SKU: IA-0.1-D-001 | PBS Biotech | |
| PBS-MINI MagDrive Base Unit | SKU: IA-UNI-B-501 | PBS Biotech | |
| Recombinant human BDNF | 450-02 | Peprotech | |
| Recombinant human bFGF/FGF2 | 100-18B | Peprotech | |
| Recombinant human FGF19 | 100-32 | Peprotech | |
| Recombinant human GDNF | 450-10 | Peprotech | |
| Recombinant human SDF1 | 300-28A | Peprotech | |
| ROCK inhibitor Y-27632 | 72302 | Stem cell technologies | |
| SB431542 | S4317 | Sigma | |
| Sucrose | S7903 | Sigma | |
| SuperFrost Microscope slides | 12372098 | ThermoFisher | adhesion microscope slides |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | 25608-930 | VWR | |
| Tris-HCL 1M | T3038-1L | Sigma | |
| Triton X-100 | 9002-93-1 | Sigma | |
| Tween-20 | P1379 | Sigma | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | 15575020 | ThermoFisher |
References
- Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Thomson, J. A. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Ishida, Y., et al. Vulnerability of Purkinje Cells Generated from Spinocerebellar Ataxia Type 6 Patient-Derived iPSCs. Cell Reports. 17 (6), 1482-1490 (2016).
- Liu, Y., Zhang, S. C. Human stem cells as a model of motoneuron development and diseases. Annals of the New York Academy of Sciences. 1198, 192-200 (2010).
- Mariani, J., Coppola, G., Pelphrey, K. A., Howe, J. R., Vaccarino, F. M. FOXG1-Dependent Dysregulation of GABA/ Glutamate Neuron Differentiation in Autism Spectrum Disorders. Cell. 162 (2), 375-390 (2015).
- Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. Self-Organization of Polarized Cerebellar Tissue in 3D Culture of Human Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).
- Qian, X., et al. Generation of human brain region-specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor. Nature Protocols. 13 (3), 565-580 (2018).
- Aubry, L., et al. Striatal progenitors derived from human ES cells mature into DARPP32 neurons in vitro and in quinolinic acid-lesioned rats. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (43), 16707-16712 (2008).
- Gunhanlar, N., et al. A simplified protocol for differentiation of electrophysiologically mature neuronal networks from human induced pluripotent stem cells. Molecular Psychiatry. 23 (5), 1336-1344 (2018).
- Hu, B. Y., Zhang, S. C. Differentiation of spinal motor neurons from pluripotent human stem cells. Nature Protocols. 4 (9), 1295-1304 (2009).
- Jo, J., et al. Midbrain-like Organoids from Human Pluripotent Stem Cells Contain Functional Dopaminergic and Neuromelanin-Producing Neurons. Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).
- Muguruma, K., et al. Ontogeny-recapitulating generation and tissue integration of ES cell-derived Purkinje cells. Nature Neurosciences. 13 (10), 1171-1180 (2010).
- Watson, L. M., Wong, M. M. K., Vowles, J., Cowley, S. A., Becker, E. B. E. A Simplified Method for Generating Purkinje Cells from Human-Induced Pluripotent Stem Cells. The Cerebellum. 17 (4), 419-427 (2018).
- Wang, S., et al. Differentiation of human induced pluripotent stem cells to mature functional Purkinje neurons. Science Reports. 5, 9232 (2015).
- Tao, O., et al. Efficient generation of mature cerebellar Purkinje cells from mouse embryonic stem cells. Journal of Neuroscience Research. 88 (2), 234-247 (2010).
- Croughan, M. S., Giroux, D., Fang, D., Lee, B. Novel Single-Use Bioreactors for Scale-Up of Anchorage-Dependent Cell Manufacturing for Cell Therapies. Stem Cell Manufacturing. , 105-139 (2016).
- Simunovic, M., Brivanlou, A. H. Embryoids, organoids and gastruloids: new approaches to understanding embryogenesis. Development. 144 (6), 976-985 (2017).
- Lou, Y. R., Leung, A. W. Next generation organoids for biomedical research and applications. Biotechnology Advances. 36 (1), 132-149 (2018).
- Silva, T. P., et al. Design Principles for Pluripotent Stem Cell-Derived Organoid Engineering. Stem Cells International. 2019, 1-17 (2019).
- Silva, T. P., et al. Maturation of human pluripotent stem cell-derived cerebellar neurons in the absence of co-culture. Frontiers of Bioengineering and Biotechnology. , (2020).
- Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PLoS One. 6 (4), 18293 (2011).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- Smith, J. R., et al. Inhibition of Activin/Nodal signaling promotes specification of human embryonic stem cells into neuroectoderm. Developmental Biology. 313 (1), 107-117 (2008).
- Yaguchi, Y., et al. Fibroblast growth factor (FGF) gene expression in the developing cerebellum suggests multiple roles for FGF signaling during cerebellar morphogenesis and development. Developmental Dynamics. 238 (8), 2058-2072 (2008).
- Fischer, T., et al. Fgf15-mediated control of neurogenic and proneural gene expression regulates dorsal midbrain neurogenesis. Developmental Biology. 350 (2), 496-510 (2011).
- Bagri, A., et al. The chemokine SDF1 regulates migration of dentate granule cells. Development. 129 (18), 4249-4260 (2002).
- Bardy, C., et al. Neuronal medium that supports basic synaptic functions and activity of human neurons in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (20), 2725-2734 (2015).
- Bauwens, C. L., et al. Control of Human Embryonic Stem Cell Colony and Aggregate Size Heterogeneity Influences Differentiation Trajectories. Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).
- Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., McDevitt, T. C. Engineering the embryoid body microenvironment to direct embryonic stem cell differentiation. Biotechnology Progress. 25 (1), 43-51 (2009).
- Miranda, C. C., et al. Spatial and temporal control of cell aggregation efficiently directs human pluripotent stem cells towards neural commitment. Biotechnology Journal. 10 (10), 1612-1624 (2015).
- Miranda, C. C., Fernandes, T. G., Diogo, M. M., Cabral, J. M. S. Scaling up a chemically-defined aggregate-based suspension culture system for neural commitment of human pluripotent stem cells. Biotechnology Journal. 11 (12), 1628-1638 (2016).
- Bardy, J., et al. Microcarrier Suspension Cultures for High-Density Expansion and Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Neural Progenitor Cells. Tissue Engineering Part C Methods. 19 (2), 166-180 (2013).
- Rigamonti, A., et al. Large-Scale Production of Mature Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Three-Dimensional Suspension Culture System. Stem Cell Reports. 6 (6), 993-1008 (2016).
- Arora, N., et al. A process engineering approach to increase organoid yield. Development. 144 (6), 1128-1136 (2017).
- Gimeno, L., Martinez, S. Expression of chick Fgf19 and mouse Fgf15 orthologs is regulated in the developing brain by Fgf8 and Shh. Developmental Dynamics. 236 (8), 2285-2297 (2007).
