Summary
Præsenteret her er en protokol til at udføre genetisk manipulation i embryonale ilder hjernen ved hjælp af i livmoderen elektroporation. Denne metode giver mulighed for målretning af neurale progenitor celler i neocortex in vivo.
Abstract
Manipulation af genekspression in vivo under embryonal udvikling er den foretrukne metode, når man analyserer de enkelte geners rolle under pattedyrs udvikling. I livmoderen elektroporation er en vigtig teknik til manipulation af genekspression i embryonale pattedyr hjernen in vivo. En protokol for in utero elektroporation af embryonale neocortex af fritter, en lille kødædende, præsenteres her. Ilderen bliver i stigende grad brugt som model for neocortex udvikling, fordi dens neocortex udviser en række anatomiske, histologiske, cellulære og molekylære træk, der også er til stede i menneskelige og ikke-menneskelige primater, men fraværende i gnavere modeller, såsom mus eller rotte. Ved utero elektroporation blev udført på embryonale dage (E) 33, en midneurogenesis fase i ilder. I livmoderen elektroporation mål neurale progenitor celler foring de laterale ventrikler i hjernen. Under neurogenese, disse stamcelleceller giver anledning til alle andre neurale celletyper. Dette værk viser repræsentative resultater og analyser på E37, postnatal dag (P) 1 og P16, svarende til henholdsvis 4, 9 og 24 dage efter in utero elektroporation. På tidligere stadier, afkommet af målrettede celler består hovedsageligt af forskellige neurale progenitor undertyper, mens der på senere stadier mest mærkede celler er postmitotiske neuroner. Således, i livmoderen elektroporation gør det muligt at studere effekten af genetisk manipulation på de cellulære og molekylære funktioner i forskellige typer af neurale celler. Gennem sin virkning på forskellige cellepopulationer, i livmoderen elektroporation kan også bruges til manipulation af histologiske og anatomiske træk ved ilder neocortex. Vigtigere, alle disse virkninger er akutte og udføres med en spatiotemporal specificitet bestemt af brugeren.
Introduction
Den neocortex er det ydre ark af pattedyr cerebrum og sæde for højere kognitive funktioner1,,2,,3,,4,5. For at opnå en akut genetisk manipulation i pattedyr neocortex in vivo under embryonale udvikling, to forskellige metoder er blevet undersøgt: virusinfektion6 og i livmoderen elektroporation7. Begge metoder tillader effektiv målretning af neokortikale celler, men lider af nogle begrænsninger. Den største fordel ved in utero elektroporation i forhold til virusinfektion er evnen til at opnå rumlig specificitet inden for neocortex, som opnås ved at regulere retningen af det elektriske felt.
Da elektroporation først blev vist sig at lette indtræden af DNA i cellerne in vitro8, er det blevet anvendt til at levere DNA i forskellige hvirveldyr in vivo. I udviklingsmæssige neurovidenskab, i livmoderen elektroporation af musen neocortex blev først rapporteret i 20019,10. Denne metode består af en injektion af DNA-blandingen i den laterale hjertekammer af embryonale hjernen og efterfølgende anvendelse af det elektriske felt ved hjælp af pincet elektroder, som giver rumlig præcision7,11. I livmoderen elektroporation er siden blevet anvendt til at levere nukleinsyrer for at manipulere udtrykket af endogene eller ektopisk tilsat gener i musen neocortex. Der er for nylig gjort vigtige fremskridt ved at anvende metoden til CRISPR/Cas9-medieret genomredigering via in utero elektroporation i musens neocortex for at udføre (1) genafbrydelse i postmitotiske neuroner12,,13 og neurale progenitorceller14og (2) genom15 og epigenome16 redigering.
Meget snart efter den første rapport i mus, i livmoderen elektroporation blev anvendt på embryonale rotte neocortex17,18. Ikke-gnavere forblev en udfordring, indtil den første in utero elektroporation af fritter, en lille kødædende, blev rapporteret i 201219,20. Siden da er der i utero-elektroporation af fritter blevet anvendt til at undersøge mekanismerne i neocortexudvikling ved at mærke neurale forfædre og neuroner20,21,22,23, der manipulerer ekspressionen af endogene gener, herunder brugen af CRISPR/Cas9-teknologi24, og ved at levere ektopiske gener21,22,25, herunder humanspecifikke gener26. Desuden er der i utero-elektroporation af fritter blevet brugt til at håndtere funktioner i menneskets neocortexudvikling under patologiskeforhold 27,28.
I forbindelse med neocortex udvikling, fordelene ved at bruge fritter som en model organisme i forhold til mus skyldes det faktum, at fritter bedre opsummere en række menneskelignende funktioner. På det anatomiske niveau udviser fritter et karakteristisk mønster af kortikal foldning, som også er til stede i menneskelige og de fleste andre primater, men er helt fraværende hos mus eller rotter4,,29,30,31. På histologisk niveau fritter har to forskellige subventrikulære germinal zoner, benævnt de indre og ydre subventrikulære zoner (ISVZ og OSVZ, henholdsvis)32,33, adskilt af den indre fiber lag23. Disse funktioner deles også med primater, herunder mennesker, men ikke med mus34. ISVZ og OSVZ i fritter og mennesker er befolket med rigelige neurale progenitor celler, mens den subventricular zone (SVZ) af mus indeholder kun sparsomme neurale forfædre21,,32,35,36. På celleniveau udviser fritter en høj andel af en undertype af neurale progenitorer benævnt henholdsvis basale eller ydre radiale glia (bRG eller oRG), som anses for medvirkende til den evolutionære udvidelse af pattedyrets neocortex34,37,38. bRG er derfor meget rigelige i fosterets og embryonale ilder neocortex, men de er meget sjældne i embryonale mus neocortex35,36. Endvidere, fritte bRG viser morfologisk heterogenitet svarende til human bRG, langt bedre end mus bRG21. Endelig, på et molekylært niveau, udvikle ferret neocortex viser genekspression mønstre meget lig dem af føtale menneskelige neocortex, som formodes at kontrollere udviklingen af kortikale foldning, blandt andet39.
De cellebiologiske og molekylære egenskaber af ilder bRG gør dem meget prolifererende, svarende til humane bRG. Dette resulterer i en øget produktion af neuroner og udvikling af en udvidet og meget kompleks neocortex34. Disse egenskaber gør fritter fremragende model organismer til at studere menneskelignende træk ved neocortex udvikling, der ikke kan modelleres i mus26,40. For at drage fuld fordel af ilderen som modelorganisme blev den præsenterede metode udviklet. Den består af i utero elektroporation af E33 fritte embryoner med en plasmid udtrykke GFP (pGFP) under kontrol af en allestedsnærværende promotor, CAG. De elektroporerede embryoner kan derefter analyseres embryonisk eller postnatalt. For at reducere antallet af ofrede dyr, er hun fritter (jills) steriliseret af hysterektomi og doneret til vedtagelse som kæledyr. Hvis de målrettede embryoner høstes på embryonale stadier, en anden operation udføres, og embryonerne fjernes af en kejsersnit, mens jills er hysterectomized. Hvis de målrettede embryoner analyseres på postnatal stadier, jills er hysterectomized efter hvalpene er blevet vænnet eller ofret. Derfor er en protokol for hysterektomi af jills også præsenteret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøgsprocedurer blev gennemført efter aftale med den tyske dyrevelfærdslovgivning efter godkendelse fra Landesdirektion Sachsen (licenser TVV 2/2015 og TVV 21/2017).
1. Forberedelse til in utero elektroporation
- Forbered DNA-blandingen. I denne protokol anvendes en endelig koncentration på 1 μg/μL pGFP. Opløs DNA i PBS og supplere med 0,1% Fast Green for at lette visualisering. Når den er forberedt, blandes DNA-blandingen ved at pipettere op og ned flere gange eller ved at trykke med fingre. Opbevares ved stuetemperatur indtil brug.
BEMÆRK: Ved coelectroporationer er DNA-blandingen forberedt til at indeholde en endelig koncentration på 1 μg/μL plasmid, der kodning et gen af interesse sammen med 0,5 μg/μL pGFP fortyndet i PBS. - Forbered operationsbordet med alle de nødvendige værktøjer og instrumenter.
- Træk glas kapillærer ved hjælp af mikropipette puller. Kapillærspidsens diameter justeres ved at afskære den distale del af kapillæren ved hjælp af hændekar som tidligere beskrevet41.
2. Forberedelse af fritter til kirurgi
- Hold de gravide jills med embryoner på E33 fastende i mindst 3 timer før operationen for at reducere risikoen for opkastning.
- Forud for operationen sterilisere alle de værktøjer ved autoclaving. Udfør operationen i et specielt tildelt rum under aseptiske forhold for at eliminere potentielle forureningskilder.
- Placer den gravide jill i narkosekassen med 4% isofluran.
- Når bedøvet, placere ilder på operationsbordet med en varmepude og fastgør narcosis maske med en konstant 2-3% isofluran flow til næsen. For at sikre et passende niveau af anæstesi, kontrollere for manglen på følgende reflekser:
- Den palpebral refleks ved at røre den periokulære hud
- Flexor refleks ved at klemme huden mellem 2nd og 3rd, eller 3rd og 4th tå af begge bagben
- Hvis palpebral refleks er fraværende og flexor refleks er klart reduceret, kontrollere for smerte refleks ved at klemme en tå af hver bagben.
BEMÆRK: Sørg for at have et stetoskop ved hånden for at overvåge puls og rytme, hvis det er nødvendigt.
- Fritte subkutant injiceres med smertestillende (0,1 ml metamizol, 50 mg/kg kropsvægt), antibiotika (0,1 ml/kg kropsvægt på 20 mg/kg amoxicillin + clavulansyre) og glucose (10 ml 5% glukoseopløsning).
- Placer en dråbe af øjet salve løsning på øjnene for at forhindre øjet dehydrering under den kirurgiske procedure.
- Barber frittemaen ved hjælp af en barbermaskine.
- Rengør huden med vand og sæbe, desinficere maven med 70% ethanol krat, desinficere 2x med jod, og lad det tørre.
3. I utero elektroporation af fritter
- Sørg for, at det kirurgiske område er sterilt: Placer sterile kirurgiske værktøjer på sterilt væv, og skift pels og handsker.
- Placer en steril kirurgisk drapere på dyret.
- Ved hjælp af en skalpel, kirurgisk åbne maven på linea alba med en ~ 5 cm lang snit.
- Skær muskellaget ved hjælp af en saks.
- Placer gaze podninger omkring indsnitstedet og våd dem med PBS. Gaze podning vil absorbere den ekstra PBS, der vil blive tilføjet under operationen.
BEMÆRK: Bevar varmen og PBS støtte under hele operationen. - Eksponere ilder livmoderen og læg den på gaze podninger.
- Læg en glaskapillær i med injektionsopløsningen ved hjælp af en pipette med en lang læssetip. Sørg for, at belastningsmængden er ca. 5-20 μL afhængigt af antallet af embryoner og antallet af forskellige forsøgsbetingelser. Det gennemsnitlige indsprøjtede volumen pr. embryo er 3-5 μL. Fastgør den indlæste glaskapillær til en holder og tilslut den anden side af holderen til et rør og et mundstykke.
- Undersøg det første foster og find hovedet.
- Placer den fiberoptiske lyskilde ved siden af fosterets hoved for at lette visualiseringen.
BEMÆRK: Ferret uterus vægge er meget mørke, og det er svært at se gennem dem, medmindre lyset er skinnede direkte på dem. - Udfør en enkelt intraventrikulær injektion i hjertekammer af en af de cerebrale halvkugler og holde den anden halvkugle intakt til at tjene som en intern kontrol. Ventrikel selv er ikke let at særskilt med øjet, så dens placering er anslået baseret på placeringen af pigmenteret iris, som er synlig. Den intraventrikulære injektion sker ved at tage indehaveren fastgjort til glas kapillær og trænge ind i huden, kraniet, og cerebralt væv med spidsen af glasset kapillær.
BEMÆRK: Sørg for ikke at beskadige moderkagen, som er mørkere end murine placentas.- Når spidsen af glaskapillæren er i hjertekammer, injiceres ca. 3-5 μL af injektionsopløsningen ved mundrørning ved hjælp af mundstykket, der er forbundet til glaskapillærholderen. Fordi den injicerede opløsning indeholder 0,1% Fast Green, vil den injicerede hjertekammer nu blive mørkegrøn, og vil være synlig som en nyreformet struktur.
- Anbring pincetelektroderne på livmoderen over fosterets hoved, så den positive pol placeres over det område, der vil blive ramt, og den negative pol under det injicerede område.
- Indstil følgende elektroporationsforhold på elektroporatoren: Pulslængde = 50 ms; Pulsspænding = 100 V; Pulsinterval = 1 s; Antal impulser = 5. Tryk derefter på knappen "Pulse" på elektroporatoren.
- Slip hurtigt flere dråber varm 1x PBS på det elektroporerede embryo.
- Gentag proceduren for alle embryoner. Hold livmoderen konstant våd med varm PBS.
BEMÆRK: Hvis de første embryoner, der vender ud mod skeden, ikke er let tilgængelige, er det bedst ikke at elektroporate dem. - Når alle embryoner er elektroporeret, skal du placere livmoderen tilbage i bughulen.
- Sutur muskellaget med bughinden ved hjælp af en 4-0 sutur.
- Sutur huden ved hjælp af samme tykkelse og spray såret med aluminium spray.
- Placer dyret i et bur og holde det varmt med en varmekilde. Overvåg forsigtigt dyret, indtil det vågner.
4. Postoperativ pasning og opboning af måldyr
- I 3 dage efter operationen sikre, at dyrene gennemgår følgende postoperative pleje: 20 mg/kg amoxicillin (antibiotikum) 1x dagligt; 25 mg/kg metamizol (smertestillende) 3x dagligt.
- Sørg for, at fritterne er anbragt individuelt.
- Sørg for, at fritterne undersøges af en dyrlæge mindst 1x pr. dag.
- Sørg for, at fritterne forstyrres så lidt som muligt under leveringen.
- Efter hvalpene er fravænnet eller ofret, forberede jills for hysterektomi.
5. Hysterektomi af fritter
BEMÆRK: En hysterektomi udføres for at reducere antallet af ofre dyr, således at de steriliserede dyr kan doneres til vedtagelse som kæledyr. Den presurgiske procedure for hysterektomi er den samme som i trin 2.
- Barber og steriliser ildemaven som beskrevet i trin 3.1 og 3.2.
- Kirurgisk åbne maven på linea alba. Skær muskellaget. Løft muskellaget og ly tarmen med en finger, mens fuldt åbne muskel lag.
- Placer gazesvaberprøver rundt om indsnitsstedet, og våd dem med steril PBS. Eksponere ilder livmoderen og æggestokkene og placere dem på gaze podninger.
- Start hysterektomi på den ene side ved at ligating arterierne ovarica og vena ovarica kraniel til mesovar. Sæt en klemme på hver side af ligationen og udføre en anden ligation kraniel til klemmer. Fastgør den tredje klemme i enderne af ligationen for at gemme dem. Gentag på den anden side.
- Skær mellem klemmerne og løsrive cornua uteri fra mesenteri på begge sider.
- Ligate arteria uterina på begge uterine sider caudal til ostium uteri. Derefter ligate skeden og fastsætte ligatur. Fastgør klemmen i enderne af ligationerne for at gemme dem. Sæt to klemmer kranie til ligaturen. Skær mellem klemmerne og løsrive livmoderen fra skeden. Fjern livmoderen og æggestokkene og bortskaffe dem. Skrab den resterende slimhinde fra livmoderen butt.
- Fjern alle de resterende klemmer og forkort ligaturenderne. Sørg for at kontrollere for blødning, efter at klemmerne er fjernet.
- Sutur muskellaget og huden som beskrevet i trin 3.16 og 3.17. Følg postoperativ protokollen som i trin 3.18 og 4.1-4.3. Hold dyrene på dyreanlægget i mindst 2 uger med regelmæssige veterinærbesøg. Når dyrene er fuldt tilbagebetalt, kan de doneres til vedtagelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I livmoderelektæration af fritter ved E33 resulterede i målretning af de neurale progenitorceller foring ventrikulære overfladen af embryonale neocortex (Figur 1). Disse celler kaldes apikale forfædre og er meget proliferative, hvilket giver anledning til alle andre celletyper under udviklingen. Efter asymmetrisk opdeling genererede apikale progenitorer en anden apinisk stamfader og en mere differentieret celle, typisk en basal stamfader (BP), som delaminerede fra ventrikulær overflade. BPs migreret ind i den sekundære germinal zone, SVZ. Når elektroporationen blev udført på E33, mange nyfødte BPs migreret til basal-meste af SVZ, hvor de dannede OSVZ22.
Da virkningerne af elektroporation blev undersøgt 4 dage senere på E37, var de fleste af de målrettede celler og deres afkom stadig i germinale zoner (VZ, ISVZ og OSVZ, se figur 2A), og cellerne var sjældent til stede yderligere basalt i den kortikale plade (CP). Afkomnet af målrettede celler bestod hovedsageligt af neurale stamfader typer og nyfødte neuroner. Stamfaderidentiteten kan undersøges ved immunfluorescens for markører for cykelceller, såsom PCNA26 (Figur 2B, C), mens en undergruppe af stamfader, der gennemgår mitose, kan påvises ved hjælp af markører som fosforsten 3 (PH3)21 (Figur 2D).
Ved P0, 8 dage efter elektroporation, blev afkomet af målrettede celler spredt i alle histologiske lag (Figur 3A, B). På dette stadium var BPs særligt rigelige, og bRG var let identificerbare. Ved hjælp af en kombination af transskriptionsfaktormarkører kan forskellige BP-populationer afsløres. Sox2 er en markør for proliferative progenitor celler, herunder bRG26. Tbr2 er en markør for neurogene BPs, som hovedsagelig er mellemliggende forfædre26 (Figur 3B). Fordi embryonerne var co-elektroporated med en plasmid kodning GFP, morfologi af neurale forfædre kunne undersøges ved at spore GFP signal. Dette er især vigtigt i forbindelse med BPs, som kommer i to store morfotyper: multipolære celler, som er stort set mellemliggende forfædre, og radiale celler, som er bRG21. Derfor, Sox2 + Tbr2- radiale celler i OSVZ er den vigtigste celle befolkning af interesse for at studere bRG26.
Ved P16, et flertal af målrettede celler stoppede dividere og differentieret i neuroner og glia. Derfor undersøges disse celletyper bedst på nuværende tidspunkt. Ud over forskellige neuronale og glia undertyper, ferret P16 neocortex udstillet karakteristika mønster af foldning (Figur 3C). På dette stadium var de fleste større gyri og sulci allerede til stede, og potentielle hjerneområder kunne identificeres31. Ferret hjernen fortsatte modning efter P16, når processer som myelinisering og synaptogenesis finder sted.
Figur 1: Målretning neurale celler ved in utero elektroporation af ilder neocortex. I livmoderelektæration af fritret neocortex på E33 resulterede i målretning af apikale stamfader. Under udviklingen disse celler giver anledning til alle andre celletyper. Basale stamfader blev bedst undersøgt ved senere embryonale (E37) og perinatale (P0) stadier. Neuroner blev bedst undersøgt på postnatal stadier, såsom P16. Kortikale lag: VZ = ventrikelzone; ISVZ = indre subventricular zone; OSVZ = ydre subventricular zone; IZ = mellemliggende zone; CP = kortikal plade; GZ = germinale zoner (VZ+SVZ); WM = hvidt stof. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Eksempel på E37 ferret neocortex efter in utero elektroporation ved E33. aog b) afsnit af E37-ferret neocortex; grøn, afkom af elektroporerede celler (GFP); blå (A)cellekerner (DAPI) magenta (B), cykelceller (PCNA). Boks (bredde = 777 μm) angiver område vist ved højere forstørrelse i (C). Skalalinje = 1 mm. Bemærk manglen på GFP signal i den kontralaterale (ikke-elektrotroperede halvkugle), der tjener som en intern kontrol. Cog D) større forstørrelser af målområdet grøn, afkom af elektroporerede celler (GFP); magenta (C), cykelceller (PCNA) rød (D), mitotiske celler (fosforsten 3, PH3). Bemærk, at størstedelen af afkom af målrettede celler var i SVZ på dette tidspunkt. Kortikale lag som i figur 1. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Eksempler på P0 og P16 ferret neocortex efter in utero elektroporation ved E33. aog B) del af P0-ferret neocortex; grøn, afkom af elektroporerede celler (GFP); blå (A)cellekerner (DAPI) cyan (B), Sox2; magenta (B), Tbr2. (B) Højere forstørrelse af det elektroporerede område. Skalastænger = 1 mm (A), 100 μm (B). Kortikale lag som i figur 1. c) sektion af P16-ilderen neocortex grøn, afkom af elektroporerede celler (GFP); grå, cellekerner (DAPI); magenta, astrocytter (GFAP). Skalalinje = 1 mm. Dette tal er blevet ændret fra Kalebic et al.25. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I livmoder elektroporation i ilder er en vigtig teknik, med fordele og ulemper med hensyn til andre metoder. Der er kritiske trin og begrænsninger for denne metode, samt potentielle ændringer og fremtidige applikationer til at huske på.
Siden det banebrydende arbejde Victor Borrell og kolleger om genetisk manipulation af postnatal ilder neocortex via elektroporation eller viral injektion35,42,43, ilder er blevet en genetisk tilgængelig model organisme. Etablering af genetisk manipulation under embryonal udvikling via in utero electroporation19,20 åbnet nye forskningsmuligheder ved at tillade målretning af neurale progenitor celler på tidligere udviklingsstadier. I forhold til postnatal manipulation, in utero elektroporation gør det muligt målretning af større områder af neocortex og mindre differentierede neurale forfædre, der sekventielt generere alle andre celletyper af neocortex. Vigtigere, sammenlignet med viral målretning, in utero elektroporation giver mulighed for rumlig præcision målretning.
Den mest kritiske del af metoden er selve operationen. I livmoderen elektroporation af ilder neocortex er betydeligt mere kompleks og vanskelig i forhold til proceduren i mus. Livmodervæggene er mørkere, og embryonerne er vanskeligere at skelne mellem. Derudover har voksne fritter større husdyrhold og veterinære krav. Særligt udfordrende er perioden omkring fødslen af hvalpene. Fritter er meget følsomme i denne periode og er bedst ikke forstyrret unødigt. De vigtigste begrænsninger i selve tilgangen hænger sammen med, at målretningen er effektiv. I livmoderen elektroporation altid resulterer i målretning af en mosaik af neurale stamfædre. Dette er ideelt til at studere de cellebiologiske aspekter af neurale forfædre eller neuroner, men det er suboptimal for at forårsage store histologiske og anatomiske perturbationer, såsom en ændring i neocortisk foldning. Hvis dette er nødvendigt, er den bedste fremgangsmåde at flytte elektroderne langs rostrocaudal aksen under proceduren for at dække store dele af neocortex. For hele organanalysen er den bedste fremgangsmåde imidlertid generering af transgene fritter fra zygotstaden44.
Den embryonale fase, hvor in utero elektroporation blev udført (E33) er ideel til at studere basale forfædre. Faktisk er elektroporationer og viral målretning på dette tidspunkt blevet anvendt til at afsløre tidspunktet for starten af OSVZ22 samt forskellige cellebiologiske træk ved basale forfædre, der er relevante for deres morfologiogspredning21,25,26. Men afhængigt af det videnskabelige formål med en undersøgelse, kan timingen af elektroporation let ændres uden væsentlige ændringer af metoden19,20. Bortset fra tidsmæssige specificitet, i livmoderen elektroporation giver mulighed for nemme ændringer af den rumlige specificitet. Den dorsolaterale neocortex på rostromedial position langs rostrocaudal akse blev målrettet, hvilket resulterede i mærkning af motor og somatosensoriske områder. Andre neokortikatiske områder kan også målrettes ved at justere placeringen af elektroderne og retningen af det elektriske felt. I mus, den mediale neocortex45 og ventrale telencephalon46 er blevet målrettet ved hjælp af i livmoderen elektroporation, hvilket tyder på, at lignende tilgange kan anvendes i fritter.
Endelig kan in utero elektroporation nemt kombineres med de seneste genom og epigenome redigeringsteknikker13,14,16,25, hvor CRISPR / (d) Cas9 komponenter kan leveres som plasmid eller som et kompleks af rekombinant Cas9 protein og guide RNAs14, med sidstnævnte afkorte den tid, der kræves for genom redigering at finde sted. Det er sandsynligt, at yderligere teknologiske forbedringer i genomredigering vil blive kombineret med in utero elektroporation i både mus og fritter med henblik på at generere præcise genomiske mutationer, der er vigtige for at forstå normal hjerneudvikling og især for at modellere menneskelige patologiske tilstande. I denne sammenhæng, i livmoderen elektroporation bliver i stigende grad brugt som målretning metode valg for efterfølgende forskellige encellede omics tilgange og levende billeddannelse til at forstå de molekylære signaturer og dynamisk adfærd af de målrettede celler og deres afkom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi er taknemmelige for de tjenester og faciliteter max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics for den fremragende støtte, især hele holdet af Biomedical services (BMS) for den fremragende ment af fritter og J. Peychl og hans team af Light Mikroskopi Facility. Vi er især taknemmelige for Katrin Reppe og Anna Pfeffer fra BMS for ekstraordinær veterinær støtte og Lei Xing fra Huttner-gruppen for at hjælpe med ildeoperationer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1ml syringe | BD | 309628 | Electroporation |
| 4-0 Vicryl suture | Ethicon | V392ZG | Surgery |
| Aluminium spray | cp-pharma | 98017 | Surgery |
| Amoxicilin+clavulanic acid (Synulox RTU) | WDT | 6301 | Surgery |
| Cappilary holder | WPI | MPH6S12 | Electroporation |
| Dexpanthenol Ointment solution | Bayer | 6029009.00.00 | Surgery |
| Drape sheet 45x75cm | Hartmann | 2513052 | Surgery |
| Electrode Tweezer, platinum plated 5mm | BTX | 45-0489 | Electroporation |
| Electroporator | BTX | ECM830 | Electroporation |
| Fast Green | Sigma | F7258-25G | Electroporation |
| Ferret Mustela putorius furo | Marshall | NA | Experimental organism |
| Fiber optic light source | Olympus | KL1500LCD | Electroporation |
| Forceps | Allgaier instrumente | 08-033-130 | Surgery |
| Forceps 3C-SA | Rubis Tech | 3C-SA | Surgery |
| Forceps 55 | Dumostar | 11295-51 | Surgery |
| Forceps 5-SA | Rubis Tech | 5-SA | Surgery |
| Gauze swabs large | Hartmann | 401723 | Surgery |
| Gauze swabs small | Hartmann | 401721 | Surgery |
| GFAP antibody | Dako | Z0334 | Antibody |
| GFP antibody | Aves labs | GFP1020 | Antibody |
| Glass cappilaries (Borosilicate glass with filament, OD:1.2mm, ID: 0.69mm, 10cm length) | Sutter Instrument | BF120-69-10 | Electroporation |
| Glucose | Bela-pharm | K4011-02 | Surgery |
| Heat pad | Hans Dinslage | Sanitas SHK18 | Surgery |
| Iodine (Betadine solution 100 mg/ml) | Meda | 997437 | Surgery |
| Isofluran | CP | 21311 | Surgery |
| Loading tips 20µl | Eppendorf | #5242 956.003 | Electroporation |
| Metamizol | WDT | 99012 | Surgery |
| Metzenbaum dissecting scissors | Aesculap | BC600R | Surgery |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | Model P-97 | Electroporation |
| pCAGGS-GFP | NA | NA | From Kalebic et al., eLife, 2018 |
| PCNA antibody | Millipore | CBL407 | Antibody |
| pH3 antibody | Abcam | ab10543 | Antibody |
| Scalpel | Aesculap | 294200104 | Surgery |
| Shaver | Braun | EP100 | Surgery |
| Sox2 antibody | R+D Systems | AF2018 | Antibody |
| Surgical clamp 13cm | WDT | 27080 | Surgery |
| Surgical double spoon (Williger) | WDT | 27232 | Surgery |
| Surgical drape | WDT | 28800 | Surgery |
| Surgical scissors small | FST | 14090-09 | Surgery |
| Suturing needle holder | Aesculap | BM149R | Surgery |
| Tbr2 antibody | Abcam | ab23345 | Antibody |
| Transfer pipette 3ml | Fischer scientific | 13439108 | Surgery |
| Water bath | Julabo | TW2 | Surgery |
References
- Kalebic, N., Long, K., Huttner, W. B. Evolution of Nervous Systems 2e. Kaas, J. 3, Elsevier. 73-89 (2017).
- Rakic, P. Evolution of the neocortex: a perspective from developmental biology. Nature Reviews Neurosciences. 10 (10), 724-735 (2009).
- Dehay, C., Kennedy, H., Kosik, K. S. The outer subventricular zone and primate-specific cortical complexification. Neuron. 85 (4), 683-694 (2015).
- Fernandez, V., Llinares-Benadero, C., Borrell, V. Cerebral cortex expansion and folding: what have we learned. EMBO Journal. 35 (10), 1021-1044 (2016).
- Molnar, Z., et al. New insights into the development of the human cerebral cortex. Journal of Anatomy. 235 (3), 432-451 (2019).
- Janson, C. G., McPhee, S. W., Leone, P., Freese, A., During, M. J. Viral-based gene transfer to the mammalian CNS for functional genomic studies. Trends in Neurosciences. 24 (12), 706-712 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation. Development Growth & Differentiation. 50 (6), 507-511 (2008).
- Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO Journal. 1 (7), 841-845 (1982).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240 (1), 237-246 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. Journal of Visualized Experiments. (6), e239 (2007).
- Straub, C., Granger, A. J., Saulnier, J. L., Sabatini, B. L. CRISPR/Cas9-mediated gene knock-down in post-mitotic neurons. PLoS One. 9 (8), 105584 (2014).
- Shinmyo, Y., et al. CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in the mouse brain using in utero electroporation. Science Reports. 6, 20611 (2016).
- Kalebic, N., et al. CRISPR/Cas9-induced disruption of gene expression in mouse embryonic brain and single neural stem cells in vivo. EMBO Reports. 17 (3), 338-348 (2016).
- Mikuni, T., Nishiyama, J., Sun, Y., Kamasawa, N., Yasuda, R. High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by In Vivo Genome Editing. Cell. 165 (7), 1803-1817 (2016).
- Albert, M., et al. Epigenome profiling and editing of neocortical progenitor cells during development. EMBO Journal. 36 (17), 2642-2658 (2017).
- Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos. Differentiation. 70 (4-5), 155-162 (2002).
- Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E16 rat embryos. Journal of Visualized Experiments. (6), e236 (2007).
- Kawasaki, H., Iwai, L., Tanno, K. Rapid and efficient genetic manipulation of gyrencephalic carnivores using in utero electroporation. Molecular Brain. 5, 24 (2012).
- Kawasaki, H., Toda, T., Tanno, K. In vivo genetic manipulation of cortical progenitors in gyrencephalic carnivores using in utero electroporation. Biology Open. 2 (1), 95-100 (2013).
- Kalebic, N., et al. Neocortical expansion due to increased proliferation of basal progenitors is linked to changes in their morphology. Cell Stem Cell. 24 (4), 535-550 (2019).
- Martinez-Martinez, M. A., et al. A restricted period for formation of outer subventricular zone defined by Cdh1 and Trnp1 levels. Nature Communication. 7, 11812 (2016).
- Saito, K., et al. Characterization of the Inner and Outer Fiber Layers in the Developing Cerebral Cortex of Gyrencephalic Ferrets. Cerebral Cortex. 29 (10), 4303-4311 (2019).
- Shinmyo, Y., et al. Folding of the Cerebral Cortex Requires Cdk5 in Upper-Layer Neurons in Gyrencephalic Mammals. Cell Reports. 20 (9), 2131-2143 (2017).
- Matsumoto, N., Shinmyo, Y., Ichikawa, Y., Kawasaki, H. Gyrification of the cerebral cortex requires FGF signaling in the mammalian brain. Elife. 6, 29285 (2017).
- Kalebic, N., et al. Human-specific ARHGAP11B induces hallmarks of neocortical expansion in developing ferret neocortex. Elife. 7, 41241 (2018).
- Masuda, K., et al. Pathophysiological analyses of cortical malformation using gyrencephalic mammals. Science Reports. 5, 15370 (2015).
- Matsumoto, N., et al. Pathophysiological analyses of periventricular nodular heterotopia using gyrencephalic mammals. Human Molecular Genetics. 26 (6), 1173-1181 (2017).
- Barnette, A. R., et al. Characterization of brain development in the ferret via MRI. Pediatric Research. 66 (1), 80-84 (2009).
- Smart, I. H., McSherry, G. M. Gyrus formation in the cerebral cortex in the ferret. I. Description of the external changes. Journal of Anatomy. 146, 141-152 (1986).
- Sawada, K., Watanabe, M. Development of cerebral sulci and gyri in ferrets (Mustela putorius). Congenital Anomalies (Kyoto). 52 (3), 168-175 (2012).
- Reillo, I., Borrell, V. Germinal zones in the developing cerebral cortex of ferret: ontogeny, cell cycle kinetics, and diversity of progenitors. Cerebral Cortex. 22 (9), 2039-2054 (2012).
- Smart, I. H., McSherry, G. M. Gyrus formation in the cerebral cortex of the ferret. II. Description of the internal histological changes. Journal of Anatomy. 147, 27-43 (1986).
- Borrell, V., Reillo, I. Emerging roles of neural stem cells in cerebral cortex development and evolution. Developmental Neurobiology. 72 (7), 955-971 (2012).
- Reillo, I., de Juan Romero, C., Garcia-Cabezas, M. A., Borrell, V. A role for intermediate radial glia in the tangential expansion of the mammalian cerebral cortex. Cerebral Cortex. 21 (7), 1674-1694 (2011).
- Fietz, S. A., et al. OSVZ progenitors of human and ferret neocortex are epithelial-like and expand by integrin signaling. Nature Neurosciences. 13 (6), 690-699 (2010).
- Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Development and evolution of the human neocortex. Cell. 146 (1), 18-36 (2011).
- Fietz, S. A., Huttner, W. B. Cortical progenitor expansion, self-renewal and neurogenesis-a polarized perspective. Current Opinion in Neurobiology. 21 (1), 23-35 (2011).
- De Juan Romero, C., Bruder, C., Tomasello, U., Sanz-Anquela, J. M., Borrell, V. Discrete domains of gene expression in germinal layers distinguish the development of gyrencephaly. EMBO Journal. 34 (14), 1859-1874 (2015).
- Kawasaki, H. Molecular investigations of the brain of higher mammals using gyrencephalic carnivore ferrets. Neurosciences Research. 86, 59-65 (2014).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. Journal of Visualized Experiments. (54), e3024 (2011).
- Borrell, V. In vivo gene delivery to the postnatal ferret cerebral cortex by DNA electroporation. Journal of Neuroscience Methods. 186 (2), 186-195 (2010).
- Borrell, V., Kaspar, B. K., Gage, F. H., Callaway, E. M. In vivo evidence for radial migration of neurons by long-distance somal translocation in the developing ferret visual cortex. Cerebral Cortex. 16 (11), 1571-1583 (2006).
- Johnson, M. B., et al. Aspm knockout ferret reveals an evolutionary mechanism governing cerebral cortical size. Nature. 556 (7701), 370-375 (2018).
- Vaid, S., et al. A novel population of Hopx-dependent basal radial glial cells in the developing mouse neocortex. Development. 145 (20), 169276 (2018).
- Pilz, G. A., et al. Amplification of progenitors in the mammalian telencephalon includes a new radial glial cell type. Nature Communications. 4, 2125 (2013).
