Summary
Présenté ici est un protocole pour effectuer la manipulation génétique dans le cerveau de furet embryonnaire en utilisant l’électroporation in utero. Cette méthode permet de cibler les cellules progénitrices neuronales dans le néocortex in vivo.
Abstract
La manipulation de l’expression des gènes in vivo au cours du développement embryonnaire est la méthode de choix lors de l’analyse du rôle des gènes individuels au cours du développement des mammifères. L’électroporation in utero est une technique clé pour la manipulation de l’expression génique dans le cerveau embryonnaire des mammifères in vivo. Un protocole pour l’électroporation in utero du néocortex embryonnaire des furets, un petit carnivore, est présenté ici. Le furet est de plus en plus utilisé comme modèle pour le développement du néocortex, parce que son néocortex présente une série de caractéristiques anatomiques, histologiques, cellulaires et moléculaires qui sont également présents chez les primates humains et non humains, mais absents dans les modèles de rongeurs, tels que la souris ou le rat. L’électroporation in utero a été exécutée au jour embryonnaire (E) 33, un stade de midneurogenesis dans le furet. L’électroporation in utero cible les cellules progénitrices neuronales qui tapissent les ventricules latéraux du cerveau. Pendant la neurogenèse, ces cellules progénitrices donnent naissance à tous les autres types de cellules neuronales. Ces travaux montrent des résultats et des analyses représentatifs à l’E37, jour postnatal (P) 1, et P16, correspondant à 4, 9 et 24 jours après l’électroporation in utero, respectivement. À un stade précoce, la progéniture des cellules ciblées se compose principalement de divers sous-types de progéniteur neuronal, alors qu’à des stades ultérieurs la plupart des cellules étiquetées sont des neurones postmitotiques. Ainsi, l’électroporation in utero permet l’étude de l’effet de la manipulation génétique sur les caractéristiques cellulaires et moléculaires de divers types de cellules neuronales. Grâce à son effet sur diverses populations cellulaires, l’électroporation in utero peut également être utilisée pour la manipulation des caractéristiques histologiques et anatomiques du néocortex de furet. Fait important, tous ces effets sont aigus et sont effectués avec une spécificité spatiotemporal déterminée par l’utilisateur.
Introduction
Le néocortex est la feuille extérieure du cerveau des mammifères et le siège des fonctions cognitives supérieures1,2,3,4,5. Afin d’obtenir une manipulation génétique aiguë dans le néocortex mammifère in vivo au cours du développement embryonnaire, deux méthodes différentes ont été explorées : l’infection virale6 et l’électroporation in utero7. Les deux méthodes permettent un ciblage efficace des cellules néocorticales, mais souffrent de certaines limitations. Le principal avantage de l’électroporation in utero par rapport à l’infection virale est la capacité d’atteindre la spécificité spatiale dans le néocortex, qui est atteint en régulant la direction du champ électrique.
Depuis l’électroporation a été montré pour faciliter l’entrée de l’ADN dans les cellules in vitro8, il a été appliqué pour fournir l’ADN dans divers vertébrés in vivo. En neurosciences développementales, l’électroporation in utero du néocortex de souris a été rapportée pour la première fois en 20019,10. Cette méthode consiste en une injection du mélange d’ADN dans le ventricule latéral du cerveau embryonnaire et l’application ultérieure du champ électrique à l’aide d’électrodes de pince à épiler, ce qui permet la précision spatiale7,11. L’électroporation in utero a depuis été appliquée pour délivrer des acides nucléiques afin de manipuler l’expression de gènes endogènes ou électrotopiques ajoutés dans le néocortex de souris. D’importants progrès ont été réalisés récemment en appliquant la méthodologie de l’édition du génome à médiation CRISPR/Cas9 via l’électroporation in utero dans le néocortex de souris pour effectuer (1) la perturbation des gènes dans les neurones postmitotes12,13 et les cellules progénitrices neuronales14, et (2) génome15 et épigénome16 édition.
Très peu de temps après le premier rapport chez la souris, l’électroporation in utero a été appliquée au rat embryonnaire néocortex17,18. Les non-rongeurs sont restés un défi jusqu’à ce que la première électroporation in utero des furets, un petit carnivore, a été signalé en 201219,20. Depuis lors, l’électroporation in utero des furets a été appliquée pour étudier les mécanismes du développement du néocortex en étiquetant les progéniteurs et neurones neuronaux20,21,22,23, manipulant l’expression des gènes endogènes, y compris l’utilisation de la technologie CRISPR/Cas924, et en livrant des gènes ectopiques21,22,25, y compris les gènes spécifiques à l’homme26. En outre, l’électroporation in utero des furets a été utilisée pour traiter les caractéristiques du développement du néocortex humain dans des conditions pathologiques27,28.
Dans le contexte du développement du néocortex, les avantages de l’utilisation des furets comme organisme modèle par rapport aux souris sont dus au fait que les furets récapitulent mieux une série de caractéristiques humaines. Au niveau anatomique, les furets présentent un modèle caractéristique de pliage cortical, qui est également présent chez l’homme et la plupart des autres primates, mais est complètement absent chez les souris ou les rats4,29,30,31. Au niveau histologique, les furets ont deux zones germinales subventriculaires distinctes, appelées zones subventriculaires intérieures et extérieures (ISVZ et OSVZ, respectivement)32,33, séparées par la couche interne de fibre23. Ces caractéristiques sont également partagées avec les primates, y compris les humains, mais pas avec des souris34. L’ISVZ et l’OSVZ chez les furets et les humains sont peuplés de cellules progénitrices neuronales abondantes, tandis que la zone subventriculaire (SVZ) des souris ne contient que des progéniteurs neuronaux clairsemés21,32,35,36. Au niveau cellulaire, les furets présentent une forte proportion d’un sous-type d’ancêtres neuronaux appelés glies radiaux basaux ou externes (bRG ou oRG, respectivement), qui sont jugés instrumentaux pour l’expansion évolutive du néocortex mammifère34,37,38. bRG sont donc très abondants dans le néocortex foetal humain et embryonnaire furet, mais ils sont très rares dans le néocortex de souris embryonnaire35,36. En outre, furet bRG montre une hétérogénéité morphologique similaire à celle de l’homme bRG, de loin supérieure à la souris bRG21. Enfin, au niveau moléculaire, le développement du néocortex de furet montre des modèles d’expression génique très semblables à ceux du néocortex humain fœtal, qui sont présumés contrôler le développement du pliage cortical, entre autres39.
Les caractéristiques biologiques et moléculaires des cellules du furet bRG les rendent très prolifératifs, semblables à l’homme bRG. Il en résulte une production accrue de neurones et le développement d’un néocortex34élargi et très complexe. Ces caractéristiques font des furets d’excellents organismes modèles pour étudier les caractéristiques humaines du développement du néocortex qui ne peuvent pas être modélisées chez les souris26,40. Pour tirer pleinement parti du furet comme organisme modèle, la méthode présentée a été développée. Il se compose d’électroporation in utero d’embryons de furet E33 avec un plasmide exprimant GFP (pGFP) sous le contrôle d’un promoteur omniprésent, CAG. Les embryons électroporés peuvent ensuite être analysés de façon embryonnaire ou postnatale. Afin de réduire le nombre d’animaux sacrifiés, les furets femelles (jills) sont stérilisés par hystérectomie et donnés pour adoption comme animaux de compagnie. Si les embryons ciblés sont récoltés à des stades embryonnaires, une deuxième chirurgie est effectuée et les embryons sont enlevés par une césarienne, tandis que les jills sont hystérectomies. Si les embryons ciblés sont analysés à des stades postnatals, les jills sont hystérectomies après que les chiots ont été sevrés ou sacrifiés. Par conséquent, un protocole pour l’hystérectomie des jills est également présenté.
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Protocol
Toutes les procédures expérimentales ont été menées en accord avec la législation allemande sur le bien-être des animaux après approbation par landesdirektion Sachsen (licences TVV 2/2015 et TVV 21/2017).
1. Préparation à l’électroporation in utero
- Préparer le mélange d’ADN. Dans ce protocole, une concentration finale de 1 μg/μL de pGFP est utilisée. Dissoudre l’ADN dans PBS et compléter avec 0,1% Vert rapide pour faciliter la visualisation. Une fois préparé, mélanger le mélange d’ADN en faisant monter et descendre plusieurs fois ou en tapant des doigts. Conserver à température ambiante jusqu’à l’utilisation.
REMARQUE : Pour les coélectroporations, le mélange d’ADN est prêt à contenir une concentration finale de 1 μg/μL de plasmide codant un gène d’intérêt ainsi que 0,5 μg/μL de pGFP dilué en PBS. - Préparez la table de chirurgie avec tous les outils et instruments requis.
- Tirez les capillaires en verre à l’aide du puller micropipette. Ajuster le diamètre de la pointe capillaire en coupant la partie distale du capillaire à l’aide de forceps comme décrit précédemment41.
2. Préparation des furets pour la chirurgie
- Gardez les jills enceintes avec des embryons à l’E33 à jeun pendant au moins 3 h avant la chirurgie pour réduire le risque de vomissements.
- Avant la chirurgie stériliser tous les outils par autoclaving. Effectuer la chirurgie dans une pièce spécialement assignée dans des conditions aseptiques pour éliminer les sources potentielles de contamination.
- Placez la jill enceinte dans la boîte de narcose avec 4% d’isoflurane.
- Lorsqu’il est anesthésié, placez le furet sur la table d’opération avec un coussin chauffant et attachez le masque de narcose avec un flux constant d’isoflurane de 2 à 3 % vers le nez. Pour assurer le niveau approprié d’anesthésie, vérifiez l’absence des réflexes suivants :
- Le réflexe palpebral en touchant la peau périoculaire
- Le réflexe de fléchisseur en pinçant la peau entre les2ème et3ème, ou3ème et4 e orteil des deux membres postérieurs
- Si le réflexe palpebral est absent et que le réflexe de fléchisseur est clairement réduit, vérifiez le réflexe de douleur en pinçant un orteil de chaque membre postérieur.
REMARQUE : Assurez-vous d’avoir un stéthoscope à portée de main pour surveiller la fréquence cardiaque et le rythme si nécessaire.
- Injectez le furet sous-cutanéement avec de l’analgésique (0,1 mL de métamizol, 50 mg/kg de poids corporel), antibiotique (0,1 mL/kg de poids corporel de 20 mg/kg d’amixicilline + acide clavulanique) et du glucose (10 mL de solution de glucose de 5%).
- Placez une goutte de solution d’onguent oculaire sur les yeux pour prévenir la déshydratation oculaire pendant la chirurgie.
- Raser le ventre de furet à l’aide d’un rasoir.
- Nettoyez la peau avec de l’eau et du savon, désinfectez le ventre avec un gommage à 70 % d’éthanol, désinfectez 2x avec de l’iode et laissez-la sécher.
3. Électroporation in utero des furets
- Assurez-vous que la zone chirurgicale est stérile : placez des outils chirurgicaux stériles sur des tissus stériles et changez de manteau et de gants.
- Placez un drapé chirurgical stérile sur l’animal.
- À l’aide d’un scalpel, ouvrir chirurgicalement le ventre au linea alba avec une coupe d’environ 5 cm de long.
- Couper la couche musculaire à l’aide de ciseaux.
- Placez les écouvillons de gaze autour du site d’incision et mouillez-les avec pbs. Les écouvillons de gaze absorberont le PBS supplémentaire qui sera ajouté pendant la chirurgie.
REMARQUE : Maintenez la chaleur et le soutien pbs tout au long de la chirurgie. - Exposez l’utérus de furet et placez-le sur les écouvillons de gaze.
- Chargez un capillaire en verre avec la solution d’injection à l’aide d’une pipette avec une longue pointe de chargement. Assurez-vous que le volume de chargement se situe entre 5 et 20 μL selon le nombre d’embryons et le nombre de conditions expérimentales différentes. Le volume moyen injecté par embryon est de 3 à 5 μL. Attachez le capillaire en verre chargé à un support et connectez l’autre côté du support à un tube et à un embout buccal.
- Inspectez le premier embryon et trouvez la tête.
- Placez la source de lumière de fibre optique à côté de la tête de l’embryon pour faciliter la visualisation.
NOTE: Les parois utérines de Ferret sont très sombres, et il est difficile de voir à travers eux à moins que la lumière est brillante directement sur eux. - Effectuer une seule injection intraventriculaire dans le ventricule de l’un des hémisphères cérébraux et garder l’autre hémisphère intact pour servir de contrôle interne. Le ventricule lui-même n’est pas facilement distinct par l’œil, de sorte que son emplacement est estimé en fonction de l’emplacement de l’iris pigmenté, qui est visible. L’injection intraventriculaire se fait en prenant le support attaché au capillaire en verre et pénétrant la peau, le crâne et le tissu cérébral avec la pointe du capillaire en verre.
REMARQUE : Assurez-vous de ne pas endommager le placenta, qui est plus foncé que les placentas murins.- Lorsque la pointe du capillaire en verre se trouve dans le ventricule, injectez environ 3 à 5 μL de la solution d’injection en mettant en bouche le tuyau à l’aide de l’embout buccal relié au support capillaire en verre. Étant donné que la solution injectée contient 0,1 % de vert rapide, le ventricule injecté deviendra maintenant vert foncé et sera visible sous forme de structure en forme de rein.
- Placez les électrodes de la pince à épiler sur l’utérus au-dessus de la tête de l’embryon afin que le poteau positif soit placé au-dessus de la zone qui sera ciblée et du poteau négatif sous la zone injectée.
- Réglez les conditions d’électroporation suivantes sur l’électroporateur : Longueur d’impulsion = 50 ms; Tension pulsée = 100 V; Intervalle de pouls = 1 s; Nombre d’impulsions = 5. Ensuite, appuyez sur le bouton "Pulse" sur l’électroporateur.
- Déposez rapidement plusieurs gouttes de 1x PBS chaud sur l’embryon électroporé.
- Répétez la procédure pour tous les embryons. Gardez l’utérus constamment humide avec pbs chaud.
REMARQUE : Si les premiers embryons faisant face au vagin ne sont pas facilement accessibles, il est préférable de ne pas les électroporate. - Lorsque tous les embryons sont électroporés, placez l’utérus dans la cavité péritonéale.
- Suturez la couche musculaire avec le péritoine à l’aide d’une suture 4-0.
- Suturer la peau en utilisant la même épaisseur et pulvériser la plaie avec un jet d’aluminium.
- Placez l’animal dans une cage et gardez-le au chaud avec une source de chaleur. Surveillez attentivement l’animal jusqu’à ce qu’il se réveille.
4. Soins postopératoires et logement d’animaux ciblés
- Pendant 3 jours après la chirurgie s’assurer que les animaux subissent les soins postopératoires suivants: 20 mg/kg amoxicilline (antibiotique) 1x par jour; 25 mg/kg de métamizol (analgésique) 3x par jour.
- Assurez-vous que les furets sont logés individuellement.
- Assurez-vous que les furets sont examinés par un vétérinaire au moins 1x par jour.
- Assurez-vous que les furets sont dérangés le moins possible pendant l’accouchement.
- Après que les chiots soient sevrés ou sacrifiés, préparez les jills pour l’hystérectomie.
5. Hystérectomie des furets
REMARQUE : Une hystérectomie est pratiquée pour réduire le nombre d’animaux sacrifiés afin que les animaux stérilisés puissent être donnés pour adoption en tant qu’animaux de compagnie. La procédure préchirurgicale pour l’hystérectomie est la même que dans l’étape 2.
- Raser et stériliser le ventre de furet tel que décrit aux étapes 3.1 et 3.2.
- Ouvrir chirurgicalement le ventre à la linéa alba. Coupez la couche musculaire. Soulevez la couche musculaire et abritez l’intestin avec un doigt tout en ouvrant complètement la couche musculaire.
- Placez les écouvillons de gaze autour du site d’incision et mouillez-les avec des PBS stériles. Exposer l’utérus de furet et les ovaires et les placer sur les écouvillons de gaze.
- Commencez l’hystérectomie d’un côté en ligatant l’arteria ovarica et vena ovarica crânien au mésovar. Mettez une pince de chaque côté de la ligature et effectuez une autre ligature crânienne aux pinces. Attachez la troisième pince aux extrémités de la ligature pour les sauver. Répétez l’opération de l’autre côté.
- Couper entre les pinces et détacher le cornua uteri de la mésenterie des deux côtés.
- Lier l’arteria utérine des deux côtés utérins caudal à l’ostium uteri. Puis lier le vagin et fixer la ligature. Attachez la pince aux extrémités des ligatures pour les sauver. Mettre deux pinces crâniennes à la ligature. Couper entre les pinces et détacher l’utérus du vagin. Retirez l’utérus et les ovaires et disposez-en. Gratter la muqueuse résiduelle du cul de l’utérus.
- Détachez toutes les pinces restantes et raccourcissez les extrémités de ligature. Assurez-vous de contrôler les saignements après l’enlèvement des pinces.
- Suturer la couche musculaire et la peau telle que décrite aux étapes 3.16 et 3.17. Suivez le protocole postopératoire comme dans les étapes 3.18 et 4.1–4.3. Gardez les animaux dans l’installation animale pendant au moins 2 semaines avec des visites vétérinaires régulières. Une fois que les animaux sont entièrement récupérés, ils peuvent être donnés pour adoption.
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Representative Results
L’électroporation in utero des furets à l’E33 a eu comme conséquence le ciblage des cellules progénitrices neuronales qui tapissent la surface ventriculaire du néocortex embryonnaire (figure 1). Ces cellules sont appelées progéniteurs apiques et sont très prolifératives, donnant lieu à tous les autres types de cellules pendant le développement. Sur la division asymétrique, les progéniteurs apiques ont généré un autre progénieur apical et une cellule plus différenciée, typiquement un progéniteur basal (BP), qui a délaminé de la surface ventriculaire. Les BP ont migré dans la zone germinale secondaire, le SVZ. Lorsque l’électroporation a été effectuée à l’E33, de nombreux BP nouveau-nés ont migré vers la partie la plus basale de la SVZ, où ils ont formé l’OSVZ22.
Lorsque les effets de l’électroporation ont été examinés 4 jours plus tard à l’E37, la plupart des cellules ciblées et leur progéniture se trouvaient encore dans les zones germinales (VZ, ISVZ et OSVZ, voir figure 2A)et les cellules étaient rarement présentes plus basalement dans la plaque corticale (CP). La progéniture des cellules ciblées se composait principalement de types de progénieur neuronaux et de neurones nouveau-nés. L’identité des progénitrices pourrait être examinée par immunofluorescence pour les marqueurs des cellules de cycle, tels que PCNA26 (Figure 2B, C), tandis qu’un sous-ensemble de progéniteurs subissant la mitose pourrait être montré par des marqueurs tels que la phosphohistone 3 (PH3)21 (figure 2D).
Au P0, 8 jours après l’électroporation, la descendance des cellules ciblées s’est répandue dans toutes les couches histologiques (Figure 3A, B). À ce stade, les BP étaient particulièrement abondants et les BRG étaient facilement identifiables. À l’aide d’une combinaison de marqueurs de facteur de transcription, différentes populations de BP pourraient être révélées. Sox2 est un marqueur de cellules progénitrices prolifératives, y compris bRG26. Tbr2 est un marqueur de BP neurogéniques, qui sont principalement des ancêtres intermédiaires26 (Figure 3B). Parce que les embryons ont été co-électroporated avec un plasmide codant GFP, la morphologie des progéniteurs neuronaux pourrait être examinée en suivant le signal GFP. Ceci est particulièrement important dans le contexte des BP, qui se présentent en deux morphotypes majeurs : les cellules multipolaires, qui sont en grande partie des progéniteurs intermédiaires, et les cellules radiales, qui sont bRG21. Par conséquent, Sox2 + Tbr2– cellules radiales dans l’OSVZ sont la population cellulaire clé d’intérêt pour l’étude bRG26.
Par P16, une majorité de cellules ciblées ont cessé de se diviser et se sont différenciées en neurones et en glies. Par conséquent, ces types de cellules sont mieux examinés à ce stade. En plus de divers sous-types neuronaux et gliaux, le furet P16 néocortex présentait les caractéristiques du pliage (figure 3C). À ce stade, la plupart des principaux gyri et sulci étaient déjà présents et les zones cérébrales potentielles pourraient être identifiées31. Le cerveau de ferret a continué à mûrir après P16, quand des processus tels que myélinisation et synaptogenèse prennent lieu.
Figure 1 : Cibler les cellules neuronales par électropore in utero du néocortex de furet. L’électroporation in utero du néocortex de furet à e33 a eu comme conséquence le ciblage des progéniteurs apicals. Pendant le développement, ces cellules donnent naissance à tous les autres types de cellules. Les progéniteurs basaux ont été mieux étudiés aux stades embryonnaires (E37) et périnatals (P0). Les neurones ont été mieux étudiés aux stades postnatals, tels que P16. Couches corticales : VZ = zone ventriculaire; ISVZ = zone subventriculaire interne; OSVZ = zone subventriculaire externe; IZ = zone intermédiaire; CP = plaque corticale; GZ = zones germinales (VZ+SVZ); WM = matière blanche. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Exemple de néocortex de furet E37 après électroporation in utero à l’E33. (A et B) Section du néocortex de furet E37; vert, descendance des cellules électroporées (GFP); noyaux cellulaires bleus (A)(DAPI); magenta (B), cellules de cyclisme (PCNA). La boîte (largeur = 777 μm) indique la surface indiquée au grossissement plus élevé dans (C). Barre d’échelle = 1 mm. Notez l’absence de signal GFP dans le contralatéral (hémisphère non électoral), qui sert de contrôle interne. (C et D) Grossissements plus élevés de la zone ciblée; vert, descendance des cellules électroporées (GFP); magenta (C), cellules de cyclisme (PCNA); rouge (D), cellules mitotiques (phosphohistone 3, PH3). Notez que la majorité de la descendance des cellules ciblées se trouvait dans le SVZ à ce stade. Couches corticales comme à la figure 1. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Exemples de néocortex de furet P0 et P16 après électroporation in utero à l’E33. (A et B) Section du néocortex de furet P0; vert, descendance des cellules électroporées (GFP); noyaux cellulaires bleus (A)(DAPI); cyan (B), Sox2; magenta (B), Tbr2. (B) Grossissement supérieur de la zone électroporée. Barres d’échelle = 1 mm (A), 100 μm (B). Couches corticales comme à la figure 1. (C) Section du néocortex de furet P16; vert, descendance des cellules électroporées (GFP); noyaux cellulaires gris (DAPI); magenta, astrocytes (GFAP). Barre d’échelle = 1 mm. Ce chiffre a été modifié à partir de Kalebic et al.25. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
L’électroporation in utero chez le furet est une technique importante, avec des avantages et des inconvénients par rapport à d’autres méthodes. Il y a des étapes et des limitations critiques à cette méthode, ainsi que des modifications potentielles et des applications futures à garder à l’esprit.
Depuis les travaux pionniers de Victor Borrell et de ses collègues sur la manipulation génétique du néocortex de furet postnatal par électroporation ou injection virale35,42,43, le furet est devenu un organisme modèle génétiquement accessible. L’établissement de la manipulation génétique au cours du développement embryonnaire par l’électroporation in utero19,20 a ouvert de nouvelles possibilités de recherche en permettant le ciblage des cellules progénitrices neuronales à des stades de développement précoces. Par rapport à la manipulation postnatale, l’électroporation in utero permet de cibler de plus grandes zones du néocortex et des progéniteurs neuronaux moins différenciés qui génèrent séquentiellement tous les autres types de cellules du néocortex. Fait important, par rapport au ciblage viral, l’électroporation in utero permet une précision spatiale du ciblage.
La partie la plus critique de la méthode est la chirurgie elle-même. L’électroporation in utero du néocortex de furet est significativement plus complexe et difficile par rapport à la procédure chez les souris. Les parois utérines sont plus foncées, et les embryons sont plus difficiles à distinguer. En outre, les furets adultes ont de plus grandes exigences d’élevage et de vétérinaire. La période autour de la naissance des chiots est particulièrement difficile. Les furets sont très sensibles pendant cette période et sont mieux pas dérangés inutilement. Les principales limites de l’approche elle-même sont liées à l’efficacité du ciblage. L’électroporation in utero entraîne toujours le ciblage d’une mosaïque d’ancêtres neuronaux. Ceci est idéal pour étudier les aspects biologiques cellulaires des progéniteurs neuronaux ou des neurones, mais il est sous-optimal pour causer de grandes perturbations histologiques et anatomiques, comme un changement dans le pliage néocortical. Si cela est nécessaire, la meilleure approche est de déplacer les électrodes le long de l’axe rostrocaudal pendant la procédure afin de couvrir de grandes parties du néocortex. Cependant, pour l’analyse d’organes entiers, la meilleure approche est la génération de furets transgéniques à partir de l’étapezygote 44.
Le stade embryonnaire au cours duquel l’électroporation in utero a été effectuée (E33) est idéal pour l’étude des progéniteurs basaux. En effet, des électroporations et le ciblage viral à ce stade ont été appliqués pour révéler le moment de l’apparition de l’OSVZ22 ainsi que diverses caractéristiques biologiques cellulaires des progéniteurs basaux pertinents à leur morphologie et prolifération21,25,26. Cependant, selon l’objectif scientifique d’une étude, le moment de l’électroporation peut être facilement modifié sans modifications significatives à la méthode19,20. Outre la spécificité temporelle, l’électroporation in utero permet des modifications faciles de la spécificité spatiale. Le néocortex dorsolatéral à la position rostromedial le long de l’axe rostrocaudal a été ciblé, ce qui a eu comme conséquence l’étiquetage des secteurs de moteur et de somatosensory. D’autres zones néocorticales peuvent également être ciblées en ajustant le placement des électrodes et la direction du champ électrique. Chez la souris, le néocortexmédial 45 et le télencéphalonventral 46 ont été ciblés à l’aide d’électroporation in utero, ce qui suggère que des approches similaires pourraient être utilisées chez les furets.
Enfin, l’électroporation in utero peut facilement être combinée avec les techniques d’édition du génome et de l’épigénome les plus récentes13,14,16,25, où les composants CRISPR/(d)Cas9 peuvent être livrés sous forme de plasmide ou comme un complexe de protéines Cas9 recombinantes et guident les ARN14, ce dernier raccourcissant le temps nécessaire à l’édition du génome. Il est probable que d’autres améliorations technologiques dans l’édition du génome seront combinées avec l’électroporation in utero chez les souris et les furets afin de générer des mutations génomiques précises importantes pour comprendre le développement normal du cerveau et en particulier pour modéliser les conditions pathologiques humaines. Dans ce contexte, l’électroporation in utero est de plus en plus utilisée comme méthode de ciblage de choix pour les différentes approches omiques unicellulaires ultérieures et l’imagerie vivante pour comprendre les signatures moléculaires et le comportement dynamique des cellules ciblées et de leur progéniture.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à révéler.
Acknowledgments
Nous sommes reconnaissants aux services et aux installations de l’Institut Max Planck de biologie cellulaire moléculaire et de génétique pour le soutien exceptionnel apporté, notamment toute l’équipe des services biomédicaux (BMS) pour l’excellente élevage des furets et J. Peychl et son équipe de l’installation de microscopie légère. Nous sommes particulièrement reconnaissants à Katrin Reppe et Anna Pfeffer du BMS pour leur soutien vétérinaire exceptionnel et à Lei Xing du groupe Huttner pour leur aide aux chirurgies du furet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1ml syringe | BD | 309628 | Electroporation |
| 4-0 Vicryl suture | Ethicon | V392ZG | Surgery |
| Aluminium spray | cp-pharma | 98017 | Surgery |
| Amoxicilin+clavulanic acid (Synulox RTU) | WDT | 6301 | Surgery |
| Cappilary holder | WPI | MPH6S12 | Electroporation |
| Dexpanthenol Ointment solution | Bayer | 6029009.00.00 | Surgery |
| Drape sheet 45x75cm | Hartmann | 2513052 | Surgery |
| Electrode Tweezer, platinum plated 5mm | BTX | 45-0489 | Electroporation |
| Electroporator | BTX | ECM830 | Electroporation |
| Fast Green | Sigma | F7258-25G | Electroporation |
| Ferret Mustela putorius furo | Marshall | NA | Experimental organism |
| Fiber optic light source | Olympus | KL1500LCD | Electroporation |
| Forceps | Allgaier instrumente | 08-033-130 | Surgery |
| Forceps 3C-SA | Rubis Tech | 3C-SA | Surgery |
| Forceps 55 | Dumostar | 11295-51 | Surgery |
| Forceps 5-SA | Rubis Tech | 5-SA | Surgery |
| Gauze swabs large | Hartmann | 401723 | Surgery |
| Gauze swabs small | Hartmann | 401721 | Surgery |
| GFAP antibody | Dako | Z0334 | Antibody |
| GFP antibody | Aves labs | GFP1020 | Antibody |
| Glass cappilaries (Borosilicate glass with filament, OD:1.2mm, ID: 0.69mm, 10cm length) | Sutter Instrument | BF120-69-10 | Electroporation |
| Glucose | Bela-pharm | K4011-02 | Surgery |
| Heat pad | Hans Dinslage | Sanitas SHK18 | Surgery |
| Iodine (Betadine solution 100 mg/ml) | Meda | 997437 | Surgery |
| Isofluran | CP | 21311 | Surgery |
| Loading tips 20µl | Eppendorf | #5242 956.003 | Electroporation |
| Metamizol | WDT | 99012 | Surgery |
| Metzenbaum dissecting scissors | Aesculap | BC600R | Surgery |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | Model P-97 | Electroporation |
| pCAGGS-GFP | NA | NA | From Kalebic et al., eLife, 2018 |
| PCNA antibody | Millipore | CBL407 | Antibody |
| pH3 antibody | Abcam | ab10543 | Antibody |
| Scalpel | Aesculap | 294200104 | Surgery |
| Shaver | Braun | EP100 | Surgery |
| Sox2 antibody | R+D Systems | AF2018 | Antibody |
| Surgical clamp 13cm | WDT | 27080 | Surgery |
| Surgical double spoon (Williger) | WDT | 27232 | Surgery |
| Surgical drape | WDT | 28800 | Surgery |
| Surgical scissors small | FST | 14090-09 | Surgery |
| Suturing needle holder | Aesculap | BM149R | Surgery |
| Tbr2 antibody | Abcam | ab23345 | Antibody |
| Transfer pipette 3ml | Fischer scientific | 13439108 | Surgery |
| Water bath | Julabo | TW2 | Surgery |
References
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