Summary
Hier wird ein Protokoll zur genetischen Manipulation im embryonalen Frettchenhirn unter Verwendung der Utero-Elektroporation vorgestellt. Diese Methode ermöglicht die Ausrichtung von neuronalen Vorläuferzellen im Neocortex in vivo.
Abstract
Die Manipulation der Genexpression in vivo während der embryonalen Entwicklung ist die Methode der Wahl bei der Analyse der Rolle einzelner Gene während der Entwicklung von Säugetieren. In der Gebärmutterelektroporation ist eine Schlüsseltechnik für die Manipulation der Genexpression im embryonalen Säugetiergehirn in vivo. Ein Protokoll zur In-Utero-Elektroporation des embryonalen Neocortex von Frettchen, einem kleinen Fleischfresser, wird hier vorgestellt. Das Frettchen wird zunehmend als Modell für die Neocortex-Entwicklung verwendet, weil sein Neocortex eine Reihe anatomischer, histologischer, zellulärer und molekularer Merkmale aufweist, die auch bei menschlichen und nichtmenschlichen Primaten vorhanden sind, aber in Nagetiermodellen wie Maus oder Ratte fehlen. Bei der Utero-Elektroporation wurde am embryonalen Tag (E) 33, einem Midneurogenese-Stadium bei Frettchen, durchgeführt. In der Gebärmutter-Elektroporation zielt auf neuronale Vorläuferzellen, die die lateralen Ventrikel des Gehirns auskleiden. Während der Neurogenese, Diese Vorläuferzellen geben alle anderen neuronalen Zelltypen. Diese Arbeit zeigt repräsentative Ergebnisse und Analysen bei E37, Postnataltag (P) 1 und P16, entsprechend 4, 9 und 24 Tagen nach der Utero-Elektroporation. In früheren Stadien besteht die Nachkommenschaft der Zielzellen hauptsächlich aus verschiedenen neuronalen Vorläufersubtypen, während in späteren Stadien die meisten markierten Zellen postmitotische Neuronen sind. So ermöglicht die in der Utero-Elektroporation die Untersuchung der Wirkung genetischer Manipulation auf die zellulären und molekularen Merkmale verschiedener Arten von Nervenzellen. Durch seine Wirkung auf verschiedene Zellpopulationen, in der Utero Elektroporation kann auch für die Manipulation von histologischen und anatomischen Merkmalen des Frettchen neocortex verwendet werden. Wichtig ist, dass alle diese Effekte akut sind und mit einer vom Benutzer bestimmten spatiotemporalen Spezifität durchgeführt werden.
Introduction
Der Neocortex ist das äußere Blatt des Säugetier-Großhirns und der Sitz der höheren kognitiven Funktionen1,2,3,4,5. Um eine akute genetische Manipulation des Säugetierneocortex in vivo während der embryonalen Entwicklung zu erreichen, wurden zwei verschiedene Methoden untersucht: Virusinfektion6 und utero Elektroporation7. Beide Methoden ermöglichen eine effiziente Ausrichtung auf neokortikale Zellen, leiden aber unter einigen Einschränkungen. Der hauptvorteil der Utero-Elektroporation im Vergleich zur Virusinfektion ist die Fähigkeit, räumliche Spezifität innerhalb des Neocortex zu erreichen, die durch die Regulierung der Richtung des elektrischen Feldes erreicht wird.
Da die Elektroporation erstmals gezeigt wurde, um den Eintrag von DNA in die Zellen in vitro8zu erleichtern, wurde sie angewendet, um DNA in verschiedenen Wirbeltieren in vivo zu liefern. In der Entwicklungsneurowissenschaft wurde in der Utero-Elektroporation der Maus Neocortex erstmals 2001 berichtet9,10. Dieses Verfahren besteht aus einer Injektion des DNA-Gemischs in den seitlichen Ventrikel des embryonalen Gehirns und der anschließenden Anwendung des elektrischen Feldes mit Pinzettenelektroden, die räumliche Präzision7,11ermöglicht. In der Gebärmutter wurde seitdem die Elektroporation angewendet, um Nukleinsäuren zu liefern, um die Expression endogener oder ektopisch zugesetzter Gene im Mausneocortex zu manipulieren. Wichtige Fortschritte wurden in letzter Zeit durch die Anwendung der Methodik der CRISPR/Cas9-vermittelten Genombearbeitung über die Utero-Elektroporation im Maus-Neocortex erzielt, um (1) Genstörungen in postmitotischen Neuronen12,,13 und neuronalen Vorläuferzellen14und (2) Genom15 und Epigenom16-Bearbeitung durchzuführen.
Sehr bald nach dem ersten Bericht in der Maus wurde in der Utero-Elektroporation auf die embryonale Ratte Neocortex17,18angewendet. Nicht-Nagetiere blieben eine Herausforderung, bis die erste in der Utero Elektroporation von Frettchen, ein kleiner Fleischfresser, wurde im Jahr 2012 gemeldet19,20. Seitdem wurde in der Utero-Elektroporation von Frettchen die Mechanismen der Neocortex-Entwicklung untersucht, indem neuronale Vorläufer und Neuronen20,21,22,22,manipuliert die Expression endogener Gene, einschließlich der Verwendung der CRISPR/Cas9-Technologie24, und durch die Bereitstellung von ektopischen Genen21,22,25, einschließlich humanspezifischer Gene26. Darüber hinaus wurde bei der Utero-Elektroporation von Frettchen verwendet, um Merkmale der menschlichen Neocortex-Entwicklung unter pathologischen Bedingungen zu adressieren27,28.
Im Kontext der Neocortex-Entwicklung sind die Vorteile der Verwendung von Frettchen als Modellorganismus im Vergleich zu Mäusen darauf zurückzuführen, dass Frettchen eine Reihe von menschenähnlichen Merkmalen besser rekapitulieren. Auf anatomischer Ebene weisen Frettchen ein charakteristisches Muster der kortikalen Faltung auf, das auch bei menschenverachtenden und den meisten anderen Primaten vorhanden ist, bei Mäusen oder Rattenjedochvöllig abwesend ist 4,29,30,31. Auf histologischer Ebene weisen Frettchen zwei unterschiedliche subventrikuläre Keimzonen auf, die als innere und äußere subventrikuläre Zonen (ISVZ bzw. OSVZ)32,33bezeichnet werden, die durch die innere Faserschicht23getrennt sind. Diese Eigenschaften werden auch mit Primaten geteilt, einschließlich Menschen, aber nicht mit Mäusen34. Die ISVZ und OSVZ bei Frettchen und Menschen sind mit reichlich neuronalen Vorläuferzellen bevölkert, während die subventrikuläre Zone (SVZ) von Mäusen nur spärliche neuronale Vorläufer21,32,35,36enthält. Auf zellulärer Ebene weisen Frettchen einen hohen Anteil eines Subtyps von neuronalen Vorläufern auf, die als basaler oder äußerer radialer Glia (bRG bzw. oRG) bezeichnet werden und als entscheidend für die evolutionäre Ausdehnung des Säugetierneocortex34,37,38angesehen werden. bRG sind daher sehr reichlich in der fetalen menschlichen und embryonalen Frettchen Neocortex, aber sie sind sehr selten in der embryonalen Maus Neocortex35,36. Darüber hinaus zeigt Frettchen bRG eine morphologische Heterogenität ähnlich der menschlichen bRG, weit überlegen gegenüber Maus bRG21. Schließlich zeigt die Entwicklung von Frettchen-Neocortex auf molekularer Ebene Genexpressionsmuster, die denen des fetalen menschlichen Neocortex sehr ähnlich sind, von denen angenommen wird, dass sie die Entwicklung der kortikalen Faltung steuern, unter anderem39.
Die zellbiologischen und molekularen Eigenschaften von Frettchen bRG machen sie hoch proliferativ, ähnlich wie menschliche bRG. Dies führt zu einer erhöhten Produktion von Neuronen und der Entwicklung eines erweiterten und hochkomplexen Neocortex34. Diese Eigenschaften machen Frettchen ausgezeichnete Modellorganismen für die Untersuchung von menschenähnlichen Merkmalen der Neocortex-Entwicklung, die nicht in Mäusen modelliert werden können26,40. Um das Frettchen als Modellorganismus voll auszunutzen, wurde die vorgestellte Methode entwickelt. Es besteht aus der Utero-Elektroporation von E33-Ferret-Embryonen mit einem Plasmid, das GFP (pGFP) unter der Kontrolle eines allgegenwärtigen Promotors, CAG, exzessiv ausdrückt. Die elektroporated Embryonen können dann embryonal oder postnatal analysiert werden. Um die Anzahl der geopferten Tiere zu reduzieren, werden weibliche Frettchen (Jills) durch Hysterektomie sterilisiert und zur Adoption als Haustiere gespendet. Wenn die gezielten Embryonen in embryonalen Stadien geerntet werden, wird eine zweite Operation durchgeführt und die Embryonen werden durch einen Kaiserschnitt entfernt, während die Jills hysterektomisiert sind. Wenn die gezielten Embryonen in postnatalen Stadien analysiert werden, werden die Jills hysterektomisiert, nachdem die Welpen entwöhnt oder geopfert wurden. Daher wird auch ein Protokoll für die Hysterektomie von Jills vorgestellt.
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Protocol
Alle Versuchsverfahren wurden nach Genehmigung durch die Landesdirektion Sachsen (Lizenzen TVV 2/2015 und TVV 21/2017) in Absprache mit dem Tierschutzgesetz durchgeführt.
1. Vorbereitung für die in utero Elektroporation
- Bereiten Sie die DNA-Mischung vor. In diesem Protokoll wird eine Endkonzentration von 1 g/l pGFP verwendet. Lösen Sie DNA in PBS und ergänzen Sie mit 0,1% Fast Green, um die Visualisierung zu erleichtern. Nach der Vorbereitung die DNA-Mischung mischen, indem Sie mehrmals nach oben und unten pfeifen oder mit dem Finger tippen. Bei Raumtemperatur bis zum Gebrauch lagern.
HINWEIS: Für Koelektroporationen ist das DNA-Gemisch so vorbereitet, dass es eine Endkonzentration von 1 g/l Plasmid enthält, die für ein Gen von Interesse kodiert, zusammen mit 0,5 g/l pGFP, die in PBS verdünnt sind. - Bereiten Sie den Operationstisch mit allen erforderlichen Werkzeugen und Instrumenten vor.
- Ziehen Sie Glaskapillaren mit dem Micropipette-Puller. Stellen Sie den Durchmesser der Kapillarspitze ein, indem Sie den distalen Teil der Kapillare mit Zangen abschneiden, wie zuvor beschrieben41.
2. Herstellung von Frettchen für die Chirurgie
- Halten Sie die schwangeren Jills mit Embryonen bei E33 Fasten für mindestens 3 h vor der Operation, um das Risiko von Erbrechen zu reduzieren.
- Vor der Operation sterilisieren alle Werkzeuge durch Autoklavieren. Führen Sie die Operation in einem speziell zugewiesenen Raum unter aseptischen Bedingungen durch, um mögliche Kontaminationsquellen zu beseitigen.
- Legen Sie die schwangere Jill in die Narkosebox mit 4% Isofluran.
- Bei der Anästhesisierung das Frettchen mit einem Wärmepolster auf den Operationstisch legen und die Narkosemaske mit einem konstanten Isofluranfluss von 2–3% an der Nase befestigen. Um das entsprechende Maß an Anästhesie zu gewährleisten, überprüfen Sie, ob die folgenden Reflexe fehlen:
- Der palpebrale Reflex durch Berühren der periokularen Haut
- Der Flexorreflex durch Kneifen der Haut zwischen dem2. und3.oder3. und4. Zehen beider Hinterbeine
- Wenn der palpebrale Reflex fehlt und der Flexorreflex deutlich reduziert ist, überprüfen Sie den Schmerzreflex, indem Sie einen Zehen jeder Hinterbeine kneifen.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Sie ein Stethoskop zur Hand haben, um Herzfrequenz und Rhythmus bei Bedarf zu überwachen.
- Das Frettchen subkutan mit Analgetika (0,1 ml Metamizol, 50 mg/kg Körpergewicht), Antibiotikum (0,1 ml/kg Körpergewicht von 20 mg/kg Amoxicillin + Clavulansäure) und Glucose (10 ml 5% Glukoselösung) injizieren.
- Legen Sie einen Tropfen Augensalbe-Lösung auf die Augen, um Augenaustrocknung während des chirurgischen Eingriffs zu verhindern.
- Rasieren Sie den Frettchenbauch mit einem Rasierer.
- Reinigen Sie die Haut mit Wasser und Seife, desinfizieren Sie den Bauch mit 70% Ethanolpeeling, desinfizieren Sie 2x mit Jod und lassen Sie ihn trocknen.
3. Bei der Utero-Elektroporation von Frettchen
- Stellen Sie sicher, dass der operationsische Bereich steril ist: Legen Sie sterile chirurgische Werkzeuge auf steriles Gewebe und wechseln Sie Mantel und Handschuhe.
- Legen Sie einen sterilen chirurgischen Vorhang auf das Tier.
- Mit einem Skalpell den Bauch an der Linea alba mit einem 5 cm langen Schnitt chirurgisch aufreißen.
- Schneiden Sie die Muskelschicht mit einer Schere.
- Gaze-Tupfer um die Einschnittstelle legen und mit PBS befeuchten. Die Gazetupfer absorbieren die zusätzlichen PBS, die während der Operation hinzugefügt werden.
HINWEIS: Halten Sie Wärme und PBS-Unterstützung während der gesamten Operation. - Setzen Sie die Frettchen-Gebärmutter aus und legen Sie sie auf die Gaze-Tupfer.
- Laden Sie eine Glaskapillare mit der Injektionslösung mit einer Pipette mit einer langen Ladespitze. Stellen Sie sicher, dass das Ladevolumen je nach Anzahl der Embryonen und Anzahl der verschiedenen Versuchsbedingungen etwa zwischen 5 und 20 l beträgt. Das durchschnittliche injizierte Volumen pro Embryo beträgt 3–5 l. Befestigen Sie die geladene Glaskapillare an einem Halter und verbinden Sie die andere Seite des Halters mit einem Rohr und einem Mundstück.
- Inspizieren Sie den ersten Embryo und finden Sie den Kopf.
- Platzieren Sie die Lichtquelle neben dem Kopf des Embryos, um die Visualisierung zu erleichtern.
HINWEIS: Ferret Uteruswände sind sehr dunkel, und es ist schwierig, durch sie zu sehen, es sei denn, Licht leuchtet direkt auf sie. - Führen Sie eine einzige intraventrikuläre Injektion in den Ventrikel einer der zerebralen Hemisphären durch und halten Sie die andere Hemisphäre intakt, um als interne Kontrolle zu dienen. Der Ventrikel selbst ist nicht leicht durch Auge zu unterscheiden, so dass seine Lage basierend auf der Lage der pigmentierten Iris geschätzt wird, die sichtbar ist. Die intraventrikuläre Injektion erfolgt, indem der Halter an der Glaskapillare befestigt und die Haut, den Schädel und das Hirngewebe mit der Spitze der Glaskapillare durchdringt.
HINWEIS: Achten Sie darauf, die Plazenta, die dunkler als murine Plazenta ist, nicht zu beschädigen.- Wenn sich die Spitze der Glaskapillare im Ventrikel befindet, injizieren Sie etwa 3–5 l der Injektionslösung durch Mundpipettieren mit dem mit dem Glaskapillarhalter verbundenen Mundstück. Da die injizierte Lösung 0,1% Fast Green enthält, wird der injizierte Ventrikel nun dunkelgrün und wird als nierenförmige Struktur sichtbar.
- Legen Sie die Pinzettenelektroden auf die Gebärmutter über dem Kopf des Embryos, so dass der positive Pol über dem Bereich platziert wird, der angegriffen wird, und dem negativen Pol unter dem injizierten Bereich.
- Stellen Sie die folgenden Elektroporationsbedingungen auf dem Elektroporator ein: Pulslänge = 50 ms; Impulsspannung = 100 V; Pulsintervall = 1 s; Anzahl der Impulse = 5. Drücken Sie dann die "Pulstaste" am Elektroporator.
- Lassen Sie schnell mehrere Tropfen warme 1x PBS auf den elektroporated Embryo fallen.
- Wiederholen Sie den Vorgang für alle Embryonen. Halten Sie die Gebärmutter ständig nass mit warmen PBS.
HINWEIS: Wenn die ersten Embryonen mit Blick auf die Vagina nicht leicht zugänglich sind, ist es am besten, sie nicht elektroporate. - Wenn alle Embryonen elektropoiert sind, legen Sie die Gebärmutter wieder in die Peritonealhöhle.
- Die Muskelschicht mit dem Peritoneum mit einer 4-0-Naht besinnen.
- Die Haut mit der gleichen Dicke besanieren und die Wunde mit Aluminiumspray besprühen.
- Legen Sie das Tier in einen Käfig und halten Sie es mit einer Wärmequelle warm. Überwachen Sie das Tier sorgfältig, bis es aufwacht.
4. Postoperative Pflege und Unterbringung von Gezielten Tieren
- 3 Tage nach der Operation sicherstellen, dass die Tiere sich der folgenden postoperativen Behandlung unterziehen: 20 mg/kg Amoxicillin (Antibiotikum) 1x täglich; 25 mg/kg Metamizol (analgetisch) 3x täglich.
- Stellen Sie sicher, dass die Frettchen einzeln untergebracht sind.
- Stellen Sie sicher, dass die Frettchen mindestens 1x pro Tag von einem Tierarzt untersucht werden.
- Stellen Sie sicher, dass die Frettchen während der Lieferung so wenig wie möglich gestört werden.
- Nachdem die Welpen entwöhnt oder geopfert wurden, bereiten Sie die Jills auf die Hysterektomie vor.
5. Hysterektomie von Frettchen
HINWEIS: Eine Hysterektomie wird durchgeführt, um die Anzahl der geopferten Tiere zu reduzieren, so dass die sterilisierten Tiere zur Adoption als Haustiere gespendet werden können. Das prächirurgische Verfahren für die Hysterektomie ist das gleiche wie in Schritt 2.
- Rasieren und sterilisieren Sie den Frettchenbauch, wie in den Schritten 3.1 und 3.2 beschrieben.
- Öffnen Sie den Bauch an der Linea alba chirurgisch. Schneiden Sie die Muskelschicht. Heben Sie die Muskelschicht an und schützen Sie den Darm mit einem Finger, während Sie die Muskelschicht vollständig öffnen.
- Gaze-Tupfer um die Einschnittstelle legen und mit sterilem PBS befeuchten. Setzen Sie die Frettchen-Gebärmutter und die Eierstöcke aus und legen Sie sie auf die Gaze-Tupfer.
- Beginnen Sie die Hysterektomie auf einer Seite, indem Sie die arteria ovarica und vena ovarica kranial zum Mesovar ligtieren. Legen Sie eine Klemme auf jeder Seite der Ligation und führen Sie eine andere Ligation Schädel zu den Klemmen. Befestigen Sie die dritte Klemme an den Enden der Ligation, um sie zu retten. Wiederholen auf der anderen Seite.
- Zwischen die Klammern schneiden und die Cornua uteri von der Mesenterie auf beiden Seiten lösen.
- Ligate die arteria uterina auf beiden Gebärmutterseiten kaudal zum Ostium uteri. Dann ligate die Vagina und fixieren Sie die Ligatur. Befestigen Sie die Klemme an den Enden der Ligationen, um sie zu speichern. Legen Sie zwei Klammern schädelseitfest auf die Ligatur. Schneiden Sie zwischen den Klammern und lösen Sie die Gebärmutter von der Vagina. Entfernen Sie die Gebärmutter und die Eierstöcke und entsorgen Sie sie. Die Restschleimhaut aus dem Gebärmutterhintern zerkleinern.
- Lösen Sie alle verbleibenden Klemmen und kürzen Sie die Ligaturenden. Achten Sie darauf, die Blutung zu kontrollieren, nachdem die Klemmen entfernt wurden.
- Naht der Muskelschicht und der Haut, wie in den Schritten 3.16 und 3.17 beschrieben. Folgen Sie dem postoperativen Protokoll wie in den Schritten 3.18 und 4.1–4.3. Halten Sie die Tiere in der Tieranlage für mindestens 2 Wochen mit regelmäßigen tierärztlichen Besuchen. Nachdem die Tiere vollständig geborgen sind, können sie zur Adoption gespendet werden.
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Representative Results
Bei der Utero-Elektroporation von Frettchen bei E33 wurde die neurale Vorläuferzelle gezielt, die die ventrikuläre Oberfläche des embryonalen Neocortex auskleide (Abbildung 1). Diese Zellen werden apikale Vorläufer genannt und sind sehr proliferativ, was zu allen anderen Zelltypen während der Entwicklung führt. Nach asymmetrischer Teilung erzeugten apikale Vorläufer einen weiteren apikalen Vorläufer und eine differenziertere Zelle, typischerweise einen Basalvorläufer (BP), der von der ventrikulären Oberfläche delaminiert wurde. BPs wanderten in die sekundäre Keimzone, die SVZ. Als die Elektroporation an der E33 durchgeführt wurde, wanderten viele neugeborene BPs in den basalsten Teil der SVZ, wo sie das OSVZ22bildeten.
Als die Auswirkungen der Elektroporation 4 Tage später bei E37 untersucht wurden, befanden sich die meisten Zielzellen und ihre Nachkommen noch in den Keimzonen (VZ, ISVZ und OSVZ, siehe Abbildung 2A) und Zellen waren selten weiter basal in der kortikalen Platte (CP) vorhanden. Die Nachkommen der Zielzellen bestanden hauptsächlich aus neuronalen Vorläufertypen und neugeborenen Neuronen. Die Vorläuferidentität könnte durch Immunfluoreszenz auf Marker von Zykluszellen untersucht werden, wie PCNA26 (Abbildung 2B, C), während eine Untergruppe von Vorläufern, die sich einer Mitose unterziehen, durch Marker wie Phosphohiston 3 (PH3)21 (Abbildung 2D) gezeigt werden könnte.
Bei P0, 8 Tage nach der Elektroporation, breitet sich die Nachkommenschaft der Zielzellen in allen histologischen Schichten aus (Abbildung 3A, B). Zu diesem Zeitpunkt waren BPs besonders reichlich vorhanden und bRG waren leicht identifizierbar. Mit einer Kombination von Transkriptionsfaktormarkern konnten verschiedene BP-Populationen aufgedeckt werden. Sox2 ist ein Marker proliferativer Vorläuferzellen, einschließlich bRG26. Tbr2 ist ein Marker für neurogene BPs, die hauptsächlich zwischengeschaltete Vorläufersind 26 (Abbildung 3B). Da die Embryonen mit einem Plasmid kodiert wurden, das GFP kodiert, konnte die Morphologie neuronaler Vorläufer durch Nachverfolgen des GFP-Signals untersucht werden. Dies ist besonders wichtig im Zusammenhang mit BPs, die in zwei hauptmischen Morphotypen vorliegen: multipolare Zellen, die größtenteils Zwischenvorläufer sind, und Radialzellen, die bRG21sind. Daher sind Sox2+ Tbr2– Radialzellen im OSVZ die Schlüsselzellpopulation von Interesse für die Untersuchung von bRG26.
Bis P16 hörte eine Mehrheit der Zielzellen auf, sich zu teilen und sich in Neuronen und Glia zu differenzieren. Daher werden diese Zelltypen in diesem Stadium am besten untersucht. Neben verschiedenen neuronalen und glialfarbenen Subtypen zeigte Frettchen P16 neocortex das Merkmalemuster der Faltung (Abbildung 3C). Zu diesem Zeitpunkt waren die meisten großen Gyri und Sulci bereits vorhanden und prospektive Hirnbereiche konnten identifiziert werden31. Ferret Gehirn weiter reifen nach P16, wenn Prozesse wie Myelinisierung und Synaptogenese stattfinden.
Abbildung 1: Ausrichtung auf Nervenzellen durch Utero-Elektroporation des Frettchen-Neocortex. Bei der Utero-Elektroporation des Frettchen-Neocortex an E33 wurden apikale Vorläufer gezielt. Während der Entwicklung führen diese Zellen zu allen anderen Zelltypen. Basale Vorläufer wurden am besten in späteren embryonalen (E37) und perinatalen (P0) Stadien untersucht. Neuronen wurden am besten in postnatalen Stadien untersucht, wie P16. Kortikale Schichten: VZ = ventrikuläre Zone; ISVZ = innere subventrikuläre Zone; OSVZ = äußere subventrikuläre Zone; IZ = Zwischenzone; CP = kortikale Platte; GZ = Keimzonen (VZ+SVZ); WM = weiße Materie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Beispiel für E37 Frettchen neocortex nach in utero Elektroporation bei E33. (A und B) Abschnitt des Frettchenneocortex E37; grün, Nachkommen von elektroporated Zellen (GFP); blau (A) Zellkerne (DAPI); Magenta (B), Zykluszellen (PCNA). Feld (Breite = 777 m) zeigt Fläche mit höherer Vergrößerung in (C). Skalenstange = 1 mm. Beachten Sie das Fehlen eines GFP-Signals in der kontralateralen (nicht elektroporated Hemisphere), die als interne Kontrolle dient. (C und D) Höhere Vergrößerungen des Zielgebiets; grün, Nachkommen von elektroporated Zellen (GFP); Magenta (C), Zykluszellen (PCNA); rote (D), mitotische Zellen (Phosphohiston 3, PH3). Beachten Sie, dass die Mehrheit der Nachkommen der Zielzellen in der SVZ in diesem Stadium war. Kortikale Schichten wie in Abbildung 1. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Beispiele für P0 und P16 Frettchen Neocortex nach in utero Elektroporation bei E33. (A und B) Abschnitt des Frettchenneocortex P0; grün, Nachkommen von elektroporated Zellen (GFP); blau (A) Zellkerne (DAPI); cyan (B), Sox2; magenta (B), Tbr2. (B) Höhere Vergrößerung des elektropolierten Bereichs. Skalenstäbe = 1 mm (A), 100 m (B). Kortikale Schichten wie in Abbildung 1. (C) Abschnitt des Frettchenneocortex P16; grün, Nachkommen von elektroporated Zellen (GFP); grau, Zellkerne (DAPI); Magenta, Astrozyten (GFAP). Skalenstange = 1 mm. Diese Zahl wurde von Kalebic et al.25geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
In der Utero-Elektroporation in Frettchen ist eine wichtige Technik, mit Vor- und Nachteilen gegenüber anderen Methoden. Es gibt wichtige Schritte und Einschränkungen für diese Methode, sowie mögliche Änderungen und zukünftige Anwendungen zu beachten.
Seit der Pionierarbeit von Victor Borrell und Kollegen zur genetischen Manipulation des postnatalen Frettchenneocortex mittels Elektroporation oder Virusinjektion35,42,43ist das Frettchen zu einem genetisch zugänglichen Modellorganismus geworden. Die Etablierung genetischer Manipulation während der embryonalen Entwicklung über die Utero-Elektroporation19,20 eröffnete neue Forschungsmöglichkeiten, indem sie die Ausrichtung auf neuronale Vorläuferzellen in früheren Entwicklungsstadien ermöglichten. Im Vergleich zur postnatalen Manipulation ermöglicht die Utero-Elektroporation die Ausrichtung größerer Bereiche des Neocortex und weniger differenzierter neuronaler Vorläufer, die sequenziell alle anderen Zelltypen des Neocortex erzeugen. Wichtig ist, im Vergleich zu viralen Targeting, in utero Elektroporation ermöglicht räumliche Präzision des Targeting.
Der kritischste Teil der Methode ist die Operation selbst. Bei der Utero-Elektroporation des Frettchens neocortex ist deutlich komplexer und schwieriger im Vergleich zum Verfahren bei Mäusen. Die Gebärmutterwände sind dunkler, und die Embryonen sind schwieriger zu unterscheiden. Darüber hinaus haben erwachsene Frettchen höhere Haltungs- und Veterinäranforderungen. Besonders herausfordernd ist die Zeit um die Geburt der Welpen. Frettchen sind in dieser Zeit sehr empfindlich und werden am besten nicht unnötig gestört. Die hauptwichtigsten Einschränkungen des Ansatzes selbst hängen mit der Effizienz des Targetings zusammen. In der Utero-Elektroporation führt immer zur Ausrichtung auf ein Mosaik von neuronalen Vorläufern. Dies ist ideal für die Untersuchung der zellbiologischen Aspekte von neuronalen Vorläufern oder Neuronen, aber es ist suboptimal für große histologische und anatomische Störungen, wie eine Änderung der neokortikalen Faltung. Wenn dies erforderlich ist, ist der beste Ansatz, die Elektroden entlang der rostrocaudalen Achse während des Verfahrens zu bewegen, um große Teile des Neocortex abzudecken. Für die gesamte Organanalyse ist jedoch die Erzeugung von transgenen Frettchen ab der Zygotenstufe44der beste Ansatz.
Das embryonale Stadium, in dem die in utero Elektroporation durchgeführt wurde (E33), ist ideal für die Untersuchung von Basalvorläufern. Tatsächlich wurden Elektroporationen und virales Targeting in diesem Stadium angewendet, um den Zeitpunkt des Beginns des OSVZ22 sowie verschiedene zellbiologische Merkmale von Basalvorläufern zu offenbaren, die für ihre Morphologie und Proliferation relevant sind21,25,26. Je nach wissenschaftlichem Zweck einer Studie kann jedoch der Zeitpunkt der Elektroporation ohne wesentliche Änderungen der Methode19,20leicht geändert werden. Neben der zeitlichen Spezifität ermöglicht die In-Utero-Elektroporation einfache Modifikationen der räumlichen Spezifität. Der dorsolaterale Neocortex an der rostromedialen Position entlang der rostrocaudalen Achse wurde gezielt, was zur Kennzeichnung der motorischen und somatosensorischen Bereiche führte. Andere neokortikale Bereiche können auch durch die Einstellung der Platzierung der Elektroden und die Richtung des elektrischen Feldes ins Visier genommen werden. Bei der Maus wurden der mediale Neocortex45 und das ventrale Telencephalon46 mit Hilfe der Utero-Elektroporation gezielt eingesetzt, was darauf hindeutet, dass ähnliche Ansätze bei Frettchen verwendet werden könnten.
Schließlich kann in der Utero-Elektroporation leicht mit den neuesten Genom- und Epigenom-Editing-Techniken13,14,16,25, kombiniert werden, wo CRISPR/(d)Cas9-Komponenten als Plasmid oder als Komplex von rekombinantem Cas9-Protein und -Leit-RNAs14geliefert werden können, wobei letztere die Fürdie Genombearbeitung erforderliche Zeit verkürzen. Es ist wahrscheinlich, dass weitere technologische Verbesserungen in der Genombearbeitung mit der Utero-Elektroporation bei Mäusen und Frettchen kombiniert werden, um präzise genomische Mutationen zu erzeugen, die für das Verständnis der normalen Gehirnentwicklung und insbesondere für die Modellierung menschlicher pathologischer Bedingungen wichtig sind. In diesem Zusammenhang wird in der Utero-Elektroporation zunehmend als Targeting-Methode der Wahl für nachfolgende einzellige Omics-Ansätze und Live-Imaging-Ansätze eingesetzt, um die molekularen Signaturen und das dynamische Verhalten der Zielzellen und ihrer Nachkommen zu verstehen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir danken den Dienstleistungen und Einrichtungen des Max-Planck-Instituts für Molekulare Zellbiologie und Genetik für die hervorragende Unterstützung, insbesondere dem gesamten Team des Biomedizinischen Dienstes (BMS) für die hervorragende Frettchenhaltung und J. Peychl und seinem Team der Lichtmikroskopieanlage. Besonders dankbar sind wir Katrin Reppe und Anna Pfeffer vom BMS für die außergewöhnliche tierärztliche Unterstützung und Lei Xing von der Huttner-Gruppe für die Unterstützung bei Frettchenoperationen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1ml syringe | BD | 309628 | Electroporation |
| 4-0 Vicryl suture | Ethicon | V392ZG | Surgery |
| Aluminium spray | cp-pharma | 98017 | Surgery |
| Amoxicilin+clavulanic acid (Synulox RTU) | WDT | 6301 | Surgery |
| Cappilary holder | WPI | MPH6S12 | Electroporation |
| Dexpanthenol Ointment solution | Bayer | 6029009.00.00 | Surgery |
| Drape sheet 45x75cm | Hartmann | 2513052 | Surgery |
| Electrode Tweezer, platinum plated 5mm | BTX | 45-0489 | Electroporation |
| Electroporator | BTX | ECM830 | Electroporation |
| Fast Green | Sigma | F7258-25G | Electroporation |
| Ferret Mustela putorius furo | Marshall | NA | Experimental organism |
| Fiber optic light source | Olympus | KL1500LCD | Electroporation |
| Forceps | Allgaier instrumente | 08-033-130 | Surgery |
| Forceps 3C-SA | Rubis Tech | 3C-SA | Surgery |
| Forceps 55 | Dumostar | 11295-51 | Surgery |
| Forceps 5-SA | Rubis Tech | 5-SA | Surgery |
| Gauze swabs large | Hartmann | 401723 | Surgery |
| Gauze swabs small | Hartmann | 401721 | Surgery |
| GFAP antibody | Dako | Z0334 | Antibody |
| GFP antibody | Aves labs | GFP1020 | Antibody |
| Glass cappilaries (Borosilicate glass with filament, OD:1.2mm, ID: 0.69mm, 10cm length) | Sutter Instrument | BF120-69-10 | Electroporation |
| Glucose | Bela-pharm | K4011-02 | Surgery |
| Heat pad | Hans Dinslage | Sanitas SHK18 | Surgery |
| Iodine (Betadine solution 100 mg/ml) | Meda | 997437 | Surgery |
| Isofluran | CP | 21311 | Surgery |
| Loading tips 20µl | Eppendorf | #5242 956.003 | Electroporation |
| Metamizol | WDT | 99012 | Surgery |
| Metzenbaum dissecting scissors | Aesculap | BC600R | Surgery |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | Model P-97 | Electroporation |
| pCAGGS-GFP | NA | NA | From Kalebic et al., eLife, 2018 |
| PCNA antibody | Millipore | CBL407 | Antibody |
| pH3 antibody | Abcam | ab10543 | Antibody |
| Scalpel | Aesculap | 294200104 | Surgery |
| Shaver | Braun | EP100 | Surgery |
| Sox2 antibody | R+D Systems | AF2018 | Antibody |
| Surgical clamp 13cm | WDT | 27080 | Surgery |
| Surgical double spoon (Williger) | WDT | 27232 | Surgery |
| Surgical drape | WDT | 28800 | Surgery |
| Surgical scissors small | FST | 14090-09 | Surgery |
| Suturing needle holder | Aesculap | BM149R | Surgery |
| Tbr2 antibody | Abcam | ab23345 | Antibody |
| Transfer pipette 3ml | Fischer scientific | 13439108 | Surgery |
| Water bath | Julabo | TW2 | Surgery |
References
- Kalebic, N., Long, K., Huttner, W. B. Evolution of Nervous Systems 2e. Kaas, J. 3, Elsevier. 73-89 (2017).
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