Presenteras här är ett protokoll för att utföra genetisk manipulation i embryonala iller hjärnan med hjälp av in utero elektroporation. Denna metod möjliggör inriktning av neurala stamceller i neocortex in vivo.
Manipulering av genuttryck in vivo under embryonal utveckling är metod för val vid analys av enskilda geners roll under däggdjursutvecklingen. In utero elektroporation är en nyckelteknik för manipulering av genuttryck i den embryonala däggdjurs hjärnan in vivo. Ett protokoll för in utero elektroporation av den embryonala neocortex av illrar, en liten köttätare, presenteras här. Illern används alltmer som modell för neocortex utveckling, eftersom dess neocortex uppvisar en serie anatomiska, histologiska, cellulära och molekylära funktioner som också finns i mänskliga och icke-mänskliga primater, men frånvarande i gnagare modeller, såsom mus eller råtta. In utero elektroporation utfördes på embryonala dag (E) 33, en midneurogenesis skede i illern. In utero elektroporation mål neurala stamceller foder laterala ventriklarna i hjärnan. Under neurogenes ger dessa progenitorceller upphov till alla andra neurala celltyper. Detta arbete visar representativa resultat och analyser vid E37, postnatal dag (P) 1, och P16, motsvarande 4, 9, och 24 dagar efter in utero elektroporation, respektive. I tidigare skeden består avkomman av riktade celler huvudsakligen av olika neurala progenitor subtyper, medan i senare skeden mest märkta celler är postmitotiska nervceller. Således, in utero elektroporation möjliggör studiet av effekten av genetisk manipulation på cellulära och molekylära funktioner i olika typer av neurala celler. Genom sin effekt på olika cellpopulationer kan in utero-elektroporation också användas för manipulering av histologiska och anatomiska drag hos illerns neocortex. Viktigt, alla dessa effekter är akuta och utförs med en spatiotemporal specificitet bestäms av användaren.
Neocortex är det yttre arket av däggdjurshjärnan och sätet för högre kognitivafunktioner 1,2,3,4,5. För att uppnå en akut genetisk manipulation i däggdjurs neocortex in vivo under den embryonala utvecklingen har man utforskat två olika metoder: virusinfektion6 och in utero electroporation7. Båda metoderna möjliggör effektiv inriktning av neokortikala celler men lider av vissa begränsningar. Den stora fördelen med in utero elektroporation jämfört med virusinfektion är förmågan att uppnå rumslig specificitet inom neocortex, vilket uppnås genom att reglera riktningen för det elektriska fältet.
Sedan electroporation visades först för att underlätta inresa av DNA i cellerna in vitro8, har det tillämpats för att leverera DNA i olika ryggradsdjur in vivo. I utvecklingsneurovetenskap, in utero elektroporation av musen neocortex rapporterades först i 20019,10. Denna metod består av en injektion av DNA-blandningen i den laterala ventrikeln i den embryonala hjärnan och efterföljande tillämpning av det elektriska fältet med hjälp av pincettelektroder, som tillåter rumslig precision7,11. In utero elektroporation har sedan dess tillämpats för att leverera nukleinsyror för att manipulera uttrycket av endogena eller ectopically lagt gener i musen neocortex. Viktiga framsteg har gjorts nyligen genom att tillämpa metodiken för CRISPR/Cas9-medierad genomredigering via in utero elektroporation i musen neocortex att utföra (1) gen störningar i postmitotiska nervceller12,13 och neurala provigare celler14, och (2) arvsmassan15 och epigenome16 redigering.
Mycket snart efter den första rapporten i mus, in utero elektroporation tillämpades på den embryonala råttan neocortex17,18. Icke-gnagare förblev en utmaning tills den första in utero elektroporation av illrar, en liten köttätare, rapporterades i 201219,20. Sedan dess har in utero elektroporation av illrar tillämpats för att studera mekanismerna för neocortex utveckling genom märkning neurala stamceller och nervceller20,21,22,23, manipulera uttryck av endogena gener, inklusive användning av CRISPR/Cas9 teknik 24 , och genom att leverera ektopiska gener21,22,25, inklusive human-specifika gener26.26 Vidare har in utero elektroporation av illrar använts för att ta itu med funktioner i mänskliga neocortex utveckling i patologiska förhållanden27,28.
I samband med neocortex utveckling beror fördelarna med att använda illrar som modellorganism jämfört med möss på att illrar bättre rekapitulerar en rad människoliknande drag. På anatomisk nivå uppvisar illrar ett karakteristiskt mönster av kortikala vikning, som också förekommer i mänskliga och de flesta andra primater, men är helt frånvarande hos möss eller råttor4,29,30,31. På den histologiska nivån har illrar två distinkta subventrikulära germinalzoner, benämnda de inre och yttre subventrikulära zonerna (ISVZ respektive OSVZ)32,33, åtskilda av det inre fiberskiktet23. Dessa funktioner delas också med primater, inklusive människor, men inte med möss34. ISVZEN och OSVZ iller och människor befolkas med överflödande neurala progenitorceller, eftersom subventricular zonplanerar (SVZ) av möss innehåller endast glesa neurala progenitors21,32,35,36. På cellnivå uppvisar illrar en hög andel av en subtyp av neurala föregångare som kallas basala eller yttre radiella glia (bRG eller oRG, respektive), som bedöms som instrumentella för den evolutionära expansionen av däggdjurs neocortex34,37,38. bRG är därför mycket riklig i fostrets mänskliga och embryonala iller neocortex, men de är mycket sällsynta i den embryonala musen neocortex35,36. Vidare visar iller bRG morfologiska heterogenitet liknande den hos mänskliga bRG, vida överlägsen mus bRG21. Slutligen, på molekylär nivå, utveckla iller neocortex visar genuttryck mönster mycket lik de av fetala mänskliga neocortex, som antas styra utvecklingen av när vikning, bland annat39.
Cellbiologiska och molekylära egenskaper hos illerbRG gör dem mycket proliferativa, liknande mänskliga bRG. Detta resulterar i en ökad produktion av nervceller och utveckling av en utökad och mycket komplex neocortex34. Dessa egenskaper gör illrar utmärkta modellorganismer för att studera människoliknande drag av neocortexutveckling som inte kan modelleras hos möss26,40. För att dra full nytta av illern som en modell organismen den presenterade metoden utvecklades. Den består av in utero-elektroporation av E33-illerembryon med en plasmid som uttrycker GFP (pGFP) under kontroll av en allestädes närvarande promotor, CAG. De elektroporerade embryona kan sedan analyseras embryonalt eller postnatally. För att minska antalet offrade djur, är hona illrar (jills) steriliseras av hysterektomi och doneras för antagande som husdjur. Om de riktade embryona skördas på embryonala stadier utförs en andra operation och embryona avlägsnas genom ett kejsarsnitt, medan jills är hysterektomiserade. Om de riktade embryona analyseras i postnatala stadier hysterektomiseras jills efter att ungarna har avvanda eller offrats. Därav presenteras också ett protokoll för hysterektomi av jills.
In utero elektroporation i illern är en viktig teknik, med fördelar och nackdelar med avseende på andra metoder. Det finns kritiska steg och begränsningar för den här metoden, samt potentiella modifieringar och framtida program att tänka på.
Sedan Victor Borrells och kollegors banbrytande arbete med genetisk manipulering av den postnatala illern neocortex via elektroporation eller viral injektion35,42,<sup class="xre…
The authors have nothing to disclose.
Vi är tacksamma för de tjänster och faciliteter som max Planck Institutet för molekylär cellbiologi och genetik för enastående stöd, särskilt hela teamet av biomedicinska tjänster (BMS) för utmärkt djurhållning av illrar och J. Peychl och hans team av Light Microscopy Facility. Vi är särskilt tacksamma mot Katrin Reppe och Anna Pfeffer från BMS för exceptionellt veterinärstöd och Lei Xing från Huttner-gruppen för att de hjälper till med illern.
1ml syringe | BD | 309628 | Electroporation |
4-0 Vicryl suture | Ethicon | V392ZG | Surgery |
Aluminium spray | cp-pharma | 98017 | Surgery |
Amoxicilin+clavulanic acid (Synulox RTU) | WDT | 6301 | Surgery |
Cappilary holder | WPI | MPH6S12 | Electroporation |
Dexpanthenol Ointment solution | Bayer | 6029009.00.00 | Surgery |
Drape sheet 45x75cm | Hartmann | 2513052 | Surgery |
Electrode Tweezer, platinum plated 5mm | BTX | 45-0489 | Electroporation |
Electroporator | BTX | ECM830 | Electroporation |
Fast Green | Sigma | F7258-25G | Electroporation |
Ferret Mustela putorius furo | Marshall | NA | Experimental organism |
Fiber optic light source | Olympus | KL1500LCD | Electroporation |
Forceps | Allgaier instrumente | 08-033-130 | Surgery |
Forceps 3C-SA | Rubis Tech | 3C-SA | Surgery |
Forceps 55 | Dumostar | 11295-51 | Surgery |
Forceps 5-SA | Rubis Tech | 5-SA | Surgery |
Gauze swabs large | Hartmann | 401723 | Surgery |
Gauze swabs small | Hartmann | 401721 | Surgery |
GFAP antibody | Dako | Z0334 | Antibody |
GFP antibody | Aves labs | GFP1020 | Antibody |
Glass cappilaries (Borosilicate glass with filament, OD:1.2mm, ID: 0.69mm, 10cm length) | Sutter Instrument | BF120-69-10 | Electroporation |
Glucose | Bela-pharm | K4011-02 | Surgery |
Heat pad | Hans Dinslage | Sanitas SHK18 | Surgery |
Iodine (Betadine solution 100 mg/ml) | Meda | 997437 | Surgery |
Isofluran | CP | 21311 | Surgery |
Loading tips 20µl | Eppendorf | #5242 956.003 | Electroporation |
Metamizol | WDT | 99012 | Surgery |
Metzenbaum dissecting scissors | Aesculap | BC600R | Surgery |
Micropipette puller | Sutter Instrument | Model P-97 | Electroporation |
pCAGGS-GFP | NA | NA | From Kalebic et al., eLife, 2018 |
PCNA antibody | Millipore | CBL407 | Antibody |
pH3 antibody | Abcam | ab10543 | Antibody |
Scalpel | Aesculap | 294200104 | Surgery |
Shaver | Braun | EP100 | Surgery |
Sox2 antibody | R+D Systems | AF2018 | Antibody |
Surgical clamp 13cm | WDT | 27080 | Surgery |
Surgical double spoon (Williger) | WDT | 27232 | Surgery |
Surgical drape | WDT | 28800 | Surgery |
Surgical scissors small | FST | 14090-09 | Surgery |
Suturing needle holder | Aesculap | BM149R | Surgery |
Tbr2 antibody | Abcam | ab23345 | Antibody |
Transfer pipette 3ml | Fischer scientific | 13439108 | Surgery |
Water bath | Julabo | TW2 | Surgery |