Summary
Burada utero elektroporasyon kullanarak embriyonik gelincik beyin genetik manipülasyon gerçekleştirmek için bir protokol sunulmaktadır. Bu yöntem in vivo neokorteks nöral progenitor hücrelerinin hedeflemesine olanak sağlar.
Abstract
Embriyonik gelişim sırasında in vivo gen ekspresyonunun manipülasyonu, memeli gelişimi sırasında tek tek genlerin rolünü analiz ederken tercih edilen yöntemdir. Rahim elektroporasyonu nda in vivo embriyonik memeli beyninde gen ekspresyonunun manipülasyonu için önemli bir tekniktir. Gelincik lerin embriyonik neokorteksinin rahim elektroporasyonunda küçük bir etobur için bir protokol burada sunulmuştur. Gelincik giderek neokorteks gelişimi için bir model olarak kullanılıyor, çünkü neokorteks, insan ve insan olmayan primatlarda da bulunan bir dizi anatomik, histolojik, hücresel ve moleküler özellikler sergiliyor, ancak fare veya sıçan gibi kemirgen modellerinde bulunmamaktadır. Uteros elektroporasyon da embriyonik gün yapıldı (E) 33, gelincik bir midnörogenez evresi. Rahim elektroporasyon beynin lateral ventrikülleri astar nöral progenitor hücreleri hedefler. Nörogenez sırasında, Bu progenitor hücreleri diğer tüm nöral hücre tiplerine yol açar. Bu çalışma, sırasıyla rahim elektroporasyonundan 4, 9 ve 24 gün sonrasına karşılık gelen E37, doğum sonrası gün (P) 1 ve P16'da temsili sonuçlar ve analizler göstermektedir. Daha önceki aşamalarda, hedeflenen hücrelerin soyundan çeşitli nöral progenitor alt tipleri esas oluşur, daha sonraki aşamalarında en etiketli hücreler postmitotik nöronlar ise. Böylece, rahim elektroporasyon nöral hücrelerin çeşitli hücresel ve moleküler özellikleri üzerinde genetik manipülasyon etkisi çalışma sağlar. Çeşitli hücre popülasyonları üzerindeki etkisi sayesinde, rahim elektroporasyon da gelincik neokorteks histolojik ve anatomik özellikleri manipülasyon için kullanılabilir. Daha da önemlisi, tüm bu etkiler akut ve kullanıcı tarafından belirlenen bir spatiotemporal özgüllük ile gerçekleştirilir.
Introduction
Neokorteks memeli serebrum dış levha ve yüksek bilişsel fonksiyonların koltuk1,2,3,4,5. Embriyonik gelişim sırasında memeli neokorteks in vivo akut genetik manipülasyon elde etmek için, iki farklı yöntem araştırılmıştır: viral enfeksiyon6 ve rahim elektroporasyon7. Her iki yöntem de neokortikal hücrelerin etkin hedeflemesine izin verir, ancak bazı sınırlamalardan muzdariptir. Viral enfeksiyona göre rahim elektroporasyonunun en büyük avantajı, elektrik alanının yönünü düzenleyerek elde edilen neokorteks içinde mekansal özgüllük elde edebilme yeteneğidir.
Elektroporasyon ilk in vitro8hücrelerine DNA girişini kolaylaştırmak için gösterildiğinden beri, in vivo çeşitli omurgalılar içine DNA teslim etmek için uygulanmıştır. Gelişimsel nörobilimde, fare neokorteks rahim elektroporasyonunda ilk olarak 2001 yılında bildirilmiştir9,10. Bu yöntem embriyonik beynin lateral ventrikül DNA karışımı bir enjeksiyon ve mekansal hassasiyet7sağlar cızırtıcı elektrotlar kullanarak elektrik alanının sonraki uygulama oluşur 7,11. Utero elektroporasyon beri fare neokorteks endojen veya ektonik eklenen genlerin ekspresyonu işlemek için nükleik asitler sunmak için uygulanmıştır. Son zamanlarda CRISPR/Cas9 aracılı genom düzenleme metodolojisi uygulanarak fare neokorteksinde rahim elektroporasyonu ile (1) postmitotik nöronlarda12,,13 ve nöral progenitor hücrelerde 14 ve (2) genom15 ve epigenom16 düzenlemesi(1)gen bozulması gerçekleştirilmiştir.
Çok kısa bir süre sonra fare ilk rapor, rahim elektroporasyon embriyonik sıçan neokorteks uygulandı17,18. Olmayan kemirgenler gelincik rahim elektroporasyonunda ilk kadar bir meydan okuma kaldı, küçük bir etobur, rapor edildi 201219,20. O zamandan beri, gelincik rahim elektroporasyonu nda nöral progenitors ve nöronlar20etiketleyerek neokorteks geliştirme mekanizmaları çalışmak için uygulanmıştır20 ,21,22,23, CRISPR/ Cas9 teknolojisinin kullanımı da dahil olmak üzere endojen genlerin ekspresyonu manipüle24, ve ektopik genler teslim ederek21,22,25, insana özgü genler dahil olmak üzere26.22 Ayrıca, gelincik rahim elektroporasyonu patolojik koşullarda insan neokorteks gelişiminin özellikleri ele kullanılmıştır27,28.
Neokorteks gelişimi bağlamında, gelincikleri farelere göre model organizma olarak kullanmanın avantajları, gelinciklerin bir dizi insanbenzeri özelliği daha iyi özetlemesi gerçeğinden kaynaklanmaktadır. Anatomik düzeyde, gelincik kortikal katlama karakteristik bir desen sergilemek, aynı zamanda insan ve diğer primatlar mevcut, ama tamamen fareler veya sıçanlarda yok4,29,30,31. Histolojik düzeyde gelincik iki farklı subventriküler germinal bölgeleri var, iç ve dış subventriküler bölgeler olarak anılacaktır (ISVZ ve OSVZ, sırasıyla)32,33, iç lif tabakası ile ayrılmış23. Bu özellikler aynı zamanda primatlarla da paylaşılır, insanlar da dahil olmak üzere, ancak fareler34ile değil. Gelincikve insanlarda ISVZ ve OSVZ bol nöral progenitor hücreleri ile doldurulur, sıçanların subventriküler zonu ise (SVZ) sadece seyrek nöral progenitors21,,32,35,36içerir . Hücresel düzeyde, gelincikler bazal veya dış radyal glia olarak adlandırılan nöral progenitors bir alt tip yüksek oranda sergilemek (bRG veya oRG, sırasıyla), hangi memeli neokorteks evrimsel genişleme için araç olarak kabul edilir34,37,38. bRG bu nedenle son derece fetal insan ve embriyonik gelincik neokorteks bol, ama embriyonik fare neokorteksçoknadirdir35 ,36. Ayrıca, gelincik bRG morfolojik heterojenite insan bRG benzer gösterir, çok fare bRG21üstün . Son olarak, moleküler düzeyde, gelişmekte olan gelincik neokorteks gen ekspresyonu desenleri son derece fetal insan neokorteks benzer gösterir, hangi kortikal katlama gelişimini kontrol etmek için tahmin edilmektedir, diğer şeyler arasında39.
Gelincik bRG hücre biyolojik ve moleküler özellikleri onları son derece çoğaltıcı hale, insan bRG benzer. Bu nöronların artan bir üretim ve genişletilmiş ve son derece karmaşık neokorteks gelişimi ile sonuçlanır34. Bu özellikler, gelincikleri farelerde modellenemez neokorteks gelişiminin insanbenzeri özelliklerini incelemek için mükemmel model organizmalar yapmak26,40. Gelincikmodel organizma olarak tam olarak yararlanmak için sunulan yöntem geliştirilmiştir. Bu her yerde organizatörü kontrolü altında bir plazmid ifade GFP ile E33 gelincik embriyolarının rahim elektroporasyonu oluşur (pGFP) her yerde organizatörü, CAG. Elektroporated embriyolar daha sonra embriyonik veya postnatal olarak analiz edilebilir. Kurban edilen hayvan sayısını azaltmak için, dişi gelincikler (jills) histerektomi ile sterilize edilir ve evcil hayvan olarak evlat edinilme için bağışlanır. Hedeflenen embriyolar embriyonik evrelerde hasat edilirse ikinci bir ameliyat yapılır ve embriyolar sezaryenle çıkarılır, jilller ise histerektomi edilir. Hedeflenen embriyolar doğum sonrası evrelerde analiz edilirse, yavrular bezlendikten veya kurban edildikten sonra jilller histerektomi edilir. Bu nedenle, jills histerektomi için bir protokol de sunulmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm deneysel prosedürler Landesdirektion Sachsen (lisanslar TVV 2/2015 ve TVV 21/2017) tarafından onaylandıktan sonra Alman Hayvan Refahı Mevzuatı ile uyum içinde gerçekleştirilmiştir.
1. Rahim elektroporasyonuna hazırlık
- DNA karışımını hazırlayın. Bu protokolde 1 μg/μL pGFP son konsantrasyonu kullanılır. PBS'de DNA'yı çözün ve görselleştirmeyi kolaylaştırmak için %0,1 Hızlı Yeşil ile tamamlayın. Hazırlandıktan sonra, birkaç kez yukarı ve aşağı boru lama veya parmak dokunarak DNA karışımı karıştırın. Kullanıma kadar oda sıcaklığında saklayın.
NOT: Koelektroporasyonlar için DNA karışımı, PBS'de seyreltilmiş 0.5 g/μL pGFP ile birlikte ilgi genini kodlayan 1 μg/μL plazmid konsantrasyonunu içerecek şekilde hazırlanır. - Gerekli tüm araç ve gereçlerle ameliyat masasını hazırlayın.
- Mikropipet çekmecesini kullanarak cam kılcal damarları çekin. Daha önce açıklandığı gibi41forceps kullanarak kapiller distal kısmını keserek kapiller ucun çapını ayarlayın.
2. Gelinciklerin ameliyata hazırlanması
- Kusma riskini azaltmak için ameliyattan önce en az 3 saat oruç E33 de embriyoile hamile jills tutun.
- Ameliyattan önce otoklavlama ile tüm araçları sterilize. Olası kontaminasyon kaynaklarını ortadan kaldırmak için ameliyatı aseptik koşullarda özel olarak atanmış bir odada gerçekleştirin.
- % 4 isoflurane ile narkoz kutusuna hamile jill yerleştirin.
- Anestezi yapıldığında gelinciği bir ısı yastığı ile operasyon masasına yerleştirin ve narkoz maskesini buruna sabit bir %2-3 isofluran akışı ile takın. Anestezinin uygun düzeyde olmasını sağlamak için, aşağıdaki reflekslerin eksikliğini kontrol edin:
- Perioküler cilde dokunarak palpebral refleks
- Her iki arka ekstremitenin2 ve3'ü arasında veya3 ve4'üncü ayak parmaklarını sıkıştırarak fleksör refleks
- Palpebral refleks yoksa ve fleksör refleks açıkça azalır, her arka ekstremite bir ayak çimdikleme tarafından ağrı refleks kontrol edin.
NOT: Gerekirse kalp hızını ve ritmi izlemek için elinizde bir stetoskop olduğundan emin olun.
- Gelinciği analjezik (0.1 mL metamizol, 50 mg/kg vücut ağırlığı), antibiyotik (0.1 mL/kg vücut ağırlığı 20 mg/kg amoksisilin + klavulanik asit) ve glikoz (10 mL%5 glikoz çözeltisi) ile enjekte edin.
- Cerrahi işlem sırasında göz dehidratasyonönlemek için gözlere göz merhem çözeltisi bir damla yerleştirin.
- Bir tıraş kullanarak gelincik göbek tıraş.
- Cildi su ve sabunla temizleyin, göbeği %70 etanol fırçalayın, 2x iyotla dezenfekte edin ve kurumasına izin verin.
3. Gelinciklerin rahim elektroporasyonunda
- Cerrahi alanın steril olduğundan emin olun: steril dokuların üzerine steril cerrahi aletler yerleştirin ve palto ve eldivenleri değiştirin.
- Hayvanın üzerine steril bir cerrahi örtü yerleştirin.
- Bir neşter kullanarak, cerrahi bir ~ 5 cm uzunluğunda kesim ile linea alba de göbek açın.
- Makas kullanarak kas tabakasını kesin.
- Kesi bölgesinin etrafına gazlı bez leri yerleştirin ve PBS ile ıslayın. Gazlı bez ler ameliyat sırasında eklenecek ek PBS absorbe edecektir.
NOT: Ameliyat boyunca ısı ve PBS desteğini koruyun. - Gelincik uterusunu ortaya çıkar ve gazlı bezlerin üzerine yerleştirin.
- Uzun yükleme ucu olan bir pipet kullanarak enjeksiyon çözeltisi ile cam bir kılcal yükleyin. Yükleme hacminin embriyo sayısına ve farklı deneysel koşulların sayısına bağlı olarak yaklaşık 5-20 μL arasında olduğundan emin olun. Embriyo başına ortalama enjekte edilen hacim 3-5 μL'dir. Yüklü cam kılcal damarı bir tutucuya takın ve tutucunun diğer tarafını bir tüpe ve ağızlıklara bağlayın.
- İlk embriyoyu inceleyin ve kafayı bulun.
- Görselleştirmeyi kolaylaştırmak için fiber optik ışık kaynağını embriyonun başının yanına yerleştirin.
NOT: Gelincik rahim duvarları çok karanlıktır ve ışık doğrudan üzerlerine parlatmadığı sürece içlerini görmek zordur. - Serebral hemisferlerden birinin ventriküliçine tek bir intraventriküler enjeksiyon gerçekleştirin ve bir iç kontrol olarak hizmet etmek için diğer yarımküre bozulmamış tutun. Ventrikül kendisi göz tarafından kolayca farklı değildir, bu yüzden konumu pigmentli iris konumuna göre tahmin edilir, hangi görünür. İntraventriküler enjeksiyon cam kılcal bağlı tutucu alarak ve cam kılcal ucu ile deri, kafatası ve serebral doku nüfuz tarafından yapılır.
NOT: Murine plasentadan daha koyu plasentaya zarar vermemeye dikkat edin.- Cam kılcal damarın ucu ventrikülde yken, cam kılcal damar tutucuya bağlı ağızlık kullanarak ağız borusu ile enjeksiyon çözeltisinin yaklaşık 3-5 l'sini enjekte edin. Enjekte edilen çözelti %0.1 Fast Green içerdiğinden, enjekte edilen ventrikül şimdi koyu yeşile dönecek ve böbrek şeklinde bir yapı olarak görülecektir.
- Bu izleyici elektrotları embriyonun başının üzerine yerleştirin, böylece pozitif kutbu hedeflenecek alanın üzerine ve negatif kutup enjekte edilen alanın altına yerleştirilir.
- Elektroporatörde aşağıdaki elektroporasyon koşullarını ayarlayın: Darbe uzunluğu = 50 ms; Darbe gerilimi = 100 V; Nabız aralığı = 1 s; Bakliyat sayısı = 5. Daha sonra elektroporatörün üzerindeki "Pulse" düğmesine basın.
- Hızlı bir şekilde elektroporated embriyo sıcak 1x PBS birkaç damla bırakın.
- Tüm embriyolar için prosedürü tekrarlayın. Sıcak PBS ile rahim sürekli ıslak tutun.
NOT: Vajinaya bakan ilk embriyolara kolayca ulaşılamazsa, elektroporate olmamak en iyisidir. - Tüm embriyolar elektroporated olduğunda, periton boşluğuna rahim geri yerleştirin.
- 4-0 sütür kullanarak periton ile kas tabakası dikiş.
- Aynı kalınlığı kullanarak cildi dikiş ve alüminyum sprey ile yara sprey.
- Bir kafese hayvan yerleştirin ve bir ısı kaynağı ile sıcak tutmak. Uyanana kadar hayvanı dikkatlice izleyin.
4. Hedeflenen hayvanların ameliyat sonrası bakımı ve barınması
- Ameliyattan sonraki 3 gün boyunca hayvanların aşağıdaki postoperatif bakımdan geçirilmesini sağlayın: Günde 20 mg/kg amoksisilin (antibiyotik) 1x; 25 mg/kg metamizol (analjezik) 3x günlük.
- Gelinciklerin ayrı ayrı barındırdığından emin olun.
- Gelincikler günde en az 1x bir veteriner tarafından incelendiğinden emin olun.
- Gelinciklerin teslimat sırasında mümkün olduğunca az rahatsız olduğundan emin olun.
- Yavrular kesildikten veya kurban edildikten sonra, jillleri histerektomiye hazırlayın.
5. Gelincik histerektomi
NOT: Sterilize edilmiş hayvanların evcil hayvan olarak evlat edinilmelerine başverilmesi için kurban edilen hayvan sayısını azaltmak için histerektomi yapılır. Histerektomi için ameliyat öncesi işlem 2.
- 3.1 ve 3.2 adımlarında açıklandığı gibi gelincik göbeğini tıraş edin ve sterilize edin.
- Cerrahi linea alba de göbek açın. Kas tabakasını kes. Kas tabakasını kaldırın ve kas tabakasını tamamen açarken bir parmakla bağırsağı koruyun.
- Kesi bölgesinin etrafına gazlı bez leri yerleştirin ve steril PBS ile ıslayın. Gelincik rahim ve yumurtalıklar maruz ve gazlı bez bezleri üzerine yerleştirin.
- Mezovar arteria ovarica ve vena ovarica kranial ligating tarafından bir tarafta histerektomi başlayın. Ligasyonun her iki tarafına bir kelepçe koyun ve kelepçelere başka bir ligasyon kranial gerçekleştirin. Onları kurtarmak için ligasyon ucunda üçüncü kelepçe takın. Diğer tarafta tekrarlayın.
- Kelepçeler arasında kesin ve her iki tarafta mezenter gelen cornua rahim ayırmak.
- Ostium uteri için her iki rahim tarafında kaudal arteria uterina ligate. Sonra vajinali ve ligature düzeltmek. Onları kurtarmak için ligasyonların ucunda kelepçe takın. Ligatura iki kelepçe koyun. Kelepçeler arasında kesilmiş ve vajinadan rahim ayırmak. Rahim ve yumurtalıkları çıkarın ve onları atın. Rahim poposundan kalan mukozayı kazıyın.
- Kalan tüm kıskaçları ayırın ve bağ uçlarını kısaltın. Kelepçeler çıkarıldıktan sonra kanamayı kontrol edin.
- 3.16 ve 3.17 adımlarında açıklandığı gibi kas tabakasını ve deriyi dikin. 3.18 ve 4.1-4.3 adımlarında olduğu gibi postoperatif protokolü izleyin. Düzenli veteriner ziyaretleri ile en az 2 hafta hayvan tesisinde hayvanları tutun. Hayvanlar tamamen kurtarıldıktan sonra evlat edinilebilirler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
E33'teki gelinciklerin rahim elektroporasyonunda, embriyonik neokorteksin ventriküler yüzeyini kaplayan nöral progenitör hücrelerinin hedefalınmasıylasonuçlanmıştır ( Şekil 1 ). Bu hücreler apikal atalar denir ve son derece çoğalan, geliştirme sırasında diğer tüm hücre tipleri neden. Asimetrik bölünme üzerine, apikal atalar başka bir apikal ata ve daha farklı bir hücre, genellikle bir bazal ata (BP), ventrikül yüzeyinden delaminated üretti. BP'ler ikincil germinal bölgeye, SVZ'ye göç ettiler. Elektroporasyon E33'te yapıldığında, birçok yenidoğan LP'si SVZ'nin bazal-en kısmına göç etti ve burada OSVZ22'yioluşturdular.
Elektroporasyonun etkileri 4 gün sonra E37'de incelendiğinde, hedeflenen hücrelerin ve bunların soyundan gelen lerin çoğu hala germinal bölgelerdeydi (VZ, ISVZ ve OSVZ, bkz. Şekil 2A)ve hücreler nadiren kortikal plakada (CP) daha fazla bazal olarak mevcuttu. Hedeflenen hücrelerin soyundan esas olarak nöral progenitor tipleri ve yenidoğan nöronlar oluşuyordu. Ata kimliği, pcna26 (Şekil 2B, C)gibi bisiklet hücrelerinin belirteçleri için immünororesans ile incelenebilirken, mitoz geçiren ataların bir alt kümesi fosfohistone 3 (PH3)21 (Şekil 2D) gibi belirteçlerle gösterilebilir.
P0'da, elektroporasyondan 8 gün sonra, hedeflenen hücrelerin soyundan gelen tüm histolojik tabakalarda yayılır (Şekil 3A, B). Bu aşamada, BPs özellikle bol ve bRG kolayca tanımlanabilir edildi. Transkripsiyon faktörü belirteçleri bir arada kullanarak, farklı BP popülasyonları ortaya olabilir. Sox2, bRG26dahil olmak üzere proliferatif progenitor hücrelerinin bir belirtecidir. Tbr2 nörojenik KOP'ların bir belirtecidir, bunlar esas olarak ara atalar26 (Şekil 3B). Embriyolar plazmid kodlama GFP ile birlikte elektroporated olduğundan, nöral atalarının morfolojisi GFP sinyali izleyerek incelenebilir. Bu özellikle iki ana morfotipte gelen P'ler bağlamında önemlidir: büyük ölçüde ara atalar olan multipolar hücreler ve bRG21olan radyal hücreler. Bu nedenle, Sox2 + Tbr2- OSVZ radyal hücreler bRG26eğitimi için ilgi önemli hücre popülasyonudur.
P16 ile, hedeflenen hücrelerin çoğunluğu bölme durdu ve nöronlar ve glia farklılaşmış. Bu nedenle, bu hücre tipleri en iyi bu aşamada incelenir. Çeşitli nöronal ve glial alt tiplerine ek olarak, gelincik P16 neokorteks katlama karakteristiklerini sergiledi (Şekil 3C). Bu aşamada en büyük gyri ve sulci zaten mevcut tu ve prospektif beyin alanları tespit edilebilir31. Gelincik beyni P16'dan sonra miyelinasyon ve sinaptogenez gibi süreçler gerçekleştiğinde olgunlaşmaya devam etti.
Şekil 1: Gelincik neokorteksinin rahim elektroporasyonunda nöral hücrelerin hedeflemi. E33'teki gelincik neokorteksinin rahim elektroporasyonunda apikal ataların hedef edilmesiyle sonuçlandı. Geliştirme sırasında bu hücreler diğer tüm hücre tiplerine yol açar. Bazal döller en iyi daha sonra embriyonik (E37) ve perinatal (P0) evrelerinde çalışılmıştır. Nöronlar en iyi p16 gibi doğum sonrası evrelerde çalışıldı. Kortikal tabakalar: VZ = ventriküler zon; ISVZ = iç subventriküler bölge; OSVZ = dış subventriküler bölge; IZ = ara bölge; CP = kortikal plaka; GZ = germinal bölgeler (VZ+SVZ); WM = beyaz madde. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: E33'te rahim elektroporasyonundan sonra E37 gelinet neokorteks örneği. (A ve B) E37 gelinet neokorteks bölümü; yeşil, elektroporated hücrelerin soyundan (GFP); mavi (A) hücre çekirdekleri (DAPI); macenta (B), bisiklet hücreleri (PCNA). Kutu (genişlik = 777 μm)(C)içinde daha yüksek büyütmede gösterilen alanı gösterir. Ölçek çubuğu = 1 mm. Bir iç kontrol olarak hizmet veren kontralateral (nonelectroporated hemisfer) GFP sinyal eksikliği ne dikkat edin. (C ve D) Hedeflenen alanın daha yüksek büyütmeleri; yeşil, elektroporated hücrelerin soyundan (GFP); macenta (C), bisiklet hücreleri (PCNA); kırmızı (D), mitotik hücreler (fosfohistone 3, PH3). Hedeflenen hücrelerin soyundan çoğunluğu bu aşamada SVZ olduğunu unutmayın. Şekil 1'dekigibi kortikal tabakalar . Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: E33'te rahim elektroporasyonundan sonra P0 ve P16 gelinet neokorteks örnekleri. (A ve B) P0 gelincik neokorteks bölümü; yeşil, elektroporated hücrelerin soyundan (GFP); mavi (A) hücre çekirdekleri (DAPI); siyan (B), Sox2; macenta (B), Tbr2. (B) Elektrohap alan yüksek büyütme. Ölçek çubukları = 1 mm (A), 100 μm (B). Şekil 1'dekigibi kortikal tabakalar . (C) P16 gelincik neokorteksinin kesiti; yeşil, elektroporated hücrelerin soyundan (GFP); gri, hücre çekirdekleri (DAPI); macenta, astrositler (GFAP). Ölçek çubuğu = 1 mm. Bu rakam Kalebic ve ark.25'tendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Rahim elektroporasyonunda gelincik diğer yöntemlere göre avantajları ve dezavantajları olan önemli bir tekniktir. Bu yöntemin kritik adımları ve sınırlamalarının yanı sıra olası değişiklikler ve gelecekteki uygulamaları da göz önünde bulundurabiliriz.
Victor Borrell ve elektroporasyon veya viral enjeksiyon yoluyla postnatal gelincik neokorteks genetik manipülasyon meslektaşlarının öncü çalışma beri35,42,43, gelincik genetik olarak erişilebilir bir model organizma haline gelmiştir. Rahim elektroporasyon yoluyla embriyonik gelişim sırasında genetik manipülasyon kurulması19,20 daha erken gelişim aşamalarında nöral progenitor hücrelerinin hedefleme izin vererek yeni araştırma olanakları açtı. Postnatal manipülasyon ile karşılaştırıldığında, rahim elektroporasyon neokorteks ve sırayla neokorteks tüm diğer hücre tipleri oluşturmak daha az farklılaştırılmış nöral progenitors daha büyük alanların hedefleme sağlar. Daha da önemlisi, viral hedefleme ile karşılaştırıldığında, rahim elektroporasyonu nda hedefleme mekansal hassasiyet sağlar.
Yöntemin en kritik kısmı ameliyatın kendisidir. Ferrat neokorteks in utero elektroporasyonu farelerde prosedürile karşılaştırıldığında önemli ölçüde daha karmaşık ve zordur. Rahim duvarları daha koyu ve embriyoları ayırt etmek daha zordur. Ayrıca, yetişkin gelincikler daha fazla hayvancılık ve veterinerlik gereksinimleri vardır. Özellikle zorlu yavruların doğum etrafında dönemdir. Gelincikler bu dönemde çok hassastır lar ve gereksiz yere rahatsız edilmemek en iyisidir. Yaklaşımın kendisinin büyük sınırlamaları hedeflemenin verimliliği ile ilgilidir. Rahim elektroporasyonunda her zaman nöral atalardan oluşan bir mozaiğin hedef edilmesiyle sonuçlanır. Bu nöral ataların veya nöronların hücre biyolojik yönlerini incelemek için idealdir, ancak neokortikal katlama bir değişiklik gibi büyük histolojik ve anatomik perturbations neden için suboptimal olduğunu. Bu gerekli ise, en iyi yaklaşım neokorteks büyük bölümlerini kapsayacak şekilde işlem sırasında rostrokaudal eksen boyunca elektrotlar taşımaktır. Ancak, tüm organ analizi için en iyi yaklaşım zigot evre44başlayarak transgenik gelincik üretimidir.
Rahim elektroporasyonunun yapıldığı embriyonik evre (E33) bazal ataları incelemek için idealdir. Nitekim, bu aşamada elektroporasyonlar ve viral hedefleme OSVZ başlangıcının zamanlaması ortaya çıkarmak için uygulanmıştır22 yanı sıra bazal atalarının çeşitli hücre biyolojik özellikleri kendi morfolojisi ve çoğalması ile ilgili21,25,26. Ancak, bir çalışmanın bilimsel amacına bağlı olarak, elektroporasyon zamanlaması kolayca yöntem19,,20önemli değişiklikler olmadan değiştirilebilir. Zamansal özgüllük dışında, rahim elektroporasyon mekansal özgüllük kolay değişiklikler için izin verir. Rostrokaudal eksen boyunca rostromedial pozisyondadorolateral neokorteks hedefalındı, bu da motor ve somatosensorik alanların etiketlemesine neden oldu. Diğer neokortikal alanlar da elektrotların yerleşimi ve elektrik alanının yönünü ayarlayarak hedeflenebilir. Farede, medial neokorteks45 ve ventral telencephalon46 rahim elektroporasyonunda kullanılarak hedeflenmiştir, bu da benzer yaklaşımların gelinciklerde de kullanılabileceğini düşündürmektedir.
Son olarak, rahim elektroporasyonu kolayca en son genom ve epigenom düzenleme teknikleri ile kombine edilebilir13,14,16,25, CRISPR / (d)Cas9 bileşenleri bir plazmid olarak teslim edilebilir veya rekombinant Cas9 protein ve kılavuz RNA14bir kompleks olarak , ikinci genom düzenleme yer almak için gerekli süreyi kısaltma ile. Normal beyin gelişimini anlamak ve özellikle insan patolojik durumlarını modellemek için önemli olan kesin genomik mutasyonlar oluşturmak için genom düzenlemede daha ileri teknolojik gelişmelerin hem farelerde hem de gelinciklerde rahim elektroporasyonunda birleştirilmesi olasıdır. Bu bağlamda, rahim elektroporasyonunda, hedeflenen hücrelerin ve bunların soyundan gelen moleküler imzaları ve dinamik davranışlarını anlamak için sonraki çeşitli tek hücreli omik yaklaşımlar ve canlı görüntüleme için tercih edilen hedefleme yöntemi olarak giderek daha fazla kullanılmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Max Planck Moleküler Hücre Biyolojisi ve Genetiği Enstitüsü'nün hizmet ve tesislerine, özellikle de gelinciklerin mükemmel yetiştiriciliği için Biyomedikal hizmetleri (BMS) tüm ekibi ve J. Peychl ve Işık Mikroskobu Tesisi ekibine verilen olağanüstü destek için müteşekkiriz. BmS'ten Katrin Reppe ve Anna Pfeffer'a istisnai veteriner desteği ve Huttner grubundan Lei Xing'e gelincik ameliyatlarına yardımcı oldukları için minnettarız.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1ml syringe | BD | 309628 | Electroporation |
| 4-0 Vicryl suture | Ethicon | V392ZG | Surgery |
| Aluminium spray | cp-pharma | 98017 | Surgery |
| Amoxicilin+clavulanic acid (Synulox RTU) | WDT | 6301 | Surgery |
| Cappilary holder | WPI | MPH6S12 | Electroporation |
| Dexpanthenol Ointment solution | Bayer | 6029009.00.00 | Surgery |
| Drape sheet 45x75cm | Hartmann | 2513052 | Surgery |
| Electrode Tweezer, platinum plated 5mm | BTX | 45-0489 | Electroporation |
| Electroporator | BTX | ECM830 | Electroporation |
| Fast Green | Sigma | F7258-25G | Electroporation |
| Ferret Mustela putorius furo | Marshall | NA | Experimental organism |
| Fiber optic light source | Olympus | KL1500LCD | Electroporation |
| Forceps | Allgaier instrumente | 08-033-130 | Surgery |
| Forceps 3C-SA | Rubis Tech | 3C-SA | Surgery |
| Forceps 55 | Dumostar | 11295-51 | Surgery |
| Forceps 5-SA | Rubis Tech | 5-SA | Surgery |
| Gauze swabs large | Hartmann | 401723 | Surgery |
| Gauze swabs small | Hartmann | 401721 | Surgery |
| GFAP antibody | Dako | Z0334 | Antibody |
| GFP antibody | Aves labs | GFP1020 | Antibody |
| Glass cappilaries (Borosilicate glass with filament, OD:1.2mm, ID: 0.69mm, 10cm length) | Sutter Instrument | BF120-69-10 | Electroporation |
| Glucose | Bela-pharm | K4011-02 | Surgery |
| Heat pad | Hans Dinslage | Sanitas SHK18 | Surgery |
| Iodine (Betadine solution 100 mg/ml) | Meda | 997437 | Surgery |
| Isofluran | CP | 21311 | Surgery |
| Loading tips 20µl | Eppendorf | #5242 956.003 | Electroporation |
| Metamizol | WDT | 99012 | Surgery |
| Metzenbaum dissecting scissors | Aesculap | BC600R | Surgery |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | Model P-97 | Electroporation |
| pCAGGS-GFP | NA | NA | From Kalebic et al., eLife, 2018 |
| PCNA antibody | Millipore | CBL407 | Antibody |
| pH3 antibody | Abcam | ab10543 | Antibody |
| Scalpel | Aesculap | 294200104 | Surgery |
| Shaver | Braun | EP100 | Surgery |
| Sox2 antibody | R+D Systems | AF2018 | Antibody |
| Surgical clamp 13cm | WDT | 27080 | Surgery |
| Surgical double spoon (Williger) | WDT | 27232 | Surgery |
| Surgical drape | WDT | 28800 | Surgery |
| Surgical scissors small | FST | 14090-09 | Surgery |
| Suturing needle holder | Aesculap | BM149R | Surgery |
| Tbr2 antibody | Abcam | ab23345 | Antibody |
| Transfer pipette 3ml | Fischer scientific | 13439108 | Surgery |
| Water bath | Julabo | TW2 | Surgery |
References
- Kalebic, N., Long, K., Huttner, W. B. Evolution of Nervous Systems 2e. Kaas, J. 3, Elsevier. 73-89 (2017).
- Rakic, P. Evolution of the neocortex: a perspective from developmental biology. Nature Reviews Neurosciences. 10 (10), 724-735 (2009).
- Dehay, C., Kennedy, H., Kosik, K. S. The outer subventricular zone and primate-specific cortical complexification. Neuron. 85 (4), 683-694 (2015).
- Fernandez, V., Llinares-Benadero, C., Borrell, V. Cerebral cortex expansion and folding: what have we learned. EMBO Journal. 35 (10), 1021-1044 (2016).
- Molnar, Z., et al. New insights into the development of the human cerebral cortex. Journal of Anatomy. 235 (3), 432-451 (2019).
- Janson, C. G., McPhee, S. W., Leone, P., Freese, A., During, M. J. Viral-based gene transfer to the mammalian CNS for functional genomic studies. Trends in Neurosciences. 24 (12), 706-712 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation. Development Growth & Differentiation. 50 (6), 507-511 (2008).
- Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO Journal. 1 (7), 841-845 (1982).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240 (1), 237-246 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. Journal of Visualized Experiments. (6), e239 (2007).
- Straub, C., Granger, A. J., Saulnier, J. L., Sabatini, B. L. CRISPR/Cas9-mediated gene knock-down in post-mitotic neurons. PLoS One. 9 (8), 105584 (2014).
- Shinmyo, Y., et al. CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in the mouse brain using in utero electroporation. Science Reports. 6, 20611 (2016).
- Kalebic, N., et al. CRISPR/Cas9-induced disruption of gene expression in mouse embryonic brain and single neural stem cells in vivo. EMBO Reports. 17 (3), 338-348 (2016).
- Mikuni, T., Nishiyama, J., Sun, Y., Kamasawa, N., Yasuda, R. High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by In Vivo Genome Editing. Cell. 165 (7), 1803-1817 (2016).
- Albert, M., et al. Epigenome profiling and editing of neocortical progenitor cells during development. EMBO Journal. 36 (17), 2642-2658 (2017).
- Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos. Differentiation. 70 (4-5), 155-162 (2002).
- Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E16 rat embryos. Journal of Visualized Experiments. (6), e236 (2007).
- Kawasaki, H., Iwai, L., Tanno, K. Rapid and efficient genetic manipulation of gyrencephalic carnivores using in utero electroporation. Molecular Brain. 5, 24 (2012).
- Kawasaki, H., Toda, T., Tanno, K. In vivo genetic manipulation of cortical progenitors in gyrencephalic carnivores using in utero electroporation. Biology Open. 2 (1), 95-100 (2013).
- Kalebic, N., et al. Neocortical expansion due to increased proliferation of basal progenitors is linked to changes in their morphology. Cell Stem Cell. 24 (4), 535-550 (2019).
- Martinez-Martinez, M. A., et al. A restricted period for formation of outer subventricular zone defined by Cdh1 and Trnp1 levels. Nature Communication. 7, 11812 (2016).
- Saito, K., et al. Characterization of the Inner and Outer Fiber Layers in the Developing Cerebral Cortex of Gyrencephalic Ferrets. Cerebral Cortex. 29 (10), 4303-4311 (2019).
- Shinmyo, Y., et al. Folding of the Cerebral Cortex Requires Cdk5 in Upper-Layer Neurons in Gyrencephalic Mammals. Cell Reports. 20 (9), 2131-2143 (2017).
- Matsumoto, N., Shinmyo, Y., Ichikawa, Y., Kawasaki, H. Gyrification of the cerebral cortex requires FGF signaling in the mammalian brain. Elife. 6, 29285 (2017).
- Kalebic, N., et al. Human-specific ARHGAP11B induces hallmarks of neocortical expansion in developing ferret neocortex. Elife. 7, 41241 (2018).
- Masuda, K., et al. Pathophysiological analyses of cortical malformation using gyrencephalic mammals. Science Reports. 5, 15370 (2015).
- Matsumoto, N., et al. Pathophysiological analyses of periventricular nodular heterotopia using gyrencephalic mammals. Human Molecular Genetics. 26 (6), 1173-1181 (2017).
- Barnette, A. R., et al. Characterization of brain development in the ferret via MRI. Pediatric Research. 66 (1), 80-84 (2009).
- Smart, I. H., McSherry, G. M. Gyrus formation in the cerebral cortex in the ferret. I. Description of the external changes. Journal of Anatomy. 146, 141-152 (1986).
- Sawada, K., Watanabe, M. Development of cerebral sulci and gyri in ferrets (Mustela putorius). Congenital Anomalies (Kyoto). 52 (3), 168-175 (2012).
- Reillo, I., Borrell, V. Germinal zones in the developing cerebral cortex of ferret: ontogeny, cell cycle kinetics, and diversity of progenitors. Cerebral Cortex. 22 (9), 2039-2054 (2012).
- Smart, I. H., McSherry, G. M. Gyrus formation in the cerebral cortex of the ferret. II. Description of the internal histological changes. Journal of Anatomy. 147, 27-43 (1986).
- Borrell, V., Reillo, I. Emerging roles of neural stem cells in cerebral cortex development and evolution. Developmental Neurobiology. 72 (7), 955-971 (2012).
- Reillo, I., de Juan Romero, C., Garcia-Cabezas, M. A., Borrell, V. A role for intermediate radial glia in the tangential expansion of the mammalian cerebral cortex. Cerebral Cortex. 21 (7), 1674-1694 (2011).
- Fietz, S. A., et al. OSVZ progenitors of human and ferret neocortex are epithelial-like and expand by integrin signaling. Nature Neurosciences. 13 (6), 690-699 (2010).
- Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Development and evolution of the human neocortex. Cell. 146 (1), 18-36 (2011).
- Fietz, S. A., Huttner, W. B. Cortical progenitor expansion, self-renewal and neurogenesis-a polarized perspective. Current Opinion in Neurobiology. 21 (1), 23-35 (2011).
- De Juan Romero, C., Bruder, C., Tomasello, U., Sanz-Anquela, J. M., Borrell, V. Discrete domains of gene expression in germinal layers distinguish the development of gyrencephaly. EMBO Journal. 34 (14), 1859-1874 (2015).
- Kawasaki, H. Molecular investigations of the brain of higher mammals using gyrencephalic carnivore ferrets. Neurosciences Research. 86, 59-65 (2014).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. Journal of Visualized Experiments. (54), e3024 (2011).
- Borrell, V. In vivo gene delivery to the postnatal ferret cerebral cortex by DNA electroporation. Journal of Neuroscience Methods. 186 (2), 186-195 (2010).
- Borrell, V., Kaspar, B. K., Gage, F. H., Callaway, E. M. In vivo evidence for radial migration of neurons by long-distance somal translocation in the developing ferret visual cortex. Cerebral Cortex. 16 (11), 1571-1583 (2006).
- Johnson, M. B., et al. Aspm knockout ferret reveals an evolutionary mechanism governing cerebral cortical size. Nature. 556 (7701), 370-375 (2018).
- Vaid, S., et al. A novel population of Hopx-dependent basal radial glial cells in the developing mouse neocortex. Development. 145 (20), 169276 (2018).
- Pilz, G. A., et al. Amplification of progenitors in the mammalian telencephalon includes a new radial glial cell type. Nature Communications. 4, 2125 (2013).
