Summary
Aquí se presenta un protocolo para realizar la manipulación genética en el cerebro de hurón embrionario utilizando en la electroporación del útero. Este método permite la focalización de células progenitoras neuronales en el neocórtex in vivo.
Abstract
La manipulación de la expresión génica in vivo durante el desarrollo embrionario es el método de elección al analizar el papel de los genes individuales durante el desarrollo de mamíferos. En la electroporación del útero es una técnica clave para la manipulación de la expresión génica en el cerebro de mamífero embrionario in vivo. Aquí se presenta un protocolo para la electroporación del útero del neocórtex embrionario de hurones, un pequeño carnívoro. El hurón se está utilizando cada vez más como modelo para el desarrollo de neocórtex, ya que su neocórtex exhibe una serie de características anatómicas, histológicas, celulares y moleculares que también están presentes en primates humanos y no humanos, pero ausentes en modelos de roedores, como el ratón o la rata. En la electroporación del útero se realizó en el día embrionario (E) 33, una etapa de midneurogénesis en hurones. En la electroporación del útero se dirige a las células progenitoras neuronales que recubren los ventrículos laterales del cerebro. Durante la neurogénesis, estas células progenitoras dan lugar a todos los demás tipos de células neuronales. Este trabajo muestra resultados representativos y análisis en E37, día postnatal (P) 1 y P16, correspondientes a 4, 9 y 24 días después en electroporación del útero, respectivamente. En etapas anteriores, la progenie de las células dirigidas consiste principalmente en varios subtipos de progenitores neuronales, mientras que en etapas posteriores la mayoría de las células etiquetadas son neuronas postmitoticas. Así, en la electroporación del útero permite el estudio del efecto de la manipulación genética en las características celulares y moleculares de varios tipos de células neuronales. A través de su efecto en varias poblaciones celulares, en la electroporación del útero también se puede utilizar para la manipulación de características histológicas y anatómicas del neocórtex hurón. Es importante destacar que todos estos efectos son agudos y se realizan con una especificidad espaciotemporal determinada por el usuario.
Introduction
El neocórtex es la lámina exterior del cerebrum mamífero y el asiento de las funciones cognitivas superiores1,2,3,4,5. Con el fin de lograr una manipulación genética aguda en el neocórtex de mamíferos in vivo durante el desarrollo embrionario, se han explorado dos métodos diferentes: infección viral6 y electroporación del útero7. Ambos métodos permiten la focalización eficiente de las células neocorticales, pero sufren de algunas limitaciones. La principal ventaja de la electroporación del útero en comparación con la infección viral es la capacidad de lograr la especificidad espacial dentro del neocórtex, que se logra mediante la regulación de la dirección del campo eléctrico.
Dado que la electroporación se demostró por primera vez para facilitar la entrada de ADN en las células in vitro8, se ha aplicado para entregar ADN en varios vertebrados in vivo. En la neurociencia del desarrollo, en la electroporación del útero del neocórtex del ratón se notificó por primera vez en 20019,10. Este método consiste en una inyección de la mezcla de ADN en el ventrículo lateral del cerebro embrionario y posterior aplicación del campo eléctrico utilizando electrodos de pinza, lo que permite la precisión espacial7,,11. En el útero la electroporación se ha aplicado desde entonces para entregar ácidos nucleicos con el fin de manipular la expresión de genes endógenos o ectópicamente añadidos en el neocórtex del ratón. Recientemente se han realizado importantes progresos al aplicar la metodología de edición del genoma mediado por CRISPR/Cas9 a través de la electroporación del útero en el neocórtex del ratón para realizar (1) la alteración del gen en las neuronas postmitóticas12,,13 y las células progenitoras neuronales14y (2) el genoma15 y la edición del epigenoma16.
Muy poco después del primer informe en ratón, en electroporación del útero se aplicó a la rata embrionaria neocórtex17,18. Los no roedores siguieron siendo un desafío hasta que se notificó la primera electroporación del útero de hurones, un pequeño carnívoro, en 201219,,20. Desde entonces, en la electroporación del útero de hurones se ha aplicado para estudiar los mecanismos del desarrollo de neocortex mediante el etiquetado de progenitores neuronales y neuronas20,,21,22,23, manipulando la expresión de genes endógenos, incluyendo el uso de la tecnología CRISPR/Cas924,y mediante la entrega de genes ectópicos21,,22,,25, incluyendo genes específicos para el ser humano26. Además, en la electroporación del útero de hurones se ha utilizado para abordar las características del desarrollo del neocórtex humano en condiciones patológicas27,,28.
En el contexto del desarrollo de neocórtex, las ventajas de usar hurones como organismo modelo en comparación con los ratones se deben al hecho de que los hurones recapitulan mejor una serie de características similares a las humanas. A nivel anatómico, los hurones presentan un patrón característico de plegado cortical, que también está presente en humanos y la mayoría de otros primates, pero está completamente ausente en ratones o ratas4,,29,,30,,31. A nivel histológico, los hurones tienen dos zonas germinales subventriculares distintas, denominadas zonas subventriculares internas y externas (ISVZ y OSVZ, respectivamente)32,33, separadas por la capa de fibra interna23. Estas características también se comparten con los primates, incluyendo los seres humanos, pero no con los ratones34. La ISVZ y la OSVZ en hurones y humanos están pobladas con abundantes células progenitoras neuronales, mientras que la zona subventricular (SVZ) de ratones contiene sólo progenitores neuronales dispersos21,32,35,36. A nivel celular, los hurones exhiben una alta proporción de un subtipo de progenitores neuronales denominados glia radial basal o externa (bRG u oRG, respectivamente), que se consideran instrumentales para la expansión evolutiva del neocortex de mamíferos34,,37,,38. por lo tanto, bRG son muy abundantes en el neocórtex hurón humano y embrionario fetal, pero son muy raros en el ratón embrionario neocórtex35,,36. Además, el hurón bRG muestra heterogeneidad morfológica similar a la del bRG humano, muy superior al ratón bRG21. Por último, a nivel molecular, el desarrollo de hurón neocórtex muestra patrones de expresión génica muy similares a los del neocórtex humano fetal, que se presume que controlan el desarrollo de plegado cortical, entre otras cosas39.
Las características biológicas y moleculares celulares del hurón bRG las hacen altamente proliferativas, similares a la bRG humana. Esto se traduce en una mayor producción de neuronas y el desarrollo de un neocórtex ampliado y altamente complejo34. Estas características hacen que los hurones sean excelentes organismos modelo para el estudio de características similares a las humanas del desarrollo de neocórtex que no se pueden modelar en ratones26,,40. Para aprovechar al máximo el hurón como organismo modelo se desarrolló el método presentado. Consiste en la electroporación del útero de embriones hurones E33 con un plásmido que expresa la GFP (pGFP) bajo el control de un promotor ubicuo, CAG. Los embriones electroporados pueden ser analizados embrionaria o postnatal. Con el fin de reducir el número de animales sacrificados, las hurones hembra (jills) son esterilizadas por histerectomía y donadas para adopción como mascotas. Si los embriones dirigidos se cosechan en etapas embrionarias, se realiza una segunda cirugía y los embriones son extirpados por una sección cesárea, mientras que las jills se histerorectan. Si los embriones objetivo se analizan en etapas postnatales, las jills se histeroscenten después de que los cachorros han sido destetados o sacrificados. Por lo tanto, también se presenta un protocolo para la histerectomía de las jills.
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Protocol
Todos los procedimientos experimentales se llevaron a cabo de acuerdo con la Legislación Alemana de Bienestar Animal después de la aprobación por el Landesdirektion Sachsen (licencias TVV 2/2015 y TVV 21/2017).
1. Preparación para la electroporación del útero
- Prepare la mezcla de ADN. En este protocolo se utiliza una concentración final de 1 g/l de pGFP. Disolver EL ADN en PBS y complementar con 0.1% Fast Green para facilitar la visualización. Una vez preparada, mezcle la mezcla de ADN en pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces o tocando los dedos. Conservar a temperatura ambiente hasta su uso.
NOTA: En el caso de las coelectrooraciones, la mezcla de ADN está preparada para contener una concentración final de 1 g/L de plásmido que codifica un gen de interés junto con 0,5 g/l de pGFP diluido en PBS. - Prepare la mesa de cirugía con todas las herramientas e instrumentos necesarios.
- Tire de los capilares de vidrio con el tirador de micropipetas. Ajuste el diámetro de la punta capilar cortando la parte distal del capilar utilizando fórceps como se describió anteriormente41.
2. Preparación de hurones para la cirugía
- Mantenga las jills embarazadas con embriones en ayunas E33 durante al menos 3 horas antes de la cirugía para reducir el riesgo de vómitos.
- Antes de la cirugía esterilizar todas las herramientas mediante autoclaving. Realizar la cirugía en una habitación especialmente asignada en condiciones asépticas para eliminar posibles fuentes de contaminación.
- Coloque la jill embarazada en la caja de narcosis con 4% de isoflurano.
- Cuando se anestesia, coloque el hurón en la mesa de operación con una almohadilla de calor y adjunte la máscara de narcosis con un flujo constante de isoflurano de 2-3% a la nariz. Para garantizar el nivel adecuado de anestesia, compruebe la falta de los siguientes reflejos:
- El reflejo palpebral al tocar la piel periocular
- El reflejo flexor pellizcando la piel entre la2a y3a,o3a y 4a de las dos extremidades posteriores
- Si el reflejo palpebral está ausente y el reflejo flexor se reduce claramente, compruebe si el reflejo del dolor pellizcando un dedo del dedo de cada extremidad posterior.
NOTA: Asegúrese de tener un estetoscopio a mano para controlar la frecuencia cardíaca y el ritmo si es necesario.
- Inyectar el hurón por vía subcutánea con analgésico (0,1 ml de metamizol, 50 mg/kg de peso corporal), antibiótico (0,1 ml/kg de peso corporal de 20 mg/kg de amoxicilina + ácido clavulánico) y glucosa (10 ml de solución de glucosa al 5%).
- Coloque una gota de solución de pomada en los ojos para prevenir la deshidratación ocular durante el procedimiento quirúrgico.
- Afeitar el vientre del hurón usando una afeitadora.
- Limpiar la piel con agua y jabón, desinfectar el vientre con un 70% de exfoliación de etanol, desinfectar 2x con yodo y dejar secar.
3. En electroporación del útero de hurones
- Asegúrese de que el área quirúrgica es estéril: coloque herramientas quirúrgicas estériles en tejidos estériles y cambie la capa y los guantes.
- Coloque una cortina quirúrgica estéril en el animal.
- Usando un bisturí, abre quirúrgicamente el vientre en la linea alba con un corte largo de 5 cm de largo.
- Corta la capa muscular usando tijeras.
- Coloque los hisopos de gasa alrededor del sitio de la incisión y mojelos con PBS. Los hisopos de gasa absorberán el PBS adicional que se agregará durante la cirugía.
NOTA: Mantenga el calor y el soporte de PBS durante toda la cirugía. - Exponga el útero de hurón y colóquelo en los hisopos de gasa.
- Cargue un capilar de vidrio con la solución inyectable utilizando una pipeta con una punta de carga larga. Asegúrese de que el volumen de carga esté aproximadamente entre 5 y 20 oL, dependiendo del número de embriones y del número de condiciones experimentales diferentes. El volumen medio inyectado por embrión es de 3-5 l. Fije el capilar de vidrio cargado a un soporte y conecte el otro lado del soporte a un tubo y una boquilla.
- Inspeccione el primer embrión y encuentre la cabeza.
- Coloque la fuente de luz de fibra óptica junto a la cabeza del embrión para facilitar la visualización.
NOTA: Las paredes uterinas de hurón son muy oscuras, y es difícil ver a través de ellas a menos que la luz brrille directamente sobre ellas. - Realizar una sola inyección intraventricular en el ventrículo de uno de los hemisferios cerebrales y mantener el otro hemisferio intacto para servir como un control interno. El ventrículo en sí no es fácilmente distinto por el ojo, por lo que su ubicación se estima en función de la ubicación del iris pigmentado, que es visible. La inyección intraventricular se realiza tomando el soporte unido al capilar del vidrio y penetrando la piel, el cráneo y el tejido cerebral con la punta del capilar del vidrio.
NOTA: Asegúrese de no dañar la placenta, que es más oscura que las placentas murinas.- Cuando la punta del capilar de vidrio esté en el ventrículo, inyecte aproximadamente 3–5 ml de la solución inyectable por la boquilla utilizando la boquilla conectada al soporte capilar de vidrio. Debido a que la solución inyectada contiene 0.1% Fast Green, el ventrículo inyectado ahora se volverá verde oscuro, y será visible como una estructura en forma de riñón.
- Coloque los electrodos de pinza en el útero por encima de la cabeza del embrión para que el polo positivo se coloque por encima del área que se dirigirá y el polo negativo por debajo del área inyectada.
- Establezca las siguientes condiciones de electroporación en el electroporador: Longitud del pulso a 50 ms; Tensión de pulso á 100 V; Intervalo de pulsos 1 s; Número de pulsos 5. A continuación, pulse el botón"Pulso"del electroporador.
- Arroje rápidamente varias gotas de PBS 1x caliente en el embrión electroporado.
- Repita el procedimiento para todos los embriones. Mantenga el útero constantemente húmedo con PBS caliente.
NOTA: Si los primeros embriones que miran hacia la vagina no son fácilmente accesibles, es mejor no electropograrlos. - Cuando todos los embriones estén electroporados, vuelva a colocar el útero en la cavidad peritoneal.
- Suturar la capa muscular con el peritoneo usando una sutura 4-0.
- Suturar la piel usando el mismo grosor y rociar la herida con spray de aluminio.
- Coloque el animal en una jaula y manténgalo caliente con una fuente de calor. Supervise cuidadosamente al animal hasta que despierte.
4. Cuidado postoperatorio y alojamiento de animales específicos
- Durante 3 días después de la cirugía asegúrese de que los animales se someten a los siguientes cuidados postoperatorios: 20 mg/kg de amoxicilina (antibiótico) 1x al día; 25 mg/kg de metamizol (analgésico) 3 veces al día.
- Asegúrese de que los hurones estén alojados individualmente.
- Asegúrese de que los hurones sean examinados por un veterinario al menos 1 veces al día.
- Asegúrese de que los hurones sean perturbados lo menos posible durante el parto.
- Después de que los cachorros sean destetados o sacrificados, prepare las jills para la histerectomía.
5. Histerectomía de hurones
NOTA: Se realiza una histerectomía para reducir el número de animales sacrificados de modo que los animales esterilizados puedan ser donados para adopción como mascotas. El procedimiento prequirúrgico para la histerectomía es el mismo que en el paso 2.
- Afeitar y esterilizar el vientre del hurón como se describe en los pasos 3.1 y 3.2.
- Abra quirúrgicamente el vientre en la linea alba. Corta la capa muscular. Levante la capa muscular y cobise el intestino con un dedo mientras abre completamente la capa muscular.
- Coloque los hisopos de gasa alrededor del sitio de la incisión y mojelos con PBS estéril. Exponga el útero de hurón y los ovarios y colóquelos en los hisopos de gasa.
- Comienza la histerectomía por un lado ligando la arteria ovarica y la vena ovarica craneal hasta el mesovar. Coloque una abrazadera a cada lado de la ligadura y realice otra ligadura craneal a las abrazaderas. Fije la tercera abrazadera en los extremos de la ligadura para salvarlos. Repita en el otro lado.
- Cortar entre las abrazaderas y separar el cornua uteri del mesentería en ambos lados.
- Ligar la arteria uterina en ambos lados uterinos caudal al ostium uteri. Luego liga la vagina y fijar la ligadura. Fije la abrazadera en los extremos de las ligaduras para salvarlas. Ponga dos abrazaderas craneales a la ligadura. Corte entre las abrazaderas y desensafíe el útero de la vagina. Retire el útero y los ovarios y deséchelos. Raspar la membrana mucosa residual de la colza del útero.
- Separe todas las abrazaderas restantes y acorte los extremos de la ligadura. Asegúrese de controlar el sangrado después de retirar las abrazaderas.
- Suturar la capa muscular y la piel como se describe en los pasos 3.16 y 3.17. Siga el protocolo postoperatorio como en los pasos 3.18 y 4.1–4.3. Mantener a los animales en el centro animal durante al menos 2 semanas con visitas veterinarias regulares. Después de que los animales están completamente recuperados, pueden ser donados para adopción.
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Representative Results
En la electroporación del útero de hurones en E33 dio lugar a la focalización de las células progenitoras neuronales que recubren la superficie ventricular del neocórtex embrionario (Figura 1). Estas células se llaman progenitores apicales y son altamente proliferativas, dando lugar a todos los demás tipos de células durante el desarrollo. Tras la división asimétrica, los progenitores apicales generaron otro progenitor apical y una célula más diferenciada, típicamente un progenitor basal (BP), que se delaminó de la superficie ventricular. Los BPs migraron a la zona germinal secundaria, la SVZ. Cuando la electroporación se realizó en E33, muchos recién nacidos emigraron a la parte basal de la SVZ, donde formaron el OSVZ22.
Cuando los efectos de la electroporación se examinaron 4 días más tarde en E37, la mayoría de las células objetivo y su progenie todavía estaban en las zonas germinales (VZ, ISVZ y OSVZ, ver Figura 2A) y las células rara vez estaban presentes más basalmente en la placa cortical (CP). La progenie de las células objetivo consistía principalmente en tipos de progenitores neuronales y neuronas recién nacidas. La identidad del progenitor podría examinarse por inmunofluorescencia para marcadores de células ciclistas, como PCNA26 (Figura 2B, C), mientras que un subconjunto de progenitores sometidos a mitosis podría mostrarse mediante marcadores como la fosfofofofotona 3 (PH3)21 (Figura 2D).
En P0, 8 días después de la electroporación, la progenie de las células objetivo se extendió en todas las capas histológicas (Figura 3A, B). En esta etapa, los BPs eran particularmente abundantes y bRG eran fácilmente identificables. Usando una combinación de marcadores de factor de transcripción, diferentes poblaciones de BP podrían ser reveladas. Sox2 es un marcador de células progenitoras proliferativas, incluyendo bRG26. Tbr2 es un marcador de BPs neurogénicos, que son principalmente progenitores intermedios26 (Figura 3B). Debido a que los embriones fueron co-electroporados con un plásmido que codifica la GFP, la morfología de los progenitores neuronales podría examinarse mediante el seguimiento de la señal GFP. Esto es particularmente importante en el contexto de los BPs, que vienen en dos morfotipos principales: las células multipolares, que son en gran parte progenitores intermedios, y las células radiales, que son bRG21. Por lo tanto, las células radiales Sox2+ Tbr2– en la OSVZ son la población celular clave de interés para estudiar bRG26.
Por P16, la mayoría de las células objetivo dejaron de dividirse y se diferenciaron en neuronas y glia. Por lo tanto, estos tipos de celda se examinan mejor en esta etapa. Además de varios subtipos neuronales y gliales, el neocórtex hurón P16 presentaba el patrón de características del plegado (Figura 3C). En esta etapa la mayoría de los principales gyri y sulci ya estaban presentes y las áreas cerebrales prospectivas podrían ser identificadas31. El cerebro de hurón continuó madurando después de P16, cuando se llevan a cabo procesos como la mielinización y la sinaptogénesis.
Figura 1: Apuntando a las células neurales en electroporación del útero del neocórtex del hurón. En la electroporación del útero del neocórtex hurones en E33 resultó en la focalización de los progenitores apicales. Durante el desarrollo, estas células dan lugar a todos los demás tipos de células. Los progenitores basales fueron mejor estudiados en etapas posteriores embrionarias (E37) y perinatales (P0). Las neuronas fueron mejor estudiadas en etapas postnatales, como P16. Capas corticales: VZ - zona ventricular; ISVZ - zona subventricular interna; OSVZ - zona subventricular externa; IZ - zona intermedia; CP - placa cortical; GZ - zonas germinales (VZ+SVZ); WM - materia blanca. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Ejemplo de neocórtex de hurón E37 después de la electroporación del útero en E33. (A y B) Sección del neocórtex E37 ferret; verde, progenie de células electroporated (GFP); núcleos celulares azules(A); magenta (B), células ciclistas (PCNA). La caja (ancho 777 m) indica el área que se muestra en un aumento más alto en (C). Barra de escala de 1 mm. Tenga en cuenta la falta de señal GFP en el contralateral (hemisferio noelectrorado), que sirve como un control interno. (C y D) Aumentos más altos del área objetivo; verde, progenie de células electroporated (GFP); magenta (C), células ciclistas (PCNA); rojo (D), células mitóticas (fosfohistone 3, PH3). Tenga en cuenta que la mayor parte de la progenie de las células objetivo estaba en el SVZ en esta etapa. Capas corticales como en la Figura 1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Ejemplos de neocórtex de hurón P0 y P16 después de la electroporación del útero en E33. (A y B) Sección del neocórtex P0 ferret; verde, progenie de células electroporated (GFP); núcleos celulares azules(A); cian (B), Sox2; magenta (B), Tbr2. (B) Aumento superior del área electroporada. Barras de escala á 1 mm(A), 100 m (B). Capas corticales como en la Figura 1. (C) Sección del neocórtex del hurón P16; verde, progenie de células electroporated (GFP); gris, núcleos celulares (DAPI); astrocitos (GFAP). Barra de escala de 1 mm. Esta cifra ha sido modificada de Kalebic et al.25. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En electroporación del útero en hurón es una técnica importante, con ventajas y desventajas con respecto a otros métodos. Hay pasos críticos y limitaciones para este método, así como posibles modificaciones y aplicaciones futuras a tener en cuenta.
Desde el trabajo pionero de Víctor Borrell y sus colegas en la manipulación genética del neocórtex hurones postnatal a través de la electroporación o inyección viral35,42,43, el hurón se ha convertido en un organismo modelo genéticamente accesible. El establecimiento de la manipulación genética durante el desarrollo embrionario a través de la electroporación del útero19,,20 abrió nuevas posibilidades de investigación al permitir la focalización de las células progenitoras neuronales en etapas de desarrollo anteriores. En comparación con la manipulación postnatal, en la electroporación del útero permite la focalización de áreas más grandes del neocórtex y progenitores neuronales menos diferenciados que generan secuencialmente todos los demás tipos celulares del neocórtex. Es importante destacar que, en comparación con la orientación viral, en la electroporación del útero permite la precisión espacial de la orientación.
La parte más crítica del método es la cirugía en sí. En la electroporación del útero del hurón el neocórtex es significativamente más complejo y difícil en comparación con el procedimiento en ratones. Las paredes uterinas son más oscuras, y los embriones son más difíciles de distinguir. Además, los hurones adultos tienen mayores requisitos de cría y veterinaria. Particularmente difícil es el período alrededor del nacimiento de los cachorros. Los hurones son muy sensibles en ese período y es mejor no perturbados innecesariamente. Las principales limitaciones del enfoque en sí están relacionadas con la eficiencia de la focalización. En la electroporación del útero siempre resulta en la focalización de un mosaico de progenitores neuronales. Esto es ideal para estudiar los aspectos biológicos celulares de los progenitores neuronales o las neuronas, pero es subóptimo para causar grandes perturbaciones histológicas y anatómicas, como un cambio en el plegado neocortical. Si esto es necesario, el mejor enfoque es mover los electrodos a lo largo del eje rostrocaudal durante el procedimiento con el fin de cubrir grandes partes del neocórtex. Sin embargo, para el análisis de órganos completos el mejor enfoque es la generación de hurones transgénicos a partir de la etapa de cigoto44.
La etapa embrionaria en la que se realizó la electroporación en el útero (E33) es ideal para el estudio de los progenitores basales. De hecho, se han aplicado electroporaciones y focalización viral en esta etapa para revelar el momento de la aparición de la OSVZ22, así como varias características biológicas celulares de los progenitores basales pertinentes a su morfología y proliferación21,,25,,26. Sin embargo, dependiendo del propósito científico de un estudio, el momento de la electroporación se puede cambiar fácilmente sin modificaciones significativas en el método19,20. Aparte de la especificidad temporal, en la electroporación del útero permite modificaciones fáciles de la especificidad espacial. El neocórtex dorsolateral en la posición rostromedial a lo largo del eje rostrocaudal fue dirigido, lo que resultó en el etiquetado de las áreas motoras y somatosensoriales. Otras áreas neocorticales también se pueden apuntar ajustando la colocación de los electrodos y la dirección del campo eléctrico. En el ratón, el neocórtex medial45 y el telencefallo ventral46 han sido dirigidos utilizando la electroporación del útero, lo que sugiere que se podrían utilizar enfoques similares en hurones.
Por último, en la electroporación del útero se puede combinar fácilmente con las técnicas de edición genómica y epigenomamás recientes 13,14,16,25, donde los componentes CRISPR/(d)Cas9 pueden ser entregados como plásmido o como un complejo de proteínas Cas9 recombinantes y ARN guía14,con este último acortando el tiempo necesario para la edición del genoma. Es probable que se combinen nuevas mejoras tecnológicas en la edición del genoma con la electroporación del útero tanto en ratones como en hurones con el fin de generar mutaciones genómicas precisas importantes para entender el desarrollo normal del cerebro y, en particular, para modelar condiciones patológicas humanas. En este contexto, en la electroporación del útero se utiliza cada vez más como el método de focalización de elección para varios enfoques omicos de una sola célula posteriores e imágenes en vivo para entender las firmas moleculares y el comportamiento dinámico de las células objetivo y su progenie.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a los Servicios e Instalaciones del Instituto Max Planck de Biología Molecular y Genética por el excelente apoyo brindado, en particular todo el equipo de los Servicios Biomédicos (BMS) para la excelente cría de hurones y J. Peychl y su equipo de la Instalación de Microscopía Ligera. Estamos particularmente agradecidos a Katrin Reppe y Anna Pfeffer del BMS por el apoyo veterinario excepcional y a Lei Xing del grupo Huttner por ayudar con cirugías de hurones.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1ml syringe | BD | 309628 | Electroporation |
| 4-0 Vicryl suture | Ethicon | V392ZG | Surgery |
| Aluminium spray | cp-pharma | 98017 | Surgery |
| Amoxicilin+clavulanic acid (Synulox RTU) | WDT | 6301 | Surgery |
| Cappilary holder | WPI | MPH6S12 | Electroporation |
| Dexpanthenol Ointment solution | Bayer | 6029009.00.00 | Surgery |
| Drape sheet 45x75cm | Hartmann | 2513052 | Surgery |
| Electrode Tweezer, platinum plated 5mm | BTX | 45-0489 | Electroporation |
| Electroporator | BTX | ECM830 | Electroporation |
| Fast Green | Sigma | F7258-25G | Electroporation |
| Ferret Mustela putorius furo | Marshall | NA | Experimental organism |
| Fiber optic light source | Olympus | KL1500LCD | Electroporation |
| Forceps | Allgaier instrumente | 08-033-130 | Surgery |
| Forceps 3C-SA | Rubis Tech | 3C-SA | Surgery |
| Forceps 55 | Dumostar | 11295-51 | Surgery |
| Forceps 5-SA | Rubis Tech | 5-SA | Surgery |
| Gauze swabs large | Hartmann | 401723 | Surgery |
| Gauze swabs small | Hartmann | 401721 | Surgery |
| GFAP antibody | Dako | Z0334 | Antibody |
| GFP antibody | Aves labs | GFP1020 | Antibody |
| Glass cappilaries (Borosilicate glass with filament, OD:1.2mm, ID: 0.69mm, 10cm length) | Sutter Instrument | BF120-69-10 | Electroporation |
| Glucose | Bela-pharm | K4011-02 | Surgery |
| Heat pad | Hans Dinslage | Sanitas SHK18 | Surgery |
| Iodine (Betadine solution 100 mg/ml) | Meda | 997437 | Surgery |
| Isofluran | CP | 21311 | Surgery |
| Loading tips 20µl | Eppendorf | #5242 956.003 | Electroporation |
| Metamizol | WDT | 99012 | Surgery |
| Metzenbaum dissecting scissors | Aesculap | BC600R | Surgery |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | Model P-97 | Electroporation |
| pCAGGS-GFP | NA | NA | From Kalebic et al., eLife, 2018 |
| PCNA antibody | Millipore | CBL407 | Antibody |
| pH3 antibody | Abcam | ab10543 | Antibody |
| Scalpel | Aesculap | 294200104 | Surgery |
| Shaver | Braun | EP100 | Surgery |
| Sox2 antibody | R+D Systems | AF2018 | Antibody |
| Surgical clamp 13cm | WDT | 27080 | Surgery |
| Surgical double spoon (Williger) | WDT | 27232 | Surgery |
| Surgical drape | WDT | 28800 | Surgery |
| Surgical scissors small | FST | 14090-09 | Surgery |
| Suturing needle holder | Aesculap | BM149R | Surgery |
| Tbr2 antibody | Abcam | ab23345 | Antibody |
| Transfer pipette 3ml | Fischer scientific | 13439108 | Surgery |
| Water bath | Julabo | TW2 | Surgery |
References
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