Summary

В Vivo Ориентация нейронных клеток-предшественников в Ferret Neocortex от In Utero Electroporation

Published: May 06, 2020
doi:

Summary

Здесь представлен протокол для выполнения генетических манипуляций в эмбриональном мозге хорька с использованием в утробе матери электропорации. Этот метод позволяет таргетирование нейронных клеток прародителя в неокортексе in vivo.

Abstract

Манипуляция экспрессией генов in vivo во время эмбрионального развития является методом выбора при анализе роли отдельных генов при развитии млекопитающих. В утробе матери электропорация является ключевым методом для манипулирования экспрессией генов в эмбриональном мозге млекопитающих in vivo. Здесь представлен протокол в утробе матери электропорации эмбрионального неокортекса хорьков, маленького хищника. Хорек все чаще используется в качестве модели для развития неокортекса, потому что его неокортекс демонстрирует ряд анатомических, гистологических, клеточных и молекулярных особенностей, которые также присутствуют у человека и нечеловеческих приматов, но отсутствуют в моделях грызунов, таких как мышь или крыса. В утробе матери электропорация проводилась в эмбриональный день (Е) 33, стадии миднейрогенеза у хорька. В утробе электропорации цели нервных клеток-предшественников накладки бокового желудочка мозга. Во время нейрогенеза, эти клетки-предшественники дают начало всем другим типам нервных клеток. Эта работа показывает репрезентативные результаты и анализы на E37, послеродовой день (P) 1, и P16, соответствующие 4, 9 и 24 дней после в утробе матери электропорации, соответственно. На более ранних стадиях потомство целевых клеток состоит в основном из различных подтипов нейронных прародителя, в то время как на более поздних стадиях большинство помеченных клеток являются постмитотические нейроны. Таким образом, в утробе матери электропорация позволяет изучать влияние генетических манипуляций на клеточные и молекулярные особенности различных типов нервных клеток. Благодаря своему влиянию на различные популяции клеток, в утробе матери электропорации также могут быть использованы для манипуляции гистологических и анатомических особенностей неокортекса хорька. Важно отметить, что все эти эффекты являются острыми и выполняются с spatiotemporal специфики определяется пользователем.

Introduction

Неокортекс является внешним листом головного мозга млекопитающих и местом высшихкогнитивных функций 1,,2,,3,,4,,5. Для достижения острой генетической манипуляции в млекопитающих neocortex in vivo во время эмбрионального развития, были изучены два различных метода: вируснаяинфекция 6 и в утробе матери электропорации7. Оба метода позволяют эффективной ориентации неокортикальные клетки, но страдают от некоторых ограничений. Основным преимуществом в электропорации матки по сравнению с вирусной инфекцией является способность достичь пространственной специфичности в неокортексе, которая достигается путем регулирования направления электрического поля.

Так как электропорация была впервые показана для облегчения вступленияДНК в клеткиin vitro 8 , она была применена для доставки ДНК в различных позвоночных in vivo. В развитии неврологии, в утробе матери электропорации мыши неокортекс был впервые зарегистрирован в 2001году 9,10. Этот метод состоит из инъекции смеси ДНК в боковой желудочек эмбрионального мозга и последующего применения электрического поля с использованием пинцетовых электродов, что позволяетпространственную точность 7,,11. В утробе электропорации с тех пор были применены для доставки нуклеиновых кислот для того, чтобы манипулировать экспрессией эндогенных или эктопически добавленных генов в неокортексе мыши. Важный прогресс был достигнут в последнее время, применяя методологию CRISPR/Cas9-опосредованного редактирования генома через в утробе матери электропорации в неокортексе мыши для выполнения (1) генного нарушенияв постмитотических нейронах 12,,13 и нейронныхклетках-предшественниках 14, и (2)геном 15 и эпигеноме16 редактирования.

Очень скоро после первого сообщения в мыши, в утробе электропорации был применен к эмбриональной крысы neocortex17,18. Не-грызунов остается проблемой до первого в утробе матери электропорации хорьков, небольшой хищник, было сообщено в 2012году 19,20. С тех пор в утробе матери электропорация хорьков была применена для изучения механизмов развития неокортекса путем маркировки нейронных прародителейи нейронов 20,,21,,22,23, манипулируя экспрессией эндогенных генов, в том числе с использованием технологии CRISPR/Cas924, и путем доставки эктопических генов21,,22,,25,в том числечеловеческих генов 26. Кроме того, в утробе матери электропорация хорьков была использована для решения особенностей развития неокортекса человека впатологических условиях 27,28.

В контексте развития неокортекса преимущества использования хорьков в качестве образцового организма по сравнению с мышами обусловлены тем, что хорьки лучше резюмируют ряд человеческих особенностей. На анатомическом уровне хорьки демонстрируют характерный узор коркового складывания, который также присутствует у человека и большинства других приматов, но полностью отсутствует умышей или крыс 4,,29,,30,,31. На гистологическом уровне хорьки имеют две различные субвентрикулярные гермезинальные зоны, называемые внутренними и внешними субвентрикулярными зонами (ISV и OSV, соответственно)32,33, разделенные слоемвнутреннего волокна 23. Эти функции также совместно с приматами, в том числе людей, но не смышами 34. ISV и OSV у хорьков и людей населены обильными нейронными клетками-предшественниками, в то время как субвентрикулярная зона (СВЗ) мышей содержит только редкие нейронные прародители21,32,35,36. На клеточном уровне хорьки обладают высокой долей подтипа нейронных прародителей, называемых базальной или внешней радиальной глией (bRG или oRG, соответственно), которые считаются инструментальными для эволюционного расширения неокортексамлекопитающих 34,37,38. bRG, следовательно, весьма обильные в плода человека и эмбрионального неокортекса хорька, но они очень редки в эмбриональной мыши neocortex35,36. Кроме того, хорек bRG показывает морфологическую неоднородность, похожую на человеческую bRG, намного превосходя мышь bRG21. Наконец, на молекулярном уровне, развивающихся хорька неокортекс показывает модели экспрессии генов очень похожи на плода человека неокортекса, которые, как предполагается, контролировать развитие корковых складывания, средипрочего 39.

Клеточные биологические и молекулярные характеристики хорька bRG делают их высокоо распространения, похожие на человека bRG. Это приводит к увеличению производства нейронов и развитию расширенного и очень сложного неокортекса34. Эти характеристики делают хорьков отличными модельными организмами для изучения человеческих особенностей развития неокортекса, которые не могут быть смоделированыу мышей 26,,40. Чтобы в полной мере использовать хорька в качестве образцового организма, был разработан представленный метод. Он состоит из в утробе матери электропорации эмбрионов хорька E33 с плазмидной экспрессии GFP (pGFP) под контролем вездесущего промоутера, CAG. Электропомерные эмбрионы могут быть проанализированы эмбрионально или постнатально. Для того, чтобы уменьшить количество принесенных в жертву животных, самки хорьков (джиллс) стерилизованы гистерэктомией и пожертвованы для усыновления в качестве домашних животных. Если целевые эмбрионы собирают на эмбриональных стадиях, проводится вторая операция и эмбрионы удаляются кесаревой сечением, в то время как джиллы гистерэктомизируются. Если целевые эмбрионы анализируются на послеродовой стадии, джиллс гистерэктомизированы после того, как щенки были отутены или принесены в жертву. Таким образом, протокол для гистерэктомии jills также представлен.

Protocol

Все экспериментальные процедуры были проведены в соответствии с немецким законодательством о защите животных после одобрения Landesdirektion Sachsen (лицензии TVV 2/2015 и TVV 21/2017). 1. Подготовка к электропорации матки Подготовь смесь ДНК. В этом протоколе используется окончательн…

Representative Results

В утробе электропорации хорьков на E33 привело к ориентации нейронных клеток-предшественников, выстилающих желудочковой поверхности эмбрионального неокортекса(рисунок 1). Эти клетки называются апическими прародителями и являются высокоо распространения, что порождае?…

Discussion

В утробе матери электропорация хорька является важным методом, с преимуществами и недостатками по отношению к другим методам. Есть критические шаги и ограничения для этого метода, а также потенциальные изменения и будущие приложения, чтобы иметь в виду.

С новаторской ра?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарны Службам и Средствам Института молекулярной клеточной биологии и генетики Макса Планка за выдающуюся поддержку, оказанную, в частности, всей команде биомедицинских услуг (BMS) за превосходное место хорьков и J. Peychl и его команда Фонда световой микроскопии. Мы особенно признательны Катрин Реппе и Анне Пфеффер из BMS за исключительную ветеринарную поддержку и Лэй Син из группы Хаттнера за помощь в операциях хорька.

Materials

1ml syringe BD 309628 Electroporation
4-0 Vicryl suture Ethicon V392ZG Surgery
Aluminium spray cp-pharma 98017 Surgery
Amoxicilin+clavulanic acid (Synulox RTU) WDT 6301 Surgery
Cappilary holder WPI MPH6S12 Electroporation
Dexpanthenol Ointment solution Bayer 6029009.00.00 Surgery
Drape sheet 45x75cm Hartmann 2513052 Surgery
Electrode Tweezer, platinum plated 5mm BTX 45-0489 Electroporation
Electroporator BTX ECM830 Electroporation
Fast Green Sigma F7258-25G Electroporation
Ferret Mustela putorius furo Marshall NA Experimental organism
Fiber optic light source Olympus KL1500LCD Electroporation
Forceps Allgaier instrumente 08-033-130 Surgery
Forceps 3C-SA Rubis Tech 3C-SA Surgery
Forceps 55 Dumostar 11295-51 Surgery
Forceps 5-SA Rubis Tech 5-SA Surgery
Gauze swabs large Hartmann 401723 Surgery
Gauze swabs small Hartmann 401721 Surgery
GFAP antibody Dako Z0334 Antibody
GFP antibody Aves labs GFP1020 Antibody
Glass cappilaries (Borosilicate glass with filament, OD:1.2mm, ID: 0.69mm, 10cm length) Sutter Instrument BF120-69-10 Electroporation
Glucose Bela-pharm K4011-02 Surgery
Heat pad Hans Dinslage Sanitas SHK18 Surgery
Iodine (Betadine solution 100 mg/ml) Meda 997437 Surgery
Isofluran CP 21311 Surgery
Loading tips 20µl Eppendorf #5242 956.003 Electroporation
Metamizol WDT 99012 Surgery
Metzenbaum dissecting scissors Aesculap BC600R Surgery
Micropipette puller Sutter Instrument Model P-97 Electroporation
pCAGGS-GFP NA NA From Kalebic et al., eLife, 2018
PCNA antibody Millipore CBL407 Antibody
pH3 antibody Abcam ab10543 Antibody
Scalpel Aesculap 294200104 Surgery
Shaver Braun EP100 Surgery
Sox2 antibody R+D Systems AF2018 Antibody
Surgical clamp 13cm WDT 27080 Surgery
Surgical double spoon (Williger) WDT 27232 Surgery
Surgical drape WDT 28800 Surgery
Surgical scissors small FST 14090-09 Surgery
Suturing needle holder Aesculap BM149R Surgery
Tbr2 antibody Abcam ab23345 Antibody
Transfer pipette 3ml Fischer scientific 13439108 Surgery
Water bath Julabo TW2 Surgery

References

  1. Kalebic, N., Long, K., Huttner, W. B., Kaas, J. . Evolution of Nervous Systems 2e. 3, 73-89 (2017).
  2. Rakic, P. Evolution of the neocortex: a perspective from developmental biology. Nature Reviews Neurosciences. 10 (10), 724-735 (2009).
  3. Dehay, C., Kennedy, H., Kosik, K. S. The outer subventricular zone and primate-specific cortical complexification. Neuron. 85 (4), 683-694 (2015).
  4. Fernandez, V., Llinares-Benadero, C., Borrell, V. Cerebral cortex expansion and folding: what have we learned. EMBO Journal. 35 (10), 1021-1044 (2016).
  5. Molnar, Z., et al. New insights into the development of the human cerebral cortex. Journal of Anatomy. 235 (3), 432-451 (2019).
  6. Janson, C. G., McPhee, S. W., Leone, P., Freese, A., During, M. J. Viral-based gene transfer to the mammalian CNS for functional genomic studies. Trends in Neurosciences. 24 (12), 706-712 (2001).
  7. Tabata, H., Nakajima, K. Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation. Development Growth & Differentiation. 50 (6), 507-511 (2008).
  8. Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO Journal. 1 (7), 841-845 (1982).
  9. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240 (1), 237-246 (2001).
  10. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
  11. Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. Journal of Visualized Experiments. (6), e239 (2007).
  12. Straub, C., Granger, A. J., Saulnier, J. L., Sabatini, B. L. CRISPR/Cas9-mediated gene knock-down in post-mitotic neurons. PLoS One. 9 (8), 105584 (2014).
  13. Shinmyo, Y., et al. CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in the mouse brain using in utero electroporation. Science Reports. 6, 20611 (2016).
  14. Kalebic, N., et al. CRISPR/Cas9-induced disruption of gene expression in mouse embryonic brain and single neural stem cells in vivo. EMBO Reports. 17 (3), 338-348 (2016).
  15. Mikuni, T., Nishiyama, J., Sun, Y., Kamasawa, N., Yasuda, R. High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by In Vivo Genome Editing. Cell. 165 (7), 1803-1817 (2016).
  16. Albert, M., et al. Epigenome profiling and editing of neocortical progenitor cells during development. EMBO Journal. 36 (17), 2642-2658 (2017).
  17. Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos. Differentiation. 70 (4-5), 155-162 (2002).
  18. Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E16 rat embryos. Journal of Visualized Experiments. (6), e236 (2007).
  19. Kawasaki, H., Iwai, L., Tanno, K. Rapid and efficient genetic manipulation of gyrencephalic carnivores using in utero electroporation. Molecular Brain. 5, 24 (2012).
  20. Kawasaki, H., Toda, T., Tanno, K. In vivo genetic manipulation of cortical progenitors in gyrencephalic carnivores using in utero electroporation. Biology Open. 2 (1), 95-100 (2013).
  21. Kalebic, N., et al. Neocortical expansion due to increased proliferation of basal progenitors is linked to changes in their morphology. Cell Stem Cell. 24 (4), 535-550 (2019).
  22. Martinez-Martinez, M. A., et al. A restricted period for formation of outer subventricular zone defined by Cdh1 and Trnp1 levels. Nature Communication. 7, 11812 (2016).
  23. Saito, K., et al. Characterization of the Inner and Outer Fiber Layers in the Developing Cerebral Cortex of Gyrencephalic Ferrets. Cerebral Cortex. 29 (10), 4303-4311 (2019).
  24. Shinmyo, Y., et al. Folding of the Cerebral Cortex Requires Cdk5 in Upper-Layer Neurons in Gyrencephalic Mammals. Cell Reports. 20 (9), 2131-2143 (2017).
  25. Matsumoto, N., Shinmyo, Y., Ichikawa, Y., Kawasaki, H. Gyrification of the cerebral cortex requires FGF signaling in the mammalian brain. Elife. 6, 29285 (2017).
  26. Kalebic, N., et al. Human-specific ARHGAP11B induces hallmarks of neocortical expansion in developing ferret neocortex. Elife. 7, 41241 (2018).
  27. Masuda, K., et al. Pathophysiological analyses of cortical malformation using gyrencephalic mammals. Science Reports. 5, 15370 (2015).
  28. Matsumoto, N., et al. Pathophysiological analyses of periventricular nodular heterotopia using gyrencephalic mammals. Human Molecular Genetics. 26 (6), 1173-1181 (2017).
  29. Barnette, A. R., et al. Characterization of brain development in the ferret via MRI. Pediatric Research. 66 (1), 80-84 (2009).
  30. Smart, I. H., McSherry, G. M. Gyrus formation in the cerebral cortex in the ferret. I. Description of the external changes. Journal of Anatomy. 146, 141-152 (1986).
  31. Sawada, K., Watanabe, M. Development of cerebral sulci and gyri in ferrets (Mustela putorius). Congenital Anomalies (Kyoto). 52 (3), 168-175 (2012).
  32. Reillo, I., Borrell, V. Germinal zones in the developing cerebral cortex of ferret: ontogeny, cell cycle kinetics, and diversity of progenitors. Cerebral Cortex. 22 (9), 2039-2054 (2012).
  33. Smart, I. H., McSherry, G. M. Gyrus formation in the cerebral cortex of the ferret. II. Description of the internal histological changes. Journal of Anatomy. 147, 27-43 (1986).
  34. Borrell, V., Reillo, I. Emerging roles of neural stem cells in cerebral cortex development and evolution. Developmental Neurobiology. 72 (7), 955-971 (2012).
  35. Reillo, I., de Juan Romero, C., Garcia-Cabezas, M. A., Borrell, V. A role for intermediate radial glia in the tangential expansion of the mammalian cerebral cortex. Cerebral Cortex. 21 (7), 1674-1694 (2011).
  36. Fietz, S. A., et al. OSVZ progenitors of human and ferret neocortex are epithelial-like and expand by integrin signaling. Nature Neurosciences. 13 (6), 690-699 (2010).
  37. Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Development and evolution of the human neocortex. Cell. 146 (1), 18-36 (2011).
  38. Fietz, S. A., Huttner, W. B. Cortical progenitor expansion, self-renewal and neurogenesis-a polarized perspective. Current Opinion in Neurobiology. 21 (1), 23-35 (2011).
  39. De Juan Romero, C., Bruder, C., Tomasello, U., Sanz-Anquela, J. M., Borrell, V. Discrete domains of gene expression in germinal layers distinguish the development of gyrencephaly. EMBO Journal. 34 (14), 1859-1874 (2015).
  40. Kawasaki, H. Molecular investigations of the brain of higher mammals using gyrencephalic carnivore ferrets. Neurosciences Research. 86, 59-65 (2014).
  41. Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. Journal of Visualized Experiments. (54), e3024 (2011).
  42. Borrell, V. In vivo gene delivery to the postnatal ferret cerebral cortex by DNA electroporation. Journal of Neuroscience Methods. 186 (2), 186-195 (2010).
  43. Borrell, V., Kaspar, B. K., Gage, F. H., Callaway, E. M. In vivo evidence for radial migration of neurons by long-distance somal translocation in the developing ferret visual cortex. Cerebral Cortex. 16 (11), 1571-1583 (2006).
  44. Johnson, M. B., et al. Aspm knockout ferret reveals an evolutionary mechanism governing cerebral cortical size. Nature. 556 (7701), 370-375 (2018).
  45. Vaid, S., et al. A novel population of Hopx-dependent basal radial glial cells in the developing mouse neocortex. Development. 145 (20), 169276 (2018).
  46. Pilz, G. A., et al. Amplification of progenitors in the mammalian telencephalon includes a new radial glial cell type. Nature Communications. 4, 2125 (2013).

Play Video

Cite This Article
Kalebic, N., Langen, B., Helppi, J., Kawasaki, H., Huttner, W. B. In Vivo Targeting of Neural Progenitor Cells in Ferret Neocortex by In Utero Electroporation. J. Vis. Exp. (159), e61171, doi:10.3791/61171 (2020).

View Video