Summary

In Vivo Targeting von neuronalen Vorläuferzellen in Ferret Neocortex durch Utero Elektroporation

Published: May 06, 2020
doi:

Summary

Hier wird ein Protokoll zur genetischen Manipulation im embryonalen Frettchenhirn unter Verwendung der Utero-Elektroporation vorgestellt. Diese Methode ermöglicht die Ausrichtung von neuronalen Vorläuferzellen im Neocortex in vivo.

Abstract

Die Manipulation der Genexpression in vivo während der embryonalen Entwicklung ist die Methode der Wahl bei der Analyse der Rolle einzelner Gene während der Entwicklung von Säugetieren. In der Gebärmutterelektroporation ist eine Schlüsseltechnik für die Manipulation der Genexpression im embryonalen Säugetiergehirn in vivo. Ein Protokoll zur In-Utero-Elektroporation des embryonalen Neocortex von Frettchen, einem kleinen Fleischfresser, wird hier vorgestellt. Das Frettchen wird zunehmend als Modell für die Neocortex-Entwicklung verwendet, weil sein Neocortex eine Reihe anatomischer, histologischer, zellulärer und molekularer Merkmale aufweist, die auch bei menschlichen und nichtmenschlichen Primaten vorhanden sind, aber in Nagetiermodellen wie Maus oder Ratte fehlen. Bei der Utero-Elektroporation wurde am embryonalen Tag (E) 33, einem Midneurogenese-Stadium bei Frettchen, durchgeführt. In der Gebärmutter-Elektroporation zielt auf neuronale Vorläuferzellen, die die lateralen Ventrikel des Gehirns auskleiden. Während der Neurogenese, Diese Vorläuferzellen geben alle anderen neuronalen Zelltypen. Diese Arbeit zeigt repräsentative Ergebnisse und Analysen bei E37, Postnataltag (P) 1 und P16, entsprechend 4, 9 und 24 Tagen nach der Utero-Elektroporation. In früheren Stadien besteht die Nachkommenschaft der Zielzellen hauptsächlich aus verschiedenen neuronalen Vorläufersubtypen, während in späteren Stadien die meisten markierten Zellen postmitotische Neuronen sind. So ermöglicht die in der Utero-Elektroporation die Untersuchung der Wirkung genetischer Manipulation auf die zellulären und molekularen Merkmale verschiedener Arten von Nervenzellen. Durch seine Wirkung auf verschiedene Zellpopulationen, in der Utero Elektroporation kann auch für die Manipulation von histologischen und anatomischen Merkmalen des Frettchen neocortex verwendet werden. Wichtig ist, dass alle diese Effekte akut sind und mit einer vom Benutzer bestimmten spatiotemporalen Spezifität durchgeführt werden.

Introduction

Der Neocortex ist das äußere Blatt des Säugetier-Großhirns und der Sitz der höheren kognitiven Funktionen1,2,3,4,5. Um eine akute genetische Manipulation des Säugetierneocortex in vivo während der embryonalen Entwicklung zu erreichen, wurden zwei verschiedene Methoden untersucht: Virusinfektion6 und utero Elektroporation7. Beide Methoden ermöglichen eine effiziente Ausrichtung auf neokortikale Zellen, leiden aber unter einigen Einschränkungen. Der hauptvorteil der Utero-Elektroporation im Vergleich zur Virusinfektion ist die Fähigkeit, räumliche Spezifität innerhalb des Neocortex zu erreichen, die durch die Regulierung der Richtung des elektrischen Feldes erreicht wird.

Da die Elektroporation erstmals gezeigt wurde, um den Eintrag von DNA in die Zellen in vitro8zu erleichtern, wurde sie angewendet, um DNA in verschiedenen Wirbeltieren in vivo zu liefern. In der Entwicklungsneurowissenschaft wurde in der Utero-Elektroporation der Maus Neocortex erstmals 2001 berichtet9,10. Dieses Verfahren besteht aus einer Injektion des DNA-Gemischs in den seitlichen Ventrikel des embryonalen Gehirns und der anschließenden Anwendung des elektrischen Feldes mit Pinzettenelektroden, die räumliche Präzision7,11ermöglicht. In der Gebärmutter wurde seitdem die Elektroporation angewendet, um Nukleinsäuren zu liefern, um die Expression endogener oder ektopisch zugesetzter Gene im Mausneocortex zu manipulieren. Wichtige Fortschritte wurden in letzter Zeit durch die Anwendung der Methodik der CRISPR/Cas9-vermittelten Genombearbeitung über die Utero-Elektroporation im Maus-Neocortex erzielt, um (1) Genstörungen in postmitotischen Neuronen12,,13 und neuronalen Vorläuferzellen14und (2) Genom15 und Epigenom16-Bearbeitung durchzuführen.

Sehr bald nach dem ersten Bericht in der Maus wurde in der Utero-Elektroporation auf die embryonale Ratte Neocortex17,18angewendet. Nicht-Nagetiere blieben eine Herausforderung, bis die erste in der Utero Elektroporation von Frettchen, ein kleiner Fleischfresser, wurde im Jahr 2012 gemeldet19,20. Seitdem wurde in der Utero-Elektroporation von Frettchen die Mechanismen der Neocortex-Entwicklung untersucht, indem neuronale Vorläufer und Neuronen20,21,22,22,manipuliert die Expression endogener Gene, einschließlich der Verwendung der CRISPR/Cas9-Technologie24, und durch die Bereitstellung von ektopischen Genen21,22,25, einschließlich humanspezifischer Gene26. Darüber hinaus wurde bei der Utero-Elektroporation von Frettchen verwendet, um Merkmale der menschlichen Neocortex-Entwicklung unter pathologischen Bedingungen zu adressieren27,28.

Im Kontext der Neocortex-Entwicklung sind die Vorteile der Verwendung von Frettchen als Modellorganismus im Vergleich zu Mäusen darauf zurückzuführen, dass Frettchen eine Reihe von menschenähnlichen Merkmalen besser rekapitulieren. Auf anatomischer Ebene weisen Frettchen ein charakteristisches Muster der kortikalen Faltung auf, das auch bei menschenverachtenden und den meisten anderen Primaten vorhanden ist, bei Mäusen oder Rattenjedochvöllig abwesend ist 4,29,30,31. Auf histologischer Ebene weisen Frettchen zwei unterschiedliche subventrikuläre Keimzonen auf, die als innere und äußere subventrikuläre Zonen (ISVZ bzw. OSVZ)32,33bezeichnet werden, die durch die innere Faserschicht23getrennt sind. Diese Eigenschaften werden auch mit Primaten geteilt, einschließlich Menschen, aber nicht mit Mäusen34. Die ISVZ und OSVZ bei Frettchen und Menschen sind mit reichlich neuronalen Vorläuferzellen bevölkert, während die subventrikuläre Zone (SVZ) von Mäusen nur spärliche neuronale Vorläufer21,32,35,36enthält. Auf zellulärer Ebene weisen Frettchen einen hohen Anteil eines Subtyps von neuronalen Vorläufern auf, die als basaler oder äußerer radialer Glia (bRG bzw. oRG) bezeichnet werden und als entscheidend für die evolutionäre Ausdehnung des Säugetierneocortex34,37,38angesehen werden. bRG sind daher sehr reichlich in der fetalen menschlichen und embryonalen Frettchen Neocortex, aber sie sind sehr selten in der embryonalen Maus Neocortex35,36. Darüber hinaus zeigt Frettchen bRG eine morphologische Heterogenität ähnlich der menschlichen bRG, weit überlegen gegenüber Maus bRG21. Schließlich zeigt die Entwicklung von Frettchen-Neocortex auf molekularer Ebene Genexpressionsmuster, die denen des fetalen menschlichen Neocortex sehr ähnlich sind, von denen angenommen wird, dass sie die Entwicklung der kortikalen Faltung steuern, unter anderem39.

Die zellbiologischen und molekularen Eigenschaften von Frettchen bRG machen sie hoch proliferativ, ähnlich wie menschliche bRG. Dies führt zu einer erhöhten Produktion von Neuronen und der Entwicklung eines erweiterten und hochkomplexen Neocortex34. Diese Eigenschaften machen Frettchen ausgezeichnete Modellorganismen für die Untersuchung von menschenähnlichen Merkmalen der Neocortex-Entwicklung, die nicht in Mäusen modelliert werden können26,40. Um das Frettchen als Modellorganismus voll auszunutzen, wurde die vorgestellte Methode entwickelt. Es besteht aus der Utero-Elektroporation von E33-Ferret-Embryonen mit einem Plasmid, das GFP (pGFP) unter der Kontrolle eines allgegenwärtigen Promotors, CAG, exzessiv ausdrückt. Die elektroporated Embryonen können dann embryonal oder postnatal analysiert werden. Um die Anzahl der geopferten Tiere zu reduzieren, werden weibliche Frettchen (Jills) durch Hysterektomie sterilisiert und zur Adoption als Haustiere gespendet. Wenn die gezielten Embryonen in embryonalen Stadien geerntet werden, wird eine zweite Operation durchgeführt und die Embryonen werden durch einen Kaiserschnitt entfernt, während die Jills hysterektomisiert sind. Wenn die gezielten Embryonen in postnatalen Stadien analysiert werden, werden die Jills hysterektomisiert, nachdem die Welpen entwöhnt oder geopfert wurden. Daher wird auch ein Protokoll für die Hysterektomie von Jills vorgestellt.

Protocol

Alle Versuchsverfahren wurden nach Genehmigung durch die Landesdirektion Sachsen (Lizenzen TVV 2/2015 und TVV 21/2017) in Absprache mit dem Tierschutzgesetz durchgeführt. 1. Vorbereitung für die in utero Elektroporation Bereiten Sie die DNA-Mischung vor. In diesem Protokoll wird eine Endkonzentration von 1 g/l pGFP verwendet. Lösen Sie DNA in PBS und ergänzen Sie mit 0,1% Fast Green, um die Visualisierung zu erleichtern. Nach der Vorbereitung die DNA-Mischung mischen, indem Sie m…

Representative Results

Bei der Utero-Elektroporation von Frettchen bei E33 wurde die neurale Vorläuferzelle gezielt, die die ventrikuläre Oberfläche des embryonalen Neocortex auskleide (Abbildung 1). Diese Zellen werden apikale Vorläufer genannt und sind sehr proliferativ, was zu allen anderen Zelltypen während der Entwicklung führt. Nach asymmetrischer Teilung erzeugten apikale Vorläufer einen weiteren apikalen Vorläufer und eine differenziertere Zelle, typischerweise einen Basalvorläufer (BP), der von d…

Discussion

In der Utero-Elektroporation in Frettchen ist eine wichtige Technik, mit Vor- und Nachteilen gegenüber anderen Methoden. Es gibt wichtige Schritte und Einschränkungen für diese Methode, sowie mögliche Änderungen und zukünftige Anwendungen zu beachten.

Seit der Pionierarbeit von Victor Borrell und Kollegen zur genetischen Manipulation des postnatalen Frettchenneocortex mittels Elektroporation oder Virusinjektion35,42,<s…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken den Dienstleistungen und Einrichtungen des Max-Planck-Instituts für Molekulare Zellbiologie und Genetik für die hervorragende Unterstützung, insbesondere dem gesamten Team des Biomedizinischen Dienstes (BMS) für die hervorragende Frettchenhaltung und J. Peychl und seinem Team der Lichtmikroskopieanlage. Besonders dankbar sind wir Katrin Reppe und Anna Pfeffer vom BMS für die außergewöhnliche tierärztliche Unterstützung und Lei Xing von der Huttner-Gruppe für die Unterstützung bei Frettchenoperationen.

Materials

1ml syringe BD 309628 Electroporation
4-0 Vicryl suture Ethicon V392ZG Surgery
Aluminium spray cp-pharma 98017 Surgery
Amoxicilin+clavulanic acid (Synulox RTU) WDT 6301 Surgery
Cappilary holder WPI MPH6S12 Electroporation
Dexpanthenol Ointment solution Bayer 6029009.00.00 Surgery
Drape sheet 45x75cm Hartmann 2513052 Surgery
Electrode Tweezer, platinum plated 5mm BTX 45-0489 Electroporation
Electroporator BTX ECM830 Electroporation
Fast Green Sigma F7258-25G Electroporation
Ferret Mustela putorius furo Marshall NA Experimental organism
Fiber optic light source Olympus KL1500LCD Electroporation
Forceps Allgaier instrumente 08-033-130 Surgery
Forceps 3C-SA Rubis Tech 3C-SA Surgery
Forceps 55 Dumostar 11295-51 Surgery
Forceps 5-SA Rubis Tech 5-SA Surgery
Gauze swabs large Hartmann 401723 Surgery
Gauze swabs small Hartmann 401721 Surgery
GFAP antibody Dako Z0334 Antibody
GFP antibody Aves labs GFP1020 Antibody
Glass cappilaries (Borosilicate glass with filament, OD:1.2mm, ID: 0.69mm, 10cm length) Sutter Instrument BF120-69-10 Electroporation
Glucose Bela-pharm K4011-02 Surgery
Heat pad Hans Dinslage Sanitas SHK18 Surgery
Iodine (Betadine solution 100 mg/ml) Meda 997437 Surgery
Isofluran CP 21311 Surgery
Loading tips 20µl Eppendorf #5242 956.003 Electroporation
Metamizol WDT 99012 Surgery
Metzenbaum dissecting scissors Aesculap BC600R Surgery
Micropipette puller Sutter Instrument Model P-97 Electroporation
pCAGGS-GFP NA NA From Kalebic et al., eLife, 2018
PCNA antibody Millipore CBL407 Antibody
pH3 antibody Abcam ab10543 Antibody
Scalpel Aesculap 294200104 Surgery
Shaver Braun EP100 Surgery
Sox2 antibody R+D Systems AF2018 Antibody
Surgical clamp 13cm WDT 27080 Surgery
Surgical double spoon (Williger) WDT 27232 Surgery
Surgical drape WDT 28800 Surgery
Surgical scissors small FST 14090-09 Surgery
Suturing needle holder Aesculap BM149R Surgery
Tbr2 antibody Abcam ab23345 Antibody
Transfer pipette 3ml Fischer scientific 13439108 Surgery
Water bath Julabo TW2 Surgery

References

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Kalebic, N., Langen, B., Helppi, J., Kawasaki, H., Huttner, W. B. In Vivo Targeting of Neural Progenitor Cells in Ferret Neocortex by In Utero Electroporation. J. Vis. Exp. (159), e61171, doi:10.3791/61171 (2020).

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