Summary
Este documento informa que la adición de Y-27632 al medio TIVA puede aumentar significativamente el rendimiento de los melanocitos de los tejidos cutáneos adultos.
Abstract
El aislamiento y cultivo de melanocitos primarios de los tejidos de la piel es muy importante para la investigación biológica y ha sido ampliamente utilizado para aplicaciones clínicas. Aislar los melanocitos primarios de los tejidos de la piel por el método convencional generalmente toma alrededor de 3 a 4 semanas para pasar lo suficiente. Más importante aún, los tejidos utilizados son generalmente prepucios recién nacidos y sigue siendo un desafío aislar eficientemente los melanocitos primarios de los tejidos adultos. Recientemente desarrollamos un nuevo método de aislamiento para melanocitos que añade Y-27632, un inhibidor de la quinasa Rho, al medio de cultivo inicial durante 48 h. En comparación con el protocolo convencional, este nuevo método aumenta dramáticamente el rendimiento de los melanocitos y acorta el tiempo necesario para aislar los melanocitos de los tejidos de prepucio. Ahora describimos este nuevo método con más detalle utilizando la epidermis adulta para cultivar eficientemente melanocitos primarios. Es importante destacar que los melanocitos obtenidos a partir de tejidos adultos preparados por este nuevo método pueden funcionar normalmente. Este nuevo protocolo beneficiará significativamente los estudios de defectos de pigmentación y melanomas utilizando melanocitos primarios preparados a partir de tejidos de piel adultos de fácil acceso.
Introduction
El objetivo de este estudio fue desarrollar un protocolo simple y eficaz para aislar los melanocitos de la epidermis de la piel adulta para la investigación biológica y aplicaciones clínicas. Los melanocitos, que se encuentran en la epidermis basal de la piel y en los folículos pilosos, desempeñan un papel importante en la pigmentación de la piel y el cabello produciendo melanina1. La pigmentación cutánea resultante de los melanocitos epidérmicos actúa como un filtro de radiación ultravioleta que reduce/previene el daño del ADN a las células subyacentes en la piel2. La proliferación anormal de melanocitos en la piel es bastante común, como en la formación de nevi benignos (moles) en los que los melanocitos potencialmente se transforman en crecimiento oncogénico seguido de la senescencia celular3.
Desde 1957, el aislamiento y posterior cultura de los melanocitos primarios humanos ha sido posible4, pero sólo desde 1982 ha habido un método eficiente que puede establecer reproduciblemente culturas de melanocitos humanos de la epidermis5. El método convencional para aislar los melanocitos primarios de la epidermis implica una digestión enzimática de dos pasos. Brevemente, la piel se digiere inicialmente con dispase para separar la epidermis de la dermis, después de lo cual la epidermis se digiere con tripina para producir suspensiones que contienen melanocitos y queratinocitos, que luego pueden ser cultivados selectivamente en diferentes medios. Actualmente, el cultivo inicial suele tardar entre 3 y 4 semanas en llegar a la confluencia utilizando el método convencional, que es probable que se deba a la baja eficiencia de su aislamiento. Por lo tanto, aumentar la producción inicial de melanocitos a partir de tejidos cutáneos adultos sería muy útil tanto para la investigación de laboratorio como para aplicaciones clínicas.
Muchos factores de crecimiento, la mayoría de los cuales han demostrado ser secretados por queratinocitos (p. ej., -MSH, ACTH, bFGF, NGF, ET-1, GM-CSF, HGF, LIF y SCF)5-8, regulan la diferenciación y proliferación de melanocitos de mamíferos. En ausencia de capas alimentadoras, la falta de esos factores de crecimiento conduce a la disminución de la proliferación de melanocitos y su aumento de la apoptosis9. El co-cultivo de queratinocitos como células alimentadas y melanocitos podría conducir a la proliferación acelerada de melanocitos y a reducir la apoptosis. Sin embargo, el método de co-cultivo no sólo exige más tejidos de la piel para preparar queratinocitos, lo que no es práctico, sino que también no podría funcionar eficientemente porque las condiciones de cultivo requeridas por los melanocitos no favorecen el crecimiento de queratinocitos, y viceversa.
Estudios previos han informado de que la adición de Y-27632, un inhibidor de ROCK, en el medio de crecimiento puede mejorar el rendimiento de las células epidérmicas primarias humanas de los tejidos de la piel10-14. Por lo tanto, sería interesante probar si el aislamiento de los melanocitos primarios humanos se beneficiaría de la presencia de Y-27632. De hecho, la adición de Y-27632 en el medio TIVA de inoculación15, que contiene TPA, IBMX, Na3VO4 y dbcAMP, aumentó significativamente el rendimiento de los melanocitos primarios aislados de los tejidos de prepucio en los cultivos iniciales16. En comparación con el protocolo convencional, este nuevo protocolo es significativamente más eficiente en el aumento del rendimiento de los melanocitos16. Por lo tanto, este protocolo describe el nuevo método en detalle utilizando tejidos cutáneos adultos basados en un estudio anterior16 con el fin de promover su aplicación en la investigación biológica básica y aplicada.
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Protocol
El uso de tejidos adultos de antepuesto en este protocolo ha sido aprobado por el Comité de ética de la investigación humana (No.2015120401, fecha: 12 de mayo de 2015).
NOTA: Realice todos los procedimientos siguientes en un entorno estéril para evitar contaminaciones de células y cultivos.
1. Preparativos
- Reunir los tejidos adultos frescos del prepucio de las cirugías de circuncisión en tubos de 15 ml que contengan 10 ml de solución salina tampón de fosfato (PBS) y almacenar en 4 oC.
NOTA: Separe los tejidos como se detalla a continuación dentro de las 24 horas después de su escisión. - Preparar reactivos y medios de cultivo.
- Preparar 3% P/S (penicilina/estreptomicina) como solución de lavado. Mezclar 50 ml de PBS con 1,5 ml de penicilina (100 U/ml) y estreptomicina (100 mg/L) (P/S).
- Preparar la solución de terminación (solución de neutralización) para la neutralización de la digestión enzimática. Suplemento 1% P/S, 10% suero bovino fetal (FBS) en medio DMEM.
- Preparar TIVA melanocitos medios a la cultura: F12 de Jamón; 10% FBS; 1x P-S-glutamina; 50 ng/mL 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (TPA); 1 x 10-4 M 3-isobutilo-1-metil xantina (IBMX); 1 m Na3VO4; 1 x 10-3 M N-6,2o-O-dibutyriladenosina-3o,5o-monofosfato cíclico (dbcAMP).
2. El método convencional
- Pretratamiento de tejido cutáneo
- Enjuagar cada tejido de prepucio adulto una vez con 10 ml de etanol al 75% (alcohol) durante 30 s, y luego enjuagar dos veces con 10 ml de solución de lavado (3% P/S), durante 5 minutos cada uno.
NOTA: Lave los tejidos del prepucio con 10 ml de PBS al principio si hay mucha sangre. Todos los lavados se preparan en platos de cultivo celular de 100 mm. - Raspa cada tejido de prepucio con una cuchilla quirúrgica para eliminar los tejidos adiposos subcutáneos y los tejidos conectivos sueltos en la cubierta de un plato de cultivo celular de 100 mm.
NOTA: Utilice un bisturí para raspar las capas de grasa hasta que sólo queden la epidermis delgada y la dermis densa. - Transfiera cada prepucio adulto a otro plato de cultivo de 100 mm con el lado de la dermis hacia abajo.
NOTA: Corte cada tejido de prepucio adulto en tiras de 3-4 mm de ancho usando una cuchilla de bisturí para hacer que el dispase funcione de manera más eficiente. - Añadir 2,5 mg/ml descaperdio a cada plato de cultivo de 100 mm con tejidos de prepucio adultos e incubar durante 16 a 20 h a 4 oC.
NOTA: Cada gramo de tejido se digiere con 10 ml de solución dispase.
- Enjuagar cada tejido de prepucio adulto una vez con 10 ml de etanol al 75% (alcohol) durante 30 s, y luego enjuagar dos veces con 10 ml de solución de lavado (3% P/S), durante 5 minutos cada uno.
- Separación de la epidermis del tejido del prepucio adulto
- Después de la digestión durante 16 a 20 h, separe la epidermis de la dermis con pinzas. Agarre un lado del borde dérmico del tejido con una pinza y la posición correspondiente de la parte epidérmica con otra pinza y despegue suavemente la epidermis.
- Lave la epidermis 3x con solución de lavado (3% P/S) y luego transfiera la epidermis a un tubo.
- Sumergir la epidermis añadiendo 5 ml de 0.05% de trippsina en el tubo e incubar en un baño de agua durante 30 min a 37 oC.
NOTA: Agitar el tubo para asegurarse de que la epidermis está completamente sumergida antes de la incubación.
- Recolección y cultivo de células primarias
- Añadir un volumen igual de solución de terminación (10% FBS, 1% P/S en DMEM) para neutralizar la tripina y pipetear la solución arriba y abajo 10-15 veces para separar las células epidérmicas.
- Pase la suspensión celular a un nuevo tubo de 50 ml a través de un filtro de malla de 100 m para eliminar los residuos.
- Centrífuga a 200 x g durante 5 min.
- Retire el sobrenadante y agregue 10 ml de inoculación TIVA medio para resuspender las células.
- Siembra las células resuspendidas en un plato de cultivo de 100 mm.
- Cultivo en una incubadora de 37oC con 5% de CO2.
- Cambie el medio cada 2 días.
- Células de paso cuando alcanzan el 80% de confluencia.
3. El nuevo método
NOTA: El procedimiento para la preparación y digestión de tejidos en el nuevo método es el mismo que se describió anteriormente para el método convencional, la única diferencia es que las células frescas aisladas se resuspenden en 10 ml de medio TIVA que contiene 10 M Y-27632.
- Dos días después de la siembra, sustituya el soporte por un medio TIVA normal sin Y-27632. Después de eso, las condiciones de cultivo son las mismas entre los métodos nuevos y los convencionales.
4. Passaging celular
- Retire el medio TIVA y enjuague cada plato de cultivo dos veces con PBS.
- Añadir 2 ml de 0,05% de trippsina por plato de cultivo celular de 100 mm.
NOTA: Agitar el plato para asegurar un contacto adecuado entre las enzimas digestivas y la parte inferior del plato. - Digerir en una incubadora de 37oC durante 2 min.
- Usa un microscopio para revisar las células y asegúrate de que la mayoría de las células se hayan disociado del plato de cultivo celular.
NOTA: Toque suavemente el plato para liberar las celdas para redondear hacia arriba y flotar en la solución. Prolongar el tiempo de digestión si la mayoría de las células no se suspendieron después de tocar, pero no más de 5 minutos más. - Transfiera los melanocitos a un tubo de 15 ml después de neutralizar la actividad de la trippsina añadiendo 2 ml de solución de terminación. Centrífuga a 200 x g durante 5 min.
- Resuspender cada pellet celular con 10 ml de medio TIVA después de eliminar lentamente el sobrenadante, y luego contar el número de melanocitos.
- Placa de aproximadamente 1 x 106 melanocitos en 10 ml de medio TIVA por plato de cultivo celular de 100 mm.
- Renovar el medio de cultivo celular cada 48 h.
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Representative Results
La Figura 1 muestra un diagrama esquemático que compara los métodos convencionales y los nuevos. El procedimiento para la preparación y digestión de tejidos con el nuevo método es el mismo que el procedimiento para el método convencional, la única diferencia es que las células aisladas se resuspenden en 10 ml de medio TIVA en presencia de 10 M Y-27632. Dos días después de la siembra, sustituya el soporte por un medio TIVA normal sin Y-27632. El método convencional de aislar los melanocitos primarios de los tejidos de la piel generalmente requiere alrededor de 3 a 4 semanas para que los melanocitos crezcan en número suficiente para el paso, pero lo más importante, los tejidos generalmente provienen de recién nacidos y es muy difícil aislar los melanocitos primarios de los tejidos adultos de la piel. Sin embargo, utilizando el nuevo método, los melanocitos de los tejidos adultos se observan en un número significativamente mayor que los melanocitos aislados utilizando el método convencional. Se tomaron vistas microscópicas en los días 3, 6 y 8 al aislar los melanocitos del tejido cutáneo adulto utilizando el método convencional y el nuevo método (Figura 2A). En estas vistas microscópicas, el nuevo método aumentó significativamente el rendimiento de los melanocitos en los días 6 y 8. Los números de melanocitos se cuantificaron contando al menos 10 campos microscópicos diferentes en los días 3, 6 y 8. Los resultados mostraron que el número de melanocitos aislados utilizando el nuevo método es mucho mayor que el número de melanocitos aislados utilizando el método convencional en los días 6 y 8(Figura 2B). Después de 8 días de cultivo, los melanocitos fueron cosechados usando trippsina y luego contados con un contador celular automatizado en cada plato de 100 mm, lo que reveló que el nuevo método aumentó el rendimiento de los melanocitos en unas cinco veces(Figura 2C). Las opiniones microscópicas tomadas en el día 9, un día después de la realización, mostraron que los melanocitos con pasos proliferaban normalmente(Figura 2D),lo que fue confirmado por la tinción Ki67 (Figura 2E).
El rendimiento mejorado de los melanocitos por Y-27632 durante el cultivo inicial después del aislamiento se ha demostrado a través de la regulación de los queratinocitos en una publicación anterior16. Como se muestra en la Figura 3, Y-27632 no aumentó el crecimiento y la proliferación de melanocitos con pasos (Figura 3A-B) y no inhibió la apoptosis de los melanocitos (Figura 3C-D). Sin embargo, Y-27632 aumentó significativamente la fijación de queratinocitos (Figura 3E-H) y también promovió su supervivencia (Figura 3I) en los medios TIVA de cultivo de melanocitos. Ya sea co-cultivo con queratinocitos en presencia de Y-27632 o el medio condicionado derivado de queratinocitos tratados Y-27632 podría mejorar significativamente el crecimiento de melanocitos (Figura 3J).
Para caracterizar aún más los melanocitos aislados utilizando el nuevo método, MITF, un marcador específico de melanocitos, se analizó utilizando la tinción de inmunofluorescencia (IF) para comprobar la pureza de los melanocitos después del passaging inicial. La Figura 4A muestra que el porcentaje de células que expresan MITF en el pasaje 1 fue de casi 100%, lo que indica que se obtuvieron melanocitos puros después del primer paso por el nuevo método, que es similar al método convencional. Para probar si los melanocitos aislados utilizando el nuevo método pueden funcionar normalmente, fueron tratados con forskoline (FSK) durante 2 días in vitro, lo que indujo los niveles de pigmentación de melanocitos (Figura 4B). En conjunto, estos datos sugieren que los melanocitos aislados utilizando el nuevo método pueden funcionar normalmente y pueden producir pigmento.
Figura 1: Comparación del nuevo método y el método convencional. Este esquema muestra una comparación del método convencional con el nuevo método de aislamiento. La única diferencia es que las células frescas aisladas se resuspenden en 10 ml de medio TIVA en presencia de 10 M Y-27632. Dos días después de la siembra, el medio se sustituye por un medio TIVA normal sin Y-27632. El nuevo método generalmente logra una densidad de melanocitos adecuado para el passaging alrededor del día 8, mientras que el método convencional generalmente toma alrededor de 20 días para crecer un número suficiente de melanocitos para el passaging. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: El nuevo método de aislamiento aumenta la producción de melanocitos primarios. (A) Imágenes representativas de melanocitos preparadas por el método convencional (fila superior) y por el nuevo método (fila inferior) en los días 3, 6 y 8 después de la inoculación inicial. (B) Cuantificación de números de melanocitos preparados utilizando el método convencional y el nuevo método mediante el recuento de números de melanocitos en al menos 10 campos microscópicos diferentes (número de célula/visión) en los días 3, 6 y 8. Todos los experimentos se realizaron por triplicado y los resultados se expresan como el número medio de células por campo microscópico. (C) Después del cultivo durante 8 días, los melanocitos se cosecharon utilizando trippsina y el número de melanocitos preparados utilizando el método convencional y el nuevo método se contaron utilizando una placa de conteo celular. El número de células se calculó a partir de experimentos por triplicados, y los resultados muestran el número promedio de células por plato de 100 mm. (D) Después de contar el número de melanocitos utilizando un contador de células automatizado, los melanocitos preparados con el método convencional o el nuevo método se se siembran en nuevos platos y se tomaron fotos microscópicas en el día 9. (E) Los melanocitos aislados utilizando el nuevo método en el pasaje 0 o en el pasaje 1 se fijaron y teñiron con anticuerpos Ki67 (rojo) y DAPI (núcleos, azul). (B-C), Se utilizó la prueba tdel estudiante para analizar las diferencias entre el método nuevo y el convencional, ** P < 0.01, ***P < 0.005. Todas las barras de escala representan 100 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Y-27632 mejora el crecimiento de melanocitos a través de la regulación de los queratinocitos. (A) Los melanocitos puros (paso 3) fueron tratados con 10 M Y-27632 para 12, 24, 48 y 60 h y el número de melanocitos fue analizado por el ensayo CCK-8. (B) Los melanocitos puros (paso 3) fueron tratados con 10 M Y-27632 durante 48h y luego se fijaron para la tinción Ki67. Cuantificación del porcentaje de células positivas Ki67 entre células vivas totales indicadas con tinción nuclear DAPI. (C-D) Los melanocitos puros (paso 3) fueron tratados con 10 M Y-27632 durante 48 h y luego fueron teñidos para células apoptóticas con Annexin V-FITC y yoduro de propidium seguidos del análisis FACS (C) o fijados para el ensayo TUNEL. (E) La epidermis aislada después de la digestión de la tripina se vajilla con un medio TIVA con o sin Y-27632 (10 m) y 2 días después se realizó un análisis de inmunofluorescencia de queratinocitos con un anticuerpo pan-citoqueratina (pan-ck). (F) Cuantificación de queratinocitos en los platos tratados con Y-27632 y de control de (E) como porcentaje de queratinocitos en un total de 500 células contadas. (G) Paso puro 3 queratinocitos fueron sembrados en medio TIVA con o sin Y-27632 (10 m). Las imágenes de las células epidérmicas se muestran un día después de la siembra. (H) Cuantificación de queratinocitos adjuntos en los platos tratados y de control de Y-27632 de (G) como porcentaje de células adheridas en un total de 5000 células sembradas. (I) El paso puro 3 queratinocitos fueron chapados con medio TIVA en presencia o ausencia de Y-27632. Las imágenes microscópicas se obtuvieron a las 24 h. (J) Panel izquierdo: Igual número de paso puro 3 melanocitos fueron chapados con medio TIVA en 4 grupos con adición(es) como se indica: 1) Y-27632 (1 sólo (Y) (Y en el gráfico), 2) pasaje 3 queratinocitos solo, 3) queratinocitos e Y-27632 (10 m) (K+Y), y 4) sin adición (control negativo, con). Los cambios relativos de pliegues en la proliferación de melanocitos en comparación con el control negativo se determinaron contando el número de melanocitos a las 24 h y 48 h después del chapado. Panel derecho: Los medios TIVA acondicionados se obtuvieron de los 4 grupos de cultivos de melanocitos de paso 3 en (panel izquierdo) a 48 h después del chapado. Entonces, el mismo número de paso 3 melanocitos fueron chapados en 4 grupos, cada uno con uno de los medios condicionados. Los cambios relativos de pliegues en la proliferación de melanocitos en comparación con el control negativo se determinaron contando el número de melanocitos a las 24 h y 48 h después del chapado. (A-J) Todos los experimentos se han repetido 3 veces, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.005. Todas las barras de las imágenes representan 100 m. La figura ha sido modificada de Mi et al.16. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Caracterización de melanocitos aislados mediante el nuevo método. (A) Imágenes representativas de la tinción por inmunofluorescencia de MITF (rojo) en melanocitos preparados con el método nuevo o convencional. DAPI mancha los núcleos (azul). (B) Los pellets celulares se recogieron de melanocitos preparados utilizando el nuevo método y fueron tratados durante 2 días con forskoline (FSK) o vehículo DMSO como control (con). Todas las barras de escala representan 100 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El protocolo descrito aquí se basó en una publicación reciente16. Se debe prestar cierta atención a los siguientes pasos críticos para lograr los mejores resultados con el nuevo método. En primer lugar, la separación exitosa de la epidermis y la dermis es crucial. Corte los tejidos adultos del prepucio en tiras de 3-4 mm de ancho usando una cuchilla de bisturí para hacer que el dispase funcione más a fondo y fácilmente para separar la epidermis de la dermis. En segundo lugar, al separar esas dos capas, se debe evitar la contaminación de la dermis, ya que los fibroblastos dérmicos también pueden crecer en un medio de cultivo de melanocitos. En tercer lugar, el paso de digestión de la trippsina debe ser inferior a 30 min; de lo contrario, disminuirá significativamente la viabilidad de las células aisladas.
Este nuevo método acorta significativamente el tiempo necesario para el aislamiento de melanocitos. Los melanocitos epidérmicos humanos producen melanina, que protege la piel del daño por irradiación solar. Eisinger y Marko propusieron el primer método práctico para la cultura de los melanocitos humanos de la epidermis5. Lo más importante es que los tejidos utilizados generalmente provienen de recién nacidos y es muy difícil aislar los melanocitos primarios de los tejidos adultos de la piel. El inhibidor de la quinasa de proteína asociada a Rho Y-27632 mejora significativamente la eficiencia del aislamiento epidérmico de células madre11-13. Además, también informamos de un método para aislar células epidérmicas primarias humanas de los tejidos de la piel en presencia de Y-2763210,11. En este protocolo, se demostró que Y-27632 aumenta eficientemente el rendimiento de los melanocitos primarios. El uso del método convencional tiene una baja tasa de recuperación celular y necesita alrededor de 3 a 4 semanas de cultivo para que los melanocitos crezcan en número suficiente para el paso. Este nuevo método, en el que se añade Y-27632 al medio de crecimiento TIVA, aumenta el rendimiento de los melanocitos en unas cinco veces, y los melanocitos obtenidos pueden proliferar normalmente. También probamos el nuevo método utilizando un medio comercial y encontramos resultados similares. En cuanto al mecanismo implicado, un estudio reciente demostró que el efecto de Y-27632 para mejorar la eficiencia del aislamiento de melanocitos se produce principalmente a través de queratinocitos16.
Es importante destacar que obtuvimos melanocitos puros con función normal utilizando el nuevo método. Los melanocitos del Pasaje 1 (P1) fueron casi todos manchados para la expresión MITF, lo que indica que se obtienen melanocitos puros después del primer pasaje. Los melanocitos primarios con alto potencial de crecimiento son muy importantes para la investigación biológica y las aplicaciones clínicas. Los melanocitos aislados utilizando el nuevo método pueden ser inducidos al pigmento después del tratamiento con forskoline, un activador de adenilato ciclasa que aumenta los niveles de AMP cíclico, lo que indica que estos melanocitos pueden funcionar normalmente, lo que será útil para el estudio de defectos de pigmentación y melanoma14.
En resumen, se estableció con éxito un método altamente eficiente para aislar los melanocitos primarios de los tejidos adultos de la piel. Este método mejorado podría contribuir a proporcionar un número suficiente de melanocitos de manera rápida para la investigación biológica y para aplicaciones clínicas.
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Disclosures
Todos los autores no declaran ningún interés de conflicto.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (2017YFA0104604), el Programa General de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81772093), Proyecto de Investigación Logística Militar (AWS17J005), el Programa Clave de la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Shandong (ZR2019ZD36) y el Programa clave de investigación y desarrollo de la provincia de Shandong (2019GSF108107) a X.W. Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (2019A1515110833) y The Fundamental Research Funds of Shandong University (2019GN043) a J.M.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa fluor-594 donkey anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | A21203 | For Immunofluorescence |
| Alexa fluor-594 donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | R37119 | For Immunofluorescence |
| Cell Culture Dish | Eppendorf | 30702115 | For cell culture |
| Cell Strainer | Corning incorporated | 431792 | Cell filtration |
| 15 mL Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifuge |
| 50 mL Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifuge |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026333 | For cell incubating |
| Constant Temperature Shaker | Shanghai Boxun | 150036 | For water bath |
| DAPI | Abcam | ab104139 | For Immunofluorescence |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | For melanocyte isolation |
| DMEM | Thermo Scientific | C11995500 | Component of neutralization medium |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1AC5 | Component of neutralization medium |
| Fluorescence microscope | Olympus | 5E44316 | For Immunofluorescence |
| Forskolin | MCE | HY-15371 | Induce pigmentation |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | melanocyte culture medium |
| Ham's F12 | Thermo Scientific | 11330032 | melanocyte culture medium |
| Inverted microscope | Olympus | 5C42258 | For cell microscopic observation |
| 3-isobutyl-1-methyl xanthine (IBMX) | Sigma | 17018 | melanocyte culture medium |
| mouse anti-human MITF | Abcam | ab12039 | For Immunofluorescence |
| Na3VO4 | Sigma | S6508 | melanocytes culture medium |
| N6,2'-O-dibutyryladeno-sine 3',5'-cyclic monophosphate (dbcAMP) | Sigma | D0627 | melanocyte culture medium |
| 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (TPA) | Sigma | 79346 | melanocyte culture medium |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
| rabbit anti-human Ki-67 | Abcam | ab15580 | For Immunofluorescence |
| Phosphate buffered solution | Solarbio Life Science | P1020-500 | Washing solution |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004380 | Cell centrifugation |
| TC20TM automated cell counter | Bio-Rad | 1450102 | Automatic cell counting |
| 0.05% Trypsin | Life Technologies | 25300-062 | For melanocyte dissociation |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | For melanocyte isolation |
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