Summary
Bu makale, Y-27632'nin TIVA ortamına eklenmesinin yetişkin cilt dokularından melanosit lerin verimini önemli ölçüde artırabileceğini bildiriyor.
Abstract
Deri dokularından birincil melanositlerin izolasyonu ve kültürü biyolojik araştırmalar için çok önemlidir ve klinik uygulamalar için yaygın olarak kullanılmaktadır. Geleneksel yöntemle deri dokularından birincil melanositizole genellikle yeterince geçmesi yaklaşık 3-4 hafta sürer. Daha da önemlisi, kullanılan dokular genellikle yenidoğan sünnet derisi ve hala verimli yetişkin dokulardan primer melanosit izole etmek için bir meydan okumadır. Yakın zamanda, rho kiril inhibitörü olan Y-27632'yi geleneksel protokolle karşılaştırıldığında ilk kültür ortamına ekleyen melanositler için yeni bir izolasyon yöntemi geliştirdik, bu yeni yöntem melanositlerin verimini önemli ölçüde artırır ve sünnet derisi dokularından melanositleri izole etmek için gereken süreyi kısaltır. Şimdi bu yeni yöntemi daha ayrıntılı olarak yetişkin epidermis kullanarak verimli bir şekilde birincil melanosit kültür açıklar. Daha da önemlisi, bu yeni yöntemle hazırlanan erişkin dokulardan elde edilen melanositlerin normal şekilde çalışabildiği gösterilebilir. Bu yeni protokol, kolayca erişilen erişilen erişilen erişilen erişilen erişilen cilt dokularından hazırlanan primer melanositler kullanılarak pigmentasyon defektleri ve melanomların çalışmalarına önemli ölçüde fayda sağlayacaktır.
Introduction
Bu çalışmanın amacı, biyolojik araştırma ve klinik uygulamalar için yetişkin cildin epidermisinden melanositleri izole etmek için basit ve etkili bir protokol geliştirmektir. Cildin bazal epidermisinde ve saç foliküllerinde bulunan melanositler,melanin1 üreterek cilt ve saç pigmentasyonunda önemli bir rol oynamaktadır. Epidermal melanositlerden elde edilen deri pigmentasyonu, derideki altta yatan hücrelere DNA hasarını azaltan/engelleyen ultraviyole radyasyon filtresi görevi görür2. Deride melanositlerin anormal çoğalması oldukça yaygındır, benign nevüs oluşumu gibi (benler) hangi melanositler potansiyel olarak onkojenik3büyümeye dönüştürmek hücresel senescence 3 .
1957 yılından bu yana, izolasyon ve insan birincil melanosit sonraki kültür mümkün olmuştur4, ama sadece 1982 yılından bu yana tekrar tekrar epidermisin insan melanosit kültürleri kurmak etkili bir yöntem olmuştur5. Primer melanositleri epidermisten izole etmek için kullanılan geleneksel yöntem iki aşamalı enzimatik sindirim gerektirir. Kısaca, cilt başlangıçta dermis epidermisini ayırmak için dispase ile sindirilir, daha sonra epidermisin tripsin ile sindirilir melanosit ler ve keratinositler içeren süspansiyonlar üretmek için, daha sonra seçici olarak farklı medyada yetiştirilebilir. Şu anda, ilk kültür genellikle melanositler için geleneksel yöntem kullanarak biraraya ulaşmak için yaklaşık 3-4 hafta sürer, hangi izolasyon düşük verimlilik nedeniyle muhtemeldir. Bu nedenle, yetişkin cilt dokularından melanosit ilk üretimini artırmak hem laboratuvar araştırmaları hem de klinik uygulamalar için oldukça yararlı olacaktır.
Çoğu keratinositler (örneğin, α-MSH, ACTH, bFGF, NGF, ET-1, GM-CSF, HGF, LIF SCF ve LIF SCF) tarafından salgılandığı gösterilen birçok büyümefaktörü,-8memeli melanositlerin farklılaşmasını ve çoğalmasını düzenler. Besleyici tabakaların yokluğunda, bu büyüme faktörlerinin eksikliği melanositlerin çoğalmasına ve artan apoptozun azalmasına yol açar9. Besleyici hücreler ve melanositler olarak keratinositlerin ortak kültürü hızlandırılmış melanosit çoğalmasına ve azaltılmış apoptosisyol açabilir. Ancak, co-kültür yöntemi sadece pratik değildir keratinositler hazırlamak için daha fazla cilt dokuları talep değil, ama aynı zamanda melanositlerin gerektirdiği kültür koşulları keratinosit büyüme lehine değildir, çünkü verimli çalışamadı, ve tersi.
Önceki çalışmalarda Y-27632 eklenmesi, bir ROCK inhibitörü, büyüme ortamına cilt dokularından insan birincil epidermal hücrelerinin verimini artırabilir bildirdin10-14. Bu nedenle, insan birincil melanosit izolasyon Y-27632 varlığından yarar olup olmadığını test etmek ilginç olacaktır. Nitekim, Y-27632 eklenmesi aşı TIVA ortaiçine 15, Hangi TPA içeren, IBMX, Na3VO4 ve dbcAMP, önemli ölçüde ilk kültürlerde sünnet derisi dokulardan izole birincil melanosit lerin verimi arttı16. Konvansiyonel protokol ile karşılaştırıldığında, bu yeni protokol melanosit16verimini artırmada önemli ölçüde daha verimlidir. Bu nedenle, bu protokol, temel ve uygulamalı biyolojik araştırmalarda uygulanmasını teşvik etmek amacıyla bir önceki çalışma16 dayalı yetişkin cilt dokuları kullanarak ayrıntılı olarak yeni yöntem açıklar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokolde yetişkin sünnet derisi dokularının kullanımı İnsan Araştırma Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır (No.2015120401, tarih: 12 Mayıs 2015).
NOT: Hücre ve kültürlerin kirlenmesini önlemek için steril bir ortamda aşağıdaki tüm işlemleri gerçekleştirin.
1. Hazırlıklar
- 10 mL fosfat tamponsal (PBS) içeren 15 mL tüpte sünnet ameliyatlarından taze yetişkin sünnet derisi dokularını toplayın ve 4 °C'de saklayın.
NOT: Dokuları eksizyondan sonra 24 saat içinde aşağıda belirtildiği şekilde ayırın. - Reaktifler ve kültür ortamı hazırlayın.
- Yıkama çözeltisi olarak %3 P/S (penisilin/streptomisin) hazırlayın. 50 mL PBS ile 1,5 mL penisilin (100 U/mL) ve streptomisin (100 mg/L) (P/S) karıştırın.
- Enzimatik sindirimnötrizasyonu için sonlandırma çözeltisi (nötralizasyon çözeltisi) hazırlayın. Ek %1 P/S, %10 fetal sığır serumu (FBS) DMEM ortamına.
- Tiva'yı kültür melanositlerine hazırlayın: Ham's F12; %10 FBS; 1x P.S.glutamin; 50 ng/mL 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-asetat (TPA); 1 x 10-4 M 3-izobütil-1-metil ksantin (IBMX); 1 μM Na3VO4; 1 x 10-3 M N-6,2′-O-dibutyryladenosine-3′,5′-siklik monofosfat (dbcAMP).
2. Geleneksel yöntem
- Cilt dokusu ön tedavisi
- Her yetişkin sünnet derisi dokuyu 30 s için 10 mL%75 etanol (alkol) ile bir kez durulayın ve ardından 10 mL yıkama solüsyonu (%3 P/S) ile her biri 5 dakika boyunca iki kez durulayın.
NOT: Çok fazla kan varsa, başlangıçta 10 mL PBS ile sünnet derisi dokuları yıkayın. Tüm yıkamalar 100 mm hücre kültürü yemeklerinde hazırlanır. - Deri altı yağ dokularını ve gevşek bağ dokularını 100 mm'lik hücre kültürü kabının kapağında çıkarmak için her sünnet derisi dokusunu cerrahi bir bıçakla kazıyın.
NOT: Sadece ince epidermis ve yoğun dermis kalana kadar uzak yağ katmanları kazımak için bir neşter kullanın. - Her yetişkin sünnet derisi başka bir 100 mm kültür çanak içine dermis tarafı aşağı aktarın.
NOT: Her yetişkin sünnet derisi dokusunu, dispase'nin daha verimli çalışması için neşter bıçağı kullanarak 3-4 mm genişliğinde şeritler halinde kesin. - Yetişkin sünnet derisi dokuları ile her 100 mm kültür çanak 2.5 mg / mL dispase ekleyin ve 4 ° C'de 16-20 saat kuluçka.
NOT: Doku her gram dispase çözeltisi 10 mL ile sindirilir.
- Her yetişkin sünnet derisi dokuyu 30 s için 10 mL%75 etanol (alkol) ile bir kez durulayın ve ardından 10 mL yıkama solüsyonu (%3 P/S) ile her biri 5 dakika boyunca iki kez durulayın.
- Epidermisin yetişkin sünnet derisi dokusundan ayrılması
- 16-20 saat sindirimi sonra, cımbız kullanarak dermis epidermis ayırın. Bir cızırdayan ve başka bir cızırtı ile epidermal parçasının karşılık gelen konumu ile dokunun dermal kenarının bir tarafı kapmak ve yavaşça epidermis soyma.
- Epidermisin 3x'i yıkama solüsyonuyla yıkayın (%3 P/S) ve epidermisin bir tüpe aktarımı.
- Tüpiçine %0,05 tripsin 5 mL ekleyerek epidermisin batırın ve 37 °C'de 30 dakika su banyosunda kuluçkaya yatırın.
NOT: Kuluçkadan önce epidermisin tamamen batırıldığından emin olmak için tüpü sallayın.
- Birincil hücrelerin toplanması ve kültürü
- Epidermal hücreleri ayırmak için trypsin ve pipet çözeltisini 10-15 kez yukarı ve aşağı nötralize etmek için eşit hacimli sonlandırma çözeltisi (%10 FBS, %1 P/S DMEM) ekleyin.
- Hücre süspansiyonundan 100 m'lik bir kafes filtresinden yeni bir 50 mL boruya geçirerek enkazı temizleyin.
- Santrifüj 200 x g 5 dk.
- Supernatant çıkarın ve hücreleri yeniden askıya almak için aşı TIVA orta 10 mL ekleyin.
- Yeniden askıya alınan hücreleri 100 mm'lik bir kültür kabına tohumlayın.
- % 5 CO2ile 37 ° C kuluçka kültürü .
- Orta yı 2 günde bir değiştirin.
- %80'e ulaştıklarında geçiş hücreleri biraraya geldiğinde.
3. Yeni yöntem
NOT: Yeni yöntemde doku hazırlama ve sindirimi prosedürü konvansiyonel yöntem için yukarıda açıklanan ile aynıdır, tek fark izole edilmiş taze hücrelerin 10 μM Y-27632 içeren TIVA ortamının 10 mL'sinde yeniden askıya alınmasıdır.
- Tohumlamadan iki gün sonra, y-27632 olmadan normal TIVA ortamı ile medya değiştirin. Bundan sonra, kültür koşulları yeni ve geleneksel yöntemler arasında aynıdır.
4. Hücre geçişi
- TIVA ortamını çıkarın ve her kültür yemeğini PBS ile iki kez durulayın.
- 100 mm hücre kültürü çanak başına% 0.05 tripsin 2 mL ekleyin.
NOT: Sindirim enzimleri ve yemeğin alt arasında yeterli temas sağlamak için çanak çalkalayın. - 37 °C'lik bir kuluçka makinesinde 2 dakika sindirin.
- Hücreleri kontrol etmek için bir mikroskop kullanın ve çoğu hücrenin hücre kültürü çanaktan ayrıştırdığından emin olun.
NOT: Hücreleri serbest bırakmak için yavaşça tabağa dokunun ve çözeltide yuvarlayın ve yüzer. Çoğu hücre dokunduktan sonra askıya almadıysa sindirim süresini uzatın, ancak en fazla 5 dakika daha. - 2 mL sonlandırma çözeltisi ekleyerek trippsin aktivitesini nötralize ettikten sonra melanositleri 15 mL'lik bir tüpe aktarın. Santrifüj 200 x g 5 dk.
- Süpernatant'ı yavaşça çıkardıktan sonra 10 mL TIVA orta ile her hücre pelesini yeniden askıya alın ve melanosit sayısını sayın.
- 100 mm hücre kültürü çanak başına TIVA orta 10 mL yaklaşık 1 x 106 melanosit plaka.
- Hücre kültürünü her 48 saatte bir yenileyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1, geleneksel ve yeni yöntemleri karşılaştıran şematik bir diyagram göstermektedir. Yeni yöntemle doku hazırlama ve sindirimi prosedürü konvansiyonel yöntemle aynıdır, tek fark izole edilmiş hücrelerin 10 μM Y-27632 varlığında TIVA ortamının 10 mL'sinde yeniden askıya alınmasıdır. Tohumlamadan iki gün sonra, y-27632 olmadan normal TIVA ortamı ile medya değiştirin. Deri dokularından birincil melanositizole geleneksel yöntem genellikle melanositler için yeterli sayıda geçiş büyümek için yaklaşık 3-4 hafta gerektirir, ama daha da önemlisi, dokular genellikle yeni doğan bebeklerden gelen ve yetişkin cilt dokularından primer melanosit izole etmek çok zordur. Ancak, yeni yöntem kullanılarak, erişkin dokulardan melanositler konvansiyonel yöntem kullanılarak izole edilen melanositlerden çok daha fazla sayıda görülmektedir. Geleneksel yöntem ve yeni yöntem kullanılarak erişkin deri dokusundan melanositler izole edildiğinde mikroskobik görünümler 3, 6 ve 8 gün lerindealınmıştır (Şekil 2A). Bu mikroskobik görünümlerde yeni yöntem 6 ve 8. Melanosit sayıları daha sonra 3, 6 ve 8 gün lerinin en az 10 farklı mikroskobik alanı sayılarak ölçüldü. Sonuçlar, yeni yöntemkullanılarak yalıtılmış melanosit sayısının 6 ve 8 günlerinde geleneksel yöntem kullanılarak yalıtılmış melanosit sayısından çok daha yüksek olduğunu göstermiştir(Şekil 2B). 8 günlük kültürden sonra, melanositler tripsin kullanılarak hasat edildi ve her 100 mm çanakta otomatik bir hücre sayacı ile sayıldı, bu da yeni yöntemin melanosit verimini yaklaşık beş kat artırdığını ortaya çıkardı(Şekil 2C). 9. günde alınan mikroskobik görünümler, geçişli melanositlerin normal olarak çoğaldığını gösterdi (Şekil 2D), Ki67 boyama ile doğrulandı(Şekil 2E).
İzolasyon sonrası ilk kültür sırasında Y-27632 tarafından melanositlerin geliştirilmiş verim bir önceki yayında keratinositlerin düzenlenmesi ile gösterilmiştir16. Şekil 3'tegösterildiği gibi, Y-27632 geçitli melanositlerin büyüme ve çoğalmasını artırmadı (Şekil 3A-B) ve melanosita apoptozini inhibe etmedi (Şekil 3C-D). Ancak, Y-27632 önemli ölçüde keratinosit eki arttı (Şekil 3E-H) ve aynı zamanda melanosit-kültür TIVA medyada hayatta kalan ( Şekil3I) terfi. Y-27632 varlığında keratinositlerle ortak kültür ya da Y-27632 tedavi edilmiş keratinositlerden elde edilen şartlı ortam melanositlerin büyümesini önemli ölçüde artırabilir(Şekil 3J).
Yeni yöntemle izole edilen melanositleri daha fazla karakterize etmek için, özel bir melanosit belirteci olan MITF, ilk geçişten sonra melanositlerin saflığını kontrol etmek için immünoresans (IF) boyama kullanılarak analiz edildi. Şekil 4A, MITF'yi paragraf 1'de ifade eden hücrelerin yüzdesinin yaklaşık %100 olduğunu göstererek, geleneksel yönteme benzer olan yeni yöntemle ilk geçişten sonra saf melanositlerin elde edildiğini göstermektedir. Yeni yöntemle izole edilen melanositlerin normal çalışıp çalışmadığını test etmek için, melanositpigmentasyon düzeylerini indükleyen 2 gün boyunca forskolin (FSK) ile tedavi edildiler (Şekil 4B). Birlikte ele alındığında, bu veriler melanositler yeni yöntem kullanılarak izole normal çalışabilir ve pigment üretebilir öneririz.
Şekil 1: Yeni yöntem ve konvansiyonel yöntemin karşılaştırılması. Bu şema, geleneksel yöntemin yeni yalıtım yöntemiyle karşılaştırılmasını gösterir. Tek fark, izole edilmiş taze hücrelerin 10 mL TIVA ortamda 10 μM Y-27632 varlığında yeniden askıya alınmasıdır. Tohumlamadan iki gün sonra ortam, Y-27632 olmadan normal TIVA ortamı ile değiştirilir. Geleneksel yöntem genellikle passaging için melanosit yeterli sayıda büyümek için yaklaşık 20 gün sürer iken yeni yöntem, genellikle 8 gün civarında passaging için uygun melanosit yoğunluğu elde eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Yeni izolasyon yöntemi primer melanosit üretimini artırır. (A) İlk aşılamadan sonra 3, 6 ve 8. (B) Konvansiyonel yöntem ve yeni yöntem kullanılarak hazırlanan melanosit sayılarının 3, 6 ve 8 günlerinde en az 10 farklı mikroskobik alanda (hücre numarası/görme) sayılarak sayısallaştırılması. Tüm deneyler triplicate olarak yapıldı ve sonuçlar mikroskobik alan başına ortalama hücre sayısı olarak ifade edilir. (C) 8 gün süren kültürden sonra melanositler tripsin kullanılarak hasat edildi ve geleneksel yöntemle hazırlanan melanosit sayısı ve yeni yöntem hücre sayma plakası kullanılarak sayıldı. Hücre sayısı üç aylık deneylerden hesaplandı ve sonuçlar 100 mm çanak başına ortalama hücre sayısını gösteriyor. (D) Otomatik hücre sayacı kullanılarak melanosit sayısı sayıldıktan sonra, konvansiyonel yöntem veya yeni yöntem kullanılarak hazırlanan melanositler yeni yemeklerde tohumlanmış ve 9. (E) Geçide 0 veya 1 numaralı geçitte yeni yöntem kullanılarak izole edilen melanositler sabit ve Ki67 antikor (kırmızı) ve DAPI (çekirdek, mavi) ile boyanmıştır. (B-C), Öğrencinin t-testi, yeni ve geleneksel yöntem arasındaki farkları analiz etmek için kullanıldı, ** P < 0.01, ***P < 0.005. Tüm ölçek çubukları 100 μm'yi temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Y-27632 keratinositlerin düzenlenmesi ile melanosit büyümesini artırır. (A) Saf melanositler (pasaj 3) 12, 24, 48 ve 60 h için 10 μM Y-27632 ile tedavi edildi ve melanosit sayısı CCK-8 tayini ile analiz edildi. (B) Saf melanositler (pasaj 3) 48 h için 10 μM Y-27632 ile tedavi edildi ve daha sonra Ki67 boyama için düzeltildi. DAPI nükleer boyama ile endike toplam canlı hücreler arasında Ki67 pozitif hücrelerin yüzdesi sayısallaştırma. (C-D) Saf melanositler (pasaj 3) 48 saat boyunca 10 μM Y-27632 ile tedavi edildi ve daha sonra Annexin V-FITC ve propidium iyodürlü apoptotik hücreler için lekeli ve ardından FACS analizi(C)veya TUNEL tahlil için sabitlendi. (E) Trypsin sindiriminden sonra izole epidermis Y-27632 (10 μM) ile tiva orta ile kaplandı ve 2 gün sonra keratinositlerin immünfloresans analizi pan-sitokeratin antikor (pan-ck) ile yapıldı. (F) Y-27632'deki keratinositlerin sayısallaştırılması ve (E)keratinositlerin toplam 500 hücredeki yüzdesi olarak kontrol yemekleri sayılmıştır. (G) Saf geçit 3 keratinosit, Y-27632 (10 μM) ile tiva ortasında tohumlandı. Epidermal hücrelerin görüntüleri tohumlamadan bir gün sonra gösterilir. (H) Y-27632-tedavi ekli keratinositlerin sayısallaştırılması ve kontrol yemekleri (G) toplam 5000 hücrelerin yüzdesi olarak tohumlanmış. (I) Saf geçit 3 keratinosit, Y-27632'nin varlığında veya yokluğunda TIVA ortamı ile kaplandı. Mikroskobik görüntüler 24 saat sonra elde edildi. (J) Sol panel: Eşit sayıda saf geçit 3 melanosit tiva orta ile 4 grupta ek(ler) ile kaplandı: 1) Y-27632 (10 μM) tek başına (Grafikte Y), 2) pasaj 3 keratinosit tek başına , 3) keratinositler ve Y-27632 (10 μM) (K+Y) ve negatif kontrol (4) kontrol (k+Y) ve 4) kontrol (k)) con). Melanosit proliferasyonunda negatif kontrole göre göreceli katlama değişiklikleri, kaplamadan sonra melanosit sayısı 24 saat ve 48 h olarak sayılarak belirlendi. Sağ panel: Koşullu TIVA media, kaplamadan sonra 48 saat sonra (sol panelde) 4 grup geçitten 3 melanosit kültürü elde edildi. Daha sonra, eşit sayıda pasaj 3 melanosit 4 gruba alındı, her biri şartlı ortama sahip. Melanosit proliferasyonunda negatif kontrole göre göreceli katlama değişiklikleri, kaplamadan sonra melanosit sayısı 24 saat ve 48 h olarak sayılarak belirlendi. (A-J) Tüm deneyler 3 kez tekrarlanmıştır, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.005. Görüntülerdeki tüm Çubuklar 100 μm'yi temsil ediyor. Şekil Mi ve ark.16'dandeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Yeni yöntem kullanılarak yalıtılmış melanositlerin karakterizasyonu. (A) Yeni veya konvansiyonel yöntem kullanılarak hazırlanan melanositlerde MITF (kırmızı) immünororesans boyama temsili görüntüler. DAPI çekirdekleri (mavi) lekeleri. (B) Hücre peletleri yeni yöntemle hazırlanan melanositlerden toplanmış ve forskolin (FSK) veya DMSO aracı ile 2 gün boyunca kontrol (con) olarak tedavi edilmiştir. Tüm ölçek çubukları 100 μm'yi temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan protokol yeni bir yayın16dayanmaktadır. Yeni yöntemle en iyi sonuçları elde etmek için aşağıdaki kritik adımlara dikkat edilmelidir. İlk olarak, epidermis ve dermis başarılı ayrılması çok önemlidir. Dermis epidermisini ayırmak için neşterin daha ayrıntılı ve kolay çalışmasını sağlamak için neşter bıçağı kullanarak yetişkin sünnet derisi dokularını 3-4 mm genişliğinde şeritler halinde kesin. İkinci olarak, bu iki tabakayı ayırırken dermis kontaminasyonundan kaçınılmalıdır, çünkü dermal fibroblastlar melanosit kültür ortamında da büyüyebilir. Üçüncü olarak, tripsin sindirim adımı 30 dk'dan az olmalıdır; aksi takdirde, izole hücrelerin canlılığını önemli ölçüde azaltacaktır.
Bu yeni yöntem, melanosit izolasyonu için gereken süreyi önemli ölçüde kısaltır. İnsan epidermal melanositler melanin üretir, bu da cildi güneş ışınlarının zarar görmesinden korur. Eisinger ve Marko epidermis5insan melanosit kültürü için ilk pratik yöntem önerdi. En önemlisi, kullanılan dokular genellikle yeni doğan bebeklerden gelir ve yetişkin cilt dokularından primer melanositleri izole etmek çok zordur. Rho-ilişkili protein kiaz inhibitörü Y-27632 önemli ölçüde epidermal kök hücreizolasyonu etkinliğiniartırır 11-13. Ayrıca, biz de Y-2763210,,11varlığında deri dokularından insan primer epidermal hücreleri izole etmek için bir yöntem bildirdi. Bu protokolde, Y-27632'nin primer melanositlerin verimini verimli bir şekilde artırdı. Konvansiyonel yöntemi kullanarak düşük hücre kurtarma hızına sahiptir ve melanositler için kültür yaklaşık 3-4 hafta geçiş için yeterli sayıda büyümek gerekir. Tiva büyüme ortamına Y-27632'nin eklendiği bu yeni yöntem melanosit verimini yaklaşık beş kat artırdı ve elde edilen melanositler normal olarak çoğalabilir. Biz de ticari bir ortam kullanarak yeni yöntem test ve benzer sonuçlar bulundu. Söz konusu mekanizma ile ilgili olarak, yeni bir çalışma da melanosit izolasyon verimliliğini artırmak için Y-27632 etkisi keratinositler16esas olarak oluşur gösterdi.
Daha da önemlisi, yeni yöntemi kullanarak normal fonksiyonlu saf melanositler elde ettik. Pasaj 1 (P1) melanositler ilk pasajdan sonra saf melanositelde edildiğini gösteren MITF ifadesi için neredeyse tüm lekeli edildi. Yüksek büyüme potansiyeline sahip primer melanositler biyolojik araştırmalar ve klinik uygulamalar için çok önemlidir. Yeni yöntem kullanılarak izole edilen melanositler forskolin ile tedaviden sonra pigmente indüklenebilir, döngüsel AMP düzeylerini artıran adenilat siklaz bir aktivatör, Bu melanositler normal çalışabilir gösteren, pigmentasyon defektleri ve melanom çalışmaları için yararlı olacaktır14.
Özetle, yetişkin cilt dokularından primer melanositleri izole etmek için son derece etkili bir yöntem başarıyla oluşturulmuştur. Bu geliştirilmiş yöntem biyolojik araştırmalar ve klinik uygulamalar için hızlı bir şekilde melanosit yeterli sayıda sağlamak için katkıda bulunabilirsiniz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Tüm yazarlar çatışmanın çıkarı olmadığını beyan etmez.
Acknowledgments
Bu çalışma Çin Ulusal Anahtar Araştırma ve Geliştirme Programı (2017YFA0104604), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Genel Programı (81772093), Askeri Lojistik Araştırma Projesi (AWS17J005), Shandong Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (ZR2019ZD36) Anahtar Programı tarafından desteklenmiştir. ) ve Shandong Eyaleti Temel Araştırma ve Geliştirme Programı (2019GSF108107) X.W. Guangdong Temel ve Uygulamalı Temel Araştırma Vakfı (2019A1515110833) ve Shandong Üniversitesi Temel Araştırma Fonları (2019GN043) J.M.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa fluor-594 donkey anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | A21203 | For Immunofluorescence |
| Alexa fluor-594 donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | R37119 | For Immunofluorescence |
| Cell Culture Dish | Eppendorf | 30702115 | For cell culture |
| Cell Strainer | Corning incorporated | 431792 | Cell filtration |
| 15 mL Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifuge |
| 50 mL Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifuge |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026333 | For cell incubating |
| Constant Temperature Shaker | Shanghai Boxun | 150036 | For water bath |
| DAPI | Abcam | ab104139 | For Immunofluorescence |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | For melanocyte isolation |
| DMEM | Thermo Scientific | C11995500 | Component of neutralization medium |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1AC5 | Component of neutralization medium |
| Fluorescence microscope | Olympus | 5E44316 | For Immunofluorescence |
| Forskolin | MCE | HY-15371 | Induce pigmentation |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | melanocyte culture medium |
| Ham's F12 | Thermo Scientific | 11330032 | melanocyte culture medium |
| Inverted microscope | Olympus | 5C42258 | For cell microscopic observation |
| 3-isobutyl-1-methyl xanthine (IBMX) | Sigma | 17018 | melanocyte culture medium |
| mouse anti-human MITF | Abcam | ab12039 | For Immunofluorescence |
| Na3VO4 | Sigma | S6508 | melanocytes culture medium |
| N6,2'-O-dibutyryladeno-sine 3',5'-cyclic monophosphate (dbcAMP) | Sigma | D0627 | melanocyte culture medium |
| 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (TPA) | Sigma | 79346 | melanocyte culture medium |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
| rabbit anti-human Ki-67 | Abcam | ab15580 | For Immunofluorescence |
| Phosphate buffered solution | Solarbio Life Science | P1020-500 | Washing solution |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004380 | Cell centrifugation |
| TC20TM automated cell counter | Bio-Rad | 1450102 | Automatic cell counting |
| 0.05% Trypsin | Life Technologies | 25300-062 | For melanocyte dissociation |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | For melanocyte isolation |
References
- Costin, G. E., Hearing, V. J. Human skin pigmentation: melanocytes modulate skin color in response to stress. FASEB Journal. 21 (4), 976-994 (2007).
- Battyani, Z., Xerri, L., Hassoun, J., Bonerandi, J. J., Grob, J. J. Tyrosinase gene expression in human tissues. Pigment Cell Research. 6 (6), 400-405 (1993).
- Michaloglou, C., et al. BRAFE600-associated senescence-like cell cycle arrest of human naevi. Nature. 436 (7051), 720-724 (2005).
- Hu, F., Staricco, R. J., Pinkus, H., Fosnaugh, R. P.
- Eisinger, M., Marko, O. Selective proliferation of normal human melanocytes in vitro in the presence of phorbol ester and cholera toxin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (6), 2018-2022 (1982).
- Hirobe, T. Role of keratinocyte-derived factors involved in regulating the proliferation and differentiation of mammalian epidermal melanocytes. Pigment Cell Research. 18 (1), 2-12 (2005).
- Halaban, R., et al. Basic fibroblast growth factor from human keratinocytes is a natural mitogen for melanocytes. Journal of Cell Biology. 107 (4), 1611-1619 (1988).
- Kunisada, T., et al. Keratinocyte expression of transgenic hepatocyte growth factor affects melanocyte development, leading to dermal melanocytosis. Mechanisms of Development. 94 (1-2), 67-78 (2000).
- Hirobe, T., Shinpo, T., Higuchi, K., Sano, T. Life cycle of human melanocytes is regulated by endothelin-1 and stem cell factor in synergy with cyclic AMP and basic fibroblast growth factor. Journal of Dermatological Science. 57 (2), 123-131 (2010).
- Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (2), 1251-1255 (2018).
- Liu, Z., et al. A simplified and efficient method to isolate primary human keratinocytes from adult skin tissue. Journal of Visualized Experiments. (138), e7862 (2018).
- Terunuma, A., Limgala, R. P., Park, C. J., Choudhary, I., Vogel, J. C. Efficient procurement of epithelial stem cells from human tissue specimens using a Rho-associated protein kinase inhibitor Y-27632. Tissue Engineering Part A. 16 (4), 1363-1368 (2010).
- Cerqueira, M. T., Frias, A. M., Reis, R. L., Marques, A. P. Interfollicular epidermal stem cells: boosting and rescuing from adult skin. Methods in Molecular Biology. 989, 1-9 (2013).
- Zhou, Q., et al. ROCK inhibitor Y-27632 increases the cloning efficiency of limbal stem/progenitor cells by improving their adherence and ROS-scavenging capacity. Tissue Engineering Part C, Methods. 19 (7), 531-537 (2013).
- Yokoyama, S., et al. Pharmacologic suppression of MITF expression via HDAC inhibitors in the melanocyte lineage. Pigment Cell & Melanoma Rresearch. 21 (4), 457-463 (2008).
- Mi, J., et al. A ROCK inhibitor promotes keratinocyte survival and paracrine secretion, enhancing establishment of primary human melanocytes and melanocyte-keratinocyte co-cultures. Pigment Cell & Melanoma Research. 33 (1), 16-19 (2020).
