Передний генетический экран, основанный на высоте Ca2 “ в качестве считывания, приводит к выявлению генетических компонентов, участвующих в зависимых от кальция сигнальных путей в растениях.
Передние генетические экраны были важными инструментами в объективной идентификации генетических компонентов, участвующих в нескольких биологических путей. Основой экрана является создание популяции мутантов, которые могут быть проверены с фенотипом интереса. EMS (сульфонат этилового метана) является широко используемым алкилатированием для индуцирования случайных мутаций в классическом переднем генетическом экране для выявления нескольких генов, участвующих в том или ином процессе. Цитосорический кальций (Ca2″)высота является ключевым ранним сигнальным путем, который активируется при восприятии стресса. Однако личность рецепторов, каналов, насосов и транспортеров Ca2 “по-прежнему неуловимы во многих системах исследования. Aequorin является клеточным кальция репортер белка изолированы от Aequorea Виктория и стабильно выражается в Arabidopsis. Используя это, мы разработали передний генетический экран, в котором мы EMS-мутагенизированные трансгенные аекворин. Семена из растений-мутантов были собраны (M1) и скрининг на фенотип интереса был проведен в сегрегации (M2) населения. Используя 96-хорошо высокопроизводительный протокол измерения Ca2, можно определить несколько новых мутантов, которые имеют различную реакцию кальция и измеряются в режиме реального времени. Мутанты с фенотипом интереса спасаются и распространяются до получения гомозиготной популяции растений-мутантов. Этот протокол обеспечивает метод для передних генетических экранов в Ca2 “репортер фон и определить роман Ca2 ” регулируемых целей.
Изменение в цитозолических кальция (Ca2 “)концентрация на восприятие биотического или абиотического стимула является хорошо изучены раннего сигнализации событие, которое активирует многие сигнальные пути1,2,3,4. Клетка в его базальном состоянии отдыха поддерживает более низкую концентрацию Ca2 “в цитозоле и секвестраторов избыток Ca2 “ в различных внутриклеточных органелл и внеклеточной апопласт, ведущих к крутой Ca2 “градиент5,6. При восприятии сигнала, Ca2 “уровни поднимаются в цитозоле из-за притока Ca2 “ из внеклеточных и / или внутриклеточных источников и генерировать стимулы конкретных подписи кальция7,8,9. Ca2 “высоты в цитосол активируются многими стимулами, но специфика поддерживается различных магазинов, выпускающих Ca2 “,уникальный Ca2 “ подпись и соответствующие белки датчика10,11.
Использование алкилатового агента, этил-метанового сульфоната (ЭМС) для мутагенеза является мощным инструментом в классических передних генетических экранах для выявления нескольких независимых генов, участвующих в процессе. EMS является химическим мутагеном, преимущественно вызывающим C к T и G к переходу случайным образом по всему геному и производит 1 bp изменение в каждых 125 кб генома. EMS mutagenesis вызовет изменения ≈1000 однобазовой пары, либо вставки / удаления (InDel) или одного нуклеотида полиморфизма (SNP) на геном12. МУТАЦИи, индуцированные EMS, представляют собой множественные точечные мутации с частотой мутаций от 1/300 до 1/30000 за локус. Это уменьшает количество растений M1, необходимых для поиска мутации в данном гене. Диапазон популяций семян M1 2000-3000 обычно используется для получения мутаций, представляющих интерес в Arabidopsis thaliana13,14.
Aequorin трансгенитики являются Arabidopsis Колумбия-0 (Col-0) экотип растений, выражающих p35S-apoaequorin (pMA’2) вцитозоле 15. Aequorin является Ca2 “связывающий белок, состоящий из апопротеина и протезной группы, состоящей из молекулы люциферина, коэлентеразин. Связывание Ca2 “к aequorin, который имеет три Ca2 “ связывающих EF-руки сайтов, приводит к coelenterazine окисляется и циклизируются, чтобы дать диоксетанон промежуточных, а затем конформационное изменение белка сопровождается выпуском двуокиси углерода и синглет-возбужденных coelenteramide16. Coelenteramide так производится испускает синий свет(no max, 470 нм), которые могут быть обнаружены люминесометр17. Таким образом, чрезвычайно быстрые высоты Ca2 можно измерять в режиме реального времени и использовать для быстрого перемотки на задние экраны. Этот протокол направлен на использование специфичности кальция ответ для выявления новых ключевых игроков, которые участвуют в Ca2 “подпись. Для достижения этой задачи мы используем МУТагенез EMS в трансгенном акурерине и идентифицируем SNPs, связанные с измененной сигнализацией Ca2. Протокол определяет мутантов, которые не показывают или уменьшены Ca2 “высоты при добавлении стимулов. Эти мутанты могут быть отображены для определения генов, ответственных за ответ Ca2. Метод применим к любому виду жидких стимулов в растениях, что приводит к ca2 “высота. Так как высота Ca2 является одним из первых ответов в пути сигнализации защиты растений, идентификация компонентов реагирования вверх по течению может обеспечить кандидатов на генную инженерию для разработки устойчивых растений.
EMS mutagenesis является мощным инструментом для генерации мутаций в популяции. Классические передние генетические экраны с использованием EMS были эффективным инструментом для выявления новых генов по двум основным причинам: во-первых, они не требуют каких-либо предварительных предположени…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим Национальный институт исследований генома растений – Фитотронный фонд для роста растений, Bombay Locale за видеосъемка, и Департамент биотехнологии- eLibrary consortium за предоставление доступа к электронным ресурсам. Эта работа была поддержана Департаментом биотехнологии, Индия через Национальный институт исследования генома растений Основной Грант, Макс Планк Gesellschaft-Индия Партнерская группа программы; и стипендию CSIR-Junior Research fellowship (до D.M и S.M) и Кафедра биотехнологии-младшего научно-исследовательского стипендий (к Р.П.).
24 well tissue culture plate | Jetbiofil | 11024 | for growing seedlings |
96 well white cliniplate | Thermo Scientific | 9502887 | for luminometer measurements |
Aequorin | |||
Agropet | Lab Chem India | for plant growth | |
Calcium chloride | Fisher Scientific | 12135 | for discharge solution |
Coelenterazine | PJK | 55779-48-1 | prosthetic group for aequorin |
Ehtylmethane sulfonate | Sigma Aldrich | M0880-5G | for seed mutagenesis |
Ethanol | Analytical reagent | 1170 | for discharge solution |
Hydrochloric acid | Merck Life Sciences | 1.93001.0521 | sterlization solution |
Hydrogen peroxide | Fisher Scientific | 15465 | as stimulus for Calcium elevation |
Luminoskan ascent | Thermo Scientific | 5300172 | aequorin luminescence measurement |
MES buffer | Himedia | RM1128-100G | plant growth |
Murashige and skoog media | Himedia | PT021-25L | plant growth |
Sodium hydroxide | Fisher Scientific | 27805 | for neutralizing EMS |
Sodium hypochlorite | Merck Life Sciences | 1.93607.5021 | sterlization solution |
Sodium thiosulfate | Fisher Scientific | 28005 | for seed washing in step 1.6 |
soilrite | Lab Chem India | for plant growth | |
Square pots | Lab Chem India | for plant growth | |
Sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | plant growth |
Taxim | Alkem | 7180720 | for seedling rescue |