Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

I nærheden af samtidig laserscanning konfokale og atomic force mikroskopi (Conpokal) på levende celler

Published: August 11, 2020 doi: 10.3791/61433
Automatic Translation
1, 2, 3,4, 2,4, 1
1Department of Mechanical Engineering, University of Kentucky, 2Department of Chemistry, University of Kentucky, 3Department of Physiology, University of Kentucky, 4UK Light Microscopy Core, University of Kentucky

Summary

Præsenteret her er protokollen af Conpokal teknik, som kombinerer konfokale og atomare kraft mikroskopi i et enkelt instrument platform. Conpokal giver samme celle, samme region, nær samtidig konfokale billeddannelse og mekanisk karakterisering af levende biologiske prøver.

Abstract

Teknikker til rådighed for mikro- og nano-skala mekanisk karakterisering er eksploderet i de sidste par årtier. Fra videreudvikling af scanning og transmission elektron mikroskop, til opfindelsen af atomare kraft mikroskopi, og fremskridt i fluorescerende billeddannelse, har der været betydelige gevinster i teknologier, der gør det muligt at studere små materialer. Conpokal er en portmanteau, der kombinerer konfokal mikroskopi med atomare kraft mikroskopi (AFM), hvor en sonde "stikker" overfladen. Selv om hver teknik er yderst effektiv til den kvalitative og / eller kvantitative billedsamling på egen hånd, Conpokal giver mulighed for at teste med blandet fluorescens billeddannelse og mekanisk karakterisering. Designet til næsten samtidig konfokal billeddannelse og atomare kraft sondering, Conpokal letter eksperimenter på levende mikrobiologiske prøver. Den ekstra indsigt fra parret instrumentering giver co-lokalisering af målte mekaniske egenskaber(f.eks.elastisk modulus, vedhæftning, overfladetydlighed) med subcellulære komponenter eller aktivitet, der kan observeres ved konfokal mikroskopi. Dette arbejde giver en trin for trin protokol for driften af laserscanning konfokale og atomare kraft mikroskopi, samtidig, for at opnå samme celle, samme region, konfokale billeddannelse, og mekanisk karakterisering.

Introduction

Mikro- eller nanoskala mekaniske evalueringsværktøjer anvendes ofte til at afdække deformationsegenskaberne på enkeltcelle- eller mikroorganismeniveau, mens der anvendes separate mikroskopiske værktøjer med høj opløsning til at visualisere delcellulære processer og strukturelle træk. Conpokal, er kombinationen af laserscanning konfokal mikroskopi og atomare kraft mikroskopi (AFM) i en enkelt instrumental platform. Conpokal-teknikken blev først implementeret i et ikke-biologisk polymersystem, hvor målet var at bestemme vedhæftning, elasticitet og overfladespænding af hårde overflader i kontakt med bløde overflader. Konfokale billeder gav en visuel gengivelse af, hvordan polymeren deformerer, klæber og frigiver fra den hårde sonde1,2. Fra polymerer til biologiske prøver, denne teknik giver mulighed for næsten samtidige levende celle eller mikroorganisme konfokal billeddannelse og AFM.

Ændringer i cellerelasticiteten har været impliceret i patogenesen hos mange sygdomme hos mennesker3 herunder vaskulære lidelser4Malaria5,6, seglcelle anæmi7Gigt8Astma9, og kræft6,10,11,12,13,14,15. Fælles teknikker til at måle mekanikken i celler omfatter brugen af magnetiske perler16,17, optisk pincet18,19, micropipette aspiration8,20,21,22, og AFM11,23,24,25,26. Siden anvendelsen af AFM på levende celler, er det let blevet tilpasset til at karakterisere celletopografi27,28 samt mekaniske egenskaber11,24,29,30,31 med nanoskalapræcision. AFM er blevet yderligere tilpasset til mikrorheologi32,33, frekvensmodulering34,35, og krybe25,36,37 forsøg med at studere de viskoelastiske egenskaber af forskellige cellelinjer. Anvendelsen af en passende nanokontaktmodel er afgørende for udvindingen af kvantitative elasticitetsværdier fra afm-producerede kraftindrykningsmålinger1,2. AFM-undersøgelser, der undersøger cytoskeletals lægemidlers indflydelse på celleryasticiteten, har vist, at den elastiske modulus er stærkt påvirket38. Baseret på de elastiske modulus målinger, mange forskere har vist, at kræftceller er blødere end deres ikke-transformerede modparter11,38,39. Øget deformabilitet sandsynligvis spiller en fremtrædende rolle i evnen af kræftceller til at metastasere og infiltrere væv40. En sådan adfærd er reguleret af ændringer i den cytoskeletale organisation af celler38,41,42. Ud over kræft, en anden klasse af mekanisk-afhængige sygdomme er luftvejssygdomme. For eksempel, akut respiratorisk stress syndrom påvirker flere og flere mennesker hvert år. Det har vist sig, at når patienter sættes på mekanisk ventilation, med høje koncentrationer af ilt, kan deres tilstand forværres43. I en række undersøgelser observere alveolær epitel makrofager med AFM, fandt forskerne, at tilsætning af en ilt-rige miljø øget stivhed af celler på grund af actin dannelse; et godt eksempel på den indvirkning, som AFM har på vores detaljerede forståelse af atmosfærisk miljømæssig indflydelse på respiratoriske funktion på celleniveau og i sidste ende, menneskelig helbredelse og sundhed44,45,46. Epitelcellestivhed under migration mod et sår kan også vurderes via AFM, og at der opstår en variation i elastisk modulus for at signalere fremtidig cellespredning47,48. Derfor er der et praktisk behov for at måle cellemekanik kvantitativt for at forstå, hvordan syge celler adskiller sig fra, og interagere med, sunde.

AFM bruges også til at studere klæbende egenskaber og overfladestruktur. En atomare kraft mikroskop har en række forskellige tilstande til at indsamle oplysninger om en prøve ved hjælp af kontakt mekanik. For levende biologiske prøver er to af de primære mål at opnå kvantitative mekaniske egenskabsværdier(f.eks. elastiskmoduli, klæbekræfter) samt kortoverfladehøjde. Disse tilstande omfatter trykke tilstand (også kendt som intermitterende kontakt), som opretholder en konstant cantilever amplitude intermitterende kontakt prøven overflade og kontakt tilstand, som hæver eller sænker cantilever at opretholde en konstant afbøjning49. Vedhæftning kort kan indsamles ved hjælp af kraft kortlægning på AFM-systemet. Den cantilever indrykning prøven til en vis kraft og trækkes derefter tilbage. Den kraft, der modstår tilbagetrækning, måles af detektoren for at generere en kraftforskydningsgraf. Vedhæftningskraften er den maksimale kraft, der måles under tilbagetrækningen. Overflademorfologi giver et detaljeret overblik over prøven på mikro- eller nanoniveau. Den cantilever fuldender en raster scanning på tværs af prøven baseret på indrykning og afbøjning fanget af bevægelsen af cantilever på hver pixel, afslører mikro- og nano-størrelse funktioner. Med AFM, størrelsen af små funktioner såsom peptidoglycan struktur50, polymer kædejustering51, flagella52, laellipodia53, og filipodia54 kan måles. Mens AFM magt ligger i kraft-forskydning kurver og ikke-optiske topologiske billeder, konfokale mikroskopi tilbyder detaljerede billedbehandling af fluorescerende mærkede prøver.

Konfokal laserscanningmikroskopi (CLSM) er en dominerende teknik til billeddannelse af levende celler, faste celler og væv55,56,57. CLSM har været ansat til biologisk billeddannelse siden 1955, dvs. Mens arbejdsprincippet for konfokale mikroskoper (dvs.afvisning af ud af fokus lys gennem et pinhole) har været stort set det samme, den tekniske gennemførelse er blevet megetforskelligartet 56,57,58,60. Konfokal billeddannelse kan implementeres via multipunktsscanning, som i et roterende disksystem61, punktscanning af en enkelt laserstråle, som i linjescanning62, eller billeddannelse af punktspredningsfunktionen med efterfølgende pixelskifte via et multidetektorelement57. De seneste fremskridt, der udvider nytten af konfokale billedbehandling omfatter laserscanning kapacitet, høj hastighed resonans scanning, og høj følsomheddetektorer 63,64,65. Fordelen ved, at alle konfokale systemer har over widefield mikroskoper er evnen til at udføre optisksektion i z aksen med flere detaljer, især i tykke prøver. Widefield-mikroskoper, der bruger kamerabaseret detektion, indsamler lys, der udsendes fra brændplanet, og samtidig lys, der udsendes overalt i belysningsvejen. Ved at lukke pinhole, på bekostning af at reducere signalet, både den aksiale og laterale opløsning kan øges66. I CLSM opbygges billeder pixel for pixel gennem indsamling af emissionssignaler, da en excitationslaser scannes på tværs af et x-y synsfelt. Indsamling af flere x-y-planer langs prøvens z-akse kan derefter bruges til at rekonstruere den 3-dimensionelle arkitekturi prøven 57,67. Konfokal mikroskopi i forbindelse med indførelsen af fluorescerende proteiner, har revolutioneret vores forståelse af cellebiologi68. For eksempel er det blevet et vigtigt redskab i neurovidenskab69. CLSM bruges regelmæssigt til at observere renset væv, og for at opnå omfattende billeder af immun farvede hjerne og neuronal netværk arkitektur70. Denne applikation har resulteret i ny indsigt i synaptiske kontakter og kommunikation blandt neuroner og gliaceller i hjernen71. Fra hjerneceller til vesikler understøtter fluorescerende farvningsprotokoller inspektion og indfangning af cellefunktioner via konfokal mikroskopi for fremskridt inden for terapeutisketeknikker 72,73.

Selv om de er imponerende og alsidige værktøjer individuelt, kombinationen af konfokale og atomare kraft mikroskopi (Conpokal) giver forskerne mulighed for entydigt korrelere topografiske og mikromekaniske cellulære / væv egenskaber med observation af forskellige cellulære organeller og deres respektive dynamik. Parret instrumentering giver brugerne mulighed for at, hovedsagelig, "se" hvad de er sondering; en kæmpe fordel i forhold til en teknik på egen hånd. Med Conpokal overlejres kraftkortlægning gennem AFM på konfokale billeder for at korrelere cellestivhed, vedhæftning eller morfologi til den cytoskeletale struktur i prøven, f.eks. Det overordnede mål med Conpokal-metoden er at skabe en platform for forskere til at studere levende prøver på en kortfattet og effektiv måde, der giver både billed- og materialeejendomsdata på en enkelt platform. I dette arbejde demonstrerer vi driften af Conpokal, herunder korrekt udvælgelse og forberedelse af prøver, instrumentopsætning, cantilever kalibrering og giver retningslinjer for vellykket fejlfinding. Efter protokollen, giver vi repræsentative resultater, der omfatter vellykkede bakterier og celle AFM højde kortlægning, bakterier og celle AFM modulus kortlægning, og konfokal billeddannelse af multi-mærket celler, gennem samme celle konfokale og AFM. Vi afslutter med en diskussion af Conpokal-procedurens kritiske trin, fejlfindingsanbefadninger, teknikbegrænsninger, betydning og fremtidsudsigter for metoden.

Protocol

1. Udarbejdelse af instrumenter, kulturmedier, fade

  1. Tænd for strømkilderne til både konfokalmikroskopet og atomkraftmikroskopet samt alle andre tilknyttede instrumenter eller enheder, der anvendes under Conpokal. Der skal være tilstrækkelig tid til, at instrumenterne kan være termisk ligevægt og stabilisere, før målingerne påbegyndes. Typisk, 1 h er tilstrækkelig.
  2. Forbered en ren, systemgodkendt petriskål med glasbund, og fyld den halvt fuldt, men ikke mere end to tredjedele fuld, med fosfatbuffersalt (PBS) eller lignende klar væske. Denne skål (benævnt "kalibreringsskålen") er adskilt fra prøveskålene og vil blive brugt til at lokalisere og kalibrere atomkraftmikroskopet (AFM) cantilever.
    BEMÆRK: Det er vigtigt, at væsken er klar og har lav autofluorescens for at forhindre interferens med fluorescensspektre. PBS anbefales, fordi det efterligner det biologiske miljø.
  3. Forbered eksperimentelle prøveretter, således at den tilhørende væske har fyldt skålen mindst halvt fyldt. Hvis prøven er fluorescerende, skal du sørge for, at den er tildækket eller på et mørkt sted, indtil det er nødvendigt. Rengør bunden af alle glasretter ved hjælp af linserens og linseservietter.
  4. Opret datalagringsmapper til konfokale og AFM på computerens eller computer-harddiskene.

2. Udvælgelse af celler eller mikroorganismer

  1. For at skabe bakterier lager løsning, inokulere Streptococcus mutans bakterier, ved hjælp af en vaccination loop, i 15 ml Todd Hewitt Gær (THY) natten (for eksponentiel fase) i en 5% CO2 inkubator.
  2. 1 h før natten inkubation er færdig, pels eksperimentel prøve retter med 1 ml poly-l-lysin opløsning eller nok til at dække glasdelen af glasbundet fad og lad i biosikkerhed kabinet i 1 time. Efter indstilling aspirere poly-l-lysinopløsningen og skyl opvasken 3x med PBS.
  3. Efter 18 - 24 h bakterieinkubation, inokuler THY med 1 ml bakteriel suspension, indtil en optisk tæthed på 0,6 – 0,7 er opnået (typiske værdier for inokulering er 3 ml THY med 1 ml bakteriesuspension pr. skål). Der tilsættes 1 ml ny bakterieopløsning til hver poly-l-lysin-belagt skål og inkuberes i 1 time. I løbet af de sidste 10 minutter tilsættes 1 ml grøn lysstofrørplet (koncentration af 1 μM) til hver skål.
  4. Skyl hver skål 3x med PBS. Fastgør forsigtigt bakterierne med ca. 1 ml 4% paraformaldehydopløsning i 15 minutter ved stuetemperatur inde i et biosikkerhedsskab. Skyl hver skål 3x med PBS efter fiksering.
  5. Opbevar humane embryonale nyrer (HEK) 293 celler i flydende nitrogen. Udfør hurtig optøning ved 37 °C vandbad før plating.
  6. Der tilsættes 1 ml kældermembranmatrixopløsning i cellekulturmedier til hver celleprøveskål og inkuberes (5% CO2) ved 37 °C i 1 time. Aspirer opløsningen og vask opvasken med cellekulturmedier. Plade det krævede antal HEK 293 celler(f.eks.100.000 celler pr. 35 mm skål) og tilsæt 2 ml cellekulturmedier. Derefter inkuberes (5% CO2) cellerne ved 37 °C i 48 timer.
  7. Efter 48 timer tilsættes 2 μL fluorescerende mikrotubulitcytoskelettonfarve (koncentration på 1x) til hver celleprøveskål og inkuberes i 30 min. Aspirere opløsningen indeholder farvestoffet, vask cellerne 3x med PBS, og tilsæt 2 ml cellekulturmedier.
  8. Der tilsættes 1 μL plasmamembranfarve (koncentration på 10 μM) til prøveretterne og inkuberes i 30 minutter. Opløsningen, der indeholder farvestoffet 3x, vaskes med PBS, og der tilsættes 2 ml cellekulturmedier.
  9. Kontrastain kernen ved tilsætning af 1 μL nukleinsyrefarvestof (koncentration af 10 μM) opløsning til prøveretterne og inkuberes i 30 minutter. Opløsningen, der indeholder farvestoffet 3x, vaskes med PBS, og der tilsættes 2 ml kulturmedier.

3. AFM-proceduren

  1. Åbn atomkraftmikroskopet (AFM) ved at klikke på softwareikonet på computeren.
  2. Roter til eller indsæt et luftmål med lav forstørrelse (anbefales 10x eller 20x). En lang arbejdsafstand på 5 mm eller mere er gavnlig under spidssænkning og kalibrering.
  3. Monter det valgte celleprøvestad, hvis det ikke allerede er installeret. For levende prøver, skal du bruge en skål varmelegemning til at holde prøven ved den ønskede temperatur.
  4. Den rene, systemgodkendte petriskål fyldes halvt fyldt med PBS (klar i trin 1.2) eller lignende klar væske (kalibreringsskål). Hvis prøvestadiet har indbyggede hægter, skal du bruge disse, ellers skal du bruge vakuumfedt til at stabilisere prøven.
  5. Vælg en passende AFM cantilever for den ønskede dataindsamling og installere den efter nedenstående trin.
    1. Ved hjælp af handsker monteres AFM-chippen i glasblokken ved hjælp af AFM-chipmonteringsfasen, pincet og en lille skruetrækker. Placer forsigtigt AFM-chippen på glasblokken, og orientere den således, at den er centreret. Den cantilever, plus en meget lille del af AFM chip, bør være i den synlige, ikke-uigennemsigtige del af monteringsblokken.
    2. Fastgør spån med skruetrækkeren ved at stramme skruen, indtil chippen sidder tæt mod glasblokken. Kontroller, at AFM cantilever er orienteret korrekt ved hjælp af et stereomikroskop eller en håndholdt spyglas. Juster efter behov. Når korrekt orienteret, placere glasblok i AFM hovedet i den korrekte retning og låse den på plads.
      BEMÆRK: AfM-chippens orientering i glasblokken er vigtig, så systemlaserne sigter mod bagsiden af cantilever og reflekterer korrekt over på fotodetektoren. Pas på ikke at overspænde skruerne under placeringen, da denne procedure kan få AFM-chippen, cantilever eller spidsen til at gå i stykker.
  6. Ved hjælp af brightfield mulighed for konfokale mikroskop, finde bunden af kalibrering parabol ved hjælp af fokus knappen. Vær opmærksom på denne z højde som den værdi, hvor bunden af skålen er placeret med hensyn til mikroskop mål.
  7. Brug AFM-systemets motoriske kontrolpanel på den computer, der driver z steppermotorerne, og flyt AFM-cantilever væk fra prøven op mod 2000 μm.
  8. Ved hjælp af begge hænder skal afm-hovedet med AFM-chippen forsigtigt anbringes på prøvescenen og sikre, at hvert af de lodrette punkter på AFM-hovedet er solidt indstillet i deres udpegede riller på AFM-scenen. Når AFM hovedet er på plads, visuelt se, hvor tæt cantilever indehaveren er til fadet. Hvis det ser ud til at være for tæt på, således at AFM-hovedet er i kontakt med eller inden for 1 mm fra prøveskålens top, skal det bakkes ud ved hjælp af z steppermotorerne, før AFM-spidsen sænkes mod prøven.
  9. Brug brightfield belysning, langsomt sænke AFM chip til bunden af glasskålen ved hjælp af z stepper motor kontrolpanel på AFM software. Find de manuelle mikrometer, der styrer x-y eller i plan bevægelse af AFM hovedet på instrumentet platform. Juster placeringen af AFM cantilever inden for synsfeltet ved at korrigere AFM hovedet som cantilever kommer i betragtning.
    1. Da placeringen med hensyn til bunden af skålen er ukendt på dette tidspunkt, lavere med trin på 100 - 200 μm for at undgå at smadre AFM spidsen i petriskålen. Typisk skal spidsen sænkes 800 – 2000 μm. Da spidsen er sænket, se for en skygge, der skal vises på mikroskop software visning, hvilket indikerer AFM spidsen kommer tættere på bunden af skålen.
    2. Reducer intervallerne til 20 – 50 μm. Sørg for at justere udseendet af kamerabilledet (LUTs), da spidsen sænkes ned i skålen ved hjælp af LUTs-panelet på konfokalsoftwaren. Fortsæt med at sænke AFM-spidsen ved hjælp af små trin, indtil det for det meste er i fokus.
    3. Sørg for, at spidsen er mørk nok, så den generelle form af det kan ses og centreret i synsfeltet. Sørg også for, at spidsen ser sløret ud, hvilket bekræfter, at den endnu ikke har mødt bunden af skålen.
  10. Juster mikroskopfokuset, så spidsen nu er i fokus, samtidig med at der tages hensyn til målsætningens arbejdsafstand. Før du går over til en højere forstørrelsesmålsætning, skal du bruge mikroskopmålingsværktøjet til at indsamle bredden og længden af AFM-cantilever ved at få adgang til måleværktøjspanelet på konfokale software. Vær opmærksom på disse målinger.
    BEMÆRK: Det er vigtigt ikke at gå ned i bunden af prøveskålen, hvilket også kan medføre, at prøveskålen kommer i kontakt med AFM-spidsen, hvilket potentielt kan beskadige den.
  11. Hvis det er til stede, skal du fjerne laserlysfilteret og sikre, at AFM-laseren er tændt, så laserlyset bliver synligt i optikken.
    1. Brug laserjusteringen ringer op, og flyt laseren ind i synsfeltet og i nærheden af AFM-spidsen. Når laseren er på dette sted, skal du udskifte laserlysfilteret.
    2. Brug laser justering ringer, skal du placere laseren på bagsiden af, hvor AFM spidsen er placeret på cantilever. På dette tidspunkt skal laserjusteringspanelet læse et sumsignal, der er større end 0,0 V. Hvis der ikke opnås et sumsignal, skal du justere spejlet ved hjælp af den manuelt styrede spejlknap, indtil et sumsignal på mere end 0,0 V lyder på skærmen.
    3. Flyt laseren i små mængder i alle retninger på AFM cantilever indtil det maksimale sumsignal er opnået, men positionen er på AFM spidsen. Når laserpositionen er indstillet, skal du nulstille den lodrette og laterale afbøjning ved hjælp af de manuelt styrede afbøjningsskive.
    4. Overhold laserjusteringspanelet på AFM-softwaren, og ved hjælp af de lodrette og laterale afbøjningsknapper på AFM-hovedet skal du justere detektoren, så målet er centreret (rød prik i midten af trådkorset), og der er ingen lodret eller lateral afbøjning.
  12. Åbn kalibreringsvinduet i AFM-softwaren. Indtast alle eksperimentspecifikke oplysninger. Før kalibrering skal konfokale mikroskoplyskilden slukkes, og AFM-kabinettet lukkes, hvis det er relevant, for at dæmpe eventuel støj fra rummets lys eller rumvibrationer. Tryk derefter på kalibreringsknappen for automatisk at lade systemet kalibrere spidsen. Når kalibreringen er færdig, vil cantileverens stivhed (N/m) og dens følsomhed (nm/V) blive forsynet i kalibreringspanelet. Bemærk disse til senere analyse.
  13. Træk AFM-cantilever mindst 2000 μm tilbage med steppermotorerne. Tag AFM hovedet af scenen og fjern kalibreringsskålen. Roter til eller indsæt den ønskede målsætning. Træk målet 10% af arbejdsafstanden tilbage, hvis systemet er programmeret til at opretholde det samme brændplan mellem målsætningerne. Hvis dette er en olie mål, placere en dråbe nedsænkning olie på øjet af målet.
    BEMÆRK: Tilbagetrækningen af målet reducerer sandsynligheden for, at målet kommer i kontakt med prøveskålen under anbringelsen.
  14. For at holde prøveskålen sikkert på plads skal du bruge en vatpind til at påføre små dubs vakuumfedt omkring prøveringens kant inden for prøvefasen eller anvende prøveclips. Prøveskålen ind i prøven ind i prøven ind i prøven.
  15. Når prøven er placeret, roteres den et par gange for at sikre, at skålen forsegles godt, så prøveholderen kan forsegles via fedtet. Hæv målet til bunden af skålen, indtil olien bare væger over øjet af målet.
  16. Brug mikroskopet, uden AFM hovedet på scenen, fokusere billedbehandlingssystemet, så prøven er i fokus. Bemærk denne z højde for reference.
  17. Afm-hovedet skal forsigtigt udskiftes på platformen.
  18. Brug z steppermotorerne til at sænke spidsen mod prøven. Når AFM-spidsen sænkes, skal du justere opslagstabellerne (LUT'er) i brightfield-billedet efter behov. Sænk spidsen, indtil den er næsten skarp. Brug de manuelt betjente AFM-spidspositionsmikrometre til at flytte AFM-hovedet, så AFM-spidsen er i midten eller venstre centreret i synsfeltet.
    BEMÆRK: Da z højden af AFM blev bemærket før i trin 3.6, større skridt kan tages for at sænke AFM spidsen, dog, fedt er blevet tilføjet til bunden af skålen og potentielt olie til målet, så denne værdi er kun for reference. Det anbefales at tage 50 - 100 μm trin og justere mindre som spidsen kommer i fokus
  19. Justere laserpositionen ved hjælp af de manuelle mikrometer på AFM-hovedet. Hvis det er nødvendigt, nulstilles de lodrette og laterale afbøjninger ved at justere de respektive knapper og kalibrere AFM-cantilever i prøveskålen.
    BEMÆRK: Hvis cantilever blev kalibreret i et andet medium end prøven, skal den kalibreres igen i scanningsmediet for at tage højde for en potentiel ændring i brydningsindekset. Derudover kan laseren glide fra bagsiden af cantilever på grund af støj eller temperaturændringer. Laseren og rekalibreret må kun justeres, hvis det er nødvendigt, og i prøveskålen over glasunderlaget, hvis der anvendes en ikke-kontaktkalibrering. Hvis der skal foretages en kontaktkalibrering, skal kalibrere indersiden af kalibreringsskålen ved hjælp af prøvemediet.
  20. For at opnå konfokale mikroskopbilleder af høj kvalitet skal du udskifte det nuværende dæmpende lysfilter med det filter, der blokerer alt AFM laserlys. Dette lysfilter sikrer ingen interferens fra AFM-laserens klare lys.
  21. Brug den automatiserede indflyvningskommandoknap, der typisk angives med en nedadvendt pil, sænk spidsen til bunden af prøveskålen. Angiv scanningens størrelse/område, opløsningen, setpunktet, z-længden og pixeltiden (eller brug de kalibrerede/overtrerede værdier) på kontrolpanelet til billeddannelse, og begynd at scanne.
  22. Når en scanning er færdig, løftes AFM-chippen 50 – 100 μm op, før du navigerer til en ny måleposition i prøveskålen. Når en ny placering er fundet, nærmer glasset, og begynde at scanne igen efter trin 3.21 og 3.22.
  23. Vælg indstillingen Gem automatisk, eller gem hver genereret fil manuelt fra hver enkelt scanning ved at klikke på Gem.

4. Konfokal procedure

  1. Åbn den konfokale betjeningssoftware. Sørg for, at alle tilknyttede eksterne enheder, lyskilder og controllere er tændt og fungerer normalt.
  2. Roter eller indsæt en målsætning med lav forstørrelse (10x eller 20x) for at få vist prøven. Sikre, at målet er i sikker arbejdsafstand fra, hvor prøveskålen vil være, og om nødvendigt at bakke målet om at undgå enhver potentiel kollision af målet med prøven. Ved hjælp af en vatpind skal du dupere vakuumfedt omkring kanten af prøveskålsringen. Hvis du bruger et oliemål, skal du placere en enkelt dråbe nedsænkningsolie på mållinsen
  3. Placer den ønskede prøve i prøvestadiet. Drej prøven omkring et par gange for at sikre, at vakuumfedt har genereret en stram binding til prøvetrinindsatsen eller anvender prøveclips. Hvis du bruger en olie mål, hæve målet til bunden af skålen, så olien bare væger over glasbunden. For at undgå overdreven blegning skal den omgivende belysning minimeres.
  4. Brug brightfield eller epifluorescence tilstande via kameraet eller okularer, finde prøven og ved hjælp af fokus knappen, fokusere på et område af interesse, der indeholder flere celler eller en enkelt celle. Ofte vil synsfeltet inden for det optiske mikroskop være større end x-y scanningsvinduet på AFM-systemet (100 x 100 μm). Foretag justeringer af AFM-positionen inden for det konfokale synsfelt ved hjælp af det motoriske kontrolpanel i AFM-softwaren, så AFM-scanningen og konfokale optik billedler de samme funktioner.
    BEMÆRK: Inden for synsfeltet er der typisk kun nogle få celler, så det er lettere at afgøre, hvilken celle der ønskes at sonde. Som AFM udføres, cellen bliver synlig på AFM software og derfra, brugeren kan lokalisere specifikke regioner af interesse for at sonde.
  5. Hvis det ønskes, tage billeder i lyse felt eller epifluorescens ved hjælp af et kamera eller CLSM tilstande baseret på etiketten af prøven, fokus knapper, og fange knapper på mikroskop software.
  6. Ved hjælp af mikroskopsoftwaren skal du vælge indstillingen eller åbne panelet for at aktivere konfokalefunktioner (f.eks.lasere og efterfølgende parametre). Denne indstilling noteres typisk af laserlinjebølgelængdeværdierne.
  7. Vælg de laserlinjer, der passer til de farvestoffer, der bruges til farvning af prøverne. Tænd for en eller flere laserlinjer for at ophidse og afbilde disse funktioner i eksemplet.
  8. Indstil forstærkningen til en værdi, der optimerer prøverne fluorescens, men begrænser mængden af støj. En typisk startværdi er en gevinst på 70.
  9. Juster lasereffekten for at undgå mættede pixel, men maksimere det dynamiske område. Et typisk startområde for lasereffekten er 1 – 3 %.
  10. Indstil pinhole-størrelsen til 1 luftig enhed for at maksimere opløsningen for den optiske sektion. Hvis prøven er nedtonet, og lasereffekten allerede er høj, skal du åbne pinhole'et for at øge signalet på bekostning af at reducere z-aksens opløsning.
  11. Indstil pixel dvæletid (dvs.scanning hastighed). Start med en 2 μs dvæle tid og om nødvendigt justeres for at afspejle prøven lysstyrke. Vælg pixelstørrelsen/scanningsstørrelsen for den valgte målsætning ved at lade instrumentet beregne det via alternativknappen Nyquist og det valgte antal pixel i billedet.
    BEMÆRK: Længere opholdstider i tykkere prøver kan føre til overdreven blegning, når z stakke indsamles.
  12. Vælg indstillingen Scan på instrumentets software, og begynd dataindsamlingen.
    BEMÆRK: Hvis instrumentet har flere lasere, kan hver især optimeres uafhængigt og derefter køres samtidigt for multi-fluorescerende billeder.
  13. Brug fokusknappen til at zoome ind og ud og finde det optimale synsfelt i prøven.
  14. Tag billeder ved hjælp af systemets Capture-knap, og gem alle de nødvendige filformater for eksemplet på en ønsket placering/mappe på computerens harddisk eller lokal ekstern harddisk.
  15. Fortsæt med at justere forstærkning, lasereffekt, pinhole størrelse, prøveudtagning sats, og andre værdier i overensstemmelse hermed for at optimere billedet. Pixelmætningsindekset kan aktiveres for at kontrollere, om pixel er overmættede. Hvis denne overmætning er til stede, kan forstærkning og lasereffekt justeres for at fjerne mættede pixel. Brug LUT'erne som en vejledning til at foretage specifikke justeringer.
  16. Hvis det er muligt, skal du bruge systemets Nyquist-samplinghastighed, som vises i softwaren som et panel eller en knap, for at sikre, at billederne indsamles ved den maksimale opløsning, der kan opnås.
  17. Aktiver det konfokale system's z stack eller billedvolumensamlingsværktøj. Ved hjælp af en top-til-top-indstilling, med kun én laserlinje, specielt den laserlinje, der belyser en funktion i prøven, den klareste, skal du indstille start- og slutplaner for den mængde, der skal måles.
  18. Brug den foreslåede afstand mellem planer i z stack, som er beregnet til at opfylde Nyquist prøvetagningskriterier for den bedste opnåelige aksial opløsning, som instrumentet og brugte laserlinje.
  19. Når der anvendes flere laserlinjer, skal du bruge den korteste bølgelængde til beregning af afstanden. Når anskaffelsen er færdig, skal du gemme filen i den relevante mappe.
  20. Hvis der findes et forudgående kendskab til prøvens tykkelse, skal du også definere lydstyrken ved at vælge det midterste plan, det, der vises som det lyseste og skarpeste. I denne situation skal du indstille toppen til halvdelen af prøvetykkelsen over det midterste plan og bunden til halvdelen af tykkelsen under det midterste plan.
  21. Når prøvesamlingen i dette synsfelt er afsluttet, eller prøven er bleget, skal du bruge det motoriserede eller manuelt kontrollerede stadie til at finde et andet sted af interesse på prøven og gentage trinnene til billedsamling.

5. Oprydningsprocedure

  1. Sørg for, at alle datafiler, både fra CLSM og AFM, gemmes på de rigtige placeringer.
  2. Træk AFM-chippen tilbage ved hjælp af z steppermotorerne mindst 2000 μm eller den tilbagelagte afstand for at komme til prøveoverfladen. Fjern AFM hovedet fra scenen og læg det omhyggeligt i sin hvilested.
  3. Træk mikroskopmålet tilbage, så den er langt væk fra prøven. Hvis der blev anvendt et oliemål, bør målet trækkes langt tilbage, så der ikke længere er kontakt mellem målet og prøveunderlaget.
  4. Brug handskerne til at fjerne prøven, og fedtet og olien, hvis det er relevant, fjernes fra bunden af prøveskålen. Erhverve en ny, ren, tom petriskål og fylde den med 70% ethanol opløsning en halv til tre fjerdedele fuld. Sæt den i prøveholderen, og afm-hovedet udskiftes, så AFM-chippen kan lægges i blød i ethanolopløsningen i 5 min.
  5. Mens AFM-chippen er i blød, anbefales det at begynde at kopiere eksperimentdataene på en ekstern harddisk. Efter nedsænkning af AFM-chippen i ethanolopløsning i mindst 5 minutter fjernes AFM-hovedet og sættes i hvilested.
  6. Tag AFM-chipholderen af med handsker, og ans anbringe den i monteringsstationen. Fjern forsigtigt AFM-chippen med pincet med gummigreb. Placer den brugte spids tilbage i placeringen af den kasse, den kom fra orienteret off akse til at angive, at det har været brugt. Bemærk, hvilket tip der blev brugt i eksperimentet, til senere brug.
  7. Tag petriskålen fyldt med ethanolopløsningen ud af systemet og bortskaf væsken og skålen. Brug handsker, linse renere, og linse klude, forsigtigt rense olien fra mikroskopet mål efter standard protokoller. Rengør prøveholderen ved at fjerne fedt. Bortskaf alle affaldsmaterialer i henhold til biosikkerhedsprotokoller og returnere værktøjer til deres kendte steder.
  8. Afslut dataindsamlingen fra computeren/computeren, og luk dem ned. Slukke alle instrumenter, tilbehør, eksterne enheder eller andre enheder, der anvendes til eksperimentet.

Representative Results

Conpokal-teknikken er skematisk repræsenteret i figur 1A, og et billede af opsætningen vises i figur 1B. For præcist at lokalisere biologiske strukturer via konfokal mikroskopi med de samme strukturer i AFM er tilpasningen af de to systemer under installationen kritisk. Vælg velrenommerede konfokale og AFM producenter, der er fortrolige med hinandens rumlige krav. Derudover er en vellykket gennemførelse af teknikken afhængig af gode farvning procedurer, immobilisering af den biologiske struktur, og det passende valg af AFM tip. Højden af levende celler ofte udgør en udfordring for AFM billeddannelse. En AFM-scanning over en levende HEK-celle er vist i figur 2A. Højden for denne særlige HEK celle var omkring 10 μm, demonstreret ved linjescanningen i grøn (Figur 2B). En AFM spids med enten nulforskydning (spidsen er i slutningen af cantilever) eller spidsen højde større end cellehøjden(f.eks.spids højde ≥ 10 μm) vil producere et stærkt løst billede af de enkelte celler. Et eksempel på en dårlig scanning på grund af forkert AFM tip valg er inkluderet i figur 2C. I dette billede dukkede sorte pixel op i toppen af cellen, hvilket indikerer, at AFM piezo er uden for området på grund af en stor cellehøjde. Slutningen af AFM cantilever dukkede op i billedet (en afrundet firkant) på grund af spidsforskydning kombineret med utilstrækkelig spidshøjde sammenlignet med cellehøjde. Disse artefakter i AFM billedet angiver en anden AFM tip bør vælges til at billedet cellen.

Effektiv mærkning i fluorescens farvning sammen med den korrekte sonde til levende celle billeddannelse er nødvendig for denne metode. Vi udførte en tre-farve konfokal billede vist i figur 3A med en nuklear plet (fluorescerende blå), en mikrotubule plet (fluorescerende grøn), og en lipofile membran plet (fluorescerende rød). Disse levende cellesonder blev valgt på grund af deres begrænsede spektrale overlapning og deres kompatibilitet med standard filter terninger. Vi har også inkluderet brightfield optiske billede i figur 3B.

Fra AFM, analyse af spidsen fordybninger sammen med en nanomekanisk model, producerer en modulus kort over overfladen. Et eksempel på et modulus kort konstrueret ved hjælp af en Hertz model pasform og en parabolsk profil (radius på 8 nm) for spidsen form er vist overlejret på 3D rekonstruktion af celleform i figur 4A (som er de samme to celler vist i figur 3). Den tilsvarende 3D-projektion af laserkonfokal z-stakken er vist i figur 4B.

Metoden er også velegnet til mindre biologiske strukturer, herunder enkelte bakterier, hvis mikro- og nanoskopiske egenskaber er vanskelige at løse ved hjælp af lysmikroskopi. En on-going undersøgelse udnytter Conpokal teknik til at udforske mekaniske mekanismer i cellevæggen, der påvirker antibiotikaresistens i Streptococcus mutans.74 Manipulation af cellevæg komponenter resulterede i ændringer i morfologi og antibiotikaresistens. Conpokal letter levende, in-solution, dataindsamling(f.eks.overflademorfologi, elastisk modulus, vedhæftningsstyrke og overfladetydstyrke) på samme celleprøver for at koere mekaniske egenskaber med tilstedeværelsen eller fraværet af cellevægkomponenter. Figur 5A, B omfatter en AFM-scanning og målt modulus kort over en Streptococcus mutans bakterie. Bedre opløsning blev opnået på denne skala med AFM end med traditionel konfokal mikroskopi.

Figur 6 indeholder et konfokalt billede af en koloni af Enterococcus fæecalis plettet med en grøn fluorescerende cellestruktur plet, som tillægger cellevæggen. Figur 5 og figur 6 viser, at Conpokal-teknikken finder anvendelse på mikrober ud over eukaryote celler.

Figure 1
Figur 1: Conpokal-opsætningen.
(A) Skematisk af Conpokal teknik. (B) Billede af instrumentopsætningen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Atomkraftmikroskopi af levende celler.
(A)AFM billede af to HEK celler. (B) Højdeprofil (grøn linje i A) af en HEK-celle, der angiver cellehøjden, er ret stor ved 10 μm. (C)Dårlig AFM billede af en astrocyt celle, hvor AFM piezo er uden for rækkevidde på toppen af cellen, og der er tegn på omvendt billeddannelse af cantilever ende. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Konfokal og brightfield mikroskopi af levende celler.
(A) Laserscanning konfokal mikroskopi af levende HEK celler farves med en nuklear plet (fluorescerende blå), en mikrotubule plet (fluorescerende grøn) og en lipofile membran plet (fluorescerende rød). (B) Tilsvarende brightfield optisk billede. Skalastænger er 10 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Sammenligning af 3D-gengivelser af AFM og konfokal mikroskopi af levende HEK-celler.
(A) Modulus kort konstrueret ved hjælp af en Hertz model pasform og en parabolsk profil (radius på 8 nm) for spidsen form overlejret på 3D rekonstruktion af cellen fra AFM. (B) Den tilsvarende 3D-projektion af laserkonfokal zstakken med en nuklear plet (fluorescerende blå), en mikrotubuleplet (fluorescerende grøn) og en lipofil membranplet (fluorescerende rød). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: AFM af bakterieprøve.
(A) AFM-scanning og (B) målt modulus kort over en Streptococcus mutans bakterie. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Konfokal mikroskopi af bakterieprøve.
Konfokale billede af en koloni af Enterococcus faecalis med grøn fluorescerende membran plet. Skalabaren er 5 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Conpokal er en avanceret, effektiv teknik til indsamling af billeder af høj kvalitet og in situ mekaniske egenskaber af levende biomaterialer i et flydende miljø. Evnen til at indsamle ekstraordinære morfologi og topografi billeder kombineret med levende-prøve mekaniske egenskaber strækker sig forbi typiske elektron og lys mikroskopi teknikker. Separat, en konfokal mikroskop giver brightfield, epifluorescens, og laser scanning konfokale kapaciteter til at opnå høj kvalitet, detaljerede fluorescerende billeder af prøver. En AFM giver mekanisk karakterisering, men uden ekstra optik bliver det vanskeligt at navigere i prøven. Med de to systemer kombineret, kan en bruger indsamle både billeder og mekaniske egenskaber af nøjagtig samme celle under eksperimentet, hvilket er en stor fordel i forhold til to separate instrumenter. Formålet med dette manuskript er at informere og vejlede brugerne om de omfattende muligheder i det kombinerede Conpokal system for fremtiden for biologi, teknik og sundhed. Protokollen indebærer forberedelse af instrumenter, kultur medier, retter, udvælgelse af mikroorganismer, AFM procedure, konfokal procedure, og oprydning. De mest kritiske skridt for en vellykket live, in-løsning, Conpokal session er prøve immobilisering, velovervejet tip udvælgelse, og levende plet udførelse. Diskussionsafsnittet til dette manuskript vil uddybe kulturanbefadinger, fejlfindingstips og operationelle retningslinjer og fremtidigt arbejde for Conpokal-teknikken. Kulturanbefadenede vil omfatte vejledning om stikprøvekultur, immobilisering og farvning. AFM, confocal, og Conpokal tips og retningslinjer vil diskutere tip udvælgelse og kalibrering, opløsning, begrænsninger, og nær samtidig drift. Det fremtidige arbejde omfatter udsigterne og potentialet for potentielle forskningsforløb.

Protokollen dækker kultur, sondering og billeddannelse af både levende celle og faste bakterieprøver. En udfordring til stede, når de udfører AFM i væske stammer fra cantilever bevægelse obstruktion på grund af prøvehindring og hydrodynamisk træk. Hvis prøven ikke er godt i klæbet til underlaget, er der risiko for tilsmudsning af udkræjsning af den udkræjnede ved dele af prøven, der flyder i væsken. I så fald kompromitteres målingerne, da de er en formodning af elastisk klæbende og mikromekaniske egenskaber ved prøven. HEK-cellerne blev ikke behandlet med fiksative, men S. mutans og E. fæecalis kræver yderligere immobilisering, svarende til andre prokaryote celler. De valgte bakterier viste aktiv bevægelse, som hindrede celle sondering og billeddannelse, derfor blev prøverne forsigtigt, kemisk fastgjort for at fremme immobilisering. Der er alternativer til kemisk fiksering, såsom filtermembraner, der fysisk fanger individuelle celler i porerne75.

Valg af tip er også en vigtig komponent i opsætningen og driften af AFM. Når mekaniske egenskaber baseret på deformation af biomaterialet søges, må man overveje cantilever stivhed og materiale stivhed kompatibilitet, som er en ikke-triviel opgave. Hovedformålet er at bedst matche materialets stivhed med stivheden af den valgte cantilever. Hvis cantilever er meget blødere end prøven, vil det være genstand for for meget afbøjning. Hvis cantilever er stivere end prøven, så AFM detektoren kan være i stand til at fange sådanne små afbøjninger. Det anbefales, at når du vælger en egnet AFM cantilever, at vælge baseret på eksperimentel anvendelse. For at indsamle detaljerede billeder i intermitterende kontakttilstand er AFM-spidser inden for en rækkevidde på 0,1 - 0,3 N/m for stivhed og spidsradius inden for 5 nm – 100 nm effektive til levende cellebilleddannelse. Små koniske spidser anbefales. Skarpe spidser giver et lille kontaktområde og evne til at indrykke yderligere medvirken til indsamling af små detaljer og funktioner i prøvemorfologi76. Skarpe spidser kan dog også være problematiske, da de er tilbøjelige til at punktere prøver, når indstillingerne(f.eks.sætpunkt, pixeltid, indrykningshastighed) kræver for meget indrykning, eller indrykningen er for hurtig. For at undgå høj belastning sats effekter, lokale stamme hærdning nær en skarp spids, eller blot at styre kontaktområdet og tilgang hastighed, mange vælger at bruge kraft spektroskopi med en kolloid spids til at måle en elastisk modulus.

AFM spidser inden for en rækkevidde på 0,01 - 1,0 N/m for stivhed og spidsradius inden for 1 – 5 μm anbefales at måle den elastiske moduli af levende celler. Store spidsstørrelser, typisk glas kolloider, giver et kendt kontaktområde og er usandsynligt, at punktere cellen, mens i kontakt. Rektangulære kantilever foretrækkes frem for trekantede, fordi den kontaktfrie metode under kalibrering kan anvendes til rektangulær geometri sammenlignet med kontaktbaseret kalibrering for trekantede geometrier. Også på grund af den delikate karakter af AFM tips, anbefales det, at operatøren gennemfører pincet med gummi tips til at reducere risikoen for at beskadige den delikate AFM chip eller montering blok. Andre parametre, der skal være opmærksomme på, omfatter indflyvningshastigheden af AFM-spidsen og mængden af indrykning i prøven. En god retningslinje er at holde indrykning til omkring 10% af tykkelsen (eller højden) af prøven og vælge en hastighed, der udelukker potentielle hydrodynamiske modstand opleves af cantilever38.

Indviklede eksperimentelle instrumenter leveres typisk med vejspærringer, der kræver fejlfinding i instrumentet, der er konfigureret, kalibrering og drift. Crashing AFM spidsen eller cantilever i prøven eller prøve substrat er en almindelig fejl for nye brugere. For at undgå dette problem foreslår protokollen at støtte cantilever ud 2000 μm. Dette trin sikrer, at spidsen ikke kommer i kontakt med bunden af skålen, hvis den tidligere bruger har glemt at bakke spidsen ud, når oprydning efter forsøg. Afstanden på 2000 μm blev dog valgt for den valgte parabolholder, der anvendes i denne protokol. Det kan være nødvendigt at vælge et andet område, større eller mindre, afhængigt af den retholderstil, der anvendes. Under justering af laser og detektor, protokollen nævner justering af et spejl knop for at maksimere sumsignalet. Der er muligvis ikke en spejljusteringsknap på alle AFM'er. Hvis den findes, er en måde at manipulere instrumentet til fejlfinding af et lavsum signal imidlertid ved at justere spejlknappen, der bruges til at tage højde for det medium, hvor scanningen finder sted. enten væske(f.eks.vand, medier, PBS) eller luft. På grund af forskellen i brydningsindeks for lys gennem luft og gennem væske kan det være nødvendigt at justere spejlknappen. AFM-cantileverens maksimale bøjningsfølsomhed vil være på afm-spidsens placering, derfor skal laserlyset, som returnerer bøjningspositionen gennem dens placering på en fotodiode, være placeret på afm-spidsens placering. Afhængigt af den valgte AFM-spids kan den samlede signalværdi variere fra 0,3 til 3,0 V. En bagside belægning på AFM cantilever såsom Cr-Au eller Al vil øge sumsignalet og følsomheden af målingen.

Tipgeometri er relevant, når du fuldfører kalibrering af spids under AFM-drift. Der er konstateret god enighed mellem ikke-kontakt- og kontaktkalibrering. Hvis den valgte AFM cantilever ikke er rektangulær, skal der udføres kontaktkalibrering. Husk, at det medium, hvor spidsen kalibreres, skal være det samme som prøvemediet. Hvis disse væsker er forskellige, skal brugeren kalibrere igen. Ved brug af AFM-spidserne i væske skal den frekvens, der måles af systemet, være en fjerdedel til en tredjedel af den naturlige resonansfrekvens, som fabrikanten har angivet. En god måde at kontrollere, at systemet kalibrerede spidsen korrekt, er at kontrollere værdierne i den termiske støjfil, der genereres. Kontroller, at denne fil gemmes i den relevante mappe. Hvis systemet har problemer med kalibrering eller ikke-sandsynlige værdier kommer ud, rekalibrere, eller justere laser position lidt derefter kalibrere.

En anden årsag til dårlig sum signal kan skyldes AFM cantilever tilpasning. Når AFM-chippen er monteret i glasblokken, er det vigtigt, at spidsen af cantilever forbliver inden for det lille laservindue (glat glasområde). Hvis chippen er for langt frem, kan den vinkel, hvor den cantilever naturligt hviler, forårsage et problem med refleksionen fra udkræsken, mangler fotodetektoren og resulterer i dårligt sumsignal. Hvis chippen er for langt tilbage, vil laseren ikke være i stand til at reflektere ud på bagsiden af cantilever, forårsager dårlig sum signal. Af disse grunde kan det være nødvendigt at justere den monterede AFM-chip. Derudover opstår et andet problem, der kan opstå, i prøvens højde. Det AFM-instrument, der anvendes i denne protokol, har en maksimal piezo z-rækkevidde (højde) på 15 μm. Hvis en bruger finder ud af, at softwaren ikke er i stand til at indsamle højdedata og tvinge kort i en bestemt pixel, vises en sort boks, der angiver, at systemet er uden for området (Figur 2C). En måde at problemer skyde dette problem er at indstille piezo højde til en lavere værdi, såsom 2 eller 3 μm, så det meste af de 15 μm rækkevidde er forpligtet til at kortlægge den forventede højde af cellen. Denne teknik bør i de fleste celle- eller bakterierelaterede eksperimenter løse det problem, der er forbundet med z-området.

Forsøgseksperter, der kræver en udvidet z rækkevidde for høje prøver med højder større end 10 - 15 μm kan være nødvendigt at forfølge et ekstra modul på AFM. AFM-producenter har denne mulighed til rådighed til ekstra omkostninger for de fleste systemer. Ved at udvide z-området har experimentalisten mulighed for at scanne prøver, der betragtes som høje på mikroskalaen med få problemer for værdier uden for området eller AFM piezomotorændring. Selv om disse moduler koster ekstra, nogle, afhængigt af producenten, kan tilbyde ekstra højde, op til 100 μm i z retning. Konfokale er stadig muligt med højere prøver, hvis brugeren har en lang arbejdsafstand, høj forstørrelse mål eller er villig til at bruge en luft mål, måske en 20x eller 40x. Ved at sænke mikroskop objektive forstørrelse, arbejdsafstanden stiger, få afstand til at se toppen af en højere prøve. Denne ændring af en lavere forstørrelse mål vil ofre opløsning. I Conpokal-opsætningen, der henvises til i dette manuskript, har 60x TIRF-målet (total intern refleksionsfluorescens) en arbejdsafstand på næsten 100 μm forbi dækslet på prøveskålen med glasbund.

Med hensyn til det konfokale mikroskop, der henvises til i dette manuskript, drøftes nogle få vigtige bestemmelser. Det konfokale system, der anvendes til fremstilling af tallene i dette manuskript, gennemførte et 60x TIRF-oliemål med en numerisk blændeåbning på 1,49. Laserledninger ved 405 nm, 488 nm og 561 nm excitation bølgelængder blev anvendt til levende celle prøve billeddannelse, vist i figur 3 og figur 4. Den diffraktion grænse konfokale mikroskop kan bestemmes ved hjælp af Abbe Resolution ligning, Abbe Resolution (x,y) = λ/2NA, hvor λ er excitation bølgelængde for Alexa 488, ved 488 nm, og NA er den numeriske blænde for konfokal kondensator, som er 0,3. Derfor bestemmes en aksial opløsning på 272 nm. For epifluorescence-billeddannelse overvejes to tilfælde for at bestemme den opløsning, hvor pinholeet er indstillet til en luftig enhed (AU) og 0,5 AU. I sidstnævnte tilfælde er pinhole lukket ned, således at betydelige lystab opstår, men opløsningen stiger. Den konfokale software beregner laterale indfødte og aksiale indfødte opløsninger ved 170 nm og 290 nm for pinhole ved 0,5 AU, og 200 nm og 370 nm for pinhole ved 1 AU, hhv. Sfæriske afvigelser indført i systemet kan gøres rede for gennem en deconvolution proces for at øge kontrast og opløsning i mikroskop billeder. På grund af de diffraktionsbegrænsninger, der er forbundet med konfokale mikroskoper, mangler bakteriekoloniens konfokale billede i figur 6 den matchende opløsning for de detaljer, der ses i AFM-scanningen af bakterier i figur 5. AFM giver adgang til nanoskala funktioner og detaljer, der er vanskeligt at fange med en konfokal mikroskop. Afhængigt af den nødvendige fluorescensopløsning viser figur 5 og figur 6 imidlertid, at Conpokal-teknikken finder anvendelse på mikrober ud over eukaryote celler.

En fordel ved at bruge et konfokalt mikroskop gør det muligt for operatøren at indsamle 3D-billeder af bestemte områder i en prøve med skærpede detaljer. Disse billeder korrelerer med AFM ved at se overfladen, der blev undersøgt via AFM billedet og en konfokal scanning af samme region. Da mikroskopet er inverteret, indsamler et epifluorescensbillede lysoplysninger fra den modsatte side af prøven, der blev undersøgt. Pinhole i konfokale system hjælper med at begrænse til et enkelt plan fra en vis afstand, mens filtrering ud lys, der kommer fra resten af prøven eller endda rummet. I bund og grund hjælper pinholeet med at isolere det lys, der kommer tilbage fra det enkelte sted af interesse i prøven. Typisk, dette plan af interesse skal indeholde stærke fluorophore markører, fordi, for inverterede konfokale systemer, enkelt molekyle detektion ville være begrænset til højere opløsning konfokale mikroskoper. Epifluorescens belysning er mindre ønskeligt på grund af det faktum, at i epifluorescens billeddannelse tilstand, ethvert lys fra prøven, der afspejles i målet indsamles og bruges til at generere billedet, derfor umuligt at isolere et enkelt plan. Konfokale teknikker giver et mere isoleret enkeltplanbillede af den pågældende prøvefunktion på grund af pinhole77. Hvis for eksempel toppen af en eukaryote celle er undersøgt af AFM, at samme overflade kan isoleres med laser scanning konfokale kapaciteter af mikroskopet, snarere end med epifluorescens billeddannelse tilstand. Det anbefales at overvåge cellernes sundhed/form under dataindsamling via billeddannelse samtidig i differenskontrasttilstand ved hjælp af den transmitterede lysdetektor og 488 nm laserlinjen. Ved optagelse af en z stak af prøven, for proceduren beskrevet ovenfor, kun gevinsten af detektoren justeres. Enhver morfologisk ændring i cellerne under målingen, som ikke nødvendigvis er synlig i lysstofrør, indikerer, at artefakter indføres i målingen.

Ideel afstand mellem fly kan opnås ved at følge software anbefaling for den korteste bølgelængde, der anvendes i billeddannelse teknik. Den oprindelige opløsning og signal til støj-forholdet i billedmængderne kan forbedres effektivt ved at anvende deconvolution algoritmer til rådighed i billedbehandling modul af erhvervelsen software. Men, udfører fluorescerende mikroskopi, udvælgelse af specifikke pletter og farvestoffer er afgørende for at undgå tidligt på sæt blegning eller krydstale fra overlappende excitation / emission spektre. Nogle gange kan en bruger opleve en fejl i konfokal lysgenerering. Hvis en bruger oplever mangel på lysemission eller fejlbehæftede laserlinjer, er en måde at foretage fejlfinding på at nulstille systemet, typisk ved at genstarte driftssoftwaren. Hvis problemet fortsætter, kan den transmitterede lysdetektor ikke være blevet bevæget ind på eller uden for stedet inden for lysmikroskopets optiske bane. Nulstilling af senderdetektorens position kan bidrage til at afhjælpe problemer med lyssamling eller laserscanning.

Conpokal-instrumentet fokuserer på at give brugerne mulighed for at indsamle optiske og kraftbaserede oplysninger om levende biomaterialer i et flydende miljø, samtidigt og på samme celle eller funktion. Dette arbejde beskriver udtrykkeligt, hvordan man udfører disse eksperimenter i væske, et naturligt hjem for mange biomaterialer, selv om, tørre eksperimenter kan stadig udføres ved hjælp af instrumentering. Med prøver tilberedt i petriskåle er skålhøjden en begrænsning. På grund af konfigurationen af glasblokken, der holder AFM cantilever, skal sidevæggene af retterne være under 10 mm i højden; Hvis skålen er for høj, vil instrumentet ikke være i stand til at sænke AFM-spidsen til prøvens eller underlagets overflade.

Selv om der er en begrænsning for stikprøvestørrelsen, er der ingen begrænsning med instrumentet eller software kapaciteter med hensyn til en tidsforsinkelse. Samtidig konfokale og AFM er muligt med de rigtige faktorer på plads. Den begrænsning, der bidrager til dens næsten samtidige kapacitet refererer til den støj, der genereres, når de udfører visse konfokale mikroskopi funktioner og atomare kraft mikroskopi funktioner samtidigt. Vibrationerne fra de motorer, der flytter mikroskopmålet under indsamling af en z-stak, føjes til signalet fra AFM-sondens spids under dens bevægelse. Støjen vil blive forstærket af et oliemål, når motorerne bevæger sig op og ned i z-retningen for at belyse sekventielle planer i prøven. Derfor omfatter den anbefalede protokol sekventiel samling af AFM-scanninger og konfokale z stack-billeder. Samtidig CLSM og AFM ville kræve stationær billeddannelse med konfokalen, men med den nuværende teknik kan forsinkelsestiden for de to instrumenter være så kort som ti sekunder. Den faktiske tid til at skifte fra AFM-drift til konfokal billeddannelse var omkring 2 - 4 minutter for de billeder, der blev indsamlet i figur 2A og figur 4B. Denne værdi blev bestemt ved at trække de to billedsamlingsperioder fra den samlede tid på 33 minutter, hvilket omfatter den tid, der skal til for at starte og fuldføre AFM-scanningen, skifte instrumenttilstande for at aktivere konfokal billeddannelse og begynde og fuldføre den konfokale billed z-stak.

Fremtiden for Conpokal har til formål at udforske nye struktur-funktion relationer ud over skarp indsigt i enkelt celle processer. For eksempel, eksperimentering af in situ narkotika behandlinger på celle eller bakterielle prøver til at bestemme virkningerne af celle elasticitet ville være et fremskridt til områderne biomaterialer, biologi, og biomekanik. Behandlingsbehandling i prøveskålen, mens billeddannelse og sondering ville give viden om, hvordan prøven reagerer på terapeutiske forhold i et levende og omhyggeligt kontrolleret miljø, over tid. Indarbejde en ny narkotika eller miljømæssig udfordring ville udvide forståelsen af, hvordan cytoskeleton eller organelle placering påvirker bevægelse, topologi, stivhed, osv. En anden potentiel udvikling af Conpokal er evnen til at have fuldstændig miljøkontrol af systemet. Den nuværende Conpokal nævnt i denne protokol er anbragt inde i en akustisk kabinet designet til at reducere støj inde fra laboratoriet. Fremme af dette hus ville give mulighed for at teste inden for, måske, en eller en kombination af faktorer, ikke begrænset til dem, såsom et sterilt miljø, temperatur-kontrolleret, eller endda variabel tyngdekraft. Som det ser ud nu, conpokal metode giver en effektiv og nyttig tilgang til at karakterisere levende, i-flydende biomaterialer, men fremtiden for teknikken vil kun fremme disse kapaciteter yderligere.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Vi anerkender NIH COBRE finansiering under nummer P20GM130456. Vi takker uk Light Microscopy Core, som støttes af Vice President for Research, for at få hjælp til dette arbejde. Stammer af S. mutans og E. fæecalis blev leveret af Dr. Natalia Korotkova. Den første omtale af play-on-ord, Conpokal, at beskrive kombinationen af konfokale mikroskopi og atomare kraft mikroskopi tilskrives Dr. Brad Berron, Chemical and Materials Engineering, ved University of Kentucky, i diskussion med Dr. Martha Grady (tilsvarende forfatter) i forventning om ankomsten af et seminar højttaler Dr. Jonathan Pham, der sluttede fakultetet i Chemical and Materials Engineering ved University of Kentucky i efteråret 2017.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acoustic Enclosure JPK-Bruker Acoustic Enclosure Chamber used to mitigate noise
BioTracker 488 Green Microtubule Cytoskeleton Dye Millipore Sigma SCT142 Used to label microtubules in mammalian cells
CP-qp-CONT-BSG AFM tips NanoAndMore CP-qp-CONT-BSG-B Collodial AFM tips good for modulus measurements on biological samples
Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3))) ThermoFischer Scientific D282 Used to label plasma membrane of mammalian cells
Dulbecco's Modified Eagle Medium VWR VWRL0100-0500 Component of cell culture media
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline ThermoFisher Scientific A1285601 Used to simulate biological environment
Fetal Bovine Serum Fischer Scientific 45000-736 Component of cell culture media
Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: Yeast Extract Fischer Scientific BP1422-500 Component of bacterial culture medium
FluoroDish Cell Culture Dish World Precision Instruments (WPI) FD35-100 Glass-bottomed dishes whose side walls are less than 10 mm, necessary for full function of Nanowizard 4a AFM
Hoechst 33342 nucleic acid stain ThermoFischer Scientific 62249 Used to label nucleus of mammalian cells, a good nuclear marker for live cells
Human embryonic kidney 293 cells ATCC Global Bioresource Center CRL-1573 Mammalian cells used in protocol
Matrigel VWR 47743-716 Coating in cell culture dish
Model: PFQNM-LC-A-CAL AFM tips Bruker PFQNM-LC-A-CAL AFM tips that work well for samples that have large heights (such as eukaryotic cells)
NanoWizard 4a JPK-Bruker NanoWizard 4a AFM
Nikon A1 Laser Scanning Confocal Microscope Nikon A1 HD25 Microscope used for brightfield, epi-fluorescence, and confocal imaging
PENICILLIN/STREPTOMYCIN VWR 16777-164 Component of cell culture media
PetriDishHeater JPK-Bruker PetriDishHeater Maintains desired Petri dish sample temperature
qp-BioAC-Cl AFM tips Nanosensors qp-BioAC-Cl-10 Three different AFM cantilevers of varying stiffness
Replaceable Carbon Fiber Tip Tweezers Ted Pella Inc. 5051 Used to carefully place and remove delicate AFM tips into the glass mounting block
Todd Hewitt Broth Bacto BD DIFCO Bacterius Ltd Bacto-249240 Component of bacterial culture medium
Vancomycin, BODIPY FL Conjugate Thermo Fisher Scientific V34850 Used to fluorescently label bacterial cell wall

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Butt, H. J., Pham, J. T., Kappl, M. Forces between a stiff and a soft surface. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 27, 82-90 (2017).
  2. Pham, J. T., Schellenberger, F., Kappl, M., Butt, H. J. From elasticity to capillarity in soft materials indentation. Physical Review Materials. 1 (1), 015602 (2017).
  3. Lee, G. Y. H., Lim, C. T. Biomechanics approaches to studying human diseases. Trends Biotechnology. 25 (3), 111-118 (2007).
  4. Qiu, H., et al. Short Communication: Vascular Smooth Muscle Cell Stiffness As a Mechanism for Increased Aortic Stiffness With Aging. Circulation Research. 107 (5), 615-619 (2010).
  5. Glenister, F. K., Coppel, R. L., Cowman, A. F., Mohandas, N., Cooke, B. M. Contribution of parasite proteins to altered mechanical properties of malaria-infected red blood cells. Blood. 99 (3), 1060-1063 (2002).
  6. Suresh, S., et al. Connections between single-cell biomechanics and human disease states: gastrointestinal cancer and malaria. Acta Biomaterialia. 1 (1), 15-30 (2005).
  7. Nash, G. B., Johnson, C. S., Meiselman, H. J. Mechanical properties of oxygenated red blood cells in sickle cell (HbSS) disease. Blood. 63 (1), 73-82 (1984).
  8. Trickey, W. R., Lee, G. M., Guilak, F. Viscoelastic properties of chondrocytes from normal and osteoarthritic human cartilage. Journal of Orthopedic Research. 18 (6), 891-898 (2000).
  9. An, S. S., Fabry, B., Trepat, X., Wang, N., Fredberg, J. J. Do Biophysical Properties of the Airway Smooth Muscle in Culture Predict Airway Hyperresponsiveness. American Journal of Respiratory Cell and Molecuar Biology. 35 (1), 55-64 (2006).
  10. Suresh, S. Biomechanics and biophysics of cancer cells. Acta Materialia. 55 (12), 3989-4014 (2007).
  11. Rebelo, L. M., de Sousa, J. S., Mendes, J., Radmacher, M. Comparison of the viscoelastic properties of cells from different kidney cancer phenotypes measured with atomic force microscopy. Nanotechnology. 24 (5), 055102 (2013).
  12. Cross, S. E., Jin, Y. S., Rao, J., Gimzewski, J. K. Nanomechanical analysis of cells from cancer patients. Nature Nanotechnology. 2 (12), 780-783 (2007).
  13. Remmerbach, T. W., et al. Oral Cancer Diagnosis by Mechanical Phenotyping. Cancer Research. 69 (5), 1728-1732 (2009).
  14. Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nature Reviews Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).
  15. Yallapu, M. M., et al. The Roles of Cellular Nanomechanics in Cancer. Medical Research Reviews. 35 (1), 198-223 (2015).
  16. Fabry, B., et al. Scaling the Microrheology of Living Cells. Physical Review Letters. 87 (14), 148102 (2001).
  17. Ingber, D. E., Prusty, D., Sun, Z., Betensky, H., Wang, N. Cell shape, cytoskeletal mechanics, and cell cycle control in angiogenesis. Jouranl of Biomechica. 28 (12), 1471-1484 (1995).
  18. Svoboda, K., Block, S. M. Biological Applications of Optical Forces. Annual Reviews of Biophysics and Biomolecular Structures. 23 (1), 247-285 (1994).
  19. Dao, M., Lim, C. T., Suresh, S. Mechanics of the human red blood cell deformed by optical tweezers. Journal of the Mechicanics and Physics of Solids. 51 (11-12), 2259-2280 (2003).
  20. Thoumine, O., Cardoso, O., Meister, J. J. Changes in the mechanical properties of fibroblasts during spreading: a micromanipulation study. European Biophys with Biophyics Letters. 28 (3), 222-234 (1999).
  21. Reynolds, N. H., et al. On the role of the actin cytoskeleton and nucleus in the biomechanical response of spread cells. Biomaterials. 35 (13), 4015-4025 (2014).
  22. Jones, W. R., et al. Alterations in the Young’s modulus and volumetric properties of chondrocytes isolated from normal and osteoarthritic human cartilage. Journal of Biomechics. 32 (2), 119-127 (1999).
  23. Radmacher, M., Fritz, M., Kacher, C. M., Cleveland, J. P., Hansma, P. K. Measuring the viscoelastic properties of human platelets with the atomic force microscope. Biophysics Journals. 70 (1), 556-567 (1996).
  24. Ketene, A. N., Roberts, P. C., Shea, A. A., Schmelz, E. M., Agah, M. Actin filaments play a primary role for structural integrity and viscoelastic response in cells. Integrative Biology. 4 (5), 540-549 (2012).
  25. Ketene, A. N., Schmelz, E. M., Roberts, P. C., Agah, M. The effects of cancer progression on the viscoelasticity of ovarian cell cytoskeleton structures. Nanomedicine-Nanotechnology. 8 (1), 93-102 (2012).
  26. Darling, E. M., Topel, M., Zauscher, S., Vail, T. P., Guilak, F. Viscoelastic properties of human mesenchymally-derived stem cells and primary osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes. Journal of Biomechics. 41 (2), 454-464 (2008).
  27. Henderson, E., Haydon, P., Sakaguchi, D. Actin filament dynamics in living glial cells imaged by atomic force microscopy. Science. 257 (5078), 1944-1946 (1992).
  28. Rotsch, C., Radmacher, M. Drug-Induced Changes of Cytoskeletal Structure and Mechanics in Fibroblasts: An Atomic Force Microscopy Study. Biophysics Jouranl. 78 (1), 520-535 (2000).
  29. Darling, E. M., Zauscher, S., Guilak, F. Viscoelastic properties of zonal articular chondrocytes measured by atomic force microscopy. Osteoarthritis Cartilage. 14 (6), 571-579 (2006).
  30. Lekka, M., et al. Local elastic properties of cells studied by SFM. Applied Surface Science. 141 (3-4), 345-349 (1999).
  31. Li, Q. S., Lee, G. Y. H., Ong, C. N., Lim, C. T. AFM indentation study of breast cancer cells. Biochemical and Biophysical Research Communication. 374 (4), 609-613 (2008).
  32. Rother, J., Noding, H., Mey, I., Janshoff, A. Atomic force microscopy-based microrheology reveals significant differences in the viscoelastic response between malign and benign cell lines. Open Biology. 4 (5), 140046 (2014).
  33. Nalam, P. C., Gosvami, N. N., Caporizzo, M. A., Composto, R. J., Carpick, R. W. Nano-rheology of hydrogels using direct drive force modulation atomic force microscopy. Soft Matter. 11 (41), 8165-8178 (2015).
  34. Raman, A., et al. Mapping nanomechanical properties of live cells using multi-harmonic atomic force microscopy. Nature Nanotechnology. 6 (12), 809 (2011).
  35. Caporizzo, M. A., et al. Strain-rate dependence of elastic modulus reveals silver nanoparticle induced cytotoxicity. Nanobiomedicine. 2, 9 (2015).
  36. Corbin, E. A., Kong, F., Lim, C. T., King, W. P., Bashir, R. Biophysical Properties of Human Breast Cancer Cells Measured Using Silicon MEMS Resonators and Atomic Force Microscopy. Lab Chip. 15 (3), 839-847 (2014).
  37. Moreno-Flores, S., Benitez, R., Vivanco, M. D., Toca-Herrera, J. L. Stress relaxation and creep on living cells with the atomic force microscope: a means to calculate elastic moduli and viscosities of cell components. Nanotechnology. 21 (44), 445101 (2010).
  38. Grady, M. E., Composto, R. J., Eckmann, D. M. Cell elasticity with altered cytoskeletal architectures across multiple cell types. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 61, 197-207 (2016).
  39. Park, S., Koch, D., Cardenas, R., Kas, J., Shih, C. K. Cell motility and local viscoelasticity of fibroblasts. Biophysical Journal. 89 (6), 4330-4342 (2005).
  40. Ribeiro, A. S., Khanna, P., Sukumar, A., Dong, C., Dahl, K. Nuclear Stiffening Inhibits Migration of Invasive Melanoma Cells. Cellular and Molecular Bioengineering. 7 (4), 1-8 (2014).
  41. Buda, A., Pignatelli, M. Cytoskeletal network in colon cancer: from genes to clinical application. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 36 (5), 759-765 (2004).
  42. Lindberg, U., Karlsson, R., Lassing, I., Schutt, C. E., Höglund, A. S. The microfilament system and malignancy. Seminars in Cancer Biology. 18 (1), 2-11 (2008).
  43. Altemeier, W. A., Sinclair, S. E. Hyperoxia in the intensive care unit: why more is not always better. Current Opinion in Critical Care. 13 (1), 73-78 (2007).
  44. Roan, E., Waters, C. M., Teng, B., Ghosh, M., Schwingshackl, A. The 2-pore domain potassium channel TREK-1 regulates stretch-induced detachment of alveolar epithelial cells. PLoS One. 9 (2), 89429 (2014).
  45. Roan, E., et al. Hyperoxia alters the mechanical properties of alveolar epithelial cells. American Journal of Physiology. 302 (12), 1235-1241 (2012).
  46. Wilhelm, K. R., Roan, E., Ghosh, M. C., Parthasarathi, K., Waters, C. M. Hyperoxia increases the elastic modulus of alveolar epithelial cells through Rho kinase. The FEBS Journal. 281 (3), 957-969 (2013).
  47. Roan, E., Wilhelm, K. R., Waters, C. M. Kymographic Imaging of the Elastic Modulus of Epithelial Cells during the Onset of Migration. Biophysical Journal. 109 (10), 2051-2057 (2015).
  48. Wagh, A. A., et al. Localized elasticity measured in epithelial cells migrating at a wound edge using atomic force microscopy. American Journal of Physiology. 295 (1), 54-60 (2008).
  49. Liu, S., Wang, Y. Application of AFM in microbiology: a review. Scanning. 32 (2), 61-73 (2010).
  50. Hayhurst, E. J., Kailas, L., Hobbs, J. K., Foster, S. J. Cell wall peptidoglycan architecture in Bacillus subtilis. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 105 (38), 14603-14608 (2008).
  51. Dover, R. S., Bitler, A., Shimoni, E., Trieu-Cuot, P., Shai, Y. Multiparametric AFM reveals turgor-responsive net-like peptidoglycan architecture in live streptococci. Nature Communications. 6 (1), 1-10 (2015).
  52. Gillis, A., Dupres, V., Delestrait, G., Mahillon, J., Dufrêne, Y. F. Nanoscale imaging of Bacillus thuringiensis flagella using atomic force microscopy. Nanoscale. 4 (5), 1585-1591 (2012).
  53. Laurent, V. M., et al. Gradient of rigidity in the lamellipodia of migrating cells revealed by atomic force microscopy. Biophysical Journal. 89 (1), 667-675 (2005).
  54. Collart-Dutilleul, P. Y., et al. Initial stem cell adhesion on porous silicon surface: molecular architecture of actin cytoskeleton and filopodial growth. Nanoscale Research Letters. 9 (1), 564 (2014).
  55. Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
  56. Ilie, M. A., et al. Current and future applications of confocal laser scanning microscopy imaging in skin oncology. Oncology Letters. 17 (5), 4102-4111 (2019).
  57. Jonkman, J., Brown, C. M. Any way you slice it-a comparison of confocal microscopy techniques. Journal of Biomolecular Techniques. 26 (2), 54 (2015).
  58. Minsky, M. Memoir on inventing the confocal scanning microscope. Scanning. 10 (4), 128-138 (1988).
  59. Paddock, S. Over the rainbow: 25 years of confocal imaging. Biotechniques. 44 (5), 643-648 (2008).
  60. Amos, W., White, J. How the confocal laser scanning microscope entered biological research. Biology of the Cell. 95 (6), 335-342 (2003).
  61. Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. Spinning-disk confocal microscopy: present technology and future trends. Methods in Cell Biology. 123, 153-175 (2014).
  62. Wolleschensky, R., Zimmermann, B., Kempe, M. High-speed confocal fluorescence imaging with a novel line scanning microscope. Journal of Biomedical Optics. 11 (6), 064011 (2006).
  63. Brakenhoff, G., Van der Voort, H., Van Spronsen, E., Nanninga, N. Three-dimensional imaging in fluorescence by confocal scanning microscopy. Journal of Microscopy. 153 (2), 151-159 (1989).
  64. Jerome, W. G., Price, R. L. Basic Confocal Microscopy. , Springer. (2018).
  65. Webb, R. H. Confocal optical microscopy. Reports on Progress in Physics. 59 (3), 427 (1996).
  66. Pawley, J. Handbook of biological confocal microscopy. , Springer. 236 (2010).
  67. Webb, D. J., Brown, C. M. Epi-fluorescence microscopy. Cell Imaging Techniques. , 29-59 (2012).
  68. Day, R. N., Davidson, M. W., Press, C. The fluorescent protein revolution. , Elseiver. (2014).
  69. Fine, A., Amos, W., Durbin, R., McNaughton, P. Confocal microscopy: applications in neurobiology. Trends in Neurosciences. 11 (8), 346-351 (1988).
  70. Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
  71. Pan, Y. A., Livet, J., Sanes, J. R., Lichtman, J. W., Schier, A. F. Multicolor Brainbow imaging in zebrafish. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (1), 5546 (2011).
  72. Fu, X., et al. Brain Region Specific Single-Molecule Fluorescence Imaging. Anals in Chemistry. 91 (15), 10125-10131 (2019).
  73. Snell, A. A., et al. Cell-Derived Vesicles for in Vitro and in Vivo Targeted Therapeutic Delivery. ACS Omega. 4 (7), 12657-12664 (2019).
  74. Edgar, R. J., et al. Discovery of glycerol phosphate modification on streptococcal rhamnose polysaccharides. Nature Chemical Biology. 15 (5), 463-471 (2019).
  75. Kailas, L., et al. Immobilizing live bacteria for AFM imaging of cellular processes. Ultramicroscopy. 109 (7), 775-780 (2009).
  76. Gavara, N. A beginner's guide to atomic force microscopy probing for cell mechanics. Microscopy Research and Technique. 80 (1), 75-84 (2017).
  77. Wilson, T. The role of the pinhole in confocal imaging system. Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 167-182 (1995).

Tags

Bioengineering konfokal mikroskopi atomare kraft mikroskopi AFM conpokal bakterier cellebiologi biomaterialer levende celle billeddannelse mekanobiologi
I nærheden af samtidig laserscanning konfokale og atomic force mikroskopi (Conpokal) på levende celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sandin, J. N., Aryal, S. P., Wilkop, … More

Sandin, J. N., Aryal, S. P., Wilkop, T., Richards, C. I., Grady, M. E. Near Simultaneous Laser Scanning Confocal and Atomic Force Microscopy (Conpokal) on Live Cells. J. Vis. Exp. (162), e61433, doi:10.3791/61433 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter