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Bioengineering

लाइव कोशिकाओं पर एक साथ लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल और परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (Conpokal) के पास

Published: August 11, 2020 doi: 10.3791/61433
Automatic Translation
1, 2, 3,4, 2,4, 1
1Department of Mechanical Engineering, University of Kentucky, 2Department of Chemistry, University of Kentucky, 3Department of Physiology, University of Kentucky, 4UK Light Microscopy Core, University of Kentucky

Summary

यहां प्रस्तुत कोंपोकल तकनीक का प्रोटोकॉल है, जो कॉन्फोकल और परमाणु बल माइक्रोस्कोपी को एक ही साधन मंच में जोड़ती है। Conpokal एक ही सेल, एक ही क्षेत्र, एक साथ कंफोकल इमेजिंग और जीवित जैविक नमूनों के यांत्रिक लक्षण वर्णन के पास प्रदान करता है ।

Abstract

सूक्ष्म और नैनो पैमाने पर यांत्रिक लक्षण वर्णन के लिए उपलब्ध तकनीकों पिछले कुछ दशकों में विस्फोट किया है । स्कैनिंग और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के आगे के विकास से, परमाणु बल माइक्रोस्कोपी के आविष्कार के लिए, और फ्लोरोसेंट इमेजिंग में प्रगति, प्रौद्योगिकियों में पर्याप्त लाभ हुआ है जो छोटी सामग्रियों के अध्ययन को सक्षम करते हैं। कॉनपोकल एक पोर्टमंटेऊ है जो परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम) के साथ कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी को जोड़ती है, जहां सतह पर जांच "पोक्स" होती है। यद्यपि प्रत्येक तकनीक गुणात्मक और/या मात्रात्मक छवि संग्रह के लिए अत्यंत प्रभावी है, फिर भी कॉनपोकल मिश्रित फ्लोरेसेंस इमेजिंग और यांत्रिक लक्षण वर्णन के साथ परीक्षण करने की क्षमता प्रदान करता है। निकट एक साथ कॉन्फोकल इमेजिंग और परमाणु बल की जांच के लिए बनाया गया है, Conpokal लाइव माइक्रोबायोलॉजिकल नमूनों पर प्रयोग की सुविधा । युग्मित इंस्ट्रूमेंटेशन से अतिरिक्त अंतर्दृष्टि कंफोकल माइक्रोस्कोपी के माध्यम से उपकोशिकीय घटकों या गतिविधि अवलोकन के साथ एएफएम द्वारा मापा जाने वाले यांत्रिक गुणों(जैसे,लोचदार मॉड्यूल, आसंजन, सतह खुरदरापन) का सह-स्थानीयकरण प्रदान करती है। यह काम लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल और परमाणु बल माइक्रोस्कोपी के संचालन के लिए एक कदम से कदम प्रोटोकॉल प्रदान करता है, साथ ही, एक ही सेल, एक ही क्षेत्र, कॉन्फोकल इमेजिंग और यांत्रिक लक्षण वर्णन प्राप्त करने के लिए।

Introduction

सूक्ष्म या नैनो-स्केल यांत्रिक मूल्यांकन उपकरण अक्सर एकल कोशिका या सूक्ष्म स्तर पर विरूपण विशेषताओं को उजागर करने के लिए नियोजित होते हैं, जबकि उपकोशिकीय प्रक्रियाओं और संरचनात्मक विशेषताओं की कल्पना करने के लिए अलग-अलग उच्च रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी उपकरण नियोजित किए जाते हैं। कॉनपोकल, एक ही वाद्य मंच में लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी और एटॉमिक फोर्स माइक्रोस्कोपी (एएफएम) का संयोजन है। कॉनपोकल तकनीक को पहले एक गैर-जैविक बहुलक प्रणाली में लागू किया गया था, जहां लक्ष्य नरम सतहों के संपर्क में कठिन सतहों के आसंजन, लोच और सतह तनाव को निर्धारित करना था। कॉन्फोकल छवियों ने एक दृश्य प्रतिपादन प्रदान किया कि पॉलीमर कैसे बनाता है, पालन करता है, और हार्ड प्रोब1,2से रिलीज करता है। पॉलीमर से जैविक नमूनों के लिए, इस तकनीक के पास एक साथ लाइव सेल या सूक्ष्मजीव कॉन्फोकल इमेजिंग और AFM के लिए अवसर प्रदान करता है ।

कोशिका लोच में परिवर्तन कई मानव रोगों के रोगजनकता में फंसाया गया है3 संवहनी विकारों सहित4मलेरिया5,6, सिकल सेल एनीमिया7गठिया8दमा9, और कैंसर6,10,11,12,13,14,15. कोशिकाओं के यांत्रिकी को मापने के लिए सामान्य तकनीकों में चुंबकीय मोतियों का उपयोग शामिल है16,17, ऑप्टिकल चिमटी18,19, माइक्रोपिपेट आकांक्षा8,20,21,22, और एएफएम11,23,24,25,26. जीवित कोशिकाओं के लिए AFM के आवेदन के बाद से, यह आसानी से सेल स्थलाकृति की विशेषता के लिए अनुकूलित किया गया है27,28 साथ ही यांत्रिक गुण11,24,29,30,31 नैनोस्केल परिशुद्धता के साथ। एएफएम को माइक्रोरहेलॉजी के लिए और अनुकूलित किया गया है32,33, आवृत्ति मॉड्यूलेशन34,35, और रेंगना25,36,37 विभिन्न सेल लाइनों के चिपचिपा गुणों का अध्ययन करने के लिए प्रयोग। एक उपयुक्त नैनोकॉन्टैक्ट मॉडल का उपयोग एएफएम-उत्पादित बल इंडेंटेशन मापन से मात्रात्मक लोच मूल्यों को निकालने के लिए महत्वपूर्ण है1,2. कोशिका लोच पर साइटोस्केलेटल दवाओं के प्रभाव की जांच करने वाले एएफएम अध्ययनों ने लोचदार मॉड्यूलस को अत्यधिक प्रभावित दिखाया है38. लोचदार मॉड्यूलस माप के आधार पर, कई शोधकर्ताओं ने दिखाया है कि कैंसर कोशिकाओं को उनके गैर बदल समकक्षों की तुलना में नरम कर रहे है11,38,39. बढ़ी हुई विकृति की संभावना कैंसर कोशिकाओं को मेटास्टेसाइज करने और ऊतकों में घुसपैठ करने की क्षमता में एक प्रमुख भूमिका निभाती है40. इस तरह के व्यवहार कोशिकाओं के साइटोस्केलेल संगठन में संशोधनों द्वारा विनियमित किया जाता है38,41,42. कैंसर के अलावा मैकेनिकल पर निर्भर बीमारियों का एक और वर्ग सांस की बीमारियां हैं । उदाहरण के लिए, तीव्र श्वसन तनाव सिंड्रोम हर साल अधिक से अधिक मनुष्यों को प्रभावित करता है। यह दिखाया गया है कि जब रोगियों को यांत्रिक वेंटिलेशन पर रखा जाता है, ऑक्सीजन की उच्च सांद्रता के साथ, उनकी स्थिति खराब हो सकती है43. एएफएम के साथ अल्वेलर एपिथेलियल मैक्रोफेज को देखते हुए अध्ययनों की एक श्रृंखला में, वैज्ञानिकों ने पाया कि ऑक्सीजन युक्त वातावरण के अलावा ऐक्टिन गठन के कारण कोशिकाओं की कठोरता में वृद्धि हुई; प्रभाव का एक प्रमुख उदाहरण है कि AFM सेलुलर स्तर पर श्वसन समारोह पर वायुमंडलीय पर्यावरणीय प्रभाव की हमारी विस्तृत समझ पर है और, अंततः, मानव चिकित्सा और स्वास्थ्य44,45,46. एक घाव की ओर प्रवास के दौरान एपिथेलियल सेल कठोरता का आकलन एएफएम के माध्यम से भी किया जा सकता है और लोचदार मॉड्यूलस में भिन्नता भविष्य की कोशिका के प्रसार का संकेत देने के लिए होती है47,48. इसलिए, कोशिका यांत्रिकी को मात्रात्मक रूप से मापने की व्यावहारिक आवश्यकता है ताकि यह समझा जा सके कि रोगग्रस्त कोशिकाएं कैसे अलग होती हैं, और स्वस्थ लोगों के साथ बातचीत करती हैं।

एएफएम का उपयोग चिपकने वाले गुणों और सतह संरचना का अध्ययन करने के लिए भी किया जाता है। एक परमाणु बल माइक्रोस्कोप में संपर्क यांत्रिकी का उपयोग करके नमूने के बारे में जानकारी एकत्र करने के लिए विभिन्न प्रकार के मोड होते हैं। जैविक नमूनों को जीने के लिए, प्राथमिक उद्देश्यों में से दो मात्रात्मक यांत्रिक संपत्ति मूल्यों(जैसे,लोचदार मोडुली, चिपकने वाली ताकतों) के साथ-साथ मानचित्र सतह की ऊंचाई प्राप्त करना है। इन मोड में टैपिंग मोड (जिसे आंतरायिक संपर्क भी कहा जाता है) शामिल है, जो एक निरंतर कैंटिलीवर आयाम को रुक-रुककर नमूना सतह और संपर्क मोड से संपर्क करता है, जो लगातार विक्षेप49बनाए रखने के लिए कैंटिलीवर को उठाता है या कम करता है। आसंजन नक्शे एएफएम प्रणाली पर बल मानचित्रण का उपयोग कर एकत्र किया जा सकता है। कैंटिलीवर एक निश्चित बल पर नमूना मांगपत्र देता है और फिर मुकर जाता है। रिऐक्शन का विरोध करने वाले बल को डिटेक्टर द्वारा मापा जाता है ताकि बल-विस्थापन ग्राफ उत्पन्न किया जा सके। आसंजन बल पीछे हटने के दौरान मापा गया अधिकतम बल है। सतह आकृति विज्ञान सूक्ष्म या नैनो स्तर पर नमूने का एक विस्तृत दृश्य प्रदान करता है। कैंटिलीवर प्रत्येक पिक्सेल पर कैंटिलीवर की गति द्वारा कैप्चर किए गए इंडेंटेशन और विक्षेप के आधार पर नमूने में एक रैस्टर स्कैन पूरा करता है, जो माइक्रो-और नैनो-आकार की सुविधाओं का खुलासा करता है। एएफएम के साथ, पेप्टिडोग्लाइकन संरचना50,पॉलीमर चेन अलाइनमेंट51,फ्लैगेला52,लैमेलिपोडिया 53 और फिलिपोडिया54जैसी छोटी विशेषताओं का आकार मापा जा सकता है। जबकि एएफएम की शक्ति बल-विस्थापन घटता और गैर-ऑप्टिकल स्थलाकृतिक छवियों में निहित है, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी फ्लोरोसेंटली लेबल वाले नमूनों की विस्तृत इमेजिंग प्रदान करती है।

कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी (सीएलएसएम) लाइव कोशिकाओं, निश्चितकोशिकाओं और ऊतकों55, 56,57इमेजिंग के लिए एक प्रमुख तकनीक है। सीएलएम को 1955 से जैविक इमेजिंग के लिए नियोजित किया गया है यानी58 ,59की स्थापना के बाद से । जबकि कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का कार्य सिद्धांत(यानी,पिनहोल के माध्यम से फोकस लाइट से बाहर की अस्वीकृति) काफी हद तक समान रहा है, तकनीकी कार्यान्वयन बहुत विविध56, 57,58,60हो गया है। कॉन्फोकल इमेजिंग को मल्टीपॉइंट स्कैनिंग के माध्यम से लागू किया जा सकता है, जैसा कि कताई डिस्क सिस्टम61में, एक लेजर बीम की पॉइंट स्कैनिंग, लाइन स्कैनिंग62के रूप में, या मल्टी-एलिमेंट डिटेक्टर57के माध्यम से बाद के पिक्सेल रीअसाइनमेंट के साथ बिंदु प्रसार फ़ंक्शन इमेजिंग। हाल ही में हुए अग्रिमों में कॉन्फोकल इमेजिंग की उपयोगिता का विस्तार करने के लिए लेजर स्कैनिंग क्षमता, उच्च गति अनुनय स्कैनिंग, और उच्च संवेदनशीलता डिटेक्टर63,64,65शामिल हैं। लाभ यह है कि सभी कॉन्फोकल सिस्टम में वाइडफील्ड माइक्रोस्कोप से अधिक है, विशेष रूप से मोटे नमूनों में, अधिक विस्तार के साथ जेड अक्ष में ऑप्टिकल सेक्शनिंग करने की क्षमता है। कैमरा-आधारित डिटेक्शन का उपयोग करके वाइडफील्ड माइक्रोस्कोप फोकल प्लेन से उत्सर्जित होने वाली रोशनी एकत्र करते हैं और साथ ही, रोशनी पथ में हर जगह से प्रकाश उत्सर्जित होता है। पिनहोल को बंद करके, सिग्नल को कम करने की कीमत पर, अक्षीय और पार्श्व संकल्प दोनों को बढ़ाया जा सकता है66। CLSM में, छवियों को उत्सर्जन संकेत संग्रह के माध्यम से पिक्सेल द्वारा पिक्सेल बनाया जाता है क्योंकि एक उत्तेजन लेजर को एक्स-वाई क्षेत्र में स्कैन किया जाता है। नमूने की जेड धुरी के साथ कई एक्स-वाई विमानों के संग्रह का उपयोग नमूना57,67के 3-आयामी वास्तुकला के पुनर्निर्माण के लिए किया जा सकता है। फ्लोरोसेंट प्रोटीन की शुरूआत के साथ मिलकर कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी ने सेल बायोलॉजी68की हमारी समझ में क्रांतिकारी बदलाव किया है। उदाहरण के लिए, यह न्यूरोसाइंस69में एक आवश्यक उपकरण बन गया है। सीएलएसएम का उपयोग नियमित रूप से साफ किए गए ऊतकों का निरीक्षण करने और प्रतिरक्षा दाग वाले मस्तिष्क और न्यूरोनल नेटवर्क आर्किटेक्चर70की व्यापक छवियों को प्राप्त करने के लिए किया जाता है। इस एप्लिकेशन के परिणामस्वरूप मस्तिष्क में न्यूरॉन्स और ग्लियल कोशिकाओं के बीच सिनैप्टिक संपर्कों और संचार में नई अंतर्दृष्टिहुईहै । मस्तिष्क की कोशिकाओं से लेकर वेसिकल तक, फ्लोरोसेंट स्टेनिंग प्रोटोकॉल चिकित्सीय तकनीकों में प्रगति के लिए कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के माध्यम से सेल कार्यों के निरीक्षण और कैप्चर का समर्थन करते हैं72,73।

यद्यपि वे व्यक्तिगत रूप से प्रभावशाली और बहुमुखी उपकरण हैं, लेकिन कॉन्फोकल और परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (कॉनपोकल) का संयोजन शोधकर्ताओं को विभिन्न सेलुलर ऑर्गेनेल्स और उनके संबंधित गतिशीलता के अवलोकन के साथ विशिष्ट रूप से टोपोग्राफिकल और सूक्ष्म सेलुलर/ऊतक गुणों को सहसंबंधित करने की अनुमति देता है। युग्मित इंस्ट्रूमेंटेशन उपयोगकर्ताओं को अनिवार्य रूप से, "देखें" कि वे क्या जांच कर रहे हैं; अपने दम पर एक तकनीक पर एक बड़ा लाभ । Conpokal के साथ, AFM के माध्यम से बल मानचित्रण नमूने के भीतर साइटोस्केलेटल संरचना के लिए सेल कठोरता, आसंजन, या आकृति विज्ञान सहसंबंधित करने के लिए confocal छवियों पर मढ़ा है, उदाहरण के लिए । कॉनपोकल विधि का समग्र लक्ष्य शोधकर्ताओं को एक संक्षिप्त, प्रभावी तरीके से जीवित नमूनों का अध्ययन करने के लिए एक मंच प्रदान करना है, जो एक ही मंच में छवि और भौतिक संपत्ति डेटा दोनों प्रदान करता है। इस काम में, हम उचित नमूना चयन और तैयारी, उपकरण सेटअप, कैंटिलीवर अंशांकन सहित कॉनपोकल के संचालन को प्रदर्शित करते हैं, और सफल समस्या निवारण के लिए दिशानिर्देश प्रदान करते हैं। प्रोटोकॉल के बाद, हम प्रतिनिधि परिणाम प्रदान करते हैं जिसमें सफल बैक्टीरिया और सेल एएफएम हाइट मैपिंग, बैक्टीरिया और सेल एएफएम मॉड्यूलस मैपिंग, और एक ही सेल कॉन्फोकल और एएफएम के माध्यम से बहु-लेबल कोशिकाओं की कॉन्फोकल इमेजिंग शामिल हैं। हम Conpokal प्रक्रिया महत्वपूर्ण कदम, समस्या निवारण सिफारिशों, तकनीक सीमाओं, महत्व, और विधि के लिए भविष्य के दृष्टिकोण की चर्चा के साथ समाप्त ।

Protocol

1. उपकरणों, संस्कृति मीडिया, व्यंजन की तैयारी

  1. कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप और परमाणु बल माइक्रोस्कोप दोनों के लिए बिजली स्रोतों को चालू करें, साथ ही किसी भी अन्य संबद्ध उपकरणों या उपकरणों का उपयोग कॉनपोकल के दौरान किया जाता है। उपकरणों को मापन शुरू करने से पहले थर्मल रूप से संतुलन और स्थिर करने के लिए पर्याप्त समय की अनुमति दें। आमतौर पर, 1 एच पर्याप्त है।
  2. एक साफ, सिस्टम-अनुमोदित, ग्लास-तली पेट्री डिश तैयार करें और आधा भरा भरें, लेकिन फॉस्फेट बफर नमकीन (पीबीएस), या इसी तरह के स्पष्ट तरल के साथ दो तिहाई से अधिक भरा नहीं है। यह पकवान (जिसे "अंशांकन पकवान" के रूप में जाना जाता है) नमूना व्यंजनों से अलग है और इसका उपयोग परमाणु बल माइक्रोस्कोप (एएफएम) कैंटिलीवर का पता लगाने और जांचने के लिए किया जाएगा।
    नोट: यह महत्वपूर्ण है कि तरल स्पष्ट है और फ्लोरेसेंस स्पेक्ट्रा के साथ किसी भी हस्तक्षेप को रोकने के लिए कम ऑटोफ्लोरेसेंस है। पीबीएस की सिफारिश की जाती है क्योंकि यह जैविक वातावरण की नकल करता है।
  3. प्रयोगात्मक नमूना व्यंजन तैयार करें जैसे कि संबंधित तरल ने पकवान को कम से कम आधा भरा दिया है। यदि नमूना फ्लोरोसेंट है, तो सुनिश्चित करें कि यह जरूरत पड़ने तक कवर किया गया है या अंधेरे जगह में है। लेंस क्लीनर और लेंस पोंछे का उपयोग कर सभी ग्लास व्यंजनों के नीचे साफ।
  4. कंप्यूटर (एस) हार्ड ड्राइव (एस) पर कॉन्फोकल और एएफएम के लिए डेटा स्टोरेज फ़ोल्डर बनाएं।

2. कोशिकाओं या सूक्ष्मजीवों का चयन

  1. बैक्टीरिया स्टॉक समाधान बनाने के लिए, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में टोड हेविट यीस्ट (रीवाई) रातोंरात (घातीय चरण के लिए) के 15 एमएल में एक टीका लूप का उपयोग करके स्ट्रेप्टोकोकस म्यूटन बैक्टीरिया को टीका लगाते हैं।
  2. रात भर इनक्यूबेशन पूरा होने से पहले 1 घंटा, पॉली-एल-लिसिन समाधान के 1 एमएल के साथ कोट प्रयोगात्मक नमूना व्यंजन या ग्लास-तली डिश के कांच के हिस्से को कवर करने के लिए पर्याप्त और 1 घंटे के लिए जैव सुरक्षा कैबिनेट में छोड़ दें। सेटिंग के बाद, पॉली-एल-लिसिन समाधान को एस्पिरेट करें और पीबीएस के साथ व्यंजन 3x कुल्ला करें।
  3. 18 - बैक्टीरियल इनक्यूबेशन के 24 घंटे के बाद, 0.6 - 0.7 के ऑप्टिकल घनत्व तक बैक्टीरियल सस्पेंशन के 1 मिलीलन के साथ रीधू को टीका लगाएं (टीका लगाने के लिए विशिष्ट मूल्य 1 एमएल बैक्टीरियल सस्पेंशन प्रति डिश के साथ तेरी के 3 एमएल हैं)। प्रत्येक पॉली-एल-लिसिन-कोटेड डिश में 1 एमसीएल नया बैक्टीरिया समाधान जोड़ें और 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। पिछले 10 मिनट के दौरान, प्रत्येक डिश में 1 मिलियन हरे फ्लोरोसेंट झिल्ली दाग (1 माइक्रोएम की एकाग्रता) जोड़ें।
  4. पीबीएस के साथ प्रत्येक डिश 3x कुल्ला। धीरे-धीरे एक जैव सुरक्षा कैबिनेट के अंदर कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड समाधान के बारे में 1 एमएल के साथ बैक्टीरिया को ठीक करें। फिक्सेशन के बाद पीबीएस के साथ प्रत्येक डिश 3x कुल्ला।
  5. तरल नाइट्रोजन में मानव भ्रूण गुर्दे (HEK) २९३ कोशिकाओं को स्टोर करें । चढ़ाना से पहले 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान पर तेजी से विगलन प्रदर्शन करें।
  6. सेल कल्चर मीडिया में बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स समाधान के 1 एमसीएल को प्रत्येक सेल नमूना डिश और 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर (5% सीओ2)में जोड़ें। समाधान को एस्पिरेट करें और सेल कल्चर मीडिया के साथ व्यंजन धोएं। एचईके 293 कोशिकाओं की आवश्यक संख्या(उदाहरण के लिए,35 मिमी डिश प्रति 100,000 कोशिकाएं) प्लेट करें और सेल कल्चर मीडिया के 2 एमएल जोड़ें। फिर, 48 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं (5% सीओ2)इनक्यूबेट (5% सीओ) ।
  7. 48 घंटे के बाद, प्रत्येक सेल नमूना पकवान में फ्लोरोसेंट माइक्रोट्यूबुल साइटोस्केलेटन डाई (1x की एकाग्रता) के 2 माइक्रोल जोड़ें और 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। डाई युक्त समाधान को एस्पिरेट करें, कोशिकाओं को पीबीएस के साथ 3x धोएं, और सेल कल्चर मीडिया के 2 एमएल जोड़ें।
  8. नमूना व्यंजनों में प्लाज्मा झिल्ली डाई (10 माइक्रोन की एकाग्रता) का 1 μL जोड़ें और 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। पीबीएस के साथ डाई 3x युक्त समाधान धोएं और सेल कल्चर मीडिया के 2 एमएल जोड़ें।
  9. एक नाभिक एसिड डाई के 1 माइक्रोन जोड़कर नाभिक को काउंटरटाइन करें (10 माइक्रोन की एकाग्रता) नमूना व्यंजनों के समाधान और 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट। पीबीएस के साथ डाई 3x युक्त समाधान धोएं और संस्कृति मीडिया के 2 एमएल जोड़ें।

3. एएफएम प्रक्रिया

  1. कंप्यूटर पर सॉफ्टवेयर आइकन पर क्लिक करके परमाणु बल माइक्रोस्कोप (एएफएम) ऑपरेटिंग सॉफ्टवेयर खोलें।
  2. कम आवर्धन वायु उद्देश्य (अनुशंसित 10x या 20x) में घुमाएं या डालें। टिप कम करने और अंशांकन के दौरान 5 मिमी या उससे अधिक की लंबी कार्य दूरी फायदेमंद है।
  3. पहले से स्थापित नहीं तो चुना सेल नमूना चरण माउंट। जीवित नमूनों के लिए, वांछित तापमान पर नमूना रखने के लिए एक डिश हीटर का उपयोग करें।
  4. साफ लोड, सिस्टम अनुमोदित पेट्री डिश पीबीएस से भरा आधा भरा (चरण १.२ में तैयार) या इसी तरह के स्पष्ट तरल (अंशांकन पकवान) । यदि नमूना चरण में अंतर्निहित क्लैप्स हैं, तो इनका उपयोग करें, अन्यथा, नमूने को स्थिर करने के लिए वैक्यूम तेल का उपयोग करें।
  5. वांछित डेटा संग्रह के लिए एक उपयुक्त एएफएम कैंटिलीवर चुनें और नीचे दिए गए चरणों के बाद इसे इंस्टॉल करें।
    1. दस्ताने का उपयोग करना, एएफएम चिप बढ़ते चरण, चिमटी, और एक छोटे पेचकश का उपयोग करके कांच ब्लॉक में AFM चिप माउंट । ध्यान से एएफएम चिप को ग्लास ब्लॉक पर रखें और इसे इस तरह उन्मुख करें कि यह केंद्रित हो। कैंटिलीवर, प्लस एएफएम चिप का एक बहुत छोटा सा हिस्सा, बढ़ते ब्लॉक के दृश्यमान, गैर-अपारदर्शी हिस्से में होना चाहिए।
    2. जब तक चिप ग्लास ब्लॉक के खिलाफ सुखद है पेंच कस द्वारा पेचकश के साथ चिप सुरक्षित। जांच करें कि एएफएम कैंटिलीवर स्टीरियो माइक्रोस्कोप या हैंडहेल्ड स्पाइग्लास का उपयोग करके सही ढंग से उन्मुख है। जरूरत के अनुसार एडजस्ट करें। एक बार ठीक से उन्मुख होने के बाद, ग्लास ब्लॉक को उचित अभिविन्यास में एएफएम हेड में रखें और इसे जगह में लॉक करें।
      नोट: ग्लास ब्लॉक के भीतर एएफएम चिप का अभिविन्यास महत्वपूर्ण है ताकि सिस्टम लेजर कैंटिलीवर की पीठ पर निशाना साधें और फोटोडिटेक्टर पर सही ढंग से प्रतिबिंबित करें। प्लेसमेंट के दौरान शिकंजा को अधिक नहीं करने के लिए सावधान रहें क्योंकि यह प्रक्रिया एएफएम चिप, कैंटिलीवर या टिप को तोड़ने का कारण बन सकती है।
  6. कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के ब्राइटफील्ड विकल्प का उपयोग करके, फोकस नॉब का उपयोग करके अंशांकन पकवान के नीचे का पता लगाएं। इस जेड ऊंचाई को उस मूल्य के रूप में ध्यान दें जहां पकवान के नीचे माइक्रोस्कोप उद्देश्य के संबंध में स्थित है।
  7. जेड स्टेपर मोटर्स संचालित करने वाले कंप्यूटर पर एएफएम सिस्टम के मोटर कंट्रोल पैनल का उपयोग करके, एएफएम कैंटिलीवर को नमूने से ऊपर की ओर 2000 माइक्रोन ले जाएं।
  8. दोनों हाथों का उपयोग करके, धीरे-धीरे एएफएम सिर को एएफएम चिप के साथ नमूना चरण पर रखें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि एएफएम सिर पर प्रत्येक ऊर्ध्वाधर बिंदु को एएफएम चरण पर उनके निर्धारित खांचे में मजबूती से सेट किया जाए। एक बार AFM सिर जगह में है, नेत्रहीन देखो कैसे करीब कैंटिलीवर धारक पकवान के लिए है । यदि यह बहुत करीब प्रतीत होता है, जैसे कि एएफएम सिर संपर्क में है या नमूना पकवान के शीर्ष के 1 मिमी के भीतर है, तो नमूने की ओर एएफएम टिप को कम करने से पहले जेड स्टेपर मोटर्स का उपयोग करके इसे वापस करें।
  9. ब्राइटफील्ड रोशनी का उपयोग करके, एएफएम सॉफ्टवेयर पर जेड स्टेपर मोटर कंट्रोल पैनल का उपयोग करके ग्लास डिश के नीचे एएफएम चिप को धीरे-धीरे कम करें। उपकरण मंच पर एएफएम सिर के एक्स-वाई या इन-प्लेन गति को नियंत्रित करने वाले मैनुअल माइक्रोमीटर का पता लगाएं। एएफएम हेड को ठीक करके एएफएम हेड को सही करके देखने के क्षेत्र के भीतर एएफएम कैंटिलीवर की स्थिति को समायोजित करें क्योंकि कैंटिलीवर देखने में आता है।
    1. चूंकि पकवान के नीचे के संबंध में स्थान इस समय अज्ञात है, पेट्री डिश में एएफएम टिप को दुर्घटनाग्रस्त करने से बचने के लिए 100 - 200 माइक्रोन के चरणों के साथ कम है। आमतौर पर, टिप को 800 - 2000 माइक्रोन कम करने की आवश्यकता है। के रूप में टिप कम है, एक छाया के लिए देखने के लिए माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर दृश्य है, जो इंगित करता है AFM टिप पकवान के नीचे के करीब हो रही है पर दिखाई देते हैं ।
    2. वेतन वृद्धि को घटाकर 20 - 50 माइक्रोन करें। कैमरा इमेज के लुक अप टेबल (LUTs) को समायोजित करना सुनिश्चित करें क्योंकि टिप कॉन्फोकल सॉफ्टवेयर पर LUTs पैनल का उपयोग करके डिश में कम करती है। छोटे चरणों का उपयोग करके एएफएम टिप को कम करना जारी रखें जब तक कि यह ज्यादातर फोकस न हो जाए।
    3. सुनिश्चित करें कि टिप काफी अंधेरा है ताकि इसका सामान्य आकार देखा जा सके और देखने के क्षेत्र में केंद्रित हो सके। यह भी सुनिश्चित करें कि टिप धुंधला दिखाई देता है, जो पुष्टि करता है कि यह पकवान के नीचे का सामना नहीं किया है, अभी तक।
  10. माइक्रोस्कोप फोकस को इस तरह एडजस्ट करें कि उद्देश्य की कामकाजी दूरी को ध्यान में रखते हुए टिप अब फोकस में हो। एक उच्च आवर्धन उद्देश्य पर जाने से पहले, कंफोकल सॉफ्टवेयर पर माप उपकरण पैनल तक पहुंच कर एएफएम कैंटिलीवर की चौड़ाई और लंबाई एकत्र करने के लिए माइक्रोस्कोप माप उपकरण का उपयोग करें। इन मापों पर ध्यान दें।
    नोट: यह महत्वपूर्ण है कि नमूना पकवान के नीचे जो भी नमूना पकवान AFM टिप के संपर्क में आने के लिए कारण हो सकता है, संभावित यह नुकसान के नीचे में उद्देश्य दुर्घटना नहीं है ।
  11. यदि मौजूद हैं, तो लेजर लाइट फिल्टर को हटा दें, और यह सुनिश्चित करें कि एएफएम लेजर चाल में है, ताकि लेजर लाइट प्रकाशिकी में दिखाई दे।
    1. लेजर संरेखण डायल का उपयोग करना, लेजर को देखने के क्षेत्र में और एएफएम टिप के पास ले जाएं। एक बार लेजर इस स्थान पर है, लेजर प्रकाश फिल्टर की जगह।
    2. लेजर संरेखण डायल का उपयोग करना, लेजर को पीछे की ओर रखें जहां एएफएम टिप कैंटिलीवर पर स्थित है। इस बिंदु पर, लेजर संरेखण पैनल 0.0 वी से अधिक एक राशि संकेत पढ़ना चाहिए। यदि कोई राशि संकेत प्राप्त नहीं किया जाता है, तो मैन्युअल रूप से नियंत्रित दर्पण घुंडी का उपयोग करके दर्पण को समायोजित करें जब तक कि स्क्रीन पर 0.0 वी से अधिक सिग्नल नहीं पढ़ता।
    3. अधिकतम राशि संकेत प्राप्त होने तक एएफएम कैंटिलीवर पर सभी दिशाओं में छोटी मात्रा में लेजर ले जाएं लेकिन स्थिति एएफएम टिप पर है। एक बार लेजर स्थिति सेट हो जाने के बाद, मैन्युअल रूप से नियंत्रित विक्षेप डायल का उपयोग करके ऊर्ध्वाधर और पार्श्व विक्षेप को शून्य करें।
    4. एएफएम सॉफ्टवेयर पर लेजर अलाइनमेंट पैनल का निरीक्षण करें और एएफएम हेड पर वर्टिकल और पार्श्व विक्षेप घुंडी का उपयोग करके, डिटेक्टर को संरेखित करें ताकि लक्ष्य केंद्रित हो (क्रॉसहेयर के केंद्र में लाल बिंदु) और कोई ऊर्ध्वाधर या पार्श्व विक्षेप न हो।
  12. एएफएम सॉफ्टवेयर में अंशांकन खिड़की खोलें। इनपुट सभी प्रयोग विशिष्ट जानकारी। अंशांकन से पहले, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप प्रकाश स्रोत को बंद करें और एएफएम बाड़े को बंद करें, यदि लागू हो, तो कमरे के प्रकाश या कमरे के कंपन से आने वाले किसी भी संभावित शोर को गीला करने के लिए। फिर अंशांकन बटन दबाएं ताकि सिस्टम को टिप को कैलिब्रेट करने की अनुमति दी जा सके। अंशांकन पूरा होने के बाद कैंटिलेवर (एन/एम) की अकड़न और उसकी संवेदनशीलता (एनएम/वी) अंशांकन पैनल के भीतर उपलब्ध कराई जाएगी । बाद में विश्लेषण के लिए इन पर ध्यान दें ।
  13. स्टेपर मोटर्स के साथ कम से कम 2000 माइक्रोनम एएफएम कैंटिलीवर को वापस लें। एएफएम हेड को स्टेज से उतारकर कैलिब्रेशन डिश निकाल लें। वांछित उद्देश्य को घुमाएं या डालें। यदि प्रणाली को उद्देश्यों के बीच एक ही फोकल प्लेन को बनाए रखने के लिए प्रोग्राम किया जाता है तो कार्य दूरी का 10% उद्देश्य वापस ले लें। यदि यह एक तेल उद्देश्य है, तो उद्देश्य की आंख पर विसर्जन तेल की एक बूंद रखें।
    नोट: उद्देश्य के पीछे हटने से प्लेसमेंट के दौरान नमूना पकवान से संपर्क करने वाले उद्देश्य की संभावना कम हो जाती है।
  14. सुरक्षित रूप से नमूना पकवान को रखने के लिए, नमूना चरण के भीतर नमूना अंगूठी के किनारे के चारों ओर वैक्यूम तेल के छोटे डब्स को लागू करने के लिए एक कपास झाड़ू का उपयोग करें, या नमूना क्लिप को नियोजित करें। नमूना चरण में नमूना पकवान को सावधानी से लोड करें।
  15. एक बार नमूना रखा जाता है, यह तेल के माध्यम से नमूना धारक के लिए पकवान की एक अच्छी मुहर सुनिश्चित करने के लिए कई बार घुमाएं । पकवान के नीचे करने के लिए उद्देश्य बढ़ा जब तक तेल सिर्फ उद्देश्य की आंख पर बाती ।
  16. माइक्रोस्कोप का उपयोग करना, मंच पर एएफएम सिर के बिना, इमेजिंग सिस्टम को केंद्रित करें ताकि नमूना ध्यान में रहे। संदर्भ के लिए इस जेड ऊंचाई पर ध्यान दें।
  17. ध्यान से मंच पर AFM सिर की जगह।
  18. जेड स्टेपर मोटर्स का उपयोग करना, नमूने की ओर टिप कम करें। जैसे ही एएफएम टिप कम हो जाती है, जरूरत के अनुसार ब्राइटफील्ड इमेज में लुक अप टेबल (LUTs) को एडजस्ट करें । लगभग तेज होने तक टिप कम करें। मैन्युअल रूप से संचालित एएफएम टिप स्थिति माइक्रोमीटर का उपयोग करके, एएफएम हेड को स्थानांतरित करें ताकि एएफएम टिप केंद्र में हो या दृश्य के क्षेत्र में केंद्रित छोड़ दिया जाए।
    नोट: चूंकि एएफएम की जेड ऊंचाई को चरण 3.6 में पहले नोट किया गया था, इसलिए एएफएम टिप को कम करने के लिए बड़े कदम उठाए जा सकते हैं, हालांकि, तेल को पकवान के नीचे और संभावित तेल को उद्देश्य के लिए जोड़ा गया है, इसलिए यह मूल्य सिर्फ संदर्भ के लिए है। टिप ध्यान में आने के साथ ही 50 - 100 माइक्रोन कदम उठाने और छोटे को समायोजित करने की सिफारिश की जाती है
  19. एएफएम सिर पर मैनुअल माइक्रोमीटर का उपयोग करके लेजर स्थिति को फिर से समायोजित करें। यदि आवश्यक हो, तो संबंधित घुंडी को समायोजित करके ऊर्ध्वाधर और पार्श्व विक्षेपों को शून्य करें और नमूना डिश में एएफएम कैंटिलीवर को फिर से रेट करें।
    नोट: यदि कैंटिलीवर को नमूने से अलग माध्यम में कैलिब्रेट किया गया था, तो इसे अपवर्तक सूचकांक में संभावित परिवर्तन के लिए स्कैनिंग माध्यम में पुनः कैलिब्रेट किया जाना चाहिए। इसके अतिरिक्त, लेजर शोर या तापमान में परिवर्तन के कारण कैंटिलीवर की पीठ से बहाव हो सकता है। केवल लेजर को पुनः समायोजित करें और यदि आवश्यक हो तो पुन: व्यवस्थित करें और गैर-संपर्क अंशांकन का उपयोग करके ग्लास सब्सट्रेट के ऊपर नमूना पकवान में। संपर्क अंशांकन का उपयोग कर रहे हैं, नमूना माध्यम का उपयोग कर अंशांकन पकवान के अंदर पुनः कैलिब्रेट।
  20. उच्च गुणवत्ता वाले कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप छवियों को प्राप्त करने के लिए, वर्तमान तनु लाइट फ़िल्टर को फ़िल्टर के साथ बदलें जो सभी एएफएम लेजर लाइट को अवरुद्ध करता है। यह प्रकाश फिल्टर एएफएम लेजर की उज्ज्वल रोशनी से कोई हस्तक्षेप सुनिश्चित करता है।
  21. स्वचालित दृष्टिकोण कमांड बटन का उपयोग करना, आमतौर पर नीचे का सामना करना पड़ तीर द्वारा चिह्नित, नमूना पकवान के नीचे टिप कम। इमेजिंग कंट्रोल पैनल पर स्कैन का आकार/क्षेत्र, रिज़ॉल्यूशन, सेटपॉइंट, जेड लेंथ और पिक्सेल समय (या कैलिब्रेटेड/प्रचारित मानों का उपयोग करें) सेट करें और स्कैनिंग शुरू करें ।
  22. स्कैन पूरा होने के बाद, नमूना डिश में एक नई माप स्थिति में नेविगेट करने से पहले एएफएम चिप 50 - 100 माइक्रोन को उठाएं। एक बार एक नया स्थान मिल जाता है, गिलास दृष्टिकोण, और कदम ३.२१ और ३.२२ के बाद फिर से स्कैन करने के लिए शुरू करते हैं ।
  23. ऑटोसेव विकल्प चुनें, या मैन्युअल रूप से सेव पर क्लिक करके प्रत्येक व्यक्ति स्कैन से प्रत्येक उत्पन्न फ़ाइल को सहेजें।

4. कॉन्फोकल प्रक्रिया

  1. कॉन्फोकल ऑपरेटिंग सॉफ्टवेयर खोलें। सुनिश्चित करें कि सभी संबद्ध परिधीय, प्रकाश स्रोत और नियंत्रक सामान्य रूप से चालू और कार्य कर रहे हैं।
  2. नमूना देखने के लिए कम आवर्धन (10x या 20x) का उद्देश्य घुमाएं या डालें। सुनिश्चित करें कि उद्देश्य एक सुरक्षित काम की दूरी पर है जहां नमूना पकवान होगा और यदि आवश्यक हो, तो नमूना के साथ उद्देश्य की किसी भी संभावित टक्कर से बचने के उद्देश्य को वापस करें। एक कपास झाड़ू का उपयोग करना, नमूना पकवान अंगूठी के किनारे के आसपास थपका वैक्यूम तेल । यदि एक तेल उद्देश्य का उपयोग कर, उद्देश्य के सामने लेंस पर विसर्जन तेल की एक बूंद जगह
  3. नमूने चरण में वांछित नमूना रखें। यह सुनिश्चित करने के लिए कुछ समय के आसपास नमूना स्पिन करें कि वैक्यूम तेल ने नमूना चरण डालने या नमूना क्लिप को नियोजित करने के लिए एक तंग बंधन उत्पन्न किया है। यदि एक तेल उद्देश्य का उपयोग कर, पकवान के नीचे करने के लिए उद्देश्य बढ़ा तो तेल सिर्फ गिलास नीचे पर बाती । अत्यधिक ब्लीडिंग से बचने के लिए, परिवेश प्रकाश को कम से कम करें।
  4. कैमरे या आईपीस के माध्यम से ब्राइटफील्ड या एपिफ्लोरेसेंस मोड का उपयोग करना, नमूना का पता लगाना और फोकस घुंडी का उपयोग करना, कई कोशिकाओं या एक एकल कोशिका वाले ब्याज के क्षेत्र पर ध्यान केंद्रित करना। अक्सर, ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के भीतर देखने का क्षेत्र एएफएम सिस्टम (100 x 100 माइक्रोन) पर एक्स-वाई स्कैनिंग विंडो से बड़ा होगा। एएफएम सॉफ्टवेयर में मोटर कंट्रोल पैनल का उपयोग करके कॉन्फोकल फील्ड ऑफ व्यू के भीतर एएफएम स्थिति का समायोजन करें ताकि एएफएम स्कैन और कॉन्फोकल ऑप्टिक्स एक ही सुविधाओं की इमेजिंग कर रहे हैं।
    नोट: देखने के क्षेत्र के भीतर, वहां आम तौर पर केवल कुछ कोशिकाओं रहे हैं, तो यह निर्धारित करने के लिए जो सेल जांच करने के लिए वांछित है आसान है । जैसा कि एएफएम आयोजित किया जाता है, सेल एएफएम सॉफ्टवेयर पर दिखाई देता है और वहां से, उपयोगकर्ता जांच करने के लिए रुचि के विशिष्ट क्षेत्रों को इंगित कर सकता है।
  5. यदि वांछित है, तो नमूने के लेबल के आधार पर कैमरा या सीएलएम मोड का उपयोग करके उज्ज्वल-क्षेत्र या एपिफ्लोरेसेंस में छवियों को कैप्चर करें, नॉब्स फोकस करें, और माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर पर बटन कैप्चर करें।
  6. माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर का उपयोग करके, विकल्प का चयन करें या कॉन्फोकल क्षमताओं(जैसे,लेजर और बाद के मापदंडों) को सक्षम करने के लिए पैनल खोलें। यह विकल्प आमतौर पर लेजर लाइन तरंगदैर्ध्य मूल्यों द्वारा उल्लेख किया जाता है।
  7. नमूनों को धुंधला करने के लिए उपयोग किए जाने वाले रंगों के लिए उपयुक्त लेजर लाइनों का चयन करें। नमूने में उन सुविधाओं को उत्तेजित और छवि करने के लिए एक या कई लेजर लाइनों को चालू करें।
  8. लाभ को एक मूल्य पर सेट करें जो नमूनों को फ्लोरेसेंस का अनुकूलन करता है लेकिन शोर की मात्रा को सीमित करता है। एक ठेठ प्रारंभिक मूल्य 70 का लाभ है।
  9. संतृप्त पिक्सेल से बचने के लिए लेजर शक्ति को समायोजित करें लेकिन गतिशील रेंज को अधिकतम करें। लेजर पावर के लिए एक विशिष्ट शुरुआती रेंज 1 - 3% है।
  10. ऑप्टिकल सेक्शनिंग के लिए संकल्प को अधिकतम करने के लिए पिनहोल आकार को 1 हवादार इकाई में सेट करें। यदि नमूना मंद है और लेजर पावर पहले से ही अधिक है, तो जेड एक्सिस रेजोल्यूशन को कम करने की कीमत पर सिग्नल बढ़ाने के लिए पिनहोल खोलें।
  11. पिक्सेल निवास समय(यानी,स्कैनिंग गति) सेट करें । 2 μs के साथ शुरू करें और यदि आवश्यक हो, तो नमूना चमक को प्रतिबिंबित करने के लिए समायोजित करें। चयनित उद्देश्य के लिए पिक्सेल आकार/स्कैन आकार चुनें जिससे इंस्ट्रूमेंट को Nyquist ऑप्शन बटन और इमेज में पिक्सेल की चुनी हुई संख्या के जरिए इसकी गणना की जा रही है ।
    नोट: मोटे नमूनों में अब रहने का समय अत्यधिक ब्लीचिंग के लिए नेतृत्व कर सकते है जब जेड ढेर एकत्र कर रहे हैं ।
  12. इंस्ट्रूमेंट के सॉफ्टवेयर पर स्कैन ऑप्शन चुनें और डाटा कलेक्शन शुरू करें।
    नोट: यदि उपकरण में कई लेजर हैं, तो प्रत्येक को स्वतंत्र रूप से अनुकूलित किया जा सकता है, और फिर बहु-फ्लोरोसेंट छवियों के लिए एक साथ भागा जा सकता है।
  13. में और बाहर ज़ूम और नमूने में देखने के इष्टतम क्षेत्र का पता लगाने के लिए फोकस घुंडी का उपयोग करें।
  14. सिस्टम के कैप्चर बटन का उपयोग करके छवियों को कैप्चर करें और कंप्यूटर की हार्ड ड्राइव, या स्थानीय बाहरी हार्ड ड्राइव पर एक वांछित स्थान/फ़ोल्डर के लिए नमूने के सभी आवश्यक फ़ाइल प्रारूपों को सहेजें।
  15. छवि को अनुकूलित करने के लिए तदनुसार लाभ, लेजर पावर, पिनहोल आकार, नमूना दर और अन्य मूल्यों को समायोजित करना जारी रखें। पिक्सेल संतृप्ति सूचकांक को यह जांचने के लिए सक्रिय किया जा सकता है कि पिक्सल ओवर-सैचुरेटेड हैं या नहीं । यदि यह अति संतृप्ति मौजूद है, लाभ और लेजर शक्ति संतृप्त पिक्सल को खत्म करने के लिए समायोजित किया जा सकता है । विशिष्ट समायोजन करने के लिए एक गाइड के रूप में LUTs का उपयोग करें।
  16. यदि संभव हो, तो सिस्टम की Nyquist नमूना दर का उपयोग करें, जो सॉफ्टवेयर में एक पैनल या बटन के रूप में प्रदर्शित किया जाता है, यह सुनिश्चित करने के लिए कि छवियां अधिकतम प्राप्य संकल्प पर एकत्र की जाती हैं।
  17. कॉन्फोकल सिस्टम के जेड स्टैक या इमेज वॉल्यूम कलेक्शन टूल को सक्रिय करें। केवल एक लेजर लाइन के साथ एक नीचे से शीर्ष विकल्प का उपयोग करना, विशेष रूप से लेजर लाइन है कि नमूना स्पष्ट में एक सुविधा रोशन, शुरू सेट और मात्रा के लिए विमानों को खत्म करने के लिए मापा जाएगा ।
  18. जेड स्टैक में विमानों के बीच सुझाए गए अंतर का उपयोग करें, जिसकी गणना उपकरण द्वारा प्रदान किए गए सर्वोत्तम प्राप्य अक्षीय संकल्प के लिए Nyquist नमूना मानदंडों को पूरा करने के लिए की जाती है और लेजर लाइन का उपयोग किया जाता है।
  19. जब कई लेजर लाइनों का उपयोग किया जाता है, तो रिक्ति की गणना के लिए सबसे कम तरंगदैर्ध्य का उपयोग करें। जब अधिग्रहण खत्म हो जाता है, तो फ़ाइल को उचित फ़ोल्डर पर सहेजें।
  20. वैकल्पिक रूप से, यदि नमूने की मोटाई का प्राथमिकताओं का ज्ञान मौजूद है, तो मध्य विमान का चयन करके मात्रा को परिभाषित करें, जो प्रतिभाशाली और सबसे तेज दिखाई देता है। इस स्थिति में, मध्य विमान के ऊपर आधा नमूना मोटाई और मध्य विमान के नीचे आधी मोटाई के लिए नीचे सेट करें।
  21. देखने के इस क्षेत्र में नमूना संग्रह पूरा हो गया है, या नमूना प्रक्षालित है के बाद, नमूना पर ब्याज की एक और जगह खोजने के लिए मोटर चालित या मैन्युअल रूप से नियंत्रित चरण का उपयोग करें और छवि संग्रह के लिए कदम दोहराने ।

5. सफाई प्रक्रिया

  1. सुनिश्चित करें कि सीएलएसएम और एएफएम दोनों से सभी डेटा फ़ाइलें उचित स्थानों पर सहेजी जाएं।
  2. कम से कम 2000 माइक्रोन या नमूना सतह पर जाने के लिए कूच की गई दूरी को जेड स्टेपर मोटर्स का उपयोग करके एएफएम चिप को वापस लें। एएफएम सिर को मंच से निकालें और इसे ध्यान से अपने विश्राम स्थल में रखें।
  3. माइक्रोस्कोप उद्देश्य को वापस लें ताकि यह नमूने से बहुत दूर हो। यदि एक तेल उद्देश्य का इस्तेमाल किया गया था, उद्देश्य अभी तक काफी दूर से मुकर जाना चाहिए कि वहां अब उद्देश्य और नमूना सब्सट्रेट के बीच संपर्क है ।
  4. दस्ताने का उपयोग करना, नमूना निकालें और तेल को साफ करें, और यदि लागू हो तो तेल, नमूना पकवान के नीचे से। एक नया, स्वच्छ, खाली पेट्री डिश प्राप्त करें और इसे 70% इथेनॉल समाधान से एक-आधा से तीन-चौथाई भरा लें। इसे नमूना धारक में रखें और एएफएम हेड को प्रतिस्थापित करें ताकि एएफएम चिप को 5 मिनट के लिए इथेनॉल समाधान में भिगोने की अनुमति दी जा सके।
  5. जबकि एएफएम चिप भिगो रही है, यह एक बाहरी हार्ड ड्राइव पर प्रयोग डेटा की नकल शुरू करने की सिफारिश की है । इथेनॉल समाधान में एएफएम चिप को कम से कम 5 मिनट तक विसर्जन करने के बाद एएफएम हेड को हटा दें और अपने विश्राम स्थल पर रख दें।
  6. दस्ताने का उपयोग करना, AFM चिप धारक को हटा दें और इसे बढ़ते स्टेशन में रखें। रबर पकड़ता के साथ चिमटी का उपयोग कर AFM चिप ध्यान से हटा दें। इस्तेमाल किए गए टिप को उस बॉक्स के स्थान पर वापस रखें जो यह अक्ष से उन्मुख होकर यह निरूपित करता है कि इसका उपयोग किया गया है। भविष्य के संदर्भ के लिए, ध्यान दें कि प्रयोग में कौन सी टिप का उपयोग किया गया था।
  7. इथेनॉल के घोल से भरी पेट्री डिश को सिस्टम से बाहर निकालकर लिक्विड और डिश को डिस्पोज करें। दस्ताने, लेंस क्लीनर, और लेंस पोंछे का उपयोग करना, धीरे मानक प्रोटोकॉल के बाद माइक्रोस्कोप उद्देश्य से तेल साफ । किसी भी तेल को हटाकर नमूना धारक को साफ करें। जैवसेफ्टी प्रोटोकॉल के अनुसार सभी अपशिष्ट सामग्रियों का निपटान करें और उनके ज्ञात स्थानों पर उपकरण वापस करें।
  8. कंप्यूटर (ओं) से डेटा संग्रह समाप्त करें और उन्हें बंद कर दें। प्रयोग के लिए उपयोग किए जाने वाले सभी उपकरणों, सहायक उपकरणों, परिधीय, या अन्य उपकरणों को बंद करें।

Representative Results

कोनोकल तकनीक को चित्रा 1 ए में योजनाबद्ध तरीके से दर्शाया गया है और सेटअप की एक छवि चित्रा 1 बीमें दिखाई गई है । एएफएम में एक ही संरचनाओं के साथ कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के माध्यम से जैविक संरचनाओं का सही सह-पता लगाने के लिए, स्थापना के दौरान दो प्रणालियों का संरेखण महत्वपूर्ण है। सम्मानित कॉन्फोकल और एएफएम निर्माताओं का चयन करें जो एक-दूसरे की स्थानिक आवश्यकताओं से परिचित हैं। इसके अतिरिक्त, तकनीक का सफल कार्यान्वयन अच्छी धुंधला प्रक्रियाओं, जैविक संरचना के स्थिरीकरण और एएफएम टिप के उचित विकल्प पर निर्भर करता है। जीवित कोशिकाओं की ऊंचाई अक्सर एएफएम इमेजिंग के लिए एक चुनौती प्रस्तुत करती है। एक जीवित HEK सेल पर एक AFM स्कैन चित्रा 2Aमें दिखाया गया है । इस विशेष एचईके सेल के लिए ऊंचाई लगभग 10 माइक्रोन थी, जो लाइन स्कैन द्वारा हरे रंग मेंप्रदर्शित (चित्रा 2B)थी। या तो शून्य ऑफसेट (टिप कैंटिलीवर के अंत में है) या सेल ऊंचाई से अधिक टिप ऊंचाई(उदाहरण के लिए,टिप ऊंचाई ≥ 10 माइक्रोन) के साथ एक एएफएम टिप व्यक्तिगत कोशिकाओं की एक अत्यधिक हल की गई छवि का उत्पादन करेगा। अनुचित एएफएम टिप विकल्प के कारण खराब स्कैन का एक उदाहरण चित्रा 2सीमें शामिल है। इस छवि में, काले पिक्सल सेल के शीर्ष पर दिखाई दिया जो यह दर्शाता है कि एएफएम पीजो एक बड़ी सेल ऊंचाई के कारण सीमा से बाहर है। एएफएम कैंटिलीवर का अंत छवि (एक गोल वर्ग) में दिखाई दिया क्योंकि टिप ऑफसेट सेल ऊंचाई की तुलना में अपर्याप्त टिप ऊंचाई के साथ संयुक्त है। AFM छवि में इन कलाकृतियों से संकेत मिलता है कि सेल को छवि के लिए एक अलग एएफएम टिप चुना जाना चाहिए।

इस विधि के लिए लाइव सेल इमेजिंग के लिए सही जांच के साथ-साथ फ्लोरेसेंस में कुशल लेबलिंग की आवश्यकता होती है। हमने चित्रा 3 ए में एक परमाणु दाग (फ्लोरेस्किंग ब्लू), एक माइक्रोट्यूबुल दाग (फ्लोरेस्किंग ग्रीन) और एक लिपोफिलिक झिल्ली दाग (फ्लोरेस्किंग लाल) के साथ एक तीन रंग की कॉन्फोकल छवि का प्रदर्शन किया। इन लाइव सेल जांच उनके सीमित स्पेक्ट्रल ओवरलैप और मानक फिल्टर क्यूब्स के साथ उनकी अनुकूलता के कारण चुना गया था। हमने चित्रा 3बीमें ब्राइटफील्ड ऑप्टिकल इमेज को भी शामिल किया है ।

एएफएम से, नैनोमैकेनिकल मॉडल के साथ टिप इंडेंटेशन का विश्लेषण, सतह का एक मॉड्यूलस मानचित्र पैदा करता है। टिप आकार के लिए हर्ट्ज मॉडल फिट और पैराबोलिक प्रोफाइल (8 एनएम का त्रिज्या) का उपयोग करके निर्मित एक मॉड्यूलस मानचित्र का एक उदाहरण चित्रा 4 ए में सेल आकार के 3 डी पुनर्निर्माण पर मढ़ा हुआ दिखाया गया है (जो चित्र 3में दिखाए गए समान दो कोशिकाएं हैं)। लेजर कॉन्फोकल जेड स्टैक का संबंधित 3डी प्रक्षेपण चित्रा 4बीमें दिखाया गया है।

विधि छोटे जैविक संरचनाओं के लिए भी उपयुक्त है, जिसमें एकल बैक्टीरिया शामिल हैं जिनकी सूक्ष्म और नैनोस्कोपिक विशेषताओं को प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके हल करना मुश्किल है। एक चल रहे अध्ययन कोंपोकल तकनीक का उपयोग करता है जो कोशिका की दीवार के भीतर यांत्रिक तंत्र का पता लगाने के लिए करता है जो स्ट्रेप्टोकोकस म्यूटनएस में एंटीबायोटिक प्रतिरोध को प्रभावित करता है।74 कोशिका दीवार घटकों में हेरफेर के परिणामस्वरूप आकृति विज्ञान और एंटीबायोटिक प्रतिरोध में परिवर्तन हुआ। कॉनपोकल सेल वॉल घटकों की उपस्थिति या अनुपस्थिति के साथ कुछ यांत्रिक गुणों के लिए एक ही सेल नमूनों पर लाइव, इन-सॉल्यूशन, डेटा संग्रह(जैसे,सतह आकृति विज्ञान, लोचदार मॉड्यूलस, आसंजन शक्ति, और सतह खुरदरापन) की सुविधा प्रदान करता है। चित्रा 5ए, बी में एक एएफएम स्कैन और स्ट्रेप्टोकोकस म्यूटन जीवाणु का मापा गया मॉड्यूलस नक्शा शामिल है। पारंपरिक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी की तुलना में एएफएम के साथ इस पैमाने पर बेहतर संकल्प हासिल किया गया।

चित्र 6 में एक हरे फ्लोरोसेंट सेल संरचना दाग के साथ दाग एंटोकोकस मल की एक कॉलोनी की एक कॉन्फोकल छवि शामिल है, जो सेल की दीवार को देता है। चित्रा 5 और चित्रा 6 यूकेरियोटिक कोशिकाओं के अलावा रोगाणुओं के लिए कोपोकल तकनीक की प्रयोज्यता प्रदर्शित करता है।

Figure 1
चित्रा 1: कॉनपोकल सेटअप।
(क)कोंपोकल तकनीक का योजनाबद्ध। (ख)इंस्ट्रूमेंट सेटअप की छवि । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: जीवित कोशिकाओं की परमाणु बल माइक्रोस्कोपी।
(A)दो एचईके कोशिकाओं की एएफएम छवि। (B)सेल की ऊंचाई को इंगित करने वाली एचईके सेल की हाइट प्रोफाइल (ए में ग्रीन लाइन) 10 माइक्रोन पर काफी बड़ी है । (ग)एस्ट्रोसाइट सेल की खराब एएफएम छवि जहां एएफएम पीजो सेल के शीर्ष पर सीमा से बाहर है और कैंटिलीवर छोर की रिवर्स इमेजिंग का सबूत है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: जीवित कोशिकाओं की कॉन्फोकल और ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोपी।
(ए)जीवित एचईके कोशिकाओं की लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी जिसमें परमाणु दाग (फ्लोरेस्किंग ब्लू), एक माइक्रोट्यूबुल दाग (फ्लोरेस्किंग ग्रीन) और एक लिपोफिलिक झिल्ली दाग (फ्लोरेस्किंग लाल) से सना हुआ है। (ख)इसी ब्राइटफील्ड ऑप्टिकल इमेज । स्केल बार 10 माइक्रोन हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: एएफएम के 3डी रेंडरिंग और जीवित एचईके कोशिकाओं के कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी की तुलना।
(ए)एमएफएम से सेल के 3डी पुनर्निर्माण पर मढ़ा टिप आकार के लिए हर्ट्ज मॉडल फिट और एक पैराबोलिक प्रोफाइल (8 एनएम के त्रिज्या) का उपयोग करके निर्मित मॉड्यूलस मानचित्र। (ख)लेजर कॉन्फोकल जेड स्टैक का इसी 3डी प्रक्षेपण एक परमाणु दाग (फ्लोरेस्किंग ब्लू), एक माइक्रोट्यूबुल दाग (फ्लोरेस्किंग ग्रीन) और एक लिपोफिलिक झिल्ली दाग (फ्लोरेसेपिंग लाल) के साथ। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: बैक्टीरिया के नमूने का एएफएम।
(A)एएफएम स्कैन और(बी)एक स्ट्रेप्टोकोकस म्यूटन जीवाणु के मॉड्यूलस मानचित्र मापा जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: बैक्टीरिया के नमूने की कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी।
हरे फ्लोरोसेंट झिल्ली दाग के साथ एंटोकोकस मल की एक कॉलोनी की कॉन्फोकल छवि। स्केल बार 5 माइक्रोन है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

कॉनपोकल उच्च गुणवत्ता वाली छवियों को इकट्ठा करने और तरल वातावरण में लाइव बायोमैटेरियल्स के सीटू यांत्रिक गुणों के लिए एक उन्नत, प्रभावी तकनीक है। लाइव-नमूना यांत्रिक गुणों के साथ संयुक्त असाधारण आकृति विज्ञान और स्थलाकृति छवियों को इकट्ठा करने की क्षमता पिछले विशिष्ट इलेक्ट्रॉन और प्रकाश माइक्रोस्कोपी तकनीकों तक फैली हुई है। अलग से, एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप नमूनों की उच्च गुणवत्ता, विस्तृत फ्लोरोसेंट छवियों को प्राप्त करने के लिए ब्राइटफील्ड, एपिफ्लोरेसेंस और लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल क्षमताएं प्रदान करता है। एएफएम यांत्रिक लक्षण वर्णन प्रदान करता है, लेकिन सहायक प्रकाशिकी के बिना नमूना नेविगेट करना मुश्किल हो जाता है। दो प्रणालियों के संयुक्त होने के साथ, एक उपयोगकर्ता प्रयोग के दौरान सटीक एक ही सेल की छवियों और यांत्रिक गुणों दोनों को एकत्र कर सकता है, जो दो अलग-अलग उपकरणों पर एक बड़ा लाभ है। इस पांडुलिपि का उद्देश्य जीव विज्ञान, इंजीनियरिंग और स्वास्थ्य के भविष्य के लिए संयुक्त Conpokal प्रणाली की व्यापक क्षमताओं पर उपयोगकर्ताओं को सूचित करना और मार्गदर्शन करना है। प्रोटोकॉल में उपकरणों, संस्कृति मीडिया, व्यंजन, सूक्ष्मजीवों का चयन, एएफएम प्रक्रिया, कॉन्फोकल प्रक्रिया और सफाई की तैयारी शामिल है। एक सफल लाइव, इन-सॉल्यूशन, कॉन्पोकल सत्र के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम नमूना स्थिरीकरण, विवेकपूर्ण टिप चयन और लाइव दाग निष्पादन हैं। इस पांडुलिपि के लिए चर्चा अनुभाग संस्कृति सिफारिशों, समस्या निवारण सुझावों और परिचालन दिशानिर्देशों, और Conpokal तकनीक के लिए भविष्य के काम पर विस्तार से होगा । संस्कृति सिफारिशों नमूना संस्कृति, स्थिरीकरण, और धुंधला पर मार्गदर्शन को कवर किया जाएगा । एएफएम, कॉन्फोकल, और कॉन्पोकल टिप्स और दिशानिर्देश टिप चयन और अंशांकन, संकल्प, सीमाओं और एक साथ ऑपरेशन के पास चर्चा करेंगे। भविष्य के काम में संभावित अनुसंधान मार्गों के दृष्टिकोण और क्षमता शामिल हैं।

प्रोटोकॉल संस्कृति, जांच, और दोनों जीवित सेल और तय बैक्टीरिया के नमूनों की इमेजिंग को शामिल किया गया । तरल में एएफएम का संचालन करते समय एक चुनौती नमूना बाधा और हाइड्रोडायनामिक ड्रैग के कारण कैंटिलीवर आंदोलन बाधा से उपजी होती है। यदि नमूने का अच्छी तरह से सब्सट्रेट का पालन नहीं किया जाता है, तो तरल में तैरते नमूने के वर्गों द्वारा कैंटिलीवर की बेईमानी की क्षमता होती है। उस मामले में, माप से समझौता किया जाता है क्योंकि वे नमूने के लोचदार पालन और माइक्रोमैकेनिकल गुणों का एक अनुमान है। एचईके कोशिकाओं को स्थिर के साथ नहीं माना जाता था, हालांकि, एस म्यूटन और ई. मल को अन्य प्रोकैरियोटिक कोशिकाओं के समान अतिरिक्त स्थिरीकरण की आवश्यकता होती है। चुने गए बैक्टीरिया ने सक्रिय आंदोलन दिखाया जो सेल जांच और इमेजिंग में रुकावट पैदा करता था, इसलिए, नमूनों को धीरे से, रासायनिक रूप से स्थिरीकरण को बढ़ावा देने के लिए तय किया गया था। रासायनिक निर्धारण के विकल्प हैं, जैसे फिल्टर झिल्ली जो शारीरिक रूप से छिद्रों75में व्यक्तिगत कोशिकाओं को फंसाते हैं।

टिप चयन भी सेटअप और AFM के संचालन के लिए एक महत्वपूर्ण घटक है। जब जैव सामग्री के विरूपण पर आधारित यांत्रिक गुणों की मांग की जाती है, तो किसी को कैंटिलीवर कठोरता और सामग्री कठोरता अनुकूलता पर विचार करना चाहिए, जो एक गैर-तुच्छ कार्य है। मुख्य लक्ष्य चयनित कैंटिलीवर की कठोरता के साथ सामग्री की कठोरता से सबसे अच्छा मिलान करना है। यदि कैंटिलीवर नमूने की तुलना में बहुत नरम है, तो यह बहुत अधिक विक्षेप के अधीन होगा। यदि कैंटिलीवर नमूने की तुलना में कठोर है, तो एएफएम डिटेक्टर ऐसे छोटे विक्षेपों को पकड़ने में असमर्थ हो सकता है। यह सिफारिश की जाती है कि प्रयोगात्मक आवेदन के आधार पर चुनने के लिए उपयुक्त एएफएम कैंटिलीवर का चयन करते समय। आंतरायिक संपर्क मोड में विस्तृत छवियों को एकत्र करने के लिए, 5 एनएम के भीतर कठोरता और टिप त्रिज्या के लिए 0.1 - 0.3 एन/एम की सीमा के भीतर एएफएम टिप्स - 100 एनएम लाइव सेल इमेजिंग के लिए प्रभावी हैं। छोटे शंकु युक्तियों की सिफारिश की जाती है। शार्प टिप्स एक छोटा संपर्क क्षेत्र और नमूना आकृति विज्ञान76में छोटे विवरण और सुविधाओं को एकत्र करने में और सहायता करने की क्षमता प्रदान करते हैं। हालांकि, तेज युक्तियां भी समस्याग्रस्त हो सकती हैं क्योंकि सेटिंग्स(जैसे,सेट पॉइंट, पिक्सेल टाइम, एप्रोच वेग) को बहुत अधिक इंडेंटेशन की आवश्यकता होती है या इंडेंटेशन बहुत तेज होता है। उच्च तनाव दर प्रभाव से बचने के लिए, एक तेज टिप के पास स्थानीय तनाव सख्त, या बस संपर्क क्षेत्र और दृष्टिकोण गति को नियंत्रित करने के लिए, कई एक लोचदार मॉड्यूलस को मापने के लिए एक कोलाइडल टिप के साथ बल स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग करने के लिए चुनते हैं ।

1 के भीतर कठोरता और टिप त्रिज्या के लिए 0.01 - 1.0 एन/एम की सीमा के भीतर एएफएम टिप्स - जीवित कोशिकाओं की लोचदार मोडुली को मापने के लिए 5 माइक्रोन की सिफारिश की जाती है। बड़े टिप आकार, आम तौर पर ग्लास कॉलोइड, एक ज्ञात संपर्क क्षेत्र प्रदान करते हैं और संपर्क में रहते हुए सेल को पंचर करने की संभावना नहीं है। आयताकार कैंटिलीवर को त्रिकोणीय पर पसंद किया जाता है क्योंकि अंशांकन के दौरान, त्रिकोणीय ज्यामिति के लिए संपर्क-आधारित अंशांकन की तुलना में आयताकार ज्यामिति के लिए संपर्क मुक्त विधि का उपयोग किया जा सकता है। इसके अलावा, AFM सुझावों की नाजुक प्रकृति के कारण, यह सिफारिश की जाती है कि ऑपरेटर नाजुक एएफएम चिप या बढ़ते ब्लॉक को नुकसान पहुंचाने की क्षमता को कम करने के लिए रबर युक्तियों के साथ चिमटी लागू करता है। ध्यान रखने के लिए अन्य मापदंडों में एएफएम टिप का दृष्टिकोण वेग और नमूने में इंडेंटेशन की मात्रा शामिल है। एक अच्छा दिशानिर्देश नमूने की मोटाई (या ऊंचाई) के बारे में 10% तक इंडेंटेशन रखना और एक वेग चुनना है जो कैंटिलीवर38द्वारा अनुभव किए गए संभावित हाइड्रोडायनामिक प्रतिरोध को पहले से ही चुनता है।

जटिल प्रयोगात्मक उपकरण आम तौर पर बाधाओं के साथ आते हैं जिन्हें स्थापित, अंशांकन और संचालन में समस्या निवारण की आवश्यकता होती है। नमूना या नमूना सब्सट्रेट में AFM टिप या कैंटिलीवर दुर्घटनाग्रस्त नए उपयोगकर्ताओं के लिए एक आम गलती है। इस मुद्दे से बचने के लिए, प्रोटोकॉल 2000 माइक्रोन से कैंटिलीवर का समर्थन करने का सुझाव देता है। यह चरण सुनिश्चित करता है कि टिप डिश के नीचे के संपर्क में नहीं आएगी यदि पिछला उपयोगकर्ता प्रयोग के बाद सफाई करते समय टिप को वापस करना भूल गया था। हालांकि, 2000 माइक्रोन दूरी इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किए गए चयनित डिश होल्डर के लिए चुनी गई थी। एक अलग रेंज, बड़ा या छोटा, डिश धारक शैली के आधार पर इस्तेमाल किया जा रहा है के आधार पर चयनित होने की आवश्यकता हो सकती है । लेजर और डिटेक्टर के संरेखण के दौरान, प्रोटोकॉल योग संकेत को अधिकतम करने के लिए एक दर्पण घुंडी के समायोजन का उल्लेख है । एक दर्पण समायोजन घुंडी सभी AFMs पर मौजूद नहीं हो सकता है । यदि वर्तमान, हालांकि, कम राशि के संकेत को परेशान करने के लिए साधन में हेरफेर करने का एक तरीका दर्पण घुंडी को समायोजित करना है, जिसका उपयोग उस माध्यम के लिए खाते में किया जाता है जिसमें स्कैनिंग होगी; या तो तरल(जैसे,पानी, मीडिया, पीबीएस) या हवा। हवा के माध्यम से और तरल के माध्यम से प्रकाश के लिए अपवर्तन के सूचकांक में अंतर के कारण, दर्पण घुंडी को समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है। एएफएम कैंटिलीवर की अधिकतम झुकने की संवेदनशीलता एएफएम टिप के स्थान पर होगी, इसलिए, लेजर लाइट, जो फोटोडिओड पर अपने प्लेसमेंट के माध्यम से झुकने की स्थिति को वापस करती है, एएफएम टिप के स्थान पर स्थित होनी चाहिए। चुने गए एएफएम टिप के आधार पर, योग सिग्नल मूल्य 0.3 - 3.0 वी से भिन्न हो सकता है। इस तरह के सीआर-Au या अल के रूप में AFM कैंटिलीवर पर एक बैकसाइड कोटिंग योग संकेत और माप की संवेदनशीलता में वृद्धि होगी ।

एएफएम ऑपरेशन के दौरान टिप अंशांकन पूरा करते समय टिप ज्यामिति प्रासंगिक है। संपर्क न होने और संपर्क अंशांकन के बीच अच्छा समझौता देखा गया है । यदि चुना गया एएफएम कैंटिलीवर आयताकार नहीं है, तो संपर्क अंशांकन करने की आवश्यकता होगी। ध्यान रखें कि जिस माध्यम में टिप को कैलिब्रेट किया जाता है, वह नमूना माध्यम के समान होना चाहिए। यदि वे तरल पदार्थ अलग होते हैं, तो उपयोगकर्ता को पुनः कैलिब्रेट करना होगा। तरल में एएफएम युक्तियों का उपयोग करते समय, सिस्टम द्वारा मापी गई आवृत्ति निर्माता द्वारा दर्शाई गई प्राकृतिक प्रतिध्वनि आवृत्ति का एक चौथाई से एक तिहाई होना चाहिए। यह जांचने का एक अच्छा तरीका है कि सिस्टम ने टिप को सही ढंग से कैलिब्रेट किया है, जेनरेट होने वाली थर्मल शोर फ़ाइल के भीतर मूल्यों को सत्यापित करना है। सुनिश्चित करें कि यह फ़ाइल उचित फ़ोल्डर को बचाती है। यदि सिस्टम को कैलिब्रेट करने में परेशानी होती है या गैर-संभावित मान बाहर आते हैं, फिर से कैलिब्रेट करते हैं, या लेजर स्थिति को थोड़ा समायोजित करते हैं तो फिर से कैलिब्रेट करें।

खराब राशि संकेत का एक और कारण AFM कैंटिलीवर संरेखण के कारण हो सकता है। जब एएफएम चिप को ग्लास ब्लॉक में रखा जाता है, तो यह आवश्यक है कि कैंटिलीवर की नोक छोटी लेजर खिड़की (चिकनी ग्लास क्षेत्र) के भीतर बनी रहे। यदि चिप बहुत दूर आगे है, जिस कोण पर कैंटिलीवर स्वाभाविक रूप से टिकी हुई है कैंटिलीवर से प्रतिबिंब के साथ एक मुद्दा पैदा कर सकता है, फोटोडिटेक्टर याद आ रही है और गरीब राशि संकेत में जिसके परिणामस्वरूप । यदि चिप बहुत दूर वापस आ गया है, लेजर से कैंटिलीवर के पीछे प्रतिबिंबित करने में असमर्थ हो जाएगा, गरीब राशि संकेत के कारण । इन कारणों से घुड़सवार एएफएम चिप को एडजस्ट करने की जरूरत पड़ सकती है । इसके अतिरिक्त, एक और मुद्दा है कि सामना किया जा सकता है नमूना की ऊंचाई के साथ होता है । इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल होने वाले एएफएम इंस्ट्रूमेंट में अधिकतम पीजो जेड रेंज (ऊंचाई) 15 माइक्रोन है। यदि कोई उपयोगकर्ता यह पाता है कि सॉफ्टवेयर किसी विशेष पिक्सेल में ऊंचाई डेटा और बल मानचित्र एकत्र करने में असमर्थ है, तो एक ब्लैक बॉक्स यह दर्शाता है कि सिस्टम सीमा से बाहर है(चित्रा 2C)दिखाई देगा । इस मुद्दे को शूट करने में परेशानी का एक तरीका पीजो ऊंचाई को कम मूल्य पर सेट करना है, जैसे कि 2 या 3 माइक्रोन इसलिए 15 माइक्रोन रेंज का अधिकांश सेल की प्रत्याशित ऊंचाई को मैप करने के लिए प्रतिबद्ध है। इस तकनीक को अधिकांश सेल या बैक्टीरिया से संबंधित प्रयोगों में जेड रेंज से जुड़े मुद्दे को ठीक करना चाहिए।

10 से अधिक ऊंचाइयों के साथ लंबे नमूनों के लिए एक विस्तारित जेड रेंज की आवश्यकता वाले प्रयोगवादी - 15 माइक्रोन को एएफएम पर एक अतिरिक्त मॉड्यूल को आगे बढ़ाने की आवश्यकता हो सकती है। एएफएम निर्माताओं के पास अधिकांश प्रणालियों के लिए अतिरिक्त लागत पर यह विकल्प उपलब्ध है। जेड रेंज का विस्तार करके, प्रयोगवादी नमूनों को स्कैन करने की उपलब्धता है जो सूक्ष्म पैमाने पर लंबा माना जाता है, जिसमें सीमा मूल्यों या AFM पीजो मोटर संशोधन से बाहर निकलने के लिए छोटे मुद्दों के साथ। यद्यपि इन मॉड्यूल की लागत अतिरिक्त होती है, कुछ, निर्माता के आधार पर, जेड दिशा में 100 माइक्रोन तक अतिरिक्त ऊंचाई प्रदान कर सकते हैं। कन्मोकल अभी भी लंबे नमूनों के साथ संभव है यदि उपयोगकर्ता के पास लंबे समय तक काम करने की दूरी है, उच्च आवर्धन उद्देश्य है या एक वायु उद्देश्य का उपयोग करने के लिए तैयार है, शायद 20x या 40x। माइक्रोस्कोप उद्देश्य आवर्धन को कम करके, काम की दूरी बढ़ जाती है, एक लंबे नमूने के शीर्ष को देखने के लिए दूरी प्राप्त करते हैं। एक कम आवर्धन उद्देश्य के लिए यह संशोधन संकल्प बलिदान होगा । इस पांडुलिपि में संदर्भित कॉन्पोकल सेटअप में, 60x टीआईआरएफ (कुल आंतरिक प्रतिबिंब फ्लोरेसेंस) उद्देश्य में ग्लास-तली नमूना डिश के कवरलिप के पास लगभग 100 माइक्रोन की कार्य दूरी है।

इस पांडुलिपि में उल्साकक्षाक्षाक्षक के संबंध में कुछ महत्वपूर्ण शर्तों पर चर्चा की जाती है । इस पांडुलिपि में आंकड़ों के उत्पादन के लिए उपयोग की जाने वाली कॉन्फोकल प्रणाली ने 1.49 के संख्यात्मक एपर्चर के साथ 60x टीआईआरएफ तेल उद्देश्य लागू किया। 405 एनएम, 488 एनएम और 561 एनएम एक्सिटेशन वेवलेंथ पर लेजर लाइनों का उपयोग लाइव सेल नमूना इमेजिंग के लिए किया गया था, जो चित्र 3 और चित्रा 4में दिखाया गया था। कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप की विवर्तन सीमा अबे संकल्प समीकरण, अबे संकल्प (x, y) = λ/2NA का उपयोग करके निर्धारित की जा सकती है, जहां λ एलेक्सा 488 के लिए एक्सट्रॉमस तरंग दैर्ध्य है, 488 एनएम पर, और एनए कॉन्फोकल कंडेनसर के लिए संख्यात्मक अपर्चर है, जो 0.3 है। इसलिए 272 एनएम का अक्षीय संकल्प निर्धारित किया जाता है। एपिफ्लोरेसेंस इमेजिंग के लिए, दो मामलों को संकल्प निर्धारित करने के लिए माना जाता है जहां पिनहोल को एक हवादार इकाई (एयू) और 0.5 एयू में सेट किया गया है। बाद के मामले में, पिनहोल को इस तरह बंद कर दिया जाता है कि महत्वपूर्ण प्रकाश हानि होती है, लेकिन संकल्प बढ़ जाता है। कॉन्फोकल सॉफ्टवेयर 170 एनएम पर पार्श्व देशी और अक्षीय देशी संकल्पों की गणना करता है और पिनहोल के लिए 0.5 एयू पर 290 एनएम, और 1 एयू में पिनहोल के लिए 200 एनएम और 370 एनएम। प्रणाली में शुरू किए गए गोलाकार विपथनों को माइक्रोस्कोप छवियों में विपरीत और संकल्प को बढ़ाने के लिए एक विहित प्रक्रिया के माध्यम से हिसाब लगाया जा सकता है। विवर्तन सीमाओं के कारण जो कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के साथ अंतर्निहित हैं, चित्रा 6 में बैक्टीरिया कॉलोनी की कॉन्फोकल छवि में चित्र 5में बैक्टीरिया के एएफएम स्कैन में देखे गए विस्तार के लिए मिलान संकल्प का अभाव है। एएफएम नैनोस्केल सुविधाओं और विस्तार तक पहुंच प्रदान करता है जिसे कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के साथ कैप्चर करना मुश्किल है। हालांकि, आवश्यक फ्लोरेसेंस रिज़ॉल्यूशन के आधार पर, चित्र 5 और चित्रा 6 यूकेरियोटिक कोशिकाओं के अलावा रोगाणुओं के लिए कोपोकल तकनीक की प्रयोज्यता प्रदर्शित करता है।

कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करने का लाभ ऑपरेटर को तेज विस्तार के साथ एक नमूने में विशिष्ट क्षेत्रों की 3डी छवियों को एकत्र करने की अनुमति देता है। ये छवियां एएफएम छवि और उसी क्षेत्र के कॉन्फोकल स्कैन के माध्यम से जांच की गई सतह को देखकर एएफएम के साथ सहसंबंधित हैं। चूंकि माइक्रोस्कोप उलटा होता है, इसलिए एक एपिफ्लोरेसेंस छवि नमूने के विपरीत पक्ष से प्रकाश जानकारी एकत्र करती है जिसकी जांच की गई थी। कॉन्फोकल सिस्टम के भीतर पिनहोल एक निश्चित दूरी से एक विमान को सीमित करने में मदद करता है, जबकि बाकी नमूने या यहां तक कि कमरे से आने वाली रोशनी को फ़िल्टर करता है। मूलतः, पिनहोल नमूने में रुचि के एकल विमान से वापस आने वाली रोशनी को अलग करने में मदद करता है। आमतौर पर, ब्याज के इस विमान में मजबूत फ्लोरोफोर मार्कर होना चाहिए क्योंकि, उल्टे कॉन्फोकल सिस्टम के लिए, एकल अणु का पता लगाना उच्च-संकल्प कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप तक सीमित होगा। एपिफ्लोरेसेंस रोशनी इस तथ्य के कारण कम वांछनीय है कि एपिफ्लोरेसेंस इमेजिंग मोड में, नमूने से कोई भी प्रकाश जो उद्देश्य में परिलक्षित होता है, एकत्र किया जाता है और छवि उत्पन्न करने के लिए उपयोग किया जाता है, इसलिए, एक ही विमान को अलग करना असंभव है। कॉन्फोकल तकनीकें पिनहोल77के कारण प्रश्न में नमूना सुविधा की अधिक अलग - अलग एकल विमान छवि प्रदान करती हैं। यदि, उदाहरण के लिए, एक यूकेरियोटिक सेल के शीर्ष की जांच एएफएम द्वारा की जाती है, तो उसी सतह को एपिफ्लोरेसेंस इमेजिंग मोड के बजाय माइक्रोस्कोप की लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल क्षमताओं से अलग किया जा सकता है। संचारित प्रकाश डिटेक्टर और 488 एनएम लेजर लाइन की सहायता से अंतर हस्तक्षेप विपरीत मोड में एक साथ इमेजिंग के माध्यम से डेटा अधिग्रहण के दौरान कोशिकाओं के स्वास्थ्य/आकार की निगरानी करने की सिफारिश की जाती है। ऊपर विस्तृत प्रक्रिया के लिए नमूने के जेड स्टैक पर कब्जा करते समय, केवल डिटेक्टर का लाभ समायोजित किया जाता है। माप के दौरान कोशिकाओं में कोई भी रूपात्मक परिवर्तन, जो फ्लोरोसेंट चैनलों में जरूरी दिखाई नहीं देता है, इंगित करता है कि कलाकृतियों को माप में पेश किया जाता है।

इमेजिंग तकनीक में उपयोग की जाने वाली सबसे कम तरंगदैर्ध्य के लिए सॉफ्टवेयर सिफारिश का पालन करके विमानों के बीच आदर्श अंतर प्राप्त किया जा सकता है। अधिग्रहण सॉफ्टवेयर के इमेज प्रोसेसिंग मॉड्यूल में उपलब्ध डेकोवोल्यूशन एल्गोरिदम को नियोजित करके देशी रिज़ॉल्यूशन और इमेज वॉल्यूम में शोर अनुपात के संकेत को प्रभावी ढंग से सुधारा जा सकता है। हालांकि, फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का प्रदर्शन, विशिष्ट दाग और रंगों का चयन जल्दी पर सेट ब्लीचिंग या ओवरलैपिंग एक्सिटेशन/उत्सर्जन स्पेक्ट्रा से क्रॉसटॉक से बचने के लिए महत्वपूर्ण है । अवसर पर, एक उपयोगकर्ता कॉन्फोकल लाइट जेनरेशन में खराबी का अनुभव कर सकता है। यदि कोई उपयोगकर्ता प्रकाश उत्सर्जन या खराब लेजर लाइनों की कमी का अनुभव करता है, तो समस्या निवारण का एक तरीका सिस्टम को रीसेट करना है, आमतौर पर ऑपरेटिंग सॉफ्टवेयर को फिर से शुरू करके किया जाता है। यदि समस्या बनी रहती है, तो प्रेषित प्रकाश डिटेक्टर प्रकाश माइक्रोस्कोप के ऑप्टिकल पथ के भीतर या जगह से बाहर जाने में विफल हो सकता है। ट्रांसमीटर डिटेक्टर की स्थिति को रीसेट करने से प्रकाश संग्रह या लेजर इमेजिंग मुद्दों को कम करने में मदद मिल सकती है।

कॉनपोकल इंस्ट्रूमेंट का फोकस यूजर्स को लिक्विड एनवायरमेंट में लाइव बायोमैटेरियल्स पर ऑप्टिकल और फोर्स बेस्ड जानकारी इकट्ठा करने की क्षमता साथ-साथ और एक ही सेल या फीचर पर देना है । यह काम स्पष्ट रूप से वर्णन करता है कि तरल में इन प्रयोगों को कैसे किया जाए, कई बायोमैटेरियल्स के लिए एक प्राकृतिक घर, हालांकि, शुष्क प्रयोग अभी भी इंस्ट्रूमेंटेशन का उपयोग करके किए जा सकते हैं। पेट्री व्यंजनों में तैयार नमूनों के साथ, पकवान की ऊंचाई एक सीमा है। एएफएम कैंटिलीवर को रखने वाले ग्लास ब्लॉक के विन्यास के कारण, व्यंजनों की साइड दीवारें ऊंचाई में 10 मिमी से कम होनी चाहिए; यदि पकवान बहुत लंबा है, तो उपकरण नमूने या सब्सट्रेट की सतह पर एएफएम टिप को कम करने में सक्षम नहीं होगा।

हालांकि नमूना आकार के लिए एक सीमा है, वहां एक समय देरी के संबंध में साधन या सॉफ्टवेयर क्षमताओं के साथ कोई सीमा नहीं है । एक साथ कॉन्फोकल और एएफएम जगह में सही कारकों के साथ संभव है। सीमा जो इसकी निकट एक साथ क्षमता में योगदान देती है, वह शोर को संदर्भित करती है जो कुछ कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी कार्यों और परमाणु बल माइक्रोस्कोपी कार्यों को एक साथ निष्पादित करते समय उत्पन्न होता है। एक जेड स्टैक के संग्रह के दौरान माइक्रोस्कोप उद्देश्य को स्थानांतरित करने वाली मोटर्स से कंपन को इसकी गति के दौरान एएफएम प्रोब टिप से संकेत में जोड़ा जाएगा। शोर एक तेल उद्देश्य से बढ़ाया जाएगा, के रूप में मोटर्स ऊपर और जेड दिशा में नीचे ले जाने के लिए नमूना में अनुक्रमिक विमानों रोशन । इसलिए, अनुशंसित प्रोटोकॉल में एएफएम स्कैन और कॉन्फोकल जेड स्टैक छवियों का अनुक्रमिक संग्रह शामिल है। एक साथ CLSM और AFM confocal के साथ स्थिर इमेजिंग की आवश्यकता होगी, हालांकि, वर्तमान तकनीक के साथ, दो उपकरणों के लिए देरी समय के रूप में सेकंड के दसियों के रूप में कम हो सकता है । एएफएम ऑपरेशन से कॉन्फोकल इमेजिंग में स्विच करने का वास्तविक समय चित्र 2ए और चित्रा 4बीमें एकत्र की गई छवियों के लिए लगभग 2 - 4 मिनट था । यह मूल्य 33 मिनट के कुल समय से दो छवि संग्रह समय अवधि को घटाकर निर्धारित किया गया था, जिसमें एएफएम स्कैन शुरू करने और पूरा करने का समय शामिल है, कॉन्फोकल इमेजिंग को सक्रिय करने के लिए इंस्ट्रूमेंट मोड स्विच करें, और कॉन्फोकल इमेजिंग को सक्रिय करने के लिए उपकरण मोड को स्विच करें, और कॉन्फोकल इमेज जेड स्टैक शुरू करें और पूरा करें।

कॉनपोकल के भविष्य का उद्देश्य एकल कोशिका प्रक्रियाओं की गहरी अंतर्दृष्टि के अलावा नए संरचना-कार्य संबंधों का पता लगाना है। उदाहरण के लिए, कोशिका लोच के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए सेल या बैक्टीरियल नमूनों पर सीटू दवा उपचार में प्रयोग बायोमैटेरियल्स, जीव विज्ञान और बायोमैकेनिक्स के क्षेत्रों में उन्नति होगी। नमूना पकवान में उपचार चिकित्सा जबकि इमेजिंग और जांच कैसे नमूना एक जीवित और ध्यान से नियंत्रित वातावरण में चिकित्सा विज्ञान का जवाब, समय के साथ ज्ञान प्रदान करेगा । एक नई दवा या पर्यावरणीय चुनौती को शामिल करने से यह समझ व्यापक होगी कि साइटोस्केलेटन या ऑर्गेनेल स्थान लोकोमोशन, टोपोलॉजी, कठोरता आदि को कैसे प्रभावित करता है। कॉनपोकल की एक और संभावित उन्नति प्रणाली का पूर्ण पर्यावरणीय नियंत्रण करने की क्षमता है। इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित वर्तमान कॉनपोकल प्रयोगशाला के अंदर से शोर को कम करने के लिए डिज़ाइन किए गए ध्वनिक बाड़े के अंदर स्थित है। इस आवास की उन्नति के भीतर परीक्षण करने की क्षमता प्रदान करेगा, शायद, एक या कारकों का एक संयोजन, ऐसे बाँझ वातावरण, तापमान नियंत्रित, या यहां तक कि चर गुरुत्वाकर्षण के रूप में उन लोगों तक ही सीमित नहीं है । जैसा कि यह खड़ा है, Conpokal विधि लाइव, इन-लिक्विड बायोमैटेरियल्स की विशेषता के लिए एक प्रभावी और उपयोगी दृष्टिकोण प्रदान करती है, लेकिन तकनीक का भविष्य केवल इन क्षमताओं को आगे बढ़ाएगा।

Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

हम संख्या P20GM130456 के तहत NIH COBRE धन स्वीकार करते हैं । हम यूके लाइट माइक्रोस्कोपी कोर को धन्यवाद देते हैं, जिसे इस काम में सहायता के लिए अनुसंधान के लिए उपाध्यक्ष द्वारा समर्थित किया जाता है । डॉ नतालिया कोरोटकोवा द्वारा एस म्यूटंस और ई. मल के उपभेदों को प्रदान किया गया था । नाटक पर शब्दों का पहला उल्लेख, Conpokal, confocal माइक्रोस्कोपी और परमाणु बल माइक्रोस्कोपी के संयोजन का वर्णन करने के लिए डॉ ब्रैड Berron, रासायनिक और सामग्री इंजीनियरिंग, केंटकी विश्वविद्यालय में, डॉ मार्था ग्रेडी (इसी लेखक) के साथ चर्चा में एक संगोष्ठी वक्ता डॉ जोनाथन फाम, जो केंटकी विश्वविद्यालय में रासायनिक और सामग्री इंजीनियरिंग में संकाय में शामिल हो गए २०१७ के पतन में ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acoustic Enclosure JPK-Bruker Acoustic Enclosure Chamber used to mitigate noise
BioTracker 488 Green Microtubule Cytoskeleton Dye Millipore Sigma SCT142 Used to label microtubules in mammalian cells
CP-qp-CONT-BSG AFM tips NanoAndMore CP-qp-CONT-BSG-B Collodial AFM tips good for modulus measurements on biological samples
Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3))) ThermoFischer Scientific D282 Used to label plasma membrane of mammalian cells
Dulbecco's Modified Eagle Medium VWR VWRL0100-0500 Component of cell culture media
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline ThermoFisher Scientific A1285601 Used to simulate biological environment
Fetal Bovine Serum Fischer Scientific 45000-736 Component of cell culture media
Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: Yeast Extract Fischer Scientific BP1422-500 Component of bacterial culture medium
FluoroDish Cell Culture Dish World Precision Instruments (WPI) FD35-100 Glass-bottomed dishes whose side walls are less than 10 mm, necessary for full function of Nanowizard 4a AFM
Hoechst 33342 nucleic acid stain ThermoFischer Scientific 62249 Used to label nucleus of mammalian cells, a good nuclear marker for live cells
Human embryonic kidney 293 cells ATCC Global Bioresource Center CRL-1573 Mammalian cells used in protocol
Matrigel VWR 47743-716 Coating in cell culture dish
Model: PFQNM-LC-A-CAL AFM tips Bruker PFQNM-LC-A-CAL AFM tips that work well for samples that have large heights (such as eukaryotic cells)
NanoWizard 4a JPK-Bruker NanoWizard 4a AFM
Nikon A1 Laser Scanning Confocal Microscope Nikon A1 HD25 Microscope used for brightfield, epi-fluorescence, and confocal imaging
PENICILLIN/STREPTOMYCIN VWR 16777-164 Component of cell culture media
PetriDishHeater JPK-Bruker PetriDishHeater Maintains desired Petri dish sample temperature
qp-BioAC-Cl AFM tips Nanosensors qp-BioAC-Cl-10 Three different AFM cantilevers of varying stiffness
Replaceable Carbon Fiber Tip Tweezers Ted Pella Inc. 5051 Used to carefully place and remove delicate AFM tips into the glass mounting block
Todd Hewitt Broth Bacto BD DIFCO Bacterius Ltd Bacto-249240 Component of bacterial culture medium
Vancomycin, BODIPY FL Conjugate Thermo Fisher Scientific V34850 Used to fluorescently label bacterial cell wall

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References

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लाइव कोशिकाओं पर एक साथ लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल और परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (Conpokal) के पास
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Sandin, J. N., Aryal, S. P., Wilkop, … More

Sandin, J. N., Aryal, S. P., Wilkop, T., Richards, C. I., Grady, M. E. Near Simultaneous Laser Scanning Confocal and Atomic Force Microscopy (Conpokal) on Live Cells. J. Vis. Exp. (162), e61433, doi:10.3791/61433 (2020).

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