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Bioengineering

라이브 셀에서 동시 레이저 스캐닝 공초점 및 원자력 현미경 검사(Conpokal) 근처

Published: August 11, 2020 doi: 10.3791/61433
Automatic Translation
1, 2, 3,4, 2,4, 1
1Department of Mechanical Engineering, University of Kentucky, 2Department of Chemistry, University of Kentucky, 3Department of Physiology, University of Kentucky, 4UK Light Microscopy Core, University of Kentucky

Summary

여기에 제시된 Conpokal 기술의 프로토콜은 공초점 및 원자력 현미경 검사를 단일 계측기 플랫폼으로 결합합니다. Conpokal은 살아있는 생물학 견본의 동시 공초점 화상 진찰 및 기계적인 특성에 가까운 동일 세포, 동일 지구를 제공합니다.

Abstract

마이크로 및 나노 규모의 기계적 특성화에 사용할 수 있는 기술은 지난 수십 년 동안 폭발적으로 성장했습니다. 스캐닝 및 투과 전자 현미경의 추가 개발에서부터 원자력 현미경 검사법의 발명, 형광 이미징의 발전에 이르기까지, 작은 물질의 연구를 가능하게 하는 기술에 상당한 이득이 있었습니다. Conpokal은 공초점 현미경 검사법과 원자력 현미경 검사법 (AFM)을 결합한 portmanteau로, 프로브가 표면을 "찌르다". 각 기술은 정성적 및/또는 정량적 이미지 수집에 매우 효과적이지만 Conpokal은 혼합 형광 이미징 및 기계적 특성으로 테스트할 수 있는 기능을 제공합니다. 거의 동시 공초점 이미징 및 원자력 탐사를 위해 설계된 Conpokal은 살아있는 미생물 샘플에 대한 실험을 용이하게합니다. 페어링된 계측기의 추가 통찰력은 AFM에 의한 측정된 기계적특성(예:탄성 계류, 접착, 표면 거칠기)의 공동 국소화를 제공하며, 서브셀룰러 구성 요소 또는 공초점 현미경 을 통해 관찰가능한 활동. 이 작업은 동일한 세포, 동일한 영역, 공초점 이미징 및 기계적 특성화를 달성하기 위해 동시에 레이저 스캐닝 공초점 및 원자력 현미경 검사법의 작동을 위한 단계별 프로토콜을 제공합니다.

Introduction

마이크로 또는 나노 규모의 기계적 평가 도구는 종종 단일 세포 또는 미생물 수준에서 변형 특성을 밝히기 위해 사용되며, 별도의 고해상도 현미경 도구는 세포 외 공정 및 구조적 특징을 시각화하는 데 사용됩니다. Conpokal은 레이저 스캐닝 공초점 현미경 검사법과 원자력 현미경 검사법(AFM)을 단일 기악 플랫폼으로 결합한 것입니다. Conpokal 기술은 먼저 비 생물학적 폴리머 시스템에서 구현되었으며, 소프트 표면과 접촉하여 단단한 표면의 접착력, 탄성 및 표면 장력을 결정하는 것이 목표였습니다. 공초점 이미지는 폴리머가 하드 프로브1,2에서변형, 부착 및 해제하는 방법을 시각적으로 렌더링했습니다. 폴리머에서 생물학적 샘플에 이르기까지,이 기술은 거의 동시 살아있는 세포 또는 미생물 공초점 이미징 및 AFM에 대한 기회를 제공합니다.

세포 탄력의 변화는 많은 인간 질병의 병인에 연루되었습니다3 혈관 장애 포함4말라리아5,6, 겸상적혈구 빈혈7관절염8천식9, 및 암6,10,11,12,13,14,15. 세포의 역학을 측정하는 일반적인 기술은 자기 구슬의 사용을 포함16,17, 광학 핀셋18,19, 마이크로 피펫 포부8,20,21,22및 AFM11,23,24,25,26. 살아있는 세포에 AFM을 적용한 이후, 세포 지형을 특성화하기 위해 쉽게 적응되었습니다.27,28 기계적 특성뿐만 아니라11,24,29,30,31 나노 스케일 정밀도. AFM은 미세학에 더욱 적응되었습니다.32,33, 주파수 변조34,35, 및 크리프25,36,37 다양한 세포주들의 점탄성 특성을 연구하는 실험. 적절한 나노접촉 모델의 사용은 AFM에서 생산된 힘 들여쓰기 측정에서 정량적 탄성 값을 추출하는 데 매우 중요합니다.1,2. 세포 탄력에 대한 세포골격약의 영향을 조사하는 AFM 연구는 탄성 계골이 매우 영향을 받는 것으로 나타났습니다.38. 탄성 계수 측정에 근거하여, 많은 연구원은 암세포가 그들의 비 변환된 대응보다는 더 부드럽다는 것을 보여주었습니다11,38,39. 증가 기형성은 가능성이 전이 및 조직을 침투하는 암세포의 능력에 있는 중요한 역할을 합니다40. 이러한 행동은 세포의 세포 골격 조직의 수정에 의해 조절됩니다.38,41,42. 암 외에도 또 다른 종류의 기계의존성 질환은 호흡기 질환입니다. 예를 들면, 급성 호흡 긴장 증후군은 점점 더 많은 인간에게 매년 영향을 미칩니다. 환자가 기계적 환기에 넣을 때, 산소의 높은 농도와, 그들의 상태가 악화 될 수 있음을 보여 주었다43. AFM을 가진 폐포 상피 대식세포를 관찰하는 일련의 연구에서 과학자들은 산소가 풍부한 환경의 추가가 액틴 형성으로 인한 세포의 강성을 증가시키는 것을 발견했습니다. AFM이 세포 수준에서 호흡기 기능에 대한 대기 환경 영향과 궁극적으로 인간의 치유 및 건강에 미치는 영향의 대표적인 예44,45,46. 상처쪽으로 이동하는 동안 상피 세포 강성또한 AFM을 통해 평가될 수 있고 탄성 계수의 변이가 향후 세포 확산을 신호하기 위하여 생깁니다47,48. 따라서, 병들게 된 세포가 어떻게 다른지 이해하기 위해 세포 역학을 정량적으로 측정하고, 건강한 세포와 상호 작용할 수 있는 실용적인 필요성이 있다.

AFM은 또한 접착제 특성 및 표면 구조를 연구하는 데 사용됩니다. 원자력 현미경은 접촉 역학을 사용하여 샘플에 대한 정보를 수집하는 다양한 모드가 있습니다. 살아있는 생물학적 샘플의 경우, 두 가지 주요 목적은 맵 표면 높이뿐만 아니라 정량적 기계적 특성값(예:탄성 계골, 접착제 력)을 얻는 것이다. 이러한 모드에는 일정한 캔틸레버 진폭을 간헐적으로 접촉하는 일정한 캔틸레버 진폭을 유지하여 캔틸레버를 올리거나 낮추는 탭 모드(간헐적 접촉이라고도 함)가 포함되며, 이는 캔틸레버를 올리거나 낮춰 일정한편향을 유지한다(49). AFM 시스템의 힘 매핑을 사용하여 접착 맵을 수집할 수 있습니다. 캔틸레버는 샘플을 특정 힘에 들여쓰기한 다음 철회됩니다. 후퇴에 저항하는 힘은 검출기에 의해 측정되어 힘 변위 그래프를 생성합니다. 접착력은 후퇴 중에 측정된 최대 힘입니다. 표면 형태학은 마이크로 또는 나노 수준에서 샘플에 대한 자세한 뷰를 제공합니다. 캔틸레버는 각 픽셀의 캔틸레버 의 움직임에 의해 포착된 들여쓰기 및 편향을 기반으로 샘플 전반에 걸쳐 래스터 스캔을 완료하여 마이크로 및 나노 크기의 특징을 드러냅니다. AFM을 사용하면 펩티도글리칸구조(50,폴리머 체인 정렬51,플래그렐라52,라멜리포디아53,및 필리포디아(54)와 같은 작은 특징의 크기를 측정할 수 있다. AFM의 힘은 강제 변위 곡선과 비 광학 적 위상 이미지에 있지만, 공초점 현미경 검사는 형광 라벨 샘플의 상세한 이미징을 제공합니다.

공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사(CLSM)는 살아있는 세포, 고정 세포 및 조직55,56,57을이미징하기 위한 지배적인 기술이다. CLSM은 1955년부터 생물학적 이미징에 사용되어 왔으며, 창립 이래 58,59. 공초점 현미경의 작동 원리(즉,핀홀을 통해 초점 빛의 거부)는 크게 동일하게 유지되었지만, 기술 구현은 매우 다양하게되고있다56,57,58,60. 공초점 이미징은 회전 디스크시스템(61)에서와같이 다중점 스캐닝을 통해 구현될 수 있으며, 단일 레이저 빔의 점 스캐닝, 라인 스캐닝(62)과 같이, 또는 다중 요소검출기를통해 후속 픽셀 재할당을 통한 점 확산 기능을 이미징할 수 있다. 공초점 이미징의 실용성을 확장하는 최근의 발전으로는 레이저 스캐닝 기능, 고속 공명 스캐닝 및 고감도검출기(63,64,65)가 포함된다. 모든 공초점 시스템이 넓은 시야 현미경을 통해 가지고 있다는 장점은 특히 두꺼운 샘플에서 더 세밀하게 z 축에서 광학 단면을 수행하는 기능입니다. 카메라 기반 검출을 사용하는 와이드필드 현미경은 초점 평면에서 방출되는 빛을 수집하고, 동시에 조명 경로의 모든 곳에서 방출되는 빛을 수집합니다. 핀홀을 닫음으로써, 신호를 줄이는 대신, 축 및 측면 해상도를 모두 증가시킬 수있다66. CLSM에서는 엑스티클 레이저가 x-y 시야에서 스캔됨에 따라 방출 신호 수집을 통해 픽셀단위로 이미지가 픽셀단위로 구축됩니다. 샘플의 z 축을 따라 여러 x-y 평면의 컬렉션은 샘플57, 67의3차원 아키텍처를 재구성하는 데 사용할 수 있다. 형광 단백질의 도입과 함께 공초점 현미경 검사는 세포 생물학68에대한 우리의 이해에 혁명을 일으켰습니다. 예를 들어, 그것은 신경 과학69에필수적인 도구가되었다. CLSM은 정기적으로 지워진 조직을 관찰하고 면역 염색 된 뇌 및 신경 네트워크 아키텍처70의포괄적 인 이미지를 얻는 데 사용됩니다. 이 응용 프로그램은 시냅스 접촉에 새로운 통찰력과 뇌의 뉴런과 신경교 세포 사이의 통신에 새로운 통찰력을초래했다 71. 뇌세포에서 소포에 이르기까지 형광 염색 프로토콜은 치료 기술의 발전을 위한 공초점 현미경검사를 통해 세포 기능의 검사 및 캡처를지원합니다(72,73).

그들은 인상적이고 다재 다능 한 도구 개별적으로, 공초점 및 원자력 현미경 검사의 조합 (Conpokal) 연구원은 독특한 다양 한 세포 세포 세포 및 그들의 각각역학의 관찰과 지형 및 미세 기계식 세포/조직 속성을 상관 관계를 수 있습니다. 페어링된 계측기를 사용하면 사용자가 기본적으로 검색 중인 내용을 "참조"할 수 있습니다. 하나의 기술에 비해 큰 이점. Conpokal을 사용하면 AFM을 통한 힘 매핑이 공초점 이미지에 오버레이되어 세포 강성, 접착 또는 형태와 샘플 내의 세포골격 구조를 상호 연관시지정합니다( 예: Conpokal 방법의 전반적인 목표는 연구원이 간결하고 효과적인 방식으로 살아있는 샘플을 연구할 수 있는 플랫폼을 제공하여 단일 플랫폼에서 이미지와 재료 특성 데이터를 모두 제공하는 것입니다. 이 작품에서는 적절한 샘플 선택 및 준비, 계측기 설정, 캔틸레버 교정 을 포함한 Conpokal의 작동을 시연하고 성공적인 문제 해결에 대한 지침을 제공합니다. 프로토콜 후, 우리는 성공적인 박테리아와 세포 AFM 높이 매핑을 포함하는 대표적인 결과를 제공, 박테리아와 세포 AFM 계수 매핑, 다중 표지 세포의 공초점 이미징, 동일한 세포 공초점 및 AFM을 통해. 우리는 Conpokal 절차 중요한 단계, 문제 해결 권장 사항, 기술 제한, 중요성 및 방법에 대한 향후 전망에 대한 논의로 마무리합니다.

Protocol

1. 악기, 문화 매체, 요리 의 준비

  1. 공초점 현미경과 원자력 현미경뿐만 아니라 Conpokal 동안 활용 된 다른 관련 기기 또는 장치에 대한 전원을 켭니다. 측정을 시작하기 전에 계측기가 열적으로 평형화되고 안정화될 수 있는 충분한 시간을 허용합니다. 일반적으로 1h는 충분합니다.
  2. 깨끗하고 시스템적으로 승인된 유리 바닥 페트리 접시 하나를 준비하고 반쯤 가득 채우지만 인산완충식염(PBS) 또는 이와 유사한 투명 액체로 3분의 2 이상을 채우지 않습니다. 이 요리 ("교정 접시"라고 함)는 샘플 접시와 분리되어 원자력 현미경 (AFM) 캔틸레버를 찾아 보정하는 데 사용됩니다.
    참고: 액체가 명확하고 형광 스펙트럼과의 간섭을 방지하기 위해 낮은 자동 불발성을 가지고 있는 것이 중요합니다. PBS는 생물학적 환경을 모방하기 때문에 권장됩니다.
  3. 관련 액체가 접시를 반 이상 가득 채우는 실험적인 샘플 요리를 준비합니다. 샘플이 형광인 경우 필요할 때까지 가려지거나 어두운 곳에서 덮여 있는지 확인하십시오. 렌즈 클리너와 렌즈 물티슈를 사용하여 모든 유리 요리의 바닥을 청소하십시오.
  4. 컴퓨터의 공초점 및 AFM용 데이터 저장소 폴더를 만듭니다.

2. 세포 또는 미생물의 선택

  1. 박테리아 스톡 용액을 만들기 위해, 접종 루프를 사용하여, 토드 휴이트 효모 (THY)의 15 mL에서 5 % CO2 인큐베이터에서 박테리아 스톡 솔루션을 만들 수 있습니다.
  2. 1시간 전에 는 폴리-l-리신 용액 1mL로 실험용 샘플 접시를 코팅하거나 유리 바닥 접시의 유리 부분을 덮고 1시간 동안 생물안전 캐비닛에 둡니다. 설정 후 폴리-l-리신 용액을 흡인하고 PBS로 3배의 접시를 헹구세요.
  3. 18 -24 h의 세균 배양 후, 0.6 - 0.7의 광학 밀도가 달성 될 때까지 세균 현탁액의 1 mL와 THY를 접종 (접종을위한 일반적인 값은 접시 당 1 mL의 흉3mL입니다). 각 폴리 l-리신 코팅 접시에 1mL의 새로운 박테리아 용액을 추가하고 1 시간 동안 배양하십시오. 마지막 10 분 동안, 각 접시에 녹색 형광 막 얼룩 (1 μM의 농도)의 1 mL을 추가합니다.
  4. PBS로 각 접시를 3배 헹구는 다. 생체 안전 캐비닛 내부실온에서 15분 동안 약 1mL의 4% 파라포름알데히드 용액으로 박테리아를 부드럽게 수정합니다. 고정 후 PBS로 각 접시를 3배 헹구는 다.
  5. 인간 배아 신장(HEK) 293세포를 액체 질소에 저장한다. 도금 전에 37 °C 수조에서 빠른 해동을 수행합니다.
  6. 세포 배양 배지에 지하 막 매트릭스 용액 1mL을 각 세포 샘플 접시에 넣고 37°C에서 1h로 인큐베이션(5%CO2)을첨가한다. 용액을 흡인하고 세포 배양 매체로 설거지를 씻으세요. HEK 293셀(예:35mm 접시당 100,000세포)의 필수 수를 플레이트하고 2mL의 세포 배양 배지를 추가한다. 이어서, 세포를 배양(5%CO2)세포가 37°C에서 48h로 한다.
  7. 48h 후, 형광 미세 투덜구 세포 골격 염료 (1x농도)의 2 μL을 각 세포 샘플 접시에 넣고 30 분 동안 배양하십시오. 염료를 함유한 용액을 흡인하고, PBS로 세포를 3배 세척하고, 세포 배양 배지2mL를 추가한다.
  8. 플라즈마 멤브레인 염료(10μM 농도)를 샘플 접시에 넣고 30분 동안 배양합니다. PBS로 염료 3x를 함유한 용액을 세척하고 세포 배양 배지 2mL를 추가한다.
  9. 핵산염료(10μM 농도) 용액의 1μL을 시료 접시에 첨가하고 30분 동안 배양하여 핵을 카운터스테인한다. PBS로 염료 3x를 함유한 용액을 세척하고 2mL의 배양 매체를 추가합니다.

3. AFM 절차

  1. 컴퓨터의 소프트웨어 아이콘을 클릭하여 원자력 현미경(AFM) 작동 소프트웨어를 엽니다.
  2. 회전하거나 낮은 배율 공기 목표 (권장 10 배 또는 20x)를 삽입합니다. 5mm 이상의 장거리 작동 거리는 팁 강하 및 교정 중에 유용합니다.
  3. 아직 설치하지 않은 경우 선택한 셀 샘플 스테이지를 마운트합니다. 라이브 샘플의 경우 접시 히터를 사용하여 샘플을 원하는 온도에서 유지합니다.
  4. 깨끗하고 시스템 승인된 페트리 접시를 PBS(1.2단계에서 준비) 또는 이와 유사한 투명 액체(교정 접시)로 가득 차 있는 세척합니다. 샘플 단계에 내장 된 걸쇠가있는 경우, 그렇지 않으면, 샘플을 안정화진공 그리스를 사용합니다.
  5. 원하는 데이터 수집에 적합한 AFM 캔틸레버를 선택하고 아래 단계에 따라 설치합니다.
    1. 장갑을 사용하여 AFM 칩 장착 단계, 핀셋 및 소형 드라이버를 사용하여 AFM 칩을 유리 블록에 장착하십시오. 조심스럽게 유리 블록에 AFM 칩을 배치하고 중심이 될 수 있도록 방향을 지정합니다. 캔틸레버와 AFM 칩의 매우 작은 부분은 마운팅 블록의 눈에 보이는 비불투명 부분에 있어야 합니다.
    2. 칩이 유리 블록에 대고 끼워들 때까지 나사를 조이면 드라이버로 칩을 고정하십시오. AFM 캔틸레버가 스테레오 현미경 또는 핸드헬드 스파이글래스를 사용하여 올바르게 지향되어 있는지 확인합니다. 필요에 따라 조정합니다. 제대로 지향되면 유리 블록을 AFM 헤드에 적절한 방향으로 배치하고 제자리에 잠급니다.
      참고: 유리 블록 내의 AFM 칩의 방향은 시스템 레이저가 캔틸레버의 뒷면을 목표로 하고 광검출기에 올바르게 반영되도록 중요합니다. 이 절차는 AFM 칩, 캔틸레버 또는 팁이 파손될 수 있으므로 배치 중에 나사를 과도하게 조이지 않도록 주의하십시오.
  6. 공초점 현미경의 밝은 필드 옵션을 사용하여 초점 노브를 사용하여 교정 접시의 바닥을 찾습니다. 이 z 높이는 현미경 목표에 대하여 접시의 바닥이 있는 값으로 주의하십시오.
  7. z 스테퍼 모터를 작동하는 컴퓨터에서 AFM 시스템의 모터 제어판을 사용하여 AFM 캔틸레버를 샘플에서 2000 μm 이상으로 이동합니다.
  8. 양손을 사용하여 AFM 칩을 샘플 스테이지에 부드럽게 배치하여 AFM 헤드의 각 수직 점이 AFM 스테이지의 지정된 홈에 단단히 고정되어 있는지 확인합니다. AFM 헤드가 제자리에 있으면 캔틸레버 홀더가 요리에 얼마나 가까운지 시각적으로 확인합니다. AFM 헤드가 샘플 접시의 상단의 1mm 이내또는 너무 가깝게 보이는 경우, AFM 팁을 샘플쪽으로 낮추기 전에 z 스테퍼 모터를 사용하여 다시 내보세요.
  9. 브라이트필드 조명을 사용하여 AFM 소프트웨어의 z 스테퍼 모터 제어판을 사용하여 AFM 칩을 유리 접시 의 바닥으로 천천히 낮춥습니다. 기기 플랫폼에서 AFM 헤드의 X-y 또는 평면 모션을 제어하는 수동 마이크로미터를 찾습니다. 캔틸레버가 시야에 들어오면 AFM 헤드를 수정하여 시야 내에서 AFM 캔틸레버의 위치를 조정합니다.
    1. 접시의 바닥에 관한 위치는 이 시점에서 알려지지 않았기 때문에, AFM 팁이 페트리 접시에 충돌하지 않도록 100 ~ 200 μm의 단계로 낮춥습니다. 일반적으로 팁은 800 ~ 2000 μm을 낮아야 합니다. 팁이 낮아짐에 따라 현미경 소프트웨어 보기에 그림자가 나타나는 것을 지켜보며, 이는 AFM 팁이 접시의 바닥에 가까워지고 있음을 나타냅니다.
    2. 증가도를 20~50μm로 줄입니다. 공초점 소프트웨어의 LUTs 패널을 사용하여 팁이 접시안으로 낮아짐에 따라 카메라 이미지의 조회 테이블(LUT)을 조정해야 합니다. 주로 초점이 될 때까지 작은 단계를 사용하여 AFM 팁을 계속 낮춥니다.
    3. 팁의 일반적인 모양을 볼 수 있고 뷰 필드에 중심이 되도록 팁이 충분히 어둡게 되어 있는지 확인합니다. 또한 팁이 흐릿해 보이는지 확인하여 접시 바닥이 아직 발생하지 않았는지 확인합니다.
  10. 목표의 작업 거리를 염두에 두고 팁이 지금 초점을 맞출 수 있도록 현미경 초점을 조정합니다. 더 높은 배율 목표로 이동하기 전에 현미경 측정 도구를 사용하여 공초점 소프트웨어의 측정 도구 패널에 액세스하여 AFM 캔틸레버의 폭과 길이를 수집합니다. 이러한 측정값을 기록해 둡시다.
    참고: 샘플을 접시의 바닥에 충돌하지 않는 것이 중요하며, 이로 인해 샘플 접시가 AFM 팁과 접촉하여 잠재적으로 손상될 수 있습니다.
  11. 존재하는 경우, 레이저 광 필터를 제거하고, AFM 레이저가 켜져 있는지 확인, 레이저 빛이 광학에서 볼 수 있도록.
    1. 레이저 정렬 다이얼을 사용하여 레이저를 시야 및 AFM 팁 근처로 이동합니다. 레이저가 이 위치에 있으면 레이저 라이트 필터를 교체하십시오.
    2. 레이저 정렬 다이얼을 사용하여 AFM 팁이 캔틸레버에 있는 곳의 뒷면에 레이저를 배치합니다. 이 시점에서 레이저 정렬 패널은 0.0 V보다 큰 합계 신호를 판독해야 합니다. 합계 신호를 얻지 못하면 화면에 0.0 V보다 큰 신호가 판독될 때까지 수동으로 제어된 미러 노브를 사용하여 미러를 조정합니다.
    3. 최대 합계 신호가 달성될 때까지 AFM 캔틸레버의 모든 방향으로 소량으로 레이저를 이동하지만 위치는 AFM 팁에 있습니다. 레이저 위치가 설정되면 수동으로 제어된 편향 다이얼을 사용하여 수직 및 측면 편향을 0으로 설정합니다.
    4. AFM 소프트웨어의 레이저 정렬 패널을 관찰하고 AFM 헤드의 수직 및 측면 편향 노브를 사용하여 검출기를 정렬하여 대상이 중심(십자선 중앙의 빨간 점)을 중심으로 수직 또는 측면 편향이 없도록 정렬합니다.
  12. AFM 소프트웨어에서 교정 창을 엽니다. 모든 실험 특정 정보를 입력합니다. 보정하기 전에 공초점 현미경 광원을 끄고 해당되는 경우 AFM 인클로저를 닫아 실내 조명 또는 실내 진동에서 발생하는 잠재적 인 소음을 완화하십시오. 그런 다음 교정 버튼을 눌러 시스템이 팁을 교정할 수 있도록 합니다. 교정이 완료되면 캔틸레버(N/m)의 강성과 그 감도(nm/V)가 교정 패널 내에서 제공됩니다. 이후 분석에 대 한 이러한 참고.
  13. 스테퍼 모터로 AFM 캔틸레버를 최소 2000 μm로 철회합니다. 무대에서 AFM 머리를 가지고 교정 접시를 제거합니다. 원하는 목표를 회전하거나 삽입합니다. 시스템이 목표 간에 동일한 초점 평면을 유지하도록 프로그래밍된 경우 작업 거리의 목표 10%를 철회합니다. 이것이 석유 목표라면 목표의 눈에 1 방울의 침지 오일을 놓습니다.
    참고: 목표의 철회는 배치 중에 샘플 접시에 접촉하는 객관적인 가능성을 줄입니다.
  14. 시료 접시를 제자리에 단단히 고정하려면 면 봉면을 사용하여 샘플 단계 내의 샘플 링 가장자리 주위에 작은 진공 그리스를 적용하거나 샘플 클립을 사용합니다. 샘플 접시를 샘플 단계에 조심스럽게 로드합니다.
  15. 시료를 배치하면 그리스를 통해 샘플 홀더에 접시의 좋은 밀봉을 보장하기 위해 몇 번 회전합니다. 오일이 목표의 눈 위에 심을 때까지 접시의 바닥에 목표를 올립니다.
  16. 현미경을 사용하여, 무대에 AFM 헤드없이, 샘플이 초점되도록 이미징 시스템에 초점을 맞춥니다. 참조를 위해 이 z 높이를 참고하십시오.
  17. AFM 헤드를 플랫폼으로 조심스럽게 교체하십시오.
  18. z 스테퍼 모터를 사용하여 팁을 샘플쪽으로 낮춥춥습니다. AFM 팁이 낮아지므로 필요에 따라 밝은 필드 이미지의 조회 테이블(LUT)을 조정합니다. 팁이 거의 날카로워질 때까지 낮춥습니다. 수동으로 작동하는 AFM 팁 위치 마이크로미터를 사용하여 AFM 헤드를 이동하여 AFM 팁이 시야의 중앙 또는 왼쪽 에 있도록 합니다.
    참고: AFM의 z 높이가 3.6단계에서 이전에 지적되었기 때문에 AFM 팁을 낮추기 위해 더 큰 단계가 필요할 수 있지만, 그리스가 접시의 바닥에 추가되고 잠재적으로 오일이 목표에 추가되므로 이 값은 참조용입니다. 팁이 집중될 때 50 ~ 100 μm 단계를 수행하고 더 작게 조정하는 것이 좋습니다.
  19. AFM 헤드의 수동 마이크로미터를 사용하여 레이저 위치를 재조정합니다. 필요한 경우 각 노브를 조정하여 수직 및 측면 편향을 0으로 조정하고 샘플 접시에서 AFM 캔틸레버를 재보정합니다.
    참고: 캔틸레버가 샘플과 다른 매체로 보정된 경우 굴절률의 잠재적 인 변화를 설명하기 위해 스캔 매체에서 재보정되어야 합니다. 또한, 레이저는 소음 이나 온도 변화로 인해 캔틸레버의 뒷면에서 표류 할 수 있습니다. 필요에 따라 레이저를 재조정하고 유리 기판 위의 샘플 접시에서 비접촉 보정을 사용하는 경우에만 재보정합니다. 접촉 보정을 사용하는 경우 샘플 매체를 사용하여 교정 접시 내부를 재보정합니다.
  20. 고품질 공초점 현미경 이미지를 얻으려면 현재 감쇠 광 필터를 모든 AFM 레이저 광을 차단하는 필터로 교체하십시오. 이 라이트 필터는 AFM 레이저의 밝은 빛으로부터 간섭을 보장합니다.
  21. 일반적으로 아래쪽 화살표로 표시된 자동 접근 명령 버튼을 사용하여 팁을 샘플 접시의 아래쪽으로 낮춥춥습니다. 이미징 제어판에서 스캔의 크기/영역, 해상도, 설정점, z 길이 및 픽셀 시간(또는 보정/전파된 값을 사용)을 설정하고 스캔을 시작합니다.
  22. 스캔이 완료되면 AFM 칩50 - 100 μm을 들어 올려 샘플 접시의 새로운 측정 위치로 이동합니다. 새 위치가 발견되면 유리에 접근하고 3.21 및 3.22 단계를 따라 다시 스캔하기 시작합니다.
  23. 자동 저장 옵션을 선택하거나 저장을 클릭하여 각 개별 검색에서 생성된 각 파일을 수동으로 저장합니다.

4. 공초점 절차

  1. 공초점 운영 소프트웨어를 엽니다. 연결된 모든 주변 장치, 광원 및 컨트롤러가 켜져 정상적으로 작동하는지 확인합니다.
  2. 낮은 배율(10배 또는 20x)의 목표를 회전하거나 삽입하여 샘플을 봅니다. 샘플 접시가 있는 곳에서 안전한 작업 거리에 목표가 있는지 확인하고 필요한 경우 샘플과의 목표 충돌이 발생할 수 없도록 목표를 철회하십시오. 면 봉면을 사용하여 샘플 접시 링의 가장자리 주위에 진공 그리스를 두드려. 오일 목표를 사용하는 경우, 목표의 전면 렌즈에 침지 오일 한 방울을 놓습니다.
  3. 원하는 샘플을 샘플 단계에 배치합니다. 진공 그리스가 샘플 스테이지 인서츠에 단단한 결합을 생성하거나 샘플 클립을 사용하는지 확인하기 위해 샘플을 몇 번 회전합니다. 오일 목표를 사용하는 경우, 오일이 유리 바닥에 심지 있도록 접시의 바닥에 목표를 올립니다. 과도한 표백을 방지하려면 주변 조명을 최소화하십시오.
  4. 카메라 나 안구를 통해 밝은 필드 또는 에피소드 형광 모드를 사용하여 샘플을 찾고 초점 노브를 사용하여 여러 세포 또는 단일 세포를 포함하는 관심 영역에 초점을 맞춥니다. 종종 광학 현미경 내의 시야는 AFM 시스템(100 x 100 μm)의 x-y 스캐닝 창보다 큽니다. AFM 스캔 및 공초점 광학이 동일한 기능을 이미징할 수 있도록 AFM 소프트웨어의 모터 제어판을 사용하여 공초점 시야 내에서 AFM 위치를 조정합니다.
    참고: 시야 내에서는 일반적으로 셀이 몇 개뿐이므로 어떤 셀을 프로브할지 쉽게 확인할 수 있습니다. AFM이 수행됨에 따라 세포가 AFM 소프트웨어에서 표시되고, 거기에서 사용자는 특정 관심 영역을 찾아 프로브할 수 있습니다.
  5. 원하는 경우 샘플 라벨을 기반으로 카메라 또는 CLSM 모드를 사용하여 밝은 필드 또는 에피소드형으로 이미지를 캡처하고 노브에 초점을 맞추고 현미경 소프트웨어의 버튼을 캡처합니다.
  6. 현미경 소프트웨어를 사용하여 옵션을 선택하거나 패널을 열어 공초점기능(예:레이저 및 후속 매개 변수)을 활성화합니다. 이 옵션은 일반적으로 레이저 라인 파장 값에 의해 지적된다.
  7. 샘플을 염색하는 데 사용되는 염료에 적합한 레이저 라인을 선택합니다. 하나 또는 여러 개의 레이저 라인을 켜서 샘플에서 이러한 기능을 흥분시키고 이미지화합니다.
  8. 게인을 샘플 형광을 최적화하지만 소음 양을 제한하는 값으로 게인을 설정합니다. 일반적인 시작 값은 70의 이득입니다.
  9. 레이저 전원을 조정하여 포화 픽셀을 방지하지만 동적 범위를 최대화합니다. 레이저 전력의 일반적인 시작 범위는 1 – 3 %입니다.
  10. 핀홀 크기를 1 개의 Airy 장치로 설정하여 광학 단면에 대한 해상도를 최대화합니다. 샘플이 어둡고 레이저 전력이 이미 높으면 핀홀을 열어 z 축 해상도를 감소시키는 비용으로 신호를 증가시합니다.
  11. 픽셀 거주시간(즉,스캔 속도)을 설정합니다. 2 μs 거주 시간으로 시작하고 필요한 경우 샘플 밝기를 반영하도록 조정하십시오. 기기가 나이퀴스트 옵션 버튼과 이미지에서 선택한 픽셀 수를 통해 계산하도록 하여 선택한 목표에 대한 픽셀 크기/스캔 크기를 선택합니다.
    참고: 두꺼운 시료의 거주 시간이 길어지면 z 스택이 수집될 때 과도한 표백이 발생할 수 있습니다.
  12. 계측기 소프트웨어에서 스캔 옵션을 선택하고 데이터 수집을 시작합니다.
    참고: 기기에 레이저가 여러 개 있는 경우 각각을 독립적으로 최적화한 다음 다중 형광 이미지에 대해 동시에 실행될 수 있습니다.
  13. 포커스 노브를 사용하여 샘플에서 최적의 시야를 확대/축소하고 찾습니다.
  14. 시스템의 캡처 버튼을 사용하여 이미지를 캡처하고 샘플의 필요한 모든 파일 형식을 컴퓨터의 하드 드라이브 또는 로컬 외장 하드 드라이브의 원하는 위치/폴더에 저장합니다.
  15. 게인, 레이저 파워, 핀홀 크기, 샘플링 속도 및 기타 값을 계속 조정하여 이미지를 최적화합니다. 픽셀 채도 인덱스를 활성화하여 픽셀이 과도하게 포화상태인지 확인할 수 있습니다. 이 과포화가 존재하는 경우, 게인 및 레이저 전력을 재조정하여 포화 픽셀을 제거할 수 있습니다. LUT를 가이드로 사용하여 특정 조정을 합니다.
  16. 가능하면 소프트웨어에 패널 또는 버튼으로 표시되는 시스템의 나이퀴스트 샘플링 속도를 사용하여 이미지를 최대한 획득 가능한 해상도로 수집할 수 있습니다.
  17. 공초점 시스템의 z 스택 또는 이미지 볼륨 수집 도구를 활성화합니다. 하단-투-탑 옵션을 사용하여 레이저 라인이 하나뿐이며, 특히 샘플에서 피처를 가장 명확하게 비추는 레이저 라인을 사용하여 볼륨을 측정할 수 있도록 시작 및 마감 평면을 설정합니다.
  18. z 스택의 평면 간의 제안된 간격을 사용하여 기기및 사용된 레이저 라인에서 제공하는 최상의 축 해상도에 대한 Nyquist 샘플링 기준을 충족하도록 계산됩니다.
  19. 여러 레이저 라인을 사용하는 경우 간격을 계산하기 위해 가장 짧은 파장을 사용합니다. 수집이 완료되면 파일을 적절한 폴더에 저장합니다.
  20. 또는 샘플 두께에 대한 사전 지식이 있는 경우 가장 밝고 선명하게 나타나는 중간 평면을 선택하여 볼륨을 정의합니다. 이 경우 위쪽을 중간 평면 위와 아래의 샘플 두께의 절반으로 중간 평면 아래 두께의 절반으로 설정합니다.
  21. 이 시야의 샘플 수집이 완료되거나 샘플이 표백된 후 전동 또는 수동으로 제어된 스테이지를 사용하여 샘플에서 다른 관심 장소를 찾고 이미지 수집단계를 반복합니다.

5. 정리 절차

  1. CLSM과 AFM의 모든 데이터 파일이 적절한 위치에 저장되도록 합니다.
  2. Z 스테퍼 모터를 사용하여 AFM 칩을 적어도 2000 μm 또는 시료 표면에 도착하기 위해 이동한 거리를 사용하여 철회합니다. 무대에서 AFM 헤드를 제거하고 조심스럽게 휴식 장소에 놓습니다.
  3. 현미경 목표를 철회하여 샘플에서 멀리 떨어져 있습니다. 오일 목표를 사용하는 경우 목표와 시료 기판 사이에 더 이상 접촉이 없을 정도로 목표를 철회해야 합니다.
  4. 장갑을 사용하여 샘플을 제거하고 시료 접시의 바닥에서 그리스와 기름을 청소하십시오. 새롭고 깨끗하고 빈 페트리 접시를 획득하고 70 % 에탄올 용액을 반에서 3 분의 1로 채웁니다. 샘플 홀더에 넣고 AFM 헤드를 교체하여 AFM 칩이 에탄올 용액에 5분 동안 담글 수 있도록 합니다.
  5. AFM 칩이 흡수되는 동안 실험 데이터를 외부 하드 드라이브에 복사하는 것이 좋습니다. AFM 칩을 에탄올 용액에 5분 이상 담은 후 AFM 헤드를 제거하고 휴게소에 넣습니다.
  6. 장갑을 사용하여 AFM 칩 홀더를 제거하고 마운팅 스테이션에 넣습니다. 고무 그립핀셋을 사용하여 AFM 칩을 조심스럽게 제거하십시오. 사용된 팁을 축 방향에서 나온 상자의 위치에 다시 배치하여 사용된 팁을 나타냅니다. 향후 참조의 경우 실험에서 사용된 팁을 참고합니다.
  7. 에탄올 용액으로 채워진 페트리 접시를 시스템에서 꺼내 액체와 접시를 폐기하십시오. 장갑, 렌즈 클리너 및 렌즈 물티슈를 사용하여 표준 프로토콜에 따라 현미경 목표에서 오일을 부드럽게 청소하십시오. 그리스를 제거하여 샘플 홀더를 청소하십시오. 생물 안전 프로토콜에 따라 모든 폐기물을 폐기하고 도구를 알려진 위치로 반환합니다.
  8. 컴퓨터에서 데이터 수집을 완료하고 종료합니다. 실험에 사용되는 모든 기기, 액세서리, 주변 장치 또는 기타 장치에 전원을 공급합니다.

Representative Results

Conpokal 기술은 도 1A에 schematically 표현되며 설정 의 이미지가 도 1B에표시됩니다. AFM에서 동일한 구조와 공초점 현미경 검사를 통해 생물학적 구조를 정확하게 공동 찾기 위해서는 설치 중에 두 시스템의 정렬이 매우 중요합니다. 서로의 공간 요구 사항에 익숙한 평판 좋은 공초점 및 AFM 제조업체를 선택합니다. 또한, 기술의 성공적인 구현은 좋은 염색 절차, 생물학적 구조의 고정, AFM 팁의 적절한 선택에 의존한다. 살아있는 세포의 높이는 수시로 AFM 화상 진찰을 위한 도전을 제시합니다. 살아있는 HEK 셀을 통해 AFM 스캔은 그림 2A에표시됩니다. 이 특정 HEK 셀의 높이는 약 10 μm였으며, 녹색으로 라인스캔(도 2B)에의해 입증되었다. 0 오프셋(팁은 캔틸레버의 맨 끝에 있음) 또는 셀 높이보다 큰 팁높이(예:팁 높이 ≥ 10 μm)를 가진 AFM 팁은 개별 세포의 고도로 해결된 이미지를 생성합니다. 부적절한 AFM 팁 선택으로 인한 불량 검사의 예가 그림 2C에포함되어 있습니다. 이 이미지에서, 검은 색 픽셀은 AFM 압소가 큰 셀 높이로 인해 범위를 벗어났음을 나타내는 셀의 정점에 나타났다. AFM 캔틸레버의 끝은 셀 높이에 비해 팁 높이가 부족하여 팁 오프셋으로 인해 이미지(둥근 사각형)에 나타났습니다. AFM 이미지의 이러한 아티팩트는 셀을 이미지하기 위해 다른 AFM 팁을 선택해야 함을 나타냅니다.

이 방법에 는 살아있는 세포 이미징을 위한 정확한 프로브와 함께 형광 염색에 있는 능률적인 라벨이 필요합니다. 우리는 핵 얼룩 (형광 청색), 마이크로 투블러 얼룩 (형광 녹색), 및 지방성 막 얼룩 (적색 형광)을 가진 도 3A에 표시된 3 색 공초점 이미지를 수행했습니다. 이러한 라이브 셀 프로브는 제한된 스펙트럼 중복 및 표준 필터 큐브와의 호환성 때문에 선택되었습니다. 우리는 또한 그림 3B에밝은 필드 광학 이미지를 포함했다.

AFM에서 나노 기계 모델과 함께 팁 들여쓰기를 분석하여 표면의 계수 맵을 생성합니다. 팁 형상에 대한 Hertz 모델 핏및 포물선 프로파일(반경 8nm)을 사용하여 생성된 계수 맵의 예는 도 4A(도 3에표시된 것과 동일한 두 개의 세포)의 셀 형상의 3D 재구성에 오버레이되어 있다. 레이저 공초점 z 스택의 해당 3D 프로젝션은 도 4B에도시된다.

이 방법은 또한 작은 생물학적 구조에 적합, 그의 마이크로 및 나노 현미경 기능을 사용 하 여 해결 하기 어려운 단일 박테리아를 포함 하 여. 진행 중 연구는 연쇄상 구균 뮤탄의항생제 내성을 영향을 미치는 세포 벽 내의 기계적 메커니즘을 탐구하기 위해 Conpokal 기술을 활용합니다. Conpokal은 동일한 셀 샘플에서 라이브, 인솔루션, 데이터수집(예:표면 형태, 탄성 계수, 접착 강도 및 표면 거칠기)을 용이하게 하여 기계적 특성을 세포벽 성분의 존재 또는 부재와 결합합니다. 도 5A, B에는 연쇄상 구균 뮤테륨의 AFM 스캔 및 측정 된 계수 맵이 포함됩니다. 더 나은 해상도는 전통적인 공초점 현미경 검사법보다는 AFM을 가진 이 규모에서 달성되었습니다.

도 6은 세포벽에 부착되는 녹색 형광세포 구조 얼룩으로 얼룩진 엔테로코커스 대변의 식민지의 공초점 이미지를 포함한다. 도 5 및 도 6은 진핵 세포 이외에 미생물에 대한 콩포크 기술의 적용가능성을 입증한다.

Figure 1
그림 1: Conpokal 설정입니다.
(A)콩포칼 기술의 회로도. (B)계측기 설정의 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 살아있는 세포의 원자력 현미경 검사.
(A)두 HEK 세포의 AFM 이미지. (B)신장 프로파일(A내 녹색선)은 10μm에서 세포 높이가 매우 크다는 것을 나타내는 HEK 셀의 높이 프로파일(A내 녹색선)이다. (C)AFM 압전이 세포 정점에 범위를 벗어나 캔틸레버 끝의 역이미징의 증거가 있는 성상세포 세포의 불량 AFM 이미지가 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 살아있는 세포의 공초점 및 밝은 필드 현미경 검사법.
(A)핵얼룩(형광파), 마이크로투룰레 얼룩(형광녹색) 및 리포필막 얼룩(홍색)으로 염색된 살아있는 HEK 세포의 공초점 현미경 검사. (B)해당 브라이트필드 광학 이미지. 스케일 바는 10 μm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: 살아있는 HEK 세포의 AFM 및 공초점 현미경 검사의 3D 렌더링 비교.
(A)헤르츠 모델 핏과 포물선 프로파일(반경 8nm)을 이용하여 생성된 모듈러스 맵은 AFM으로부터 셀의 3D 재구성에 겹쳐진 팁 형상에 대해 이다. (b)핵얼룩(형광파), 마이크로투블러 얼룩(형광녹색) 및 리포필막 얼룩(적색형)을 가진 레이저 공초점 z 스택의 상응하는 3D 프로젝션. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
그림 5: 박테리아 샘플의 AFM.
(A)AFM 스캔 및(B) 연쇄상 구균 뮤탄균의 계체 맵을 측정하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 6
그림 6: 박테리아 샘플의 공초점 현미경 검사법.
녹색 형광막 얼룩이있는 엔테로 코커스 대변의 식민지의 공초점 이미지. 스케일 바는 5 μm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

Conpokal은 액체 환경에서 고품질의 이미지를 수집하고 살아있는 생체 재료의 기계적 특성을 수용하기위한 고급의 효과적인 기술입니다. 라이브 샘플 기계적 특성과 결합된 뛰어난 형태및 지형 이미지를 수집하는 기능은 일반적인 전자 및 광 현미경 기술을 지나확장됩니다. 이와 는 별도로, 공초점 현미경은 샘플의 고품질의 상세한 형광 이미지를 달성하기 위해 밝은 필드, 에피플루오네이션 및 레이저 스캐닝 공초점 기능을 제공합니다. AFM은 기계적 특성화를 제공하지만 보조 광학이 없으면 샘플을 탐색하기가 어려워집니다. 두 시스템을 결합하면 사용자는 실험 중에 동일한 셀의 이미지와 기계적 특성을 모두 수집할 수 있으며 이는 두 개의 개별 계측기에 비해 큰 이점입니다. 이 원고의 목적은 생물학, 엔지니어링 및 건강의 미래를 위해 결합 된 Conpokal 시스템의 광범위한 기능을 사용자에게 알리고 안내하는 것입니다. 이 프로토콜에는 기기, 문화 매체, 접시, 미생물 선택, AFM 절차, 공초점 절차 및 정리의 준비가 포함됩니다. 성공적인 라이브, 인솔루션, Conpokal 세션을 위한 가장 중요한 단계는 샘플 고정화, 현명한 팁 선택 및 라이브 얼룩 실행입니다. 이 원고의 토론 섹션은 문화 권고 사항, 문제 해결 팁 및 운영 지침 및 Conpokal 기술에 대한 향후 작업에 대해 자세히 설명합니다. 문화 권세 권장 사항은 샘플 문화, 고정 및 염색에 대한 지침을 다룹니다. AFM, 공초점 및 Conpokal 팁 및 지침은 팁 선택 및 교정, 해상도, 제한 사항 및 거의 동시 작동에 대해 논의합니다. 미래의 작업에는 미래의 연구 경로에 대한 전망과 잠재력이 포함됩니다.

이 프로토콜은 살아있는 세포와 고정 된 박테리아 샘플의 문화, 탐구 및 이미징을 다룹니다. 액체에서 AFM을 수행 할 때 존재하는 한 가지 과제는 샘플 장애 및 유체 역학 적 드래그로 인한 캔틸레버 운동 방해에서 비롯됩니다. 시료가 기판에 잘 부착되지 않으면 액체에 떠있는 샘플의 섹션에 의해 캔틸레버의 파울링 가능성이 있습니다. 이 경우 샘플의 탄성 준수 및 미세 기계적 특성의 우위이기 때문에 측정이 손상됩니다. HEK 세포는 고정으로 처리되지 않았습니다, 그러나, S. mutans 및 E. faecalis는 그밖 원핵 세포와 유사한 추가 고정이 필요합니다. 선택된 박테리아는 세포 탐사 및 화상 진찰을 방해하는 적극적인 움직임을 보여주었습니다, 그러므로, 견본은 부드럽게, 화학적으로 고정되어 고정되었습니다. 모공(75)에서개별 세포를 물리적으로 트랩하는 필터 멤브레인과 같은 화학적 고정에 대한 대안이 있다.

팁 선택은 AFM의 설정 및 작동에 중요한 구성 요소이기도 합니다. 생체 재료의 변형에 기초한 기계적 특성이 모색될 때, 하나는 비 사소한 작업인 캔틸레버 강성 및 재료 강성 호환성을 고려해야 합니다. 주요 목표는 선택한 캔틸레버의 강성과 재료의 강성과 가장 잘 일치하는 것입니다. 캔틸레버가 시료보다 훨씬 부드럽으면 너무 많은 편향이 적용됩니다. 캔틸레버가 시료보다 딱딱한 경우 AFM 검출기는 이러한 작은 편향을 포착할 수 없을 수 있습니다. 적절한 AFM 캔틸레버를 선택할 때 실험용 응용 프로그램에 따라 선택하는 것이 좋습니다. 간헐적인 접촉 모드에서 상세한 이미지를 수집하기 위해 5nm 내의 강성과 팁 반경을 위해 0.1 - 0.3 N/m 범위 내에서 AFM 팁이 라이브 셀 이미징에 효과적입니다. 작은 원식 팁을 추천합니다. 날카로운 팁은 작은 접촉 영역과 샘플 형태76의작은 세부 사항 및 기능을 수집하는 데 도움이 더 들여쓰기 할 수있는 기능을 제공합니다. 그러나설정(예:설정점, 픽셀 시간, 접근 속도)이 너무 많은 들여쓰기를 필요로 하거나 들여쓰기가 너무 빠르기 때문에 날카로운 팁은 샘플을 천공하는 경향이 있기 때문에 문제가 될 수 있습니다. 높은 변형 속도 효과를 피하기 위해, 날카로운 팁 근처 의 로컬 변형 경화, 또는 단순히 접촉 영역과 접근 속도를 제어하기 위해, 많은 탄성 계수를 측정하기 위해 콜로이드 팁으로 힘 분광법을 사용하기로 선택합니다.

1 - 5 μm 내의 강성 및 팁 반경에 대한 0.01 - 1.0 N /m 범위 내에서 AFM 팁은 살아있는 세포의 탄성 계수를 측정하는 것이 좋습니다. 큰 팁 크기, 일반적으로 유리 콜로이드, 알려진 된 접촉 영역을 제공 하 고 접촉 하는 동안 셀을 펑크 가능성이. 직사각형 캔틸레버는 교정 중에 삼각 형상에 대한 접촉 기반 교정과 비교하여 직사각형 형상에 접촉없는 방법을 사용할 수 있기 때문에 삼각형보다 선호됩니다. 또한 AFM 팁의 섬세한 특성으로 인해 운전자는 고무 팁이 있는 핀셋을 구현하여 섬세한 AFM 칩 이나 장착 블록을 손상시킬 가능성을 줄이는 것이 좋습니다. 염두에 두어야 할 다른 매개 변수에는 AFM 팁의 접근 속도와 샘플에 대한 들여쓰기 의 양이 포함됩니다. 좋은 지침은 샘플의 두께 (또는 높이)의 약 10 %까지 들여 쓰기를 유지하고 캔틸레버(38)에의해 경험 잠재적 인 유체 역학 저항을 배제 하는 속도를 선택하는 것입니다.

복잡한 실험 계측기에는 일반적으로 계측기 설정, 교정 및 작동에 문제 해결이 필요한 장애물이 있습니다. AFM 팁이나 캔틸레버를 샘플 또는 샘플 기판에 충돌하는 것은 신규 사용자에게 일반적인 실수입니다. 이 문제를 피하기 위해 프로토콜은 캔틸레버를 2000 μm 밖으로 뒷받침하는 것을 제안합니다. 이 단계는 이전 사용자가 실험 후 청소 할 때 팁을 철회하는 것을 잊어 버린 경우 팁이 접시의 바닥과 접촉하지 않도록합니다. 그러나, 2000 μm 거리는 이 프로토콜에 사용되는 선택된 접시 홀더에 대해 선택되었다. 사용되는 접시 홀더 스타일에 따라 다른 범위, 더 크거나 작은, 선택해야 할 수도 있습니다. 레이저 및 검출기의 정렬 동안, 프로토콜은 합계 신호를 최대화하기 위해 거울 노브의 조정을 언급한다. 모든 AfM에는 미러 조정 노브가 없을 수 있습니다. 그러나, 낮은 섬 신호를 해결하기 위해 악기를 조작하는 한 가지 방법은 스캐닝이 일어나는 매체를 고려하는 데 사용되는 미러 노브를 조정하는 것입니다. 액체(예:물, 미디어, PBS) 또는 공기. 공기를 통해 액체를 통해 빛에 대한 굴절 지수의 차이로 인해 거울 손잡이를 조정해야 할 수도 있습니다. AFM 캔틸레버의 최대 굽힘 감도는 AFM 팁의 위치에 있으므로 포토다이오드에 배치를 통해 굽힘 위치를 반환하는 레이저 라이트는 AFM 팁의 위치에 있어야 합니다. 선택한 AFM 팁에 따라 총 신호 값은 0.3 ~ 3.0 V에서 다를 수 있습니다. Cr-Au 또는 Al과 같은 AFM 캔틸레버의 뒷면 코팅은 측정의 합계 신호 및 감도를 증가시게 됩니다.

팁 지오메트리는 AFM 작업 중에 팁 보정을 완료할 때 관련이 있습니다. 비접촉식 및 접촉 보정 간에 좋은 합의가 관찰되었습니다. 선택한 AFM 캔틸레버가 직사각형이 아닌 경우 접촉 보정을 수행해야 합니다. 팁이 보정되는 매체는 샘플 매체와 같아야 합니다. 이러한 유체가 다른 경우 사용자는 다시 보정해야 합니다. 액체에서 AFM 팁을 사용하는 경우, 시스템에 의해 측정된 주파수는 제조업체가 나타내는 천연 공명 주파수의 1/3에서 1/3이어야 합니다. 시스템이 팁을 올바르게 보정했는지 확인하는 좋은 방법은 생성된 열 노이즈 파일 내의 값을 확인하는 것입니다. 이 파일이 적절한 폴더에 저장되었는지 확인합니다. 시스템에 문제가 있거나 가능성 없는 값이 나오지 않으면 레이저 위치를 약간 재조정한 다음 다시 보정합니다.

Sum 신호가 좋지 않아 AFM 캔틸레버 정렬때문일 수 있습니다. AFM 칩이 유리 블록에 장착되면 캔틸레버 의 끝이 작은 레이저 창 (부드러운 유리 영역) 내에 남아 있는 것이 필수적입니다. 칩이 너무 멀리 앞으로 나아오면 캔틸레버가 자연스럽게 놓이는 각도는 캔틸레버반사에 문제가 발생하여 광검출기가 누락되어 합계 신호가 좋지 않을 수 있습니다. 칩이 너무 멀리 뒤로 되면 레이저가 캔틸레버 뒤쪽을 반사할 수 없으므로 합계 신호가 떨어집니다. 이러한 이유로 장착된 AFM 칩을 조정해야 할 수 있습니다. 또한 샘플 높이와 함께 발생할 수 있는 또 다른 문제가 발생합니다. 이 프로토콜에 사용되는 AFM 계측기는 15 μm의 최대 압압 z 범위(높이)를 가지고 있습니다. 사용자가 소프트웨어가 특정 픽셀에서 높이 데이터를 수집하고 맵을 강제로 수집할 수 없음을 발견하면 시스템이 범위를 벗어났음을 나타내는 블랙박스가나타납니다(그림 2C). 이 문제를 쏘는 한 가지 방법은 압전 높이를 2 또는 3 μm과 같은 낮은 값으로 설정하여 15 μm 범위의 대부분이 셀의 예상 높이를 매핑하는 데 전념하는 것입니다. 이 기술은 대부분의 세포 또는 박테리아 관련 실험에서 z 범위와 관련된 문제를 해결해야 합니다.

높이가 10μm이상인 높은 시료에 대해 확장 된 z 범위를 필요로하는 실험가들은 AFM에 추가 모듈을 추구해야 할 수도 있습니다. AFM 제조업체는 대부분의 시스템에 추가 비용으로 이 옵션을 사용할 수 있습니다. z 범위를 확장함으로써, 실험자는 범위를 벗어난 값 이나 AFM 압압 모터 수정에 대 한 작은 문제와 마이크로 규모에서 키가 간주 되는 샘플을 스캔 하는 가용성. 이러한 모듈은 추가 비용이 들지만 제조업체에 따라 일부 모듈은 z 방향으로 최대 100 μm의 추가 높이를 제공할 수 있습니다. 사용자가 장거리, 높은 배율 목표를 가지고 있거나 공기 목표, 아마도 20배 또는 40x를 사용하려는 경우 더 높은 샘플로 여전히 공초점이 가능합니다. 현미경 목표 배율을 낮춤으로써 작업 거리가 증가하여 키가 큰 시료의 정점을 볼 수 있는 거리를 확보합니다. 낮은 배율 목표에 대한 이러한 수정은 해결책을 희생할 것입니다. 이 원고에서 언급된 Conpokal 설정에서 60x TIRF(총 내부 반사 형광) 목표는 유리 바닥 시료 접시의 커버슬립을 지나 100 μm 에 가까운 작업 거리를 가한다.

이 원고에서 언급 된 공초점 현미경에 관해서는 몇 가지 중요한 규정이 논의됩니다. 이 원고에서 수치의 생산에 사용되는 공초점 시스템은 1.49의 수치 조리개와 함께 60배 TIRF 오일 목표를 구현했습니다. 405nm, 488nm 및 561 nm 내포 파장의 레이저 라인은 도 3 및 도 4에도시된 살아있는 세포 샘플 이미징에 사용되었다. 공초점 현미경의 회절 제한은 Abbe 해상도 방정식, Abbe Resolution(x,y) = λ/2NA를 사용하여 결정할 수 있으며, 여기서 λ는 알렉사 488, 488 nm에서, 및 NA는 0.3인 공초점 응축기의 수치 조리개이다. 따라서 272nm의 축 분해능이 결정된다. epifluorescence 화상 진찰을 위해, 2개의 케이스는 핀홀이 1개의 통풍 장치 (AU) 및 0.5 AU로 설정된 해결책을 결정하기 위하여 고려됩니다. 후자의 경우 핀홀이 닫혀 상당한 광 손실이 발생하지만 해상도가 증가합니다. 공초점 소프트웨어는 0.5 AU에서 핀홀의 경우 170nm 및 290 nm에서 측면 네이티브 및 축 네이티브 해상도를 계산하고, 핀홀의 경우 각각 1AU의 핀홀에 대해 200 nm 및 370 nm를 계산합니다. 시스템에 도입된 구형 수차는 현미경 이미지의 대비 및 해상도를 높이기 위해 극율 보정 과정을 통해 설명할 수 있다. 공초점 현미경으로 내재된 회절 제한으로 인해 도 6의 박테리아 콜로니의 공초점 이미지는 도 5에서박테리아의 AFM 스캔에서 볼 수 있는 세부 사항에 대한 일치해상도가 결여되어 있다. AFM은 공초점 현미경으로 캡처하기 어려운 나노 스케일 기능과 세부 사항에 대한 액세스를 제공합니다. 그러나 필요한 형광 해상도에 따라 도 5 및 도 6은 진핵 세포 이외에 미생물에 대한 Conpokal 기술의 적용 가능성을 입증합니다.

공초점 현미경을 사용하면 작업자가 선명한 디테일이 있는 샘플에서 특정 영역의 3D 이미지를 수집할 수 있습니다. 이러한 이미지는 AFM 이미지와 동일한 영역의 공초점 스캔을 통해 프로브된 표면을 확인하여 AFM과 상관관계가 있습니다. 현미경이 반전되기 때문에, 상피형 화상은 조사된 견본의 반대쪽에서 광 정보를 수집합니다. 공초점 시스템 내의 핀홀은 샘플의 나머지 부분이나 방에서 나오는 빛을 필터링하는 동안 특정 거리에서 단일 평면으로 제한하는 데 도움이됩니다. 기본적으로 핀홀은 샘플에 대한 관심의 단일 평면에서 돌아오는 빛을 분리하는 데 도움이 됩니다. 전형적으로, 이 관심 있는 평면은 강한 불소공포증 마커를 포함해야 하는데, 왜냐하면, 반전된 공초점 계통을 위해, 단 하나 분자 검출은 고해상도 공초점 현미경으로 제한될 것이기 때문입니다. 에피플루오레시언스 조명은 상피 형광 이미징 모드에서, 목표에 반영되는 샘플의 모든 빛이 수집되어 이미지를 생성하는 데 사용되므로 단일 평면을 분리하는 것이 불가능하기 때문에 덜 바람직하다. 공초점 기술은핀홀(77)으로인해 문제의 샘플 피쳐의 보다 격리된 단일 평면 이미지를 제공한다. 예를 들어, 진핵 세포의 정점이 AFM에 의해 조사되는 경우, 동일한 표면은 상피 이미징 모드가 아닌 현미경의 레이저 스캐닝 공초점 기능으로 격리될 수 있다. 전달된 광 검출기 및 488 nm 레이저 라인의 도움으로 차동 간섭 콘트라스트 모드에서 동시에 이미징을 통해 데이터 수집 시 세포의 상태/모양을 모니터링하는 것이 좋습니다. 샘플의 z 스택을 캡처할 때 위에 자세히 설명된 프로시저의 경우 검출기의 게인만 조정됩니다. 형광 채널에서 반드시 볼 수 없는 측정 중 세포의 형태학적 변화는 아티팩트가 측정에 도입된다는 것을 나타냅니다.

평면 간의 이상적인 간격은 이미징 기술에 사용되는 가장 짧은 파장에 대한 소프트웨어 권장 사항을 따라 얻을 수 있습니다. 수집 소프트웨어의 이미지 처리 모듈에서 사용할 수 있는 디온볼루션 알고리즘을 사용하여 이미지 볼륨의 기본 해상도 및 신호 대 노이즈 비율을 효과적으로 향상시킬 수 있습니다. 그러나 형광 현미경 검사를 수행하면 특정 얼룩과 염료를 선택하는 것은 초기 의 표백 또는 교차 토크를 피하기 위해 중요합니다. 경우에 따라 사용자는 공초점 광 생성에서 오작동을 경험할 수 있습니다. 사용자가 발광 부족또는 레이저 라인 오작동이 발생하는 경우, 문제를 해결하는 한 가지 방법은 일반적으로 작동 소프트웨어를 다시 시작하여 시스템을 재설정하는 것입니다. 문제가 지속되면, 전달된 광 검출기는 광 현미경의 광학 경로 내에서 제자리에서 또는 밖으로 이동하지 못했을 수 있습니다. 송신기 검출기의 위치를 재설정하면 광 수집 또는 레이저 이미징 문제를 완화하는 데 도움이 될 수 있습니다.

Conpokal 기기의 초점은 액체 환경에서 살아있는 생체 재료에 대한 광학 및 힘 기반 정보를 동시에 동일한 세포 또는 기능에 수집 할 수있는 기능을 사용자에게 제공하는 것입니다. 이 작품은 많은 생체 재료에 대한 천연 가정인 액체에서 이러한 실험을 수행하는 방법을 명시적으로 설명하지만, 건조한 실험은 여전히 계측을 사용하여 수행 될 수 있습니다. 페트리 요리에 샘플을 준비, 접시 높이는 제한이다. AFM 캔틸레버를 보유하는 유리 블록의 구성으로 인해 요리의 측면 벽은 높이가 10mm 미만이어야합니다. 접시가 너무 키가 큰 경우 기기는 AFM 팁을 샘플 또는 기판의 표면으로 낮출 수 없습니다.

샘플 크기에는 제한이 있지만 시간 지연과 관련하여 계측기 또는 소프트웨어 기능에는 제한이 없습니다. 동시 공초점 및 AFM은 적절한 요소를 갖춘 경우에 가능합니다. 그 가까운 동시 기능에 기여하는 제한은 특정 공초점 현미경 기능 및 원자력 현미경 검사법을 동시에 수행할 때 생성되는 소음을 말합니다. z 스택을 수집하는 동안 현미경 목표를 이동하는 모터의 진동이 모션 중에 AFM 프로브 팁의 신호에 추가됩니다. 모터가 z 방향으로 위아래로 움직여 시료의 순차적인 평면을 비추기 때문에 오일 목표에 의해 소음이 향상됩니다. 따라서 권장 프로토콜에는 AFM 스캔 및 공초점 z 스택 이미지의 순차적 컬렉션이 포함됩니다. 동시 CLSM및 AFM은 공초점과 고정 된 이미징을 필요로하지만, 현재 의 기술로, 두 악기의 지연 시간은 수십 초만큼 짧을 수 있습니다. AFM 작업에서 공초점 이미징으로 전환하는 실제 시간은 도 2A 및 도 4B에서수집된 이미지의 경우 약 2~4분이었습니다. 이 값은 AFM 스캔을 시작하고 완료하는 시간, 공초점 이미징을 활성화하기 위한 계측기 모드를 전환하고 공초점 이미지 z 스택을 시작하고 완료하는 시간을 포함하는 총 33분 의 총 시간에서 두 개의 이미지 수집 기간을 빼서 결정되었습니다.

Conpokal의 미래는 단일 세포 프로세스에 대한 예리한 통찰력 외에도 새로운 구조 기능 관계를 탐구하는 것을 목표로합니다. 예를 들어, 세포 탄성의 효과를 결정하기 위해 세포 또는 세균 샘플에 대한 현장 약물 치료의 실험은 생체 재료, 생물학 및 생체 역학 분야로의 발전이 될 것입니다. 이미징 및 프로빙 동안 샘플 접시에 대한 치료 치료는 시간이 지남에 따라 샘플이 라이브 및 신중하게 제어 된 환경에서 치료에 어떻게 반응하는지에 대한 지식을 제공합니다. 새로운 약 또는 환경 과제를 통합하는 것은 세포골격 또는 세포기관 위치가 운동, 토폴로지, 강성 등에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 이해를 넓힐 것입니다. Conpokal의 또 다른 잠재적 발전은 시스템의 완전한 환경 제어를 할 수있는 능력입니다. 이 프로토콜에 언급 된 현재 Conpokal은 실험실 내부에서 소음을 줄이기 위해 설계된 음향 인클로저 내부에 보관되어 있습니다. 이 하우징의 발전은 멸균 환경, 온도 제어 또는 가변 중력과 같은 요인에 국한되지 않는 요인의 하나 또는 조합 내에서 테스트 할 수있는 기능을 제공합니다. 그것은 의미로, Conpokal 방법은 살아있는 액체 생체 물질을 특성화하기위한 효과적이고 유용한 접근 방식을 제공하지만, 기술의 미래는 이러한 기능을 더 발전시킬 것입니다.

Disclosures

저자는 경쟁적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

Acknowledgments

우리는 번호 P20GM130456에서 NIH COBRE 자금을 인정합니다. 우리는 이 일에 도움을 준 영국 빛 현미경 코어에 감사드립니다. 나탈리아 코로트코바 박사가 S. 뮤탄과 E. faecalis균을 제공했습니다. 공초점 현미경 검사법과 원자력 현미경 검사법의 조합을 설명하기 위해 연극 에 단어, Conpokal의 첫 번째 언급은 박사 브래드 베론에 기인, 화학 및 재료 공학, 켄터키 대학에서, 박사 마사 그레이디 (해당 저자)와 논의, 누가 켄터키 대학의 화학 및 재료에 교수에 합류 기대 (해당 저자) 박사.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acoustic Enclosure JPK-Bruker Acoustic Enclosure Chamber used to mitigate noise
BioTracker 488 Green Microtubule Cytoskeleton Dye Millipore Sigma SCT142 Used to label microtubules in mammalian cells
CP-qp-CONT-BSG AFM tips NanoAndMore CP-qp-CONT-BSG-B Collodial AFM tips good for modulus measurements on biological samples
Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3))) ThermoFischer Scientific D282 Used to label plasma membrane of mammalian cells
Dulbecco's Modified Eagle Medium VWR VWRL0100-0500 Component of cell culture media
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline ThermoFisher Scientific A1285601 Used to simulate biological environment
Fetal Bovine Serum Fischer Scientific 45000-736 Component of cell culture media
Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: Yeast Extract Fischer Scientific BP1422-500 Component of bacterial culture medium
FluoroDish Cell Culture Dish World Precision Instruments (WPI) FD35-100 Glass-bottomed dishes whose side walls are less than 10 mm, necessary for full function of Nanowizard 4a AFM
Hoechst 33342 nucleic acid stain ThermoFischer Scientific 62249 Used to label nucleus of mammalian cells, a good nuclear marker for live cells
Human embryonic kidney 293 cells ATCC Global Bioresource Center CRL-1573 Mammalian cells used in protocol
Matrigel VWR 47743-716 Coating in cell culture dish
Model: PFQNM-LC-A-CAL AFM tips Bruker PFQNM-LC-A-CAL AFM tips that work well for samples that have large heights (such as eukaryotic cells)
NanoWizard 4a JPK-Bruker NanoWizard 4a AFM
Nikon A1 Laser Scanning Confocal Microscope Nikon A1 HD25 Microscope used for brightfield, epi-fluorescence, and confocal imaging
PENICILLIN/STREPTOMYCIN VWR 16777-164 Component of cell culture media
PetriDishHeater JPK-Bruker PetriDishHeater Maintains desired Petri dish sample temperature
qp-BioAC-Cl AFM tips Nanosensors qp-BioAC-Cl-10 Three different AFM cantilevers of varying stiffness
Replaceable Carbon Fiber Tip Tweezers Ted Pella Inc. 5051 Used to carefully place and remove delicate AFM tips into the glass mounting block
Todd Hewitt Broth Bacto BD DIFCO Bacterius Ltd Bacto-249240 Component of bacterial culture medium
Vancomycin, BODIPY FL Conjugate Thermo Fisher Scientific V34850 Used to fluorescently label bacterial cell wall

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생명 공학 문제 162 공초점 현미경 검사 원자력 현미경 검사 AFM 콩포칼 박테리아 세포 생물학 생체 재료 살아있는 세포 이미징 메카노생물학
라이브 셀에서 동시 레이저 스캐닝 공초점 및 원자력 현미경 검사(Conpokal) 근처
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Sandin, J. N., Aryal, S. P., Wilkop, … More

Sandin, J. N., Aryal, S. P., Wilkop, T., Richards, C. I., Grady, M. E. Near Simultaneous Laser Scanning Confocal and Atomic Force Microscopy (Conpokal) on Live Cells. J. Vis. Exp. (162), e61433, doi:10.3791/61433 (2020).

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