Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

ליד סריקת לייזר בו זמנית מיקרוסקופיה קונפוקל וכוח אטומי (Conpokal) על תאים חיים

Published: August 11, 2020 doi: 10.3791/61433
Automatic Translation
1, 2, 3,4, 2,4, 1
1Department of Mechanical Engineering, University of Kentucky, 2Department of Chemistry, University of Kentucky, 3Department of Physiology, University of Kentucky, 4UK Light Microscopy Core, University of Kentucky

Summary

להלן הפרוטוקול של טכניקת קונפוקל, המשלבת מיקרוסקופיה של כוח קונפוקלי ואטומי לפלטפורמת מכשיר יחיד. Conpokal מספק תא זהה, אותו אזור, ליד הדמיה קונפוקאלית בו זמנית אפיון מכני של דגימות ביולוגיות חיות.

Abstract

טכניקות זמינות לאפיון מכני מיקרו וננו-סולם התפוצצו בעשורים האחרונים. החל מהתפתחות נוספת של מיקרוסקופ האלקטרונים בסריקה והעברה, וכלה בהמצאת מיקרוסקופ כוח אטומי והתקדמות בהדמיה פלואורסצנטית, היו רווחים משמעותיים בטכנולוגיות המאפשרות חקר של חומרים קטנים. קונפוקל הוא פורטמנטאו המשלב מיקרוסקופיה קונפוקאלית עם מיקרוסקופיה של כוח אטומי (AFM), שבה גשוש "דוקר" את פני השטח. למרות שכל טכניקה יעילה ביותר לאוסף התמונה האיכותית ו/או הכמותית בעצמה, Conpokal מספקת את היכולת לבדוק עם הדמיית פלואורסצנטיות מעורבת ואפיון מכני. עוצב עבור הדמיה קונפוקאלית כמעט בו זמנית ו חיקור כוח אטומי, Conpokal מקל על ניסויים על דגימות מיקרוביולוגיות חיות. התובנה הנוסף מכישור מזווג מספקת לוקליזציה הדדית של תכונות מכניות נמדדות (למשל,מודולוס אלסטי, הידבקות, חספוס פני השטח) על ידי AFM עם רכיבים תת-תאיים או פעילות שניתן לצפות בה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקולרית. עבודה זו מספקת פרוטוקול צעד אחר צעד לפעולה של מיקרוסקופיה קונפוקל וכוח אטומי סריקת לייזר, בו זמנית, כדי להשיג את אותו תא, אותו אזור, הדמיה קונפוקל, ואפיון מכני.

Introduction

כלי הערכה מכניים מיקרו או בקנה מידה ננו משמשים לעתים קרובות כדי לחשוף את מאפייני הדפורמציה ברמת התא הבודד או מיקרואורגניזם, בעוד כלי מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה נפרדים משמשים כדי לדמיין תהליכים תת-תאיים ותכונות מבניות. Conpokal, הוא השילוב של מיקרוסקופיה קונפוקאלית סריקת לייזר מיקרוסקופיה כוח אטומי (AFM) לתוך פלטפורמה אינסטרומנטלית אחת. טכניקת קונפוקל יושמה לראשונה במערכת פולימרים לא ביולוגית, שם המטרה הייתה לקבוע את ההידבקות, הגמישות ומתח פני השטח של משטחים קשים במגע עם משטחים רכים. תמונות קונפוקל סיפקו עיבוד חזותי של האופן שבו הפולימר מעוות, דבק ומשחרר מהגשושהקשה 1,2. מפולימרים לדגימות ביולוגיות, טכניקה זו מספקת את ההזדמנות כמעט בו זמנית תא חי או מיקרואורגניזם הדמיה קונפוקל ו AFM.

שינויים בגמישות התאים היו מעורבים בפתוגנזה של מחלות אנושיות רבות3 כולל הפרעות בכלי הדם4מלריה5,6אנמיה חרמשית,7דלקת פרקים, דלקת פרקים,8אסטמה9וסרטן,6,10,11,12,13,14,15. טכניקות נפוצות למדידת המכניקה של תאים כוללות שימוש חרוזים מגנטיים16,17פינצטה אופטית,18,19שאיפת מיקרופיגט,8,20,21,22ו- AFM11,23,24,25,26. מאז היישום של AFM לתאים חיים, זה הותאם בקלות כדי לאפיין טופוגרפיה של התא27,28 כמו גם תכונות מכניות11,24,29,30,31 בדיוק ננומטרי. AFM הותאם עוד יותר למיקרו-ארכיאולוגיה32,33אפנון תדרים,34,35וזחל25,36,37 ניסויים לחקר המאפיינים הוויסקואלסטיים של קווי תאים שונים. השימוש במודל ננו-קונטקט מתאים הוא קריטי להפקת ערכי גמישות כמותית ממדידות כניסת כוח המיוצרות על ידי AFM1,2. מחקרי AFM החוקרים את ההשפעה של תרופות ציטוסקלטליות על גמישות התא הראו את מודולוס אלסטי להיות מושפע מאוד38. בהתבסס על מדידות מודולוס אלסטי, חוקרים רבים הראו כי תאים סרטניים הם רכים יותר מאשר עמיתיהם שאינם משתנים11,38,39. עיוות מוגבר ממלא ככל הנראה תפקיד בולט ביכולתם של תאים סרטניים לגרות גרורות ולחדור לרקמות40. התנהגות כזו מוסדרת על ידי שינויים בארגון cytoskeletal של תאים38,41,42. בנוסף לסרטן, סוג אחר של מחלות תלויות מכנית הן מחלות בדרכי הנשימה. לדוגמה, תסמונת מתח נשימתי חריפה משפיעה על יותר ויותר בני אדם בכל שנה. הוכח כי כאשר חולים לשים על אוורור מכני, עם ריכוזים גבוהים של חמצן, מצבם יכול להחמיר43. בסדרה של מחקרים המתבוננים מקרופאגים אפיתל מכתש עם AFM, מדענים מצאו כי תוספת של סביבה עשירה בחמצן גדל הנוקשות של תאים עקב היווצרות actin; דוגמה עיקרית להשפעה שיש ל-AFM על ההבנה המפורטת שלנו את ההשפעה הסביבתית האטמוספרית על תפקוד הנשימה ברמה התאית, ובסופו של דבר על הריפוי והבריאות האנושית.44,45,46. נוקשות תא אפיתל במהלך הנדידה לכיוון פצע ניתן להעריך גם באמצעות AFM, כי וריאציה של מודולוס אלסטי מתרחשת כדי לאותת על התפשטות תאים בעתיד47,48. לכן, יש צורך מעשי למדוד מכניקת תאים כמותית כדי להבין כיצד תאים חיים שונים, ולקיים אינטראקציה עם, בריאים.

AFM משמש גם לחקר תכונות דבק ומבנה פני השטח. מיקרוסקופ כוח אטומי יש מגוון של מצבים כדי לאסוף מידע על מדגם באמצעות מכניקת מגע. עבור דגימות ביולוגיות חיות, שתיים מהמטרות העיקריות הן להשיג ערכי מאפיינים מכניים כמותיים (למשל,מודולי אלסטי, כוחות דבק) כמו גם למפות גובה פני השטח. מצבים אלה כוללים מצב הקשה (הידוע גם בשם מגע לסירוגין), אשר שומר על משרעת קבועה לסירוגין יצירת קשר עם פני השטח לדוגמה ואת מצב מגע, אשר מעלה או מוריד את cantilever כדי לשמור על הסטהמתמדת 49. ניתן לאסוף מפות הידבקות באמצעות מיפוי כוח במערכת AFM. ה- cantilever מהסיט פנימה את המדגם לכוח מסוים ולאחר מכן נסוג. הכוח המתנגד לנסיגה נמדד על ידי הגלאי כדי ליצור גרף עקירת כוח. כוח ההיתוך הוא הכוח המרבי שנמדד במהלך הנסיגה. מורפולוגיה פני השטח מספקת תצוגה מפורטת של המדגם ברמת המיקרו או הננו. ה- cantilever משלים סריקת רסטר על פני המדגם בהתבסס על הכניסה וההטיה שנלכדו על ידי תנועת ה- cantilever בכל פיקסל, וחושף תכונות בגודל מיקרו וננו. עם AFM, ניתן למדוד את גודלם שלתכונות קטנות כגון מבנה פפטידוגליקן 50,יישור שרשרת פולימר 51, פלאגלה52, לאמליפודיה53ו Filipodia54. בעוד שהכוח של AFM טמון בעקומות תזוזה בכוח ובתמונות טופולוגיות לא אופטיות, מיקרוסקופיה קונפוקלית מציעה הדמיה מפורטת של דגימות עם תוויות פלואורסצנטיות.

מיקרוסקופיית סריקת לייזר קונפוקל (CLSM) היא טכניקה דומיננטית להדמיית תאים חיים, תאיםקבועים ורקמות 55,56,57. CLSM מועסק עבור הדמיה ביולוגית מאז 1955 כלומר, מאזהקמתה 58,59. בעוד עקרון העבודה של מיקרוסקופים קונפוקלים(כלומר,הדחייה של אור מחוץ לפוקוס דרך חור סיכה) נשאר במידה רבה זהה, היישום הטכניהפך מגוון מאוד 56,57,58,60. הדמיה קונפוקל ניתן ליישם באמצעות סריקה רב נקודתית, כמו במערכתדיסק מסתובב 61, סריקת נקודה של קרן לייזר אחת,כמו בסריקת קו 62, או הדמיה של פונקציית התפשטות הנקודה עם הקצאות מחדש פיקסלים הבאים באמצעות גלאימרובה אלמנטים 57. ההתקדמות האחרונה המרחיבה את התועלת של הדמיה קונפוקל כוללים יכולת סריקת לייזר, סריקת תהודה במהירותגבוהה, וגלאי רגישות גבוהה 63,64,65. היתרון שיש לכל מערכות הקונפוקל על פני מיקרוסקופים רחבים הוא היכולת לבצע חתך אופטי בציר z בפירוט רב יותר, במיוחד בדגימות עבות. מיקרוסקופים רחבים באמצעות זיהוי מבוסס מצלמה אוספים אור הנפלט ממישור המוקד ובמקביל, אור הנפלט מכל מקום בנתיב התאורה. על ידי סגירת חור הסיכה, במחיר של הפחתת האות, ניתן להגדיל הן את הרזולוציה האקסיאלית והן את הרזולוציה הצדדית66. ב- CLSM, תמונות נבנות פיקסל אחר פיקסל באמצעות אוסף אותות פליטה כאשר לייזר בעירור נסרק על-פני שדה תצוגה של x-y. לאחר מכן ניתן להשתמש באוסף של מספר מטוסי x-y לאורך ציר z של המדגם כדי לשחזר את הארכיטקטורה התלת מימדיתשל המדגם 57,67. מיקרוסקופ קונפוקל בשילוב עם כניסתה של חלבונים פלואורסצנטיים, יש מהפכה ההבנה שלנו של ביולוגיה של התא68. לדוגמה, זה הפך לכלי חיוני במדעי המוח69. CLSM משמש באופן קבוע כדי לבחון רקמה מנוקה, ולקבל תמונות מקיפות של המוח מוכתם במערכת החיסון וארכיטקטורת רשתעצבית 70. יישום זה הביא תובנות חדשות לתוך מגעים סינפטיים ותקשורת בין נוירונים ותאי גליה במוח71. מתאי מוח לווסיקלים, פרוטוקולי כתמים פלואורסצנטיים תומכים בבדיקה ולכידה של תפקודי תאים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקל להתקדמותבטכניקות טיפוליות 72,73.

למרות שהם כלים מרשימים ורב-תכליתיים בנפרד, השילוב של מיקרוסקופיה של כוח קונפוקלי ואטומי (Conpokal) מאפשר לחוקרים לתאם באופן ייחודי תכונות תאיות/רקמות מיקרומכניות עם התבוננות של אורגנים תאיים שונים והדינמיקה שלהם בהתאמה. מכשור מזווג מאפשר למשתמשים, בעיקרו של דבר, "לראות" מה הם מחפשים; יתרון עצום על פני טכניקה אחת בפני עצמה. עם קונפוקל, מיפוי כוח באמצעות AFM מכוסה בתמונות קונפוקליות כדי לתאם נוקשות תאים, הידבקות או מורפולוגיה למבנה הציטוסקלאטל בתוך המדגם, למשל. המטרה הכוללת של שיטת Conpokal היא לספק פלטפורמה לחוקרים ללמוד דגימות חיות בצורה תמציתית ויעילה, המספקת הן נתוני מאפיינים של תמונה והן של חומר בפלטפורמה אחת. בעבודה זו, אנו מדגימים את הפעולה של Conpokal כולל בחירה והכנה מדגם נאות, הגדרת מכשיר, כיול cantilever, ולספק קווים מנחים לפתרון בעיות מוצלח. לאחר הפרוטוקול, אנו מספקים תוצאות מייצגות הכוללות מיפוי מוצלח של חיידקים ותאים בגובה AFM, מיפוי מודולוס AFM של חיידקים ותאים, והדמיה קונפוקל של תאים מרובי תוויות, באמצעות אותו תא confocal ו- AFM. אנו מסיימים בדיון על הצעדים הקריטיים של הליך קונפוקל, המלצות לפתרון בעיות, מגבלות טכניקה, משמעות ותחזית עתידית עבור השיטה.

Protocol

1. הכנת כלים, מדיה תרבותית, מנות

  1. הפעל את מקורות הכוח הן עבור המיקרוסקופ הקונפוקלי והן עבור מיקרוסקופ הכוח האטומי, כמו גם עבור כל מכשירים או מכשירים אחרים הקשורים לשימוש במהלך קונפוקל. אפשר מספיק זמן עבור המכשירים כדי לצייד תרמית ולייצב לפני תחילת מדידות. בדרך כלל, 1 שעות מספיק.
  2. הכינו צלחת פטרי אחת נקייה, מאושרת על ידי המערכת, עם תחתית זכוכית ומלאים למחצה, אך לא יותר משני שליש מלאים, עם תמיסת מלח מאוגרת פוספט (PBS), או נוזל ברור דומה. מנה זו (המכונה "צלחת הכיול") נפרדת ממנות המדגם ותשמש לאיתור וכיול מיקרוסקופ הכוח האטומי (AFM).
    הערה: חשוב שהנוזל יהיה ברור ויש לו שפעת אוטומטית נמוכה כדי למנוע כל הפרעה לספקטרום הפלואורסצנטי. PBS מומלץ כי זה מחקה את הסביבה הביולוגית.
  3. מכינים מנות מדגם ניסיוניות כך שהנוזל המשויך מילא את המנה לפחות חצי מלא. אם המדגם הוא פלואורסצנטי, ודא שהוא מכוסה או במקום חשוך עד הצורך. נקה את החלק התחתון של כל כלי הזכוכית באמצעות מנקה עדשות ומגבוני עדשה.
  4. צור תיקיות אחסון נתונים עבור הקונפוקל וה- AFM בכוננים הקשיחים של המחשבים.

2. בחירת תאים או מיקרואורגניזמים

  1. כדי ליצור פתרון מלאי חיידקים, לחסן חיידקים מוטנים סטרפטוקוקוס, באמצעות לולאת חיסון, ב 15 מ"ל של טוד יואיט שמרים (THY) לילה (עבור שלב מעריכי) ב 5% CO2 אינקובטור.
  2. 1 שעה לפני הדגירה לילה הושלמה, מנות מדגם ניסיוני מעיל עם 1 מ"ל של פתרון פולי L-ליסין או מספיק כדי לכסות את חלק הזכוכית של צלחת תחתית זכוכית ולהשאיר את ארון biosafety במשך 1 שעות. לאחר ההגדרה, שאפו תסנובת פולי-ל-ליסין ושטוף את הכלים 3x עם PBS.
  3. לאחר 18 – 24 שעות של דגירה חיידקית, לחסן THY עם 1 מ"ל של השעיה חיידקית עד צפיפות אופטית של 0.6 – 0.7 מושגת (ערכים אופייניים לחיסון הם 3 מ"ל של THY עם 1 מ"ל של השעיה חיידקית לכל צלחת). הוסיפו 1 מ"ל של חיידקים חדשים לכל מנה מצופה פולי-ל-ליסין ודגירה למשך שעה. במהלך 10 דקות האחרונות, להוסיף 1 מ"ל של כתם קרום פלואורסצנטי ירוק (ריכוז של 1 מיקרומטר) לכל מנה.
  4. יש לשטוף כל מנה פי 3 עם PBS. בעדינות לתקן את החיידקים עם כ 1 מ"ל של 4% paraformaldehyde פתרון במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בתוך ארון biosafety. יש לשטוף כל מנה פי 3 עם PBS לאחר קיבעון.
  5. לאחסן את הכליה העוברית האנושית (HEK) 293 תאים בחנקן נוזלי. בצע הפשרה מהירה באמבט מים 37 °C (69 °F) לפני ציפוי.
  6. הוסף 1 מ"ל של פתרון מטריצת קרום מרתף במדיית תרבות התא לכל צלחת מדגם תא ודגירה (5% CO2) ב 37 °C (60 °F) עבור 1 שעות. שאפו את הפתרון ושטפו את הכלים במדיה של תרבות התאים. צלחת המספר הנדרש של תאי HEK 293 (למשל,100,000 תאים לכל צלחת 35 מ"מ) ולהוסיף 2 מ"ל של מדיה תרבות התא. לאחר מכן, דגירה (5% CO2) התאים ב 37 °C (69 °F) עבור 48 שעות.
  7. לאחר 48 שעות, מוסיפים 2 μL של צבע ציטוסקלטון microtubule פלואורסצנטי (ריכוז של 1x) לכל צלחת מדגם תא דגירה במשך 30 דקות. שאפו את הפתרון המכיל את הצבע, שטפו את התאים 3x עם PBS, והוסיפו 2 מ"ל של מדיה לתרבות התאים.
  8. הוסף 1 μL של צבע קרום פלזמה (ריכוז של 10 μM) לכלים מדגם דגירה במשך 30 דקות. לשטוף את הפתרון המכיל את הצבע 3x עם PBS ולהוסיף 2 מ"ל של מדיה תרבות התא.
  9. נטרל את הגרעין על ידי הוספת 1 μL של צבע חומצת גרעין (ריכוז של 10 מיקרומטר) פתרון מנות מדגם דגירה במשך 30 דקות. לשטוף את הפתרון המכיל את הצבע 3x עם PBS ולהוסיף 2 מ"ל של מדיה תרבותית.

3. הליך AFM

  1. פתח את תוכנת ההפעלה מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) על ידי לחיצה על סמל התוכנה במחשב.
  2. סובב אל המטרה של אוויר הגדלה נמוכה או הכנסה (מומלץ 10x או 20x). מרחק עבודה ארוך של 5 מ"מ או יותר מועיל במהלך הנכיול והכיול של הקצה.
  3. תקן את שלב דגימת התא הנבחר אם הוא עדיין לא מותקן. לדגימות חיות, יש להשתמש בתנור כלים כדי לשמור על הדגימה בטמפרטורה הרצויה.
  4. טוענים את צלחת פטרי הנקייה המאושרת על ידי המערכת, המלאה בחצי מלא ב-PBS (מוכן בשלב 1.2) או נוזל ברור דומה (צלחת כיול). אם שלב הדגימה כולל אבזם מובנה, השתמש בהם, אחרת, השתמש בשומן ואקום כדי לייצב את הדגימה.
  5. בחר CANTILEVER AFM המתאים עבור איסוף הנתונים הרצוי ולהתקין אותו בעקבות השלבים הבאים.
    1. באמצעות כפפות, הר את שבב AFM לתוך בלוק הזכוכית באמצעות שלב ההרכבה שבב AFM, פינצטה, מברג קטן. מניחים בזהירות את שבב ה- AFM על בלוק הזכוכית ומכווןים אותו כך שהוא מרוכז. Cantilever, בתוספת חלק קטן מאוד של שבב AFM, צריך להיות בחלק גלוי, לא אטום של בלוק הרכבה.
    2. אבטחו את השבב עם המברג על ידי הידוק המברג עד השבב נוח נגד בלוק הזכוכית. ודא כי cantilever AFM מכוונת כראוי באמצעות מיקרוסקופ סטריאו או spyglass כף יד. התאם לפי הצורך. לאחר התמצאות נכונה, מניחים את בלוק הזכוכית לתוך ראש AFM בכיוון הנכון ולנעול אותו במקום.
      הערה: הכיוון של שבב AFM בתוך בלוק הזכוכית חשוב, כך לייזרים המערכת לכוון בחלק האחורי של cantilever ולהרהר על photodetector כראוי. היזהר לא לחוץ את הברגים במהלך המיקום כמו הליך זה יכול לגרום שבב AFM, cantilever, או טיפ לשבור.
  6. באמצעות אפשרות השדה הבהיר של מיקרוסקופ הקונפוקל, אתר את החלק התחתון של צלחת הכיול באמצעות ידית המיקוד. שים לב לגובה z זה כערך שבו החלק התחתון של המנה ממוקם ביחס למטרה מיקרוסקופ.
  7. באמצעות לוח הבקרה המוטורי של מערכת AFM במחשב שמפעיל את מנועי הצעד z, להזיז את cantilever AFM מן המדגם כלפי מעלה 2000 מיקרומטר.
  8. בעזרת שתי הידיים, מניחים בעדינות את ראש ה-AFM עם שבב ה-AFM על במת הדגימה ומוודאים שכל אחת מהנקודות האנכיות על ראש ה-AFM מוגדרת היטב החריצים המיועדים להם על במת AFM. לאחר ראש AFM הוא במקום, חזותית לראות כמה קרוב מחזיק cantilever הוא המנה. אם זה נראה קרוב מדי, כך ראש AFM הוא במגע או בתוך 1 מ"מ של החלק העליון של צלחת המדגם, לגבות אותו באמצעות מנועי צעד z לפני הנתחת קצה AFM לכיוון המדגם.
  9. באמצעות תאורת שדה בהיר, לאט לאט להוריד את שבב AFM לתחתית צלחת הזכוכית באמצעות מנוע צעד z לוח הבקרה על תוכנת AFM. אתר את המיקרומטרים הידניים השליטה ב- x-y או בתנועה במטוס של ראש AFM בפלטפורמת המכשיר. התאם את המיקום של ה- AFM בתוך שדה התצוגה על-ידי תיקון ראש ה- AFM כפי שניתן לראות את ה- cantilever.
    1. מאז המיקום ביחס לתחתית המנה אינו ידוע בשלב זה, נמוך יותר עם מדרגות של 100 – 200 מיקרומטר כדי למנוע קריסה של קצה AFM לתוך צלחת פטרי. בדרך כלל, הטיפ צריך להיות הוריד 800 – 2000 מיקרומטר. כשהטיפ יורד, צפו בצל שיופיע בתצוגת תוכנת המיקרוסקופ, מה שמצביע על כך שטיפ ה-AFM מתקרב לתחתית המנה.
    2. הקטן במרווחים ל- 20 - 50 מיקרומטר. הקפד לכוונן את טבלאות המראה (LUTs) של תמונת המצלמה כאשר הקצה יורד לתוך המנה באמצעות החלונית LUTs בתוכנת הקונפוקל. המשך להנמיך את קצה ה- AFM באמצעות שלבים קטנים עד שהוא נמצא בעיקר בפוקוס.
    3. ודא שהטיפ כהה מספיק כדי שניתן יהיה לראות ולרכז את הצורה הכללית שלו בשדה המבט. כמו כן, ודא כי הקצה נראה מטושטש, אשר מאשר כי הוא לא נתקל בחלק התחתון של המנה, עדיין.
  10. התאימו את מיקוד המיקרוסקופ כך שהטיפ נמצא כעת בפוקוס, תוך שמירה על מרחק העבודה של המטרה. לפני המעבר למטרת הגדלה גבוהה יותר, השתמש בכלי מדידת המיקרוסקופ כדי לאסוף את הרוחב והאורך של ה- AFM על-ידי גישה לחלונית כלי המדידה בתוכנת הקונפוקל. שים לב למדידות אלה.
    הערה: חשוב לא לקרוס את המטרה לתחתית צלחת המדגם אשר עלול גם לגרום צלחת מדגם לבוא במגע עם קצה AFM, פוטנציאל לפגוע בו.
  11. אם קיים, הסר את מסנן אור הלייזר וודא שלייזר AFM דול, כך שאור הלייזר יהיה גלוי באופטיקה.
    1. באמצעות חוגות יישור לייזר, להעביר את הלייזר לתוך שדה הנוף ליד קצה AFM. לאחר הלייזר הוא במיקום זה, להחליף את מסנן אור לייזר.
    2. באמצעות חוגות יישור לייזר, למקם את הלייזר על הישבן שבו קצה AFM ממוקם על cantilever. בשלב זה, לוח יישור הלייזר צריך לקרוא אות סכום גדול מ- 0.0 V. אם לא מתקבל אות סכום, כוונן את המראה באמצעות ידית המראה הנשלטת באופן ידני עד שאות סכום גדול מ- 0.0 V יקרא על המסך.
    3. להזיז את הלייזר בכמויות קטנות לכל הכיוונים על cantilever AFM עד אות הסכום המרבי מושגת אבל המיקום הוא בקצה AFM. לאחר הגדרת מיקום הלייזר, אפס את ההטיה האנכית והאצלית באמצעות חוגות הסטה הנשלטות באופן ידני.
    4. שים לב לוח יישור לייזר על תוכנת AFM ועל ידי שימוש ידיות הסטה אנכית וצד על ראש AFM, ליישר את הגלאי, כך היעד מרוכז (נקודה אדומה במרכז הכוונת) ואין הסטה אנכית או לצדדים.
  12. פתח את חלון הכיול בתוכנת AFM. הזן את כל המידע הספציפי לניסויים. לפני הכיול, כבה את מקור האור של המיקרוסקופ הקונפוקלי וסגור את מארז AFM, אם רלוונטי, כדי לעמעם כל רעש פוטנציאלי המגיע מהאור או מתנודות החדר בחדר. לאחר מכן לחץ על לחצן הכיול כדי לאפשר למערכת לכייל את הקצה באופן אוטומטי. לאחר השלמת הכיול, הנוקשות של ה- cantilever (N/m) והרגישות שלו (nm/V) יסופקו בתוך לוח הכיול. שים לב אלה לניתוח מאוחר יותר.
  13. לסגת AFM cantilever לפחות 2000 מיקרומטר עם מנועי צעד. תוריד את ראש ה-AFM מהבמה ותסיר את צלחת הכיול. סובב אל המטרה הרצויה או הוסף לה. לסגת המטרה 10% של מרחק העבודה אם המערכת מתוכנתת לשמור על אותו מישור מוקד בין המטרות. אם זוהי מטרת שמן, מניחים טיפה אחת של שמן טבילה על עין המטרה.
    הערה: נסיגת המטרה מפחיתה את הסבירות שהמטרה תיצור קשר עם צלחת המדגם במהלך ההשמה.
  14. כדי להחזיק בבטחה את צלחת המדגם במקום, השתמש ספוגית כותנה להחיל dabs קטן של שומן ואקום סביב קצה טבעת המדגם בתוך שלב המדגם, או להשתמש קליפים מדגם. טוענים בזהירות את צלחת הדגימה לשלב הדגימה.
  15. לאחר הדגימה ממוקמת, לסובב אותו כמה פעמים כדי להבטיח חותם טוב של המנה למחזיק מדגם דרך השומן. העלה את המטרה לתחתית המנה עד שהשמן פשוט יפתיל מעל עין המטרה.
  16. באמצעות המיקרוסקופ, ללא ראש AFM על הבמה, למקד את מערכת ההדמיה, כך המדגם הוא בפוקוס. שים לב לגובה z זה לעיון.
  17. בזהירות להחליף את ראש AFM על הרציף.
  18. באמצעות מנועי צעד z, להוריד את הקצה לכיוון המדגם. עם הורדת קצה ה- AFM, התאימו את טבלאות המראה (LUTs) בתדמית השדה הבהיר לפי הצורך. מנמיך את הקצה עד כמעט חד. באמצעות מיקרומטרים של מיקום קצה AFM המופעלים באופן ידני, הזז את ראש ה- AFM כך שטיפ ה- AFM יהיה במרכז או משמאל במרכז שדה המבט.
    הערה: מאז גובה z של AFM צוין לפני בשלב 3.6, ניתן לנקוט צעדים גדולים יותר כדי להוריד את קצה AFM, עם זאת, שומן נוסף לתחתית המנה שמן פוטנציאלי למטרה, כך ערך זה הוא רק לעיון. מומלץ לקחת 50 - 100 צעדים מיקרומטר והתאמה קטנה יותר כמו הקצה נכנס לפוקוס
  19. תן מחדש את מיקום הלייזר באמצעות המיקרומטרים הידניים על ראש ה- AFM. במידת הצורך, אפס את הסטיות אנכיות צדדיות על ידי התאמת הידיות המתאימות לכייל מחדש את cantilever AFM בצלחת המדגם.
    הערה: אם ה- cantilever כויל במדיום שונה מהדגימה, יש לכייל אותו מחדש במדיום הסריקה כדי להסביר שינוי פוטנציאלי באינדקס השבירה. בנוסף, הלייזר עשוי להיסחף מהישבן של cantilever עקב רעש או שינויי טמפרטורה. רק להסתגל מחדש את הלייזר לכייל מחדש במידת הצורך ואת צלחת המדגם מעל מצע הזכוכית אם באמצעות כיול ללא מגע. אם אתה משתמש בכיול מגע, כייל מחדש בתוך צלחת הכיול באמצעות המדיום לדוגמה.
  20. כדי להשיג תמונות מיקרוסקופ קונפוקל באיכות גבוהה, החלף את מסנן האור הנוכחי המקלה במסנן החוסם את כל אור הלייזר של AFM. מסנן אור זה אינו מבטיח הפרעה מהאור הבהיר של לייזר AFM.
  21. באמצעות לחצן פקודת הגישה האוטומטית, המסומנה בדרך כלל על-ידי חץ הפונה כלפי מטה, מנמיך את הקצה לתחתית צלחת הדגימה. קבעו את גודל/אזור הסריקה, הרזולוציה, נקודת הסט, אורך z ותזמן הפיקסל (או השתמשו בערכים מכוילים/מופץ) בלוח הבקרה של ההדמיה והתחלו בסריקה.
  22. לאחר השלמת הסריקה, הרם את שבב AFM 50 - 100 מיקרומטר למעלה לפני הניווט למיקום מדידה חדש בצלחת המדגם. לאחר שנמצא מיקום חדש, התקרב לזכוכית והתחל לסרוק שוב לאחר השלבים 3.21 ו- 3.22.
  23. בחר באפשרות שמירה אוטומטית, או שמור באופן ידני כל קובץ שנוצר מכל סריקה בודדת על-ידי לחיצה על שמור.

4. הליך קונפוקל

  1. פתח את תוכנת ההפעלה של הקונפוקל. ודא שכל הציוד ההיקפי, מקורות האור והבקרים המשויכים מופעלים ומתפקדים כרגיל.
  2. סובב או הוסף מטרה של הגדלה נמוכה (10x או 20x) כדי להציג דוגמה. ודא שהמטרה נמצאת במרחק עבודה בטוח מהמקום שבו תהיה צלחת המדגם וב במידת הצורך, לסגת מהמטרה כדי למנוע כל התנגשות פוטנציאלית של המטרה עם המדגם. באמצעות ספוגית כותנה, לטבול שומן ואקום סביב קצה טבעת צלחת מדגם. אם משתמשים במטרה שמן, מניחים טיפה אחת של שמן טבילה על העדשה הקדמית של המטרה
  3. מניחים את הדגימה הרצויה בשלב הדגימה. סובב את המדגם כמה פעמים כדי להבטיח כי שומן ואקום יצר קשר הדוק לשלב המדגם להוסיף או להעסיק קליפים לדוגמה. אם משתמשים במטרה שמן, להעלות את המטרה לתחתית המנה כך השמן פשוט פתיל מעל תחתית הזכוכית. כדי למנוע הלבנה מוגזמת, מזערו את תאורת הסביבה.
  4. באמצעות מצבי בהירות או אפיפלואורסצנטיות באמצעות המצלמה או העיניים, אתר את הדגימה ובאמצעות ידית המיקוד, התמקד באזור מעניין המכיל תאים מרובים או תא יחיד. לעתים קרובות, שדה התצוגה בתוך המיקרוסקופ האופטי יהיה גדול יותר מחלון הסריקה x-y במערכת AFM (100 x 100 מיקרומטר). בצע התאמות של מיקום ה- AFM בתוך שדה הראייה הקונפוקל באמצעות לוח הבקרה המוטורי בתוכנת AFM כך שסריקת AFM ואופטיקה קונפוקל מדמיינים את אותן תכונות.
    הערה: בתוך שדה התצוגה, בדרך כלל יש רק כמה תאים, ולכן קל יותר לקבוע איזה תא רצוי לחקור. כמו AFM מתנהל, התא הופך גלוי על תוכנת AFM, משם, המשתמש יכול להצביע על אזורים ספציפיים של עניין לחקור.
  5. אם תרצה, לכוד תמונות בשדה בהיר או במצב epifluorescence באמצעות מצלמה או מצבי CLSM בהתבסס על התווית של המדגם, ידיות המיקוד וכפתורי הלכידה בתוכנת המיקרוסקופ.
  6. באמצעות תוכנת המיקרוסקופ, בחר באפשרות או פתח את הלוח כדי לאפשר יכולות קונפוקל (למשל,לייזרים ופרמטרים עוקבים). אפשרות זו מצוינת בדרך כלל על-ידי ערכי אורך הגל של קו הלייזר.
  7. בחר את קווי הלייזר המתאימים לצבעים המשמשים להכתמת הדגימות. הפעל קו לייזר אחד או יותר כדי לרגש ולדמיין תכונות אלה בדגימה.
  8. הגדר את הרווח לערך הממטב את פלואורסצנטיות הדגימות אך מגביל את כמות הרעש. ערך התחלתי טיפוסי הוא רווח של 70.
  9. כוונן את עוצמת הלייזר כדי להימנע מפיקסלים רוויים אך הגדל את הטווח הדינמי. טווח התחלה טיפוסי עבור כוח הלייזר הוא 1 – 3 %.
  10. הגדר את גודל חור הסיכה ליחידה אווריורית אחת כדי למקסם את הרזולוציה עבור הסעיף האופטי. אם המדגם עמום וכוח הלייזר כבר גבוה, פתח את חור הסיכה כדי להגדיל את האות במחיר של הפחתת רזולוציית ציר z.
  11. הגדר את זמן ההתעכבות שלהפיקסל (כלומר,מהירות הסריקה). התחל עם זמן התעכבות של 2 מיקרומטר וב במידת הצורך, התאם כדי לשקף את בהירות הדגימה. בחר את גודל הפיקסל/גודל הסריקה עבור המטרה שנבחרה על-ידי מתן אפשרות לכלי לחשב אותו באמצעות לחצן האפשרויות Nyquist ומספר הפיקסלים הנבחר בתמונה.
    הערה: זמני התעכבות ארוכים יותר בדגימות עבות יותר עלולים להוביל להלבנה מוגזמת בעת איסוף ערימות z.
  12. בחר באפשרות סריקה בתוכנת המכשיר והתחל באיסוף נתונים.
    הערה: אם המכשיר כולל לייזרים מרובים, ניתן למטב כל אחד מהם באופן עצמאי ולאחר מכן לרוץ בו-זמנית לתמונות מרובות פלואורסצנטיות.
  13. השתמשו ב ידית המיקוד כדי להגדיל ולהקטין את התצוגה ולאתר את שדה התצוגה האופטימלי בדגימה.
  14. לכוד תמונות באמצעות לחצן לכידה של המערכת ושמור את כל תבניות הקובץ הדרושות של הדוגמה במיקום/תיקיה הרצויים בכונן הקשיח של המחשב או בכונן הקשיח החיצוני המקומי.
  15. המשך להתאים רווח, עוצמת לייזר, גודל חור סיכה, קצב דגימה וערכים אחרים בהתאם כדי למטב את התמונה. ניתן להפעיל את אינדקס רוויית הפיקסלים כדי לבדוק אם הפיקסלים רוויים יתר על כן. אם רוויית יתר זו קיימת, ניתן להסתגל מחדש לכוח רווח ולייזר כדי למנוע פיקסלים רוויים. השתמש ב- LUTs כמדריך כדי לבצע התאמות ספציפיות.
  16. במידת האפשר, השתמש בקצב הדגימה Nyquist של המערכת, המוצג בתוכנה כחלונית או כלחצן, כדי להבטיח שתמונות ייאספו ברזולוציה המרבית הניתנת להשגה.
  17. הפעל את מחסנית z של מערכת confocal או כלי אוסף אמצעי אחסון תמונה. באמצעות אפשרות מלמטה למעלה, עם קו לייזר אחד בלבד, במיוחד קו הלייזר המאיר תכונה בדגימה הברורה ביותר, הגדר את מישורי ההתחלה והסיום כדי שהנפח יימדד.
  18. השתמש בריווח המוצע בין מישורים בערימת z, המחושבת כדי לעמוד בקריטריוני הדגימה של Nyquist עבור הרזולוציה האקסיאלית הניתנת להשגה הטובה ביותר המוענקת על-ידי המכשיר ושורת הלייזר המשומשת.
  19. כאשר נעשה שימוש בקווי לייזר מרובים, השתמש באורך הגל הקצר ביותר לחישוב המרווח. כאשר הרכישה מסתיימת, שמור את הקובץ בתיקיה המתאימה.
  20. לחלופין, אם קיים ידע מראש בעובי המדגם, הגדר את עוצמת הקול על-ידי בחירת המישור האמצעי, זה שנראה הבהיר והחד ביותר. במצב זה, הגדר את החלק העליון לחצי מעובי המדגם מעל המישור האמצעי ואת החלק התחתון לחצי העובי מתחת למישור האמצעי.
  21. לאחר השלמת איסוף הדגימה בשדה תצוגה זה, או שהדגימה מולבן, השתמש בשלב ממונע או מבוקר ידנית כדי למצוא מקום אחר של עניין בדגימה וחזור על השלבים לאיסוף תמונות.

5. הליך ניקוי

  1. ודא שכל קבצי הנתונים, הן מ- CLSM והן מ- AFM, נשמרים במיקומים המתאימים.
  2. לסגת שבב AFM באמצעות מנועי צעד z לפחות 2000 מיקרומטר או המרחק שנסע כדי להגיע למשטח המדגם. מוציאים את ראש ה-AFM מהבמה וממקמיים אותו בזהירות במקום מנוחתו.
  3. לסגת המטרה מיקרוסקופ, כך שהוא רחוק מן המדגם. אם נעשה שימוש במטרה לשמן, יש לסגת מהמטרה מספיק רחוק כדי שלא יהיה עוד מגע בין המטרה לבין מצע המדגם.
  4. באמצעות כפפות, להסיר את המדגם ולנקות את השומן, ושמן אם ישים, מתחתית צלחת המדגם. לרכוש צלחת פטרי חדשה, נקייה וריקה ולמלא אותו עם 70% פתרון אתנול חצי עד שלושה רבעים מלא. מניחים אותו לתוך מחזיק הדגימה ולהחליף את ראש AFM כדי לאפשר שבב AFM להשרות את פתרון האתנול במשך 5 דקות.
  5. בעוד שבב AFM הוא השריה, מומלץ להתחיל להעתיק את נתוני הניסוי על כונן קשיח חיצוני. לאחר טבילה של שבב AFM בתת פתרון אתנול לפחות 5 דקות, להסיר את הראש AFM ולשים אותו במקום מנוחתו.
  6. באמצעות כפפות, להסיר את מחזיק שבב AFM ולהמקם אותו לתוך תחנת ההרכבה. הסר בזהירות את שבב AFM באמצעות פינצטה עם ידיות גומי. מקם את הקצה שבו נעשה שימוש בחזרה במיקום התיבה ממנה הוא הגיע בכיוון מחוץ לציר כדי לציין שהוא נמצא בשימוש. לעיון בעתיד, שים לב באיזה טיפ נעשה שימוש בניסוי.
  7. מוציאים את צלחת פטרי המלאה בתסכול האתנול מהמערכת ונפטרים מהנוזל ומהמנה. באמצעות כפפות, מנקה עדשות ומגבוני עדשה, נקה בעדינות את השמן ממטרת המיקרוסקופ בהתאם לפרוטוקולים הסטנדרטיים. נקה את מחזיק הדגימה על ידי הסרת כל שומן. יש להשליך את כל חומרי הפסולת על פי פרוטוקולי בטיחות ביולוגית ולהחזיר כלים למקומות הידועים להם.
  8. סיים את איסוף הנתונים מהמחשבים וכבה אותם. כבה את כל המכשירים, האביזרים, הציוד ההיקפי או התקנים אחרים המשמשים לניסוי.

Representative Results

הטכניקה Conpokal מיוצגת באופן סכמטי איור 1A ותמונה של ההתקנה מוצגת איור 1B. על מנת לאתר במדויק מבנים ביולוגיים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקל עם אותם מבנים ב- AFM, היישור של שתי המערכות במהלך ההתקנה הוא קריטי. בחר יצרני קונפוקל ו- AFM בעלי מוניטין המכירים את הדרישות המרחביות אחד של השני. בנוסף, יישום מוצלח של הטכניקה מסתמך על הליכי הכתמה טובים, קיבוע המבנה הביולוגי, ואת הבחירה המתאימה של קצה AFM. גובה התאים החיים מציב לעתים קרובות אתגר להדמיית AFM. סריקת AFM מעל תא HEK חי מוצגת איור 2A. הגובה עבור תא HEK מסוים זה היה סביב 10 מיקרומטר, הפגינו על ידי סריקת הקו בירוק (איור 2B). קצה AFM עם היסט אפס (קצה נמצא ממש בקצה ה- cantilever) או גובה הקצה הגדול מגובה התא (למשל,גובה קצה ≥ 10 מיקרומטר) יפיק תמונה פתורה מאוד של תאים בודדים. דוגמה לסריקה גרועה עקב בחירת קצה AFM לא נכונה כלולה ב- איור 2C. בתמונה זו, פיקסלים שחורים הופיעו בשיא התא והצביעו על כך שה-AFM piezo נמצא מחוץ לטווח עקב גובה תא גדול. קצה ה- CANTILEVER של AFM הופיע בתמונה (ריבוע מעוגל) עקב היסט קצה בשילוב עם גובה קצה לא מספיק בהשוואה לגובה התא. ממצאים אלה בתדמית AFM מצביעים על כך שיש לבחור עצה אחרת של AFM כדי לדמיין את התא.

תיוג יעיל בכתמי פלואורסצנטיות יחד עם הבדיקה הנכונה להדמיית תאים חיים נדרשים לשיטה זו. ביצענו תמונה קונפוקלית תלת-צבעית המוצגת איור 3A עם כתם גרעיני (כחול פלואורסצנטי), כתם מיקרוטובול (ירוק פלואורסצנטי) וכתם קרום ליפופילי (אדום פלואורסצנטי). בדיקות תאים חיים אלה נבחרו בשל החפיפה הספקטרלית המוגבלת שלהם ותאימותם לקוביות סינון סטנדרטיות. כללנו גם את התמונה האופטית של שדה בהיר ב איור 3B.

מ- AFM, ניתוח חריצי הקצה יחד עם מודל ננו-מכני, מייצר מפת מודולוס של פני השטח. דוגמה למפת מודולוס שנבנתה באמצעות התאמה של דגם הרץ ופרופיל פרבולי (רדיוס של 8 ננומטריות) עבור צורת הקצה מוצגת מכוסה בשחזור תלת-ממד של צורת התא באיזור 4A (שהוא אותם שני תאים המוצגים באיזור 3). ההקרנה התל-מימדית המתאימה של מחסנית ה-z הקונפוקל לייזר מוצגת איור 4B.

השיטה מתאימה גם למבנים ביולוגיים קטנים יותר, כולל חיידקים בודדים שקשה לפתור את תכונותיהם המיקרו וננוסקופיות באמצעות מיקרוסקופ אור. מחקר מתמשך משתמש בטכניקת קונפוקל כדי לחקור מנגנונים מכניים בתוך דופן התא המשפיעים על עמידות לאנטיביוטיקה בסטרפטוקוקוס מוטאןs.74 מניפולציה של רכיבי דופן התא הביא לשינויים במורפולוגיה ועמידות לאנטיביוטיקה. Conpokal מקל על חיים, בפתרון, איסוף נתונים (למשל,מורפולוגיה פני השטח, מודולוס אלסטי, חוזק הידבקות, וחספוס פני השטח) על דגימות תא זהה לזוג תכונות מכניות עם נוכחות או היעדר רכיבי קיר התא. איור 5A,B כולל סריקת AFM ומפת מודולוס נמדדת של חיידק סטרפטוקוקוס מוטנס. רזולוציה טובה יותר הושגה בקנה מידה זה עם AFM מאשר עם מיקרוסקופ קונפוקל מסורתי.

איור 6 מכיל תמונה קונפוקאלית של מושבה של צואה של Enterococcus מוכתמת בכתם מבנה תא פלואורסצנטי ירוק, המתחבר לקיר התא. איור 5 ואיור 6 מדגימים את הכדאיות של טכניקת קונפוקל למיקרואורגניזמים בנוסף לתאים אוקריוטיים.

Figure 1
איור 1: מערך קונפוקל.
(א)סכמטי של טכניקת קונפוקל. (B)תמונה של התקנת הכלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: מיקרוסקופ כוח אטומי של תאים חיים.
(א)תמונת AFM של שני תאי HEK. (B) פרופיל גובה (קו ירוק ב- A) של תא HEK המציין את גובה התא הוא די גדול ב 10 מיקרומטר. (C)תמונת AFM גרועה של תא אסטרוציטים שבו פיזו AFM הוא מחוץ לטווח על אופן התא ויש ראיות של הדמיה הפוכה של הקצה cantilever. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: מיקרוסקופיה קונפוקל וברייטפילד של תאים חיים.
(A)מיקרוסקופיית לייזר של תאי HEK חיים מוכתמים בכתם גרעיני (כחול פלואורסצנטי), כתם מיקרוטובול (ירוק פלואורסצנטי) וכתם קרום ליפופילי (אדום פלואורסצנטי). (B)תמונה אופטית תואמת של שדה בהיר. סרגלי קנה מידה הם 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: השוואה של עיבודים תלת-ממדיים של AFM ומיקרוסקופיה קונפוקל של תאי HEK חיים.
(A)מפת מודולוס שנבנתה באמצעות התאמה לדגם הרץ ופרופיל פרבולי (רדיוס של 8 ננומטריה) עבור צורת הקצה מכוסה בשחזור תלת-ממד של התא מ- AFM. (B)ההקרנה התלת-מימדית המתאימה של מחסנית ה-z הקונפוקל לייזר עם כתם גרעיני (כחול פלואורסצנטי), כתם microtubule (ירוק פלואורסצנטי) וכתם קרום ליפופילי (אדום פלואורסצנטי). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: דגימת AFM של חיידקים.
(A)סריקת AFMו- ( B) נמדדה מפת מודולוס של חיידק מוטנס סטרפטוקוקוס. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: מיקרוסקופיה קונפוקל של דגימת חיידקים.
תמונה קונפוקאלית של מושבה של צואה Enterococcus עם כתם קרום פלואורסצנטי ירוק. סרגל קנה המידה הוא 5 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

Conpokal היא טכניקה מתקדמת ויעילה לאיסוף תמונות באיכות גבוהה ובתכונות מכניות של ביו-חומרים חיים בסביבה נוזלית. היכולת לאסוף תמונות מורפולוגיה וטופוגרפיה יוצאות דופן בשילוב עם תכונות מכניות מדגם חי משתרעת על פני טכניקות מיקרוסקופיות טיפוסיות של אלקטרונים ואור. בנפרד, מיקרוסקופ קונפוקלי מספק יכולות קונפוסל בהירות, אפיפורסצנטיות וסריקת לייזר כדי להשיג תמונות פלואורסצנטיות מפורטות באיכות גבוהה של דגימות. AFM מספק אפיון מכני, אך ללא אופטיקה עזר זה הופך להיות קשה לנווט את המדגם. עם שתי המערכות משולבות, משתמש יכול לאסוף הן תמונות ומאפיינים מכניים של אותו תא בדיוק במהלך הניסוי, וזה יתרון גדול על פני שני מכשירים נפרדים. מטרת כתב יד זה היא ליידע ולהדריך את המשתמשים ביכולות הנרחבות של מערכת קונפוקל המשולבת לעתיד הביולוגיה, ההנדסה והבריאות. הפרוטוקול כולל הכנת כלים, מדיה תרבותית, כלים, בחירת מיקרואורגניזמים, הליך AFM, הליך קונפוקל, ולנקות. השלבים הקריטיים ביותר עבור חיים מוצלחים, בפתרון, מפגש Conpokal הם קיבוע מדגם, בחירת טיפים שיפוטית, וביצוע כתם חי. סעיף הדיון בכתב יד זה ירחיב על המלצות תרבות, טיפים לפתרון בעיות והנחיות תפעוליות, ועבודה עתידית עבור טכניקת קונפוקל. המלצות תרבות יכסו הדרכה על תרבות מדגם, קיבוע, וכתמים. טיפים והנחיות של AFM, confocal ו- Conpokal ידונו בבחירת וכיול טיפים, ברזולוציה, במגבלות ובפעולה כמעט בו-זמנית. עבודה עתידית כוללת את התחזית ואת הפוטנציאל עבור מסלולי מחקר פוטנציאליים.

הפרוטוקול מכסה תרבות, חיתוח והדמיה של תאים חיים ודגימות חיידקים קבועים. אתגר אחד נוכח בעת ביצוע AFM בנוזל נובע חסימת תנועה cantilever עקב מכשול מדגם גרירה הידרודינמית. אם המדגם אינו דבק היטב במצע, קיים פוטנציאל לעבירה של cantilever על ידי חלקים של המדגם צף בנוזל. במקרה זה, מדידות נפגעות שכן הם השערה של דבקות אלסטית ומאפיינים מיקרומכניים של המדגם. תאי HEK לא טופלו עם תיקון, עם זאת, S. mutans ו E. faecalis דורשים קיבוע נוסף, בדומה לתאים פרוקריוטיים אחרים. החיידקים שנבחרו הראו תנועה פעילה שעיכבה את בדיקה והדמיה של תאים, ולכן הדגימות תוקנו בעדינות, כימית כדי לקדם קיבוע. ישנן חלופות קיבעון כימי, כגון קרום מסנן כי פיזית ללכוד תאים בודדים נקבוביות75.

בחירת עצה היא גם רכיב קריטי בהגדרה ובפעולה של AFM. כאשר תכונות מכניות המבוססות על עיוות של הביו-חומרים מבוקשות, יש לשקול נוקשות ונוקשות חומרית, שהיא משימה לא טריוויאלית. המטרה העיקרית היא להתאים בצורה הטובה ביותר את הנוקשות של החומר עם הנוקשות של cantilever שנבחר. אם cantilever הוא הרבה יותר רך מאשר המדגם, זה יהיה כפוף להטיה יותר מדי. אם cantilever הוא נוקשה יותר מאשר המדגם, אז גלאי AFM לא יוכל ללכוד סטיות קטנות כאלה. מומלץ כי בעת בחירת cantilever AFM מתאים, לבחור על בסיס יישום ניסיוני. כדי לאסוף תמונות מפורטות במצב מגע לסירוגין, טיפים AFM בטווח של 0.1 - 0.3 N/m עבור נוקשות רדיוס קצה בתוך 5 ננונום – 100 ננונום יעילים עבור הדמיה של תאים חיים. מומלץ להשתמש בטיפים חרוטיים קטנים. טיפים חדים מספקים אזור מגע קטן ויכולת להסיט פנימה סיוע נוסף באיסוף פרטים קטנים ותכונות במורפולוגיה לדוגמה76. עם זאת, טיפים חדים יכולים גם להיות בעייתיים מכיוון שהם נוטים לנקב דגימות כאשר ההגדרות(למשל,נקודת הגדרה, זמן פיקסל, מהירות גישה) דורשות יותר מדי כניסה או שהכניסה מהירה מדי. כדי למנוע אפקטים של קצב מאמץ גבוה, התקשות מאמץ מקומי ליד קצה חד, או פשוט כדי לשלוט באזור המגע ומהירות הגישה, רבים בוחרים להשתמש בספקטרוסקופיית כוח עם קצה קולואידי כדי למדוד מודולוס אלסטי.

טיפים AFM בטווח של 0.01 - 1.0 N/m עבור נוקשות רדיוס קצה בתוך 1 - 5 מיקרומטר מומלץ למדוד את מודולי אלסטי של תאים חיים. גדלי טיפים גדולים, בדרך כלל קולואידים מזכוכית, מספקים אזור מגע ידוע ולא סביר לנקב את התא בזמן מגע. מתלים מלבניים מועדפים על פני משולשים מכיוון שבמהלך הכיול, השיטה ללא מגע יכולה לשמש לגיאומטריה מלבנית בהשוואה לכיול מבוסס מגע עבור גיאומטריות משולשות. כמו כן, בשל האופי העדין של טיפים AFM, מומלץ כי המפעיל מיישם פינצטה עם טיפים גומי כדי להפחית את הפוטנציאל לפגיעה שבב AFM עדין או בלוק הרכבה. פרמטרים אחרים שיש לזכור כוללים את מהירות הגישה של קצה AFM ואת כמות הכניסה לדגימה. קו מנחה טוב הוא לשמור על כניסה על 10% מעובי (או גובה) של המדגם ולבחור מהירות מונעת התנגדות הידרודינמית פוטנציאלית מנוסה על ידי cantilever38.

מכשירי ניסוי מורכבים מגיעים בדרך כלל עם מחסומים הדורשים פתרון בעיות בהגדרת המכשיר, בכיולו ובפעולתו. קריסה של קצה ה- AFM או המצע לדוגמה או לדוגמה היא טעות נפוצה עבור משתמשים חדשים. כדי למנוע בעיה זו, הפרוטוקול מציע לגבות את cantilever החוצה 2000 מיקרומטר. שלב זה מבטיח שהטיפ לא יבוא במגע עם תחתית המנה אם המשתמש הקודם שכח לסגת מהטיפ בעת הניקוי לאחר הניסוי. עם זאת, המרחק של 2000 מיקרומטר נבחר עבור מחזיק הכלים שנבחר המשמש בפרוטוקול זה. ייתכן שיהיה צורך לבחור טווח אחר, גדול יותר או קטן יותר, בהתאם לסגנון מחזיק הכלים בו נעשה שימוש. במהלך היישור של הלייזר והגלאי, הפרוטוקול מזכיר התאמה של ידית מראה כדי למקסם את אות הסכום. ייתכן ש ידית התאמת מראה לא תהיה קיימת בכל ה- AFMs. עם זאת, אם קיימת, אחת הדרך לטפל במכשיר כדי לפתור בעיות של אות סכום נמוך היא להתאים את ידית המראה, המשמשת לחשבון עבור המדיום שבו תביע הסריקה; או נוזל (למשל, מים,מדיה, PBS) או אוויר. בשל ההבדל במדד השבירה לאור דרך האוויר ודרך הנוזל, ייתכן שיהיה צורך להתאים את ידית המראה. רגישות הכיפוף המרבית של ה- AFM cantilever תהיה במיקום של קצה AFM, ולכן, אור הלייזר, אשר מחזיר את מיקום הכיפוף באמצעות מיקומו על פוטודיודה, חייב להיות ממוקם במיקום של קצה AFM. בהתאם לטיפ AFM שנבחר, ערך אות הסכום עשוי להשתנות מ- 0.3 - 3.0 V. ציפוי אחורי על cantilever AFM כגון Cr-Au או Al יגדיל את אות הסכום ואת הרגישות של המדידה.

גיאומטריית עצה רלוונטית בעת השלמת כיול קצה במהלך פעולת AFM. הסכם טוב נצפה בין אי מגע וכיול מגע. אם ה- AFM שנבחר אינו מלבני, יהיה צורך לבצע כיול מגע. זכור שהמדיום שבו הקצה מכויל חייב להיות זהה למדיום המדגם. אם נוזלים אלה שונים, על המשתמש לכייל מחדש. בעת שימוש בטיפים AFM בנוזל, התדירות הנמדדת על ידי המערכת צריכה להיות רבע עד שליש מזה של תדר תהודה טבעי שצוין על ידי היצרן. דרך טובה לבדוק שהמערכת כיילה את הקצה כראוי היא לאמת ערכים בתוך קובץ הרעש התרמי שנוצר. ודא שקובץ זה שומר בתיקיה המתאימה. אם המערכת מתקשה לכייל או ערכים שאינם סבירים לצאת, לכייל מחדש, או להתאים את מיקום הלייזר מעט ואז לכייל מחדש.

סיבה נוספת לאות סכום גרוע עשויה להיות בגלל יישור CANTILEVER AFM. כאשר שבב AFM מותקן לתוך בלוק הזכוכית, חיוני כי קצה cantilever נשאר בתוך חלון לייזר קטן (אזור זכוכית חלקה). אם השבב הוא רחוק מדי קדימה, הזווית שבה cantilever באופן טבעי נשען עלול לגרום לבעיה עם ההשתקפות את cantilever, חסר photodetector וכתוצאה מכך אות סכום גרוע. אם השבב הוא רחוק מדי לאחור, הלייזר לא יוכל לשקף את החלק האחורי של cantilever, גרימת אות סכום גרוע. מסיבות אלה, ייתכן שיהיה צורך להתאים את שבב AFM המותקן. בנוסף, בעיה נוספת שעלולה להיתקל בה מתרחשת עם גובה המדגם. מכשיר AFM המשמש בפרוטוקול זה יש טווח פיזו z מרבי (גובה) של 15 מיקרומטר. אם משתמש מגלה שלתוכנה אין אפשרות לאסוף את נתוני הגובה ולכפות מפות בפיקסל מסוים, תופיע תיבה שחורה המציינת שהמערכת נמצאת מחוץ לטווח (איור 2C). אחת הדרך לצרות לירות בבעיה זו היא להגדיר את גובה הפיזו לערך נמוך יותר, כגון 2 או 3 מיקרומטר כך שרוב טווח 15 מיקרומטר מחויב למיפוי הגובה הצפוי של התא. טכניקה זו צריכה, ברוב הניסויים הקשורים לתאים או לחיידקים, לתקן את הבעיה הקשורה לטווח z.

ניסויים הדורשים טווח z מורחב עבור דגימות גבוהות עם גבהים גדולים מ 10 – 15 מיקרומטר ייתכן שיהיה צורך להמשיך מודול נוסף על AFM. ליצרני AFM יש אפשרות זו זמינה בעלויות נוספות עבור רוב המערכות. על ידי הרחבת טווח z, הניסוי יש את הזמינות כדי לסרוק דגימות הנחשבות גבוהות בסולם מיקרו עם בעיות קטנות עבור ערכים מחוץ לטווח או שינוי מנוע פיזו AFM. למרות מודולים אלה עולים תוספת, כמה, בהתאם ליצרן, יכול להציע גובה נוסף, עד 100 מיקרומטר בכיוון z. Confocal עדיין אפשרי עם דגימות גבוהות יותר אם למשתמש יש מרחק עבודה ארוך, מטרת הגדלה גבוהה או מוכן להשתמש במטרה אוויר, אולי 20x או 40x. על ידי הורדת הגדלה אובייקטיבית של מיקרוסקופ, מרחק העבודה גדל, צובר מרחק כדי להציג את הגובה של מדגם גבוה יותר. שינוי זה במטרה הגדלה נמוכה יותר יקריב את הפתרון. במערך Conpokal המכונה בכתב יד זה, המטרה 60x TIRF (פלואורסצנטיות השתקפות פנימית מוחלטת) יש מרחק עבודה של כמעט 100 מיקרומטר בעבר את הכיסוי של צלחת מדגם תחתית זכוכית.

לגבי המיקרוסקופ הקונפוקל המוזכר בכתב יד זה, נדונים כמה התניות חשובות. מערכת הקונפוקל המשמשת לייצור הנתונים בכתב יד זה יישמה יעד שמן TIRF 60x עם צמצם מספרי של 1.49. קווי לייזר באורך גל של 405 ננוגרם, 488 ננוגרם ו- 561 ננוגרם שימשו להדמיית דגימת תאים חיים, המוצגים איור 3 ואיור 4. ניתן לקבוע את מגבלת הפיזור של המיקרוסקופ הקונפוקל באמצעות משוואת הרזולוציה Abbe, Abbe Resolution(x,y) = ρ/2NA, כאשר ρ הוא אורך הגל של העירור עבור Alexa 488, ב- 488 nm, ו- NA הוא הצמצם המספרי עבור מעבה הקונפוקל, שהוא 0.3. לכן, נקבעת רזולוציה של 272 ננונום. עבור דימות epifluorescence, שני מקרים נחשבים כדי לקבוע את הרזולוציה שבה חור הסיכה מוגדר יחידה אוורירית אחת (AU) ו 0.5 AU. במקרה האחרון, חור הסיכה נסגר כך שמתרחש אובדן אור משמעותי, אך הרזולוציה עולה. תוכנת confocal מחשבת רזולוציות מקוריות ואקסיאליות מקוריות לאורך זמן ב- 170 ננונום ו- 290 ננומס עבור חור הסיכה ב- 0.5 AU, ו- 200 ננונום ו- 370 ננומס עבור חור הסיכה ב- 1 AU, בהתאמה. סטיות כדוריות שהוכנסו במערכת יכולות להתוות דרך תהליך פירוק כדי להגביר את הניגודיות והרזולוציה בתמונות מיקרוסקופ. בשל מגבלות הפיזור הטבועות במיקרוסקופים קונפוקליים, התמונה הקונפוקלית של מושבת החיידקים באיור 6 חסרה את הרזולוציה התואמת לפרטים שנראו בסריקת החיידקים של AFM באיור 5. AFM מספק גישה לתכונות ננומטריות ופרטים שקשה ללכוד באמצעות מיקרוסקופ קונפוקל. עם זאת, בהתאם לרזולוציית הפלואורסצנטיות הנדרשת, איור 5 ואיור 6 מדגימים את הישימות של טכניקת קונפוקל למיקרואורגניזמים בנוסף לתאים אוקריוטיים.

היתרון בשימוש במיקרוסקופ קונפוקל מאפשר לאופרטור לאסוף תמונות תלת-מימד של אזורים מסוימים בדגימה עם פרטים מחודדים. תמונות אלה מתואמות עם AFM על ידי הצגת פני השטח ש נבדקו באמצעות תמונת AFM וסריקת קונפוקל של אותו אזור. מאז המיקרוסקופ הוא הפוך, תמונת epifluorescence אוספת מידע אור מהצד הנגדי של המדגם כי נבדק. חור הסיכה בתוך מערכת הקונפוקל מסייע להגביל למישור יחיד ממרחק מסוים תוך סינון אור שמגיע משאר הדגימה או אפילו מהחדר. בעיקרו של דבר, חור הסיכה עוזר לבודד את האור חוזר ממישור אחד של עניין בדגימה. בדרך כלל, מישור זה של עניין חייב להכיל סמני פלואורופור חזקים, כי, עבור מערכות קונפוקל הפוכות, זיהוי מולקולה אחת יוגבל למיקרוסקופים קונפוקלים ברזולוציה גבוהה יותר. תאורת Epifluorescence רצויה פחות בשל העובדה כי במצב הדמיה epifluorescence, כל אור מן המדגם המשתקף לתוך המטרה נאסף ושימש ליצירת התמונה, ולכן, בלתי אפשרי לבודד מישור אחד. טכניקות קונפוקל לספק תמונה מבודדת יותר במישור יחיד של תכונת המדגם המדוברת בגלל חור הסיכה77. אם, למשל, את איפקס של תא eukaryotic נבדק על ידי AFM, אותו משטח ניתן לבודד עם לייזר סריקת יכולות confocal של המיקרוסקופ, ולא עם מצב הדמיה epifluorescence. מומלץ לנטר את הבריאות/צורה של התאים במהלך רכישת נתונים באמצעות הדמיה בו זמנית במצב ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית בעזרת גלאי האור המשודר וקו הלייזר 488 ננונום. בעת לכידת ערימת z של המדגם, עבור ההליך המפורט לעיל, רק הרווח של הגלאי מותאם. כל שינוי מורפולוגי בתאים במהלך המדידה, אשר אינו נראה בהכרח בתערוצי הפלואורסצנטיים, מצביע על כך שחפצים מוחדרים למדידה.

מרווח אידיאלי בין מטוסים ניתן להשיג על ידי ביצוע המלצת התוכנה לאורך הגל הקצר ביותר המשמש בטכניקת ההדמיה. ניתן לשפר ביעילות את הרזולוציה המקורית ואת יחס האות לרעש בנפחי התמונה על ידי שימוש באלגוריתמי deconvolution הזמינים במודול עיבוד התמונה של תוכנת הרכישה. עם זאת, ביצוע מיקרוסקופיה פלואורסצנטי, הבחירה של כתמים וצבעים ספציפיים היא חיונית כדי למנוע הלבנה מוקדמת על הסט או crosstalk מן ספקטרום קריאה / פליטה חופף. לעתים, משתמש עלול לחוות תקלה בהדורת אור קונפוקל. אם משתמש נתקל במחסור בהפחתת אור או בקווי לייזר לא מתפקדים, דרך אחת לפתרון בעיות היא לאפס את המערכת, בדרך כלל על-ידי הפעלה מחדש של תוכנת ההפעלה. אם הבעיה נמשכת, ייתכן שגלאי האור המשודר לא הצליח לנוע לתוך או לא במקום בתוך הנתיב האופטי של מיקרוסקופ האור. איפוס המיקום של גלאי המשדר עשוי לסייע בהקלה על בעיות איסוף אור או הדמיית לייזר.

המוקד של מכשיר Conpokal הוא לספק למשתמשים את היכולת לאסוף מידע אופטי ומבוסס כוח על ביו-חומרים חיים בסביבה נוזלית, בו זמנית ועל אותו תא או תכונה. עבודה זו מתארת במפורש כיצד לבצע ניסויים אלה בנוזל, בית טבעי עבור ביו-חומרים רבים, אם כי, ניסויים יבשים עדיין יכולים להתבצע באמצעות המכשור. עם דגימות שהוכנו במנות פטרי, גובה המנה הוא מגבלה. בשל התצורה של בלוק הזכוכית המחזיק את cantilever AFM, הקירות הצדדיים של הכלים חייב להיות תחת 10 מ"מ גובה; אם המנה גבוהה מדי, המכשיר לא יוכל להוריד את קצה ה- AFM לפני השטח של המדגם או המצע.

למרות שיש מגבלה עבור גודל המדגם, אין הגבלה עם המכשיר או יכולות התוכנה לגבי השהיית זמן. בו זמנית confocal ו AFM אפשרי עם הגורמים הנכונים במקום. המגבלה התורמת ליכולתה הכמעט סימולטנית מתייחסת לרעש שנוצר בעת ביצוע פונקציות מיקרוסקופיות קונפוקל מסוימות ופונקציות מיקרוסקופיה של כוח אטומי בו זמנית. התנודות מהמנועים שמזיזים את מטרת המיקרוסקופ במהלך איסוף מחסנית z יתווספו לאות מהטיפ של הגשושית AFM במהלך התנועה שלה. הרעש ישופר על ידי מטרת שמן, כאשר המנועים נעים מעלה ומטה בכיוון z כדי להאיר מישורים רציפים בדגימה. לכן, הפרוטוקול המומלץ כולל אוסף רציף של סריקות AFM ותמונות מחסנית confocal z. CLSM ו- AFM בו זמנית ידרשו הדמיה נייחת עם הקונפוקל, עם זאת, עם הטכניקה הנוכחית, זמן ההשהיה של שני המכשירים יכול להיות קצר כמו עשרות שניות. הזמן בפועל לעבור מפעולת AFM להדמיית קונפוקל היה בסביבות 2 - 4 דקות עבור התמונות שנאספו איור 2A ואיור 4B. ערך זה נקבע על-ידי חיסור שתי פרקי הזמן של איסוף התמונות מהזמן הכולל של 33 דקות, הכולל את הזמן להתחיל ולהשלים את סריקת AFM, לעבור בין מצבי מכשירים כדי להפעיל דימות קונפוקל, ולהתחיל ולהשלים את מחסנית z של תמונת הקונפוקל.

העתיד של קונפוקל שואף לחקור קשרים חדשים בין מבנה לתפקוד בנוסף לתובנה חדה של תהליכים של תא יחיד. לדוגמה, ניסויים של טיפולים תרופתיים באתרו על דגימות תאים או חיידקים כדי לקבוע את ההשפעות של גמישות התא יהיה התקדמות לתחומי הביו-חומרים, הביולוגיה והביומכניקה. טיפול בצלחת המדגם תוך הדמיה וחקירה יספק ידע כיצד המדגם מגיב לטיפולים בסביבה חיה ומבוקרת בקפידה, לאורך זמן. שילוב תרופה חדשה או אתגר סביבתי ירחיב את ההבנה כיצד מיקום הציטוסקלטון או האורגן משפיע על הקטר, הטופולוגיה, הנוקשות וכו '. התקדמות אפשרית נוספת של קונפוקל היא היכולת לקבל שליטה סביבתית מלאה על המערכת. הקונפוקל הנוכחי המוזכר בפרוטוקול זה שוכנת בתוך מארז אקוסטי שנועד להפחית רעש מתוך המעבדה. קידום דיור זה יספק את היכולת לבחון בתוך, אולי, אחד או שילוב של גורמים, לא מוגבל לאלה כגון סביבה סטרילית, מבוקר טמפרטורה, או אפילו כבידה משתנה. כפי שהיא עומדת, שיטת קונפוקל מספקת גישה יעילה ושימושית לאפיון ביו-חומרים חיים בנוזלים, אך עתיד הטכניקה רק יקדם יכולות אלה עוד יותר.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

אנו מכירים במימון NIH COBRE תחת מספר P20GM130456. אנו מודים לליבת המיקרוסקופיה הקלה בבריטניה, הנתמכת על ידי סגן הנשיא למחקר, על הסיוע בעבודה זו. זנים של S. mutans ו E. faecalis סופקו על ידי ד"ר נטליה Korotkova. האזכור הראשון של המחזה על מילים, Conpokal, כדי לתאר את השילוב של מיקרוסקופיה קונפוקאלית מיקרוסקופיה כוח אטומי מיוחס ד"ר בראד ברון, כימיה וחומרים הנדסה, באוניברסיטת קנטאקי, בדיון עם ד"ר מרתה גריידי (המחבר המקביל) לקראת הגעתו של דובר סמינר ד"ר ג'ונתן פאם, שהצטרף הפקולטה להנדסת כימיקלים וחומרים באוניברסיטת קנטאקי

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acoustic Enclosure JPK-Bruker Acoustic Enclosure Chamber used to mitigate noise
BioTracker 488 Green Microtubule Cytoskeleton Dye Millipore Sigma SCT142 Used to label microtubules in mammalian cells
CP-qp-CONT-BSG AFM tips NanoAndMore CP-qp-CONT-BSG-B Collodial AFM tips good for modulus measurements on biological samples
Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3))) ThermoFischer Scientific D282 Used to label plasma membrane of mammalian cells
Dulbecco's Modified Eagle Medium VWR VWRL0100-0500 Component of cell culture media
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline ThermoFisher Scientific A1285601 Used to simulate biological environment
Fetal Bovine Serum Fischer Scientific 45000-736 Component of cell culture media
Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: Yeast Extract Fischer Scientific BP1422-500 Component of bacterial culture medium
FluoroDish Cell Culture Dish World Precision Instruments (WPI) FD35-100 Glass-bottomed dishes whose side walls are less than 10 mm, necessary for full function of Nanowizard 4a AFM
Hoechst 33342 nucleic acid stain ThermoFischer Scientific 62249 Used to label nucleus of mammalian cells, a good nuclear marker for live cells
Human embryonic kidney 293 cells ATCC Global Bioresource Center CRL-1573 Mammalian cells used in protocol
Matrigel VWR 47743-716 Coating in cell culture dish
Model: PFQNM-LC-A-CAL AFM tips Bruker PFQNM-LC-A-CAL AFM tips that work well for samples that have large heights (such as eukaryotic cells)
NanoWizard 4a JPK-Bruker NanoWizard 4a AFM
Nikon A1 Laser Scanning Confocal Microscope Nikon A1 HD25 Microscope used for brightfield, epi-fluorescence, and confocal imaging
PENICILLIN/STREPTOMYCIN VWR 16777-164 Component of cell culture media
PetriDishHeater JPK-Bruker PetriDishHeater Maintains desired Petri dish sample temperature
qp-BioAC-Cl AFM tips Nanosensors qp-BioAC-Cl-10 Three different AFM cantilevers of varying stiffness
Replaceable Carbon Fiber Tip Tweezers Ted Pella Inc. 5051 Used to carefully place and remove delicate AFM tips into the glass mounting block
Todd Hewitt Broth Bacto BD DIFCO Bacterius Ltd Bacto-249240 Component of bacterial culture medium
Vancomycin, BODIPY FL Conjugate Thermo Fisher Scientific V34850 Used to fluorescently label bacterial cell wall

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Butt, H. J., Pham, J. T., Kappl, M. Forces between a stiff and a soft surface. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 27, 82-90 (2017).
  2. Pham, J. T., Schellenberger, F., Kappl, M., Butt, H. J. From elasticity to capillarity in soft materials indentation. Physical Review Materials. 1 (1), 015602 (2017).
  3. Lee, G. Y. H., Lim, C. T. Biomechanics approaches to studying human diseases. Trends Biotechnology. 25 (3), 111-118 (2007).
  4. Qiu, H., et al. Short Communication: Vascular Smooth Muscle Cell Stiffness As a Mechanism for Increased Aortic Stiffness With Aging. Circulation Research. 107 (5), 615-619 (2010).
  5. Glenister, F. K., Coppel, R. L., Cowman, A. F., Mohandas, N., Cooke, B. M. Contribution of parasite proteins to altered mechanical properties of malaria-infected red blood cells. Blood. 99 (3), 1060-1063 (2002).
  6. Suresh, S., et al. Connections between single-cell biomechanics and human disease states: gastrointestinal cancer and malaria. Acta Biomaterialia. 1 (1), 15-30 (2005).
  7. Nash, G. B., Johnson, C. S., Meiselman, H. J. Mechanical properties of oxygenated red blood cells in sickle cell (HbSS) disease. Blood. 63 (1), 73-82 (1984).
  8. Trickey, W. R., Lee, G. M., Guilak, F. Viscoelastic properties of chondrocytes from normal and osteoarthritic human cartilage. Journal of Orthopedic Research. 18 (6), 891-898 (2000).
  9. An, S. S., Fabry, B., Trepat, X., Wang, N., Fredberg, J. J. Do Biophysical Properties of the Airway Smooth Muscle in Culture Predict Airway Hyperresponsiveness. American Journal of Respiratory Cell and Molecuar Biology. 35 (1), 55-64 (2006).
  10. Suresh, S. Biomechanics and biophysics of cancer cells. Acta Materialia. 55 (12), 3989-4014 (2007).
  11. Rebelo, L. M., de Sousa, J. S., Mendes, J., Radmacher, M. Comparison of the viscoelastic properties of cells from different kidney cancer phenotypes measured with atomic force microscopy. Nanotechnology. 24 (5), 055102 (2013).
  12. Cross, S. E., Jin, Y. S., Rao, J., Gimzewski, J. K. Nanomechanical analysis of cells from cancer patients. Nature Nanotechnology. 2 (12), 780-783 (2007).
  13. Remmerbach, T. W., et al. Oral Cancer Diagnosis by Mechanical Phenotyping. Cancer Research. 69 (5), 1728-1732 (2009).
  14. Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nature Reviews Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).
  15. Yallapu, M. M., et al. The Roles of Cellular Nanomechanics in Cancer. Medical Research Reviews. 35 (1), 198-223 (2015).
  16. Fabry, B., et al. Scaling the Microrheology of Living Cells. Physical Review Letters. 87 (14), 148102 (2001).
  17. Ingber, D. E., Prusty, D., Sun, Z., Betensky, H., Wang, N. Cell shape, cytoskeletal mechanics, and cell cycle control in angiogenesis. Jouranl of Biomechica. 28 (12), 1471-1484 (1995).
  18. Svoboda, K., Block, S. M. Biological Applications of Optical Forces. Annual Reviews of Biophysics and Biomolecular Structures. 23 (1), 247-285 (1994).
  19. Dao, M., Lim, C. T., Suresh, S. Mechanics of the human red blood cell deformed by optical tweezers. Journal of the Mechicanics and Physics of Solids. 51 (11-12), 2259-2280 (2003).
  20. Thoumine, O., Cardoso, O., Meister, J. J. Changes in the mechanical properties of fibroblasts during spreading: a micromanipulation study. European Biophys with Biophyics Letters. 28 (3), 222-234 (1999).
  21. Reynolds, N. H., et al. On the role of the actin cytoskeleton and nucleus in the biomechanical response of spread cells. Biomaterials. 35 (13), 4015-4025 (2014).
  22. Jones, W. R., et al. Alterations in the Young’s modulus and volumetric properties of chondrocytes isolated from normal and osteoarthritic human cartilage. Journal of Biomechics. 32 (2), 119-127 (1999).
  23. Radmacher, M., Fritz, M., Kacher, C. M., Cleveland, J. P., Hansma, P. K. Measuring the viscoelastic properties of human platelets with the atomic force microscope. Biophysics Journals. 70 (1), 556-567 (1996).
  24. Ketene, A. N., Roberts, P. C., Shea, A. A., Schmelz, E. M., Agah, M. Actin filaments play a primary role for structural integrity and viscoelastic response in cells. Integrative Biology. 4 (5), 540-549 (2012).
  25. Ketene, A. N., Schmelz, E. M., Roberts, P. C., Agah, M. The effects of cancer progression on the viscoelasticity of ovarian cell cytoskeleton structures. Nanomedicine-Nanotechnology. 8 (1), 93-102 (2012).
  26. Darling, E. M., Topel, M., Zauscher, S., Vail, T. P., Guilak, F. Viscoelastic properties of human mesenchymally-derived stem cells and primary osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes. Journal of Biomechics. 41 (2), 454-464 (2008).
  27. Henderson, E., Haydon, P., Sakaguchi, D. Actin filament dynamics in living glial cells imaged by atomic force microscopy. Science. 257 (5078), 1944-1946 (1992).
  28. Rotsch, C., Radmacher, M. Drug-Induced Changes of Cytoskeletal Structure and Mechanics in Fibroblasts: An Atomic Force Microscopy Study. Biophysics Jouranl. 78 (1), 520-535 (2000).
  29. Darling, E. M., Zauscher, S., Guilak, F. Viscoelastic properties of zonal articular chondrocytes measured by atomic force microscopy. Osteoarthritis Cartilage. 14 (6), 571-579 (2006).
  30. Lekka, M., et al. Local elastic properties of cells studied by SFM. Applied Surface Science. 141 (3-4), 345-349 (1999).
  31. Li, Q. S., Lee, G. Y. H., Ong, C. N., Lim, C. T. AFM indentation study of breast cancer cells. Biochemical and Biophysical Research Communication. 374 (4), 609-613 (2008).
  32. Rother, J., Noding, H., Mey, I., Janshoff, A. Atomic force microscopy-based microrheology reveals significant differences in the viscoelastic response between malign and benign cell lines. Open Biology. 4 (5), 140046 (2014).
  33. Nalam, P. C., Gosvami, N. N., Caporizzo, M. A., Composto, R. J., Carpick, R. W. Nano-rheology of hydrogels using direct drive force modulation atomic force microscopy. Soft Matter. 11 (41), 8165-8178 (2015).
  34. Raman, A., et al. Mapping nanomechanical properties of live cells using multi-harmonic atomic force microscopy. Nature Nanotechnology. 6 (12), 809 (2011).
  35. Caporizzo, M. A., et al. Strain-rate dependence of elastic modulus reveals silver nanoparticle induced cytotoxicity. Nanobiomedicine. 2, 9 (2015).
  36. Corbin, E. A., Kong, F., Lim, C. T., King, W. P., Bashir, R. Biophysical Properties of Human Breast Cancer Cells Measured Using Silicon MEMS Resonators and Atomic Force Microscopy. Lab Chip. 15 (3), 839-847 (2014).
  37. Moreno-Flores, S., Benitez, R., Vivanco, M. D., Toca-Herrera, J. L. Stress relaxation and creep on living cells with the atomic force microscope: a means to calculate elastic moduli and viscosities of cell components. Nanotechnology. 21 (44), 445101 (2010).
  38. Grady, M. E., Composto, R. J., Eckmann, D. M. Cell elasticity with altered cytoskeletal architectures across multiple cell types. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 61, 197-207 (2016).
  39. Park, S., Koch, D., Cardenas, R., Kas, J., Shih, C. K. Cell motility and local viscoelasticity of fibroblasts. Biophysical Journal. 89 (6), 4330-4342 (2005).
  40. Ribeiro, A. S., Khanna, P., Sukumar, A., Dong, C., Dahl, K. Nuclear Stiffening Inhibits Migration of Invasive Melanoma Cells. Cellular and Molecular Bioengineering. 7 (4), 1-8 (2014).
  41. Buda, A., Pignatelli, M. Cytoskeletal network in colon cancer: from genes to clinical application. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 36 (5), 759-765 (2004).
  42. Lindberg, U., Karlsson, R., Lassing, I., Schutt, C. E., Höglund, A. S. The microfilament system and malignancy. Seminars in Cancer Biology. 18 (1), 2-11 (2008).
  43. Altemeier, W. A., Sinclair, S. E. Hyperoxia in the intensive care unit: why more is not always better. Current Opinion in Critical Care. 13 (1), 73-78 (2007).
  44. Roan, E., Waters, C. M., Teng, B., Ghosh, M., Schwingshackl, A. The 2-pore domain potassium channel TREK-1 regulates stretch-induced detachment of alveolar epithelial cells. PLoS One. 9 (2), 89429 (2014).
  45. Roan, E., et al. Hyperoxia alters the mechanical properties of alveolar epithelial cells. American Journal of Physiology. 302 (12), 1235-1241 (2012).
  46. Wilhelm, K. R., Roan, E., Ghosh, M. C., Parthasarathi, K., Waters, C. M. Hyperoxia increases the elastic modulus of alveolar epithelial cells through Rho kinase. The FEBS Journal. 281 (3), 957-969 (2013).
  47. Roan, E., Wilhelm, K. R., Waters, C. M. Kymographic Imaging of the Elastic Modulus of Epithelial Cells during the Onset of Migration. Biophysical Journal. 109 (10), 2051-2057 (2015).
  48. Wagh, A. A., et al. Localized elasticity measured in epithelial cells migrating at a wound edge using atomic force microscopy. American Journal of Physiology. 295 (1), 54-60 (2008).
  49. Liu, S., Wang, Y. Application of AFM in microbiology: a review. Scanning. 32 (2), 61-73 (2010).
  50. Hayhurst, E. J., Kailas, L., Hobbs, J. K., Foster, S. J. Cell wall peptidoglycan architecture in Bacillus subtilis. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 105 (38), 14603-14608 (2008).
  51. Dover, R. S., Bitler, A., Shimoni, E., Trieu-Cuot, P., Shai, Y. Multiparametric AFM reveals turgor-responsive net-like peptidoglycan architecture in live streptococci. Nature Communications. 6 (1), 1-10 (2015).
  52. Gillis, A., Dupres, V., Delestrait, G., Mahillon, J., Dufrêne, Y. F. Nanoscale imaging of Bacillus thuringiensis flagella using atomic force microscopy. Nanoscale. 4 (5), 1585-1591 (2012).
  53. Laurent, V. M., et al. Gradient of rigidity in the lamellipodia of migrating cells revealed by atomic force microscopy. Biophysical Journal. 89 (1), 667-675 (2005).
  54. Collart-Dutilleul, P. Y., et al. Initial stem cell adhesion on porous silicon surface: molecular architecture of actin cytoskeleton and filopodial growth. Nanoscale Research Letters. 9 (1), 564 (2014).
  55. Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
  56. Ilie, M. A., et al. Current and future applications of confocal laser scanning microscopy imaging in skin oncology. Oncology Letters. 17 (5), 4102-4111 (2019).
  57. Jonkman, J., Brown, C. M. Any way you slice it-a comparison of confocal microscopy techniques. Journal of Biomolecular Techniques. 26 (2), 54 (2015).
  58. Minsky, M. Memoir on inventing the confocal scanning microscope. Scanning. 10 (4), 128-138 (1988).
  59. Paddock, S. Over the rainbow: 25 years of confocal imaging. Biotechniques. 44 (5), 643-648 (2008).
  60. Amos, W., White, J. How the confocal laser scanning microscope entered biological research. Biology of the Cell. 95 (6), 335-342 (2003).
  61. Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. Spinning-disk confocal microscopy: present technology and future trends. Methods in Cell Biology. 123, 153-175 (2014).
  62. Wolleschensky, R., Zimmermann, B., Kempe, M. High-speed confocal fluorescence imaging with a novel line scanning microscope. Journal of Biomedical Optics. 11 (6), 064011 (2006).
  63. Brakenhoff, G., Van der Voort, H., Van Spronsen, E., Nanninga, N. Three-dimensional imaging in fluorescence by confocal scanning microscopy. Journal of Microscopy. 153 (2), 151-159 (1989).
  64. Jerome, W. G., Price, R. L. Basic Confocal Microscopy. , Springer. (2018).
  65. Webb, R. H. Confocal optical microscopy. Reports on Progress in Physics. 59 (3), 427 (1996).
  66. Pawley, J. Handbook of biological confocal microscopy. , Springer. 236 (2010).
  67. Webb, D. J., Brown, C. M. Epi-fluorescence microscopy. Cell Imaging Techniques. , 29-59 (2012).
  68. Day, R. N., Davidson, M. W., Press, C. The fluorescent protein revolution. , Elseiver. (2014).
  69. Fine, A., Amos, W., Durbin, R., McNaughton, P. Confocal microscopy: applications in neurobiology. Trends in Neurosciences. 11 (8), 346-351 (1988).
  70. Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
  71. Pan, Y. A., Livet, J., Sanes, J. R., Lichtman, J. W., Schier, A. F. Multicolor Brainbow imaging in zebrafish. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (1), 5546 (2011).
  72. Fu, X., et al. Brain Region Specific Single-Molecule Fluorescence Imaging. Anals in Chemistry. 91 (15), 10125-10131 (2019).
  73. Snell, A. A., et al. Cell-Derived Vesicles for in Vitro and in Vivo Targeted Therapeutic Delivery. ACS Omega. 4 (7), 12657-12664 (2019).
  74. Edgar, R. J., et al. Discovery of glycerol phosphate modification on streptococcal rhamnose polysaccharides. Nature Chemical Biology. 15 (5), 463-471 (2019).
  75. Kailas, L., et al. Immobilizing live bacteria for AFM imaging of cellular processes. Ultramicroscopy. 109 (7), 775-780 (2009).
  76. Gavara, N. A beginner's guide to atomic force microscopy probing for cell mechanics. Microscopy Research and Technique. 80 (1), 75-84 (2017).
  77. Wilson, T. The role of the pinhole in confocal imaging system. Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 167-182 (1995).

Tags

הנדסה ביולוגית גיליון 162 מיקרוסקופיה קונפוקאלית מיקרוסקופיה של כוח אטומי AFM קונפוקל חיידקים ביולוגיה של התא ביו-חומרים הדמיית תאים חיים מכנוביולוגיה
ליד סריקת לייזר בו זמנית מיקרוסקופיה קונפוקל וכוח אטומי (Conpokal) על תאים חיים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sandin, J. N., Aryal, S. P., Wilkop, … More

Sandin, J. N., Aryal, S. P., Wilkop, T., Richards, C. I., Grady, M. E. Near Simultaneous Laser Scanning Confocal and Atomic Force Microscopy (Conpokal) on Live Cells. J. Vis. Exp. (162), e61433, doi:10.3791/61433 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter