Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Nær samtidig laserskanning konfokal og atomkraft mikroskopi (Conpokal) på levende celler

Published: August 11, 2020 doi: 10.3791/61433
Automatic Translation
1, 2, 3,4, 2,4, 1
1Department of Mechanical Engineering, University of Kentucky, 2Department of Chemistry, University of Kentucky, 3Department of Physiology, University of Kentucky, 4UK Light Microscopy Core, University of Kentucky

Summary

Presentert her er protokollen til Conpokal teknikken, som kombinerer konfokal og atomkraft mikroskopi i en enkelt instrument plattform. Conpokal gir samme celle, samme region, nær samtidig konfokal avbildning og mekanisk karakterisering av levende biologiske prøver.

Abstract

Teknikker tilgjengelig for mikro- og nano-skala mekanisk karakterisering har eksplodert de siste tiårene. Fra videreutvikling av skanning og overføring elektron mikroskop, til oppfinnelsen av atomkraft mikroskopi, og fremskritt i fluorescerende avbildning, det har vært betydelige gevinster i teknologier som gjør det mulig å studere små materialer. Conpokal er et portmanteau som kombinerer konfokal mikroskopi med atomkraftmikroskopi (AFM), hvor en sonde "pokes" overflaten. Selv om hver teknikk er ekstremt effektiv for kvalitativ og/ eller kvantitativ bildesamling alene, gir Conpokal muligheten til å teste med blandet fluorescensavbildning og mekanisk karakterisering. Conpokal er designet for nær samtidig konfokal avbildning og atomkrafts sondering, og forenkler eksperimentering på levende mikrobiologiske prøver. Den ekstra innsikten fra sammenkobling gir samlokaliseringav målte mekaniske egenskaper ( f.eks.elastisk modulus, vedheft, overflaterushet) av AFM med subcellulære komponenter eller aktivitet som kan observeres gjennom konfokal mikroskopi. Dette arbeidet gir en trinnvis protokoll for drift av laserskanning konfokal og atomkraft mikroskopi, samtidig, for å oppnå samme celle, samme region, konfokal avbildning, og mekanisk karakterisering.

Introduction

Mikro- eller nanoskala mekaniske evalueringsverktøy brukes ofte til å avdekke deformasjonsegenskapene på enkeltcelle- eller mikroorganismenivå, mens separate høyoppløselige mikroskopiverktøy brukes til å visualisere subcellulære prosesser og strukturelle egenskaper. Conpokal, er kombinasjonen av laserskanning konfokal mikroskopi og atomkraft mikroskopi (AFM) i en enkelt instrumental plattform. Conpokal-teknikken ble først implementert i et ikke-biologisk polymersystem, hvor målet var å bestemme vedheft, elastisitet og overflatespenning av harde overflater i kontakt med myke overflater. Konfokale bilder ga en visuell gjengivelse av hvordan polymeren deformerer, holder seg og frigjør fra den harde sonden1,2. Fra polymerer til biologiske prøver, gir denne teknikken mulighet for nær samtidig levende celle eller mikroorganisme confocal imaging og AFM.

Endringer i celleelastisitet har vært innblandet i patogenesen av mange menneskelige sykdommer3 inkludert vaskulære lidelser4Malaria5,6, sigdcelleanemi7Leddgikt8Astma9, og kreft6,10,11,12,13,14,15. Vanlige teknikker for å måle mekanikken til celler inkluderer bruk av magnetiske perler16,17, optiske pinsett18,19, mikropipette aspirasjon8,20,21,22og AFM11,23,24,25,26. Siden anvendelsen av AFM til levende celler, har det lett blitt tilpasset for å karakterisere celletopografi27,28 samt mekaniske egenskaper11,24,29,30,31 med nanoskala presisjon. AFM er ytterligere tilpasset mikrorheologi32,33, frekvensmodulering34,35, og krype25,36,37 eksperimenter for å studere viskoelastiske egenskaper av ulike cellelinjer. Bruken av en passende nanokontaktmodell er avgjørende for ekstraksjon av kvantitative elastisitetsverdier fra AFM-produserte kraftinnrykkmålinger1,2. AFM-studier som undersøker påvirkning av cytoskeletale legemidler på celleelastisitet har vist at elastisk modulus er sterkt påvirket38. Basert på de elastiske modulusmålingene har mange forskere vist at kreftceller er mykere enn deres ikke-transformerte kolleger11,38,39. Økt deformabilitet spiller sannsynligvis en fremtredende rolle i kreftcellers evne til å metastasere og infiltrere vev40. Slik oppførsel er regulert av modifikasjoner i cytoskeletal organisering av celler38,41,42. I tillegg til kreft er en annen klasse mekanisk avhengige sykdommer luftveissykdommer. For eksempel påvirker akutt respiratorisk stresssyndrom flere og flere mennesker hvert år. Det har vist seg at når pasienter blir satt på mekanisk ventilasjon, med høye konsentrasjoner av oksygen, kan tilstanden forverres43. I en rekke studier som observerte alveolr epitelmakrofager med AFM, fant forskere at tilsetningen av et oksygenrikt miljø økte stivheten av celler på grunn av aktindannelse; et godt eksempel på virkningen AFM har på vår detaljerte forståelse av atmosfærisk miljøpåvirkning på respiratorisk funksjon på cellenivå og til slutt menneskelig helbredelse og helse44,45,46. Epitelcellestivhet under migrering mot et sår kan også vurderes via AFM, og at det oppstår en variasjon i elastisk modulus for å signalisere fremtidig cellespredning47,48. Derfor er det et praktisk behov for å måle cellemekanikk kvantitativt for å forstå hvordan syke celler skiller seg fra, og samhandler med, sunne.

AFM brukes også til å studere klebende egenskaper og overflatestruktur. Et atomkraftmikroskop har en rekke moduser for å samle inn informasjon om en prøve ved hjelp av kontaktmekanikk. For levende biologiske prøver er to av hovedmålene å oppnåkvantitative mekaniske eiendomsverdier ( f.eks.elastisk moduli, selvklebende krefter) samt kartoverflatehøyde. Disse modusene inkluderer tappemodus (også kjent som intermitterende kontakt), som opprettholder en konstant cantilever amplitude som midlertidig kontakter prøveoverflaten og kontaktmodusen, noe som hever eller senker cantilever for å opprettholde en konstant avbøyning49. Vedheftskart kan samles inn ved hjelp av krafttilordning på AFM-systemet. Cantilever rykker prøven til en viss kraft og trekkes deretter tilbake. Kraften som motstår tilbaketrekking måles av detektoren for å generere en kraftforskyvningsgraf. Vedheftskraften er den maksimale kraften målt under tilbaketrekking. Overflatemorfologi gir en detaljert visning av prøven på mikro- eller nanonivå. Cantilever fullfører en rasterskanning over prøven basert på innrykk og avbøyning fanget av bevegelsen til cantilever på hver piksel, avslører mikro- og nanostørrelsesfunksjoner. Med AFM, størrelsen på små funksjoner som peptidoglykan struktur50, polymer kjedejustering 51, flagella52, lamellipodia53, og filipodia54 kan måles. Mens AFMs kraft ligger i kraftforskyvningskurver og ikke-optiske topologiske bilder, gir konfokal mikroskopi detaljert avbildning av fluorescerende merkede prøver.

Konfokal laserskanning mikroskopi (CLSM) er en dominerende teknikk for avbildning av levende celler, faste celler ogvev 55,56,57. CLSM har vært ansatt for biologisk avbildning siden 1955, det vil vil,siden starten58,59. Mens arbeidsprinsippet for konfokale mikroskoper ( det vil at avvisningen av ut av fokuslys gjennom et pinhole) har forblitt stort sett det samme, har dentekniske implementeringenblitt svært variert56,57,58,60. Konfokal avbildning kan implementeres via flerpunktsskanning, som i et spinnende platesystem61,punktskanning av en enkelt laserstråle, som i linjeskanning62, eller bilde av punktspredningsfunksjonen med påfølgende pikselomfordelinger via en multi-elementdetektor 57. Nylige fremskritt som utvider nytten av konfokal bildebehandling inkluderer laserskanning evne, høyhastighets resonans skanning, og høy følsomhetdetektorer 63,64,65. Fordelen som alle konfokale systemer har over widefield mikroskoper er evnen til å utføre optisk snitting i z-aksen med større detaljer, spesielt i tykke prøver. Widefield-mikroskoper ved hjelp av kamerabasert deteksjon samler lys som slippes ut fra fokalplanet, og samtidig lys slippes ut fra overalt i belysningsbanen. Ved å lukke pinhole, på bekostning av å redusere signalet, kan både aksial og lateral oppløsning økes66. I CLSM er bilder bygget opp piksel for piksel gjennom utslippssignalsamling som en eksitasjonslaser skannes over et x-y synsfelt. Samling av flere x-y-plan langs z-aksen til prøven kan deretter brukes til å rekonstruere den 3-dimensjonale arkitekturentil prøven 57,67. Konfokal mikroskopi i forbindelse med innføringen av fluorescerende proteiner, har revolusjonert vår forståelse av cellebiologi68. For eksempel har det blitt et viktig verktøy i nevrovitenskap69. CLSM brukes regelmessig til å observere ryddet vev, og for å oppnå omfattende bilder av immunfarget hjerne og nevronal nettverksarkitektur70. Dette programmet har resultert i ny innsikt i synaptiske kontakter og kommunikasjon mellom nevroner og glialceller i hjernen71. Fra hjerneceller til vesikler, fluorescerende fargingsprotokoller støtter inspeksjon og fangst av cellefunksjoner via konfokal mikroskopi for fremskritt i terapeutisketeknikker 72,73.

Selv om de er imponerende og allsidige verktøy individuelt, gjør kombinasjonen av konfokal og atomkraftmikroskopi (Conpokal) forskere å unikt korrelere topografiske og mikromekaniske cellulære / vevegenskaper med observasjon av ulike cellulære organeller og deres respektive dynamikk. Paret instrumentering tillater brukere å, i hovedsak, "se" hva de sonderer; en stor fordel over en teknikk alene. Med Conpokal er kraftkartlegging gjennom AFM lagt over på konfokale bilder for å korrelere cellestivhet, vedheft eller morfologi til cytoskeletalstrukturen i prøven, for eksempel. Det overordnede målet med Conpokal-metoden er å gi en plattform for forskere å studere levende prøver på en konsis, effektiv måte, og gi både bilde- og materialeiendomsdata i en enkelt plattform. I dette arbeidet demonstrerer vi driften av Conpokal, inkludert riktig prøvevalg og forberedelse, instrumentoppsett, kantileverkalibrering og gi retningslinjer for vellykket feilsøking. Etter protokollen gir vi representative resultater som inkluderer vellykket bakterier og celleAFM høydekartlegging, bakterier og celle AFM modulus kartlegging, og konfokal avbildning av multi-merkede celler, gjennom samme celle confocal og AFM. Vi avslutter med en diskusjon om Conpokal-prosedyren kritiske trinn, feilsøkingsanbefalinger, teknikkbegrensninger, betydning og fremtidige utsikter for metoden.

Protocol

1. Utarbeidelse av instrumenter, kulturmedier, retter

  1. Slå på strømkildene for både det konfokale mikroskopet og atomkraftmikroskopet, samt eventuelle andre tilknyttede instrumenter eller enheter som brukes under Conpokal. Gi nok tid til at instrumentene varmet likevekt og stabiliseres før de begynner å måle. Vanligvis er 1 t tilstrekkelig.
  2. Forbered en ren, systemgodkjent petriskål med glassbunn og fyll halvfull, men ikke mer enn to tredjedeler full, med fosfatbufret saltvann (PBS), eller lignende klar væske. Denne retten (referert til som "kalibreringsfatet") er atskilt fra prøverettene og vil bli brukt til å lokalisere og kalibrere atomkraftmikroskopet (AFM) cantilever.
    MERK: Det er viktig at væsken er klar og har lav autofluorescens for å forhindre forstyrrelser i fluorescensspektra. PBS anbefales fordi det etterligner det biologiske miljøet.
  3. Forbered eksperimentelle prøveretter slik at den tilhørende væsken har fylt parabolen minst halvfull. Hvis prøven er fluorescerende, må du sørge for at den er dekket eller på et mørkt sted til det er nødvendig. Rengjør bunnen av alle glassretter ved hjelp av linserenser og linseservietter.
  4. Opprett datalagringsmapper for konfokalen og AFM på datamaskinens(e) harddisk(er).

2. Valg av celler eller mikroorganismer

  1. For å skape bakterier lager løsning, inokulere Streptococcus mutans bakterier, ved hjelp av en inokulasjon sløyfe, i 15 ml Todd Hewitt Gjær (THY) over natten (for eksponentiell fase) i en 5% CO2 inkubator.
  2. 1 t før inkubasjonen over natten er fullført, belegge eksperimentelle prøveretter med 1 ml poly-l-lysinløsning eller nok til å dekke glassdelen av den glassbunnede parabolen og la det stå i biosikkerhetsskapet i 1 time. Etter innstilling, aspirere poly-l-lysin løsning og skyll oppvasken 3x med PBS.
  3. Etter 18 – 24 timer bakteriell inkubasjon, inokuler THY med 1 ml bakteriell suspensjon til en optisk tetthet på 0,6 – 0,7 oppnås (typiske verdier for inokulasjon er 3 ml THY med 1 ml bakteriell suspensjon per tallerken). Tilsett 1 ml ny bakterieløsning til hver poly-l-lysinbelagte tallerken og inkuber i 1 time. I løpet av de siste 10 min, tilsett 1 ml grønn fluorescerende membranflekk (konsentrasjon på 1 μM) til hver tallerken.
  4. Skyll hver tallerken 3x med PBS. Fest bakteriene forsiktig med ca. 1 ml paraformaldehydløsning i 15 min ved romtemperatur inne i et biosikkerhetsskap. Skyll hver tallerken 3x med PBS etter fiksering.
  5. Oppbevar human embryonal nyre (HEK) 293 celler i flytende nitrogen. Utfør rask tining ved 37 °C vannbad før plating.
  6. Tilsett 1 ml kjellermembranmatriseløsning i cellekulturmedier i hver celleprøveskål og inkuber (5 % CO2) ved 37 °C i 1 time. Aspirer løsningen og vask oppvasken med cellekulturmedier. Plate det nødvendige antallet HEK 293 celler(f.eks.100.000 celler per 35 mm fat) og tilsett 2 ml cellekulturmedier. Deretter inkubere (5% CO2) cellene ved 37 °C i 48 timer.
  7. Etter 48 timer, tilsett 2 μL av en fluorescerende mikrotubule cytoskeleton fargestoff (konsentrasjon på 1x) til hver celle prøverett og inkubere i 30 min. Aspirer oppløsningen som inneholder fargestoffet, vask cellene 3x med PBS, og legg til 2 ml cellekulturmedier.
  8. Tilsett 1 μL plasmamembranfarge (konsentrasjon på 10 μM) til prøven og inkuber i 30 minutter. Vask oppløsningen som inneholder fargestoffet 3x med PBS og tilsett 2 ml cellekulturmedier.
  9. Motvirke kjernen ved å tilsette 1 μL av et nukleinsyrefargestoff (konsentrasjon på 10 μM) oppløsning til prøven retter og inkubere i 30 min. Vask oppløsningen som inneholder fargestoffet 3x med PBS og tilsett 2 ml kulturmedier.

3. AFM-prosedyre

  1. Åpne atomkraftmikroskopet (AFM) driftsprogramvaren ved å klikke på programvareikonet på datamaskinen.
  2. Drei til eller sett inn et lavt forstørrelsesluftmål (anbefalt 10x eller 20x). En lang arbeidsavstand på 5 mm eller mer er gunstig under tuppsenking og kalibrering.
  3. Monter det valgte celleprøvestadiet hvis det ikke allerede er installert. For levende prøver, bruk en oppvasker for å holde prøven ved ønsket temperatur.
  4. Legg den rene, systemgodkjente petriskålen fylt halvfull av PBS (tilberedt i trinn 1.2) eller lignende klar væske (kalibreringsfat). Hvis prøvestadiet har innebygde klemmer, bruk disse, ellers, bruk vakuumfett for å stabilisere prøven.
  5. Velg en passende AFM-cantilever for ønsket datainnsamling, og installer den ved å følge trinnene nedenfor.
    1. Bruk hansker til å montere AFM-brikken i glassblokken ved hjelp av AFM-monteringsstadiet, pinsett og en liten skrutrekker. Plasser AFM-chipen forsiktig på glassblokken og orienter den slik at den er sentrert. Cantilever, pluss en svært liten del av AFM-brikken, bør være i den synlige, ikke-ugjennomsiktige delen av monteringsblokken.
    2. Fest brikken med skrutrekkeren ved å stramme skruen til brikken sitter godt mot glassblokken. Kontroller at AFM cantilever er riktig orientert ved hjelp av et stereomikroskop eller et håndholdt spionglass. Juster etter behov. Når den er riktig orientert, plasserer du glassblokken i AFM-hodet i riktig retning og låser den på plass.
      MERK: Retningen på AFM-brikken i glassblokken er viktig slik at systemlaserne sikter mot baksiden av cantileveren og reflekterer riktig på fotodetektoren. Vær forsiktig så du ikke strammer skruene for mye under plasseringen, da denne prosedyren kan føre til at AFM-brikken, kantilever eller spissen knekkes.
  6. Bruk brightfield-alternativet til det konfokale mikroskopet til å finne bunnen av kalibreringsfatet ved hjelp av fokusknappen. Legg merke til denne z-høyden som verdien der bunnen av parabolen er plassert med hensyn til mikroskopets mål.
  7. Bruk AFM-systemets motorkontrollpanel på datamaskinen som driver z steppermotorene, og flytt AFM-kantileveren bort fra prøven oppover 2000 μm.
  8. Bruk begge hender til å plassere AFM-hodet forsiktig med AFM-chipen på prøvestadiet, og pass på at hvert av de vertikale punktene på AFM-hodet er godt festet i de angitte sporene på AFM-scenen. Når AFM-hodet er på plass, se visuelt hvor nær cantilever holderen er til parabolen. Hvis det ser ut til å være for nært, slik at AFM-hodet er i kontakt eller innenfor 1 mm av toppen av prøvefatet, rygger du det ut ved hjelp av z steppermotorene før du senker AFM-spissen mot prøven.
  9. Bruk brightfield-belysning, senk AFM-brikken langsomt ned til bunnen av glassfatet ved hjelp av z stepper motor kontrollpanel på AFM-programvaren. Finn de manuelle mikrometer som styrer x-y eller in-plane bevegelse av AFM hodet på instrumentet plattformen. Juster posisjonen til AFM-cantilever innenfor synsfeltet ved å korrigere AFM-hodet etter hvert som cantileveren kommer til syne.
    1. Siden plasseringen med hensyn til bunnen av fatet er ukjent på dette tidspunktet, lavere med trinn på 100 - 200 μm for å unngå å krasje AFM spissen inn i petriskålen. Vanligvis må spissen senkes 800 - 2000 μm. Når spissen senkes, se etter en skygge som skal vises på mikroskopprogramvarevisningen, noe som indikerer at AFM-spissen nærmer seg bunnen av parabolen.
    2. Reduser trinn til 20 – 50 μm. Pass på at du justerer oppslagstabellene (LUTs) på kamerabildet når spissen senkes ned i parabolen ved hjelp av LUTs-panelet på den kondoble programvaren. Fortsett å senke AFM-spissen ved hjelp av små trinn til den for det meste er i fokus.
    3. Kontroller at spissen er mørk nok slik at den generelle formen på den kan sees og midtstilles i synsfeltet. Sørg også for at spissen ser uklar ut, noe som bekrefter at den ikke har møtt bunnen av parabolen ennå.
  10. Juster mikroskopfokuset slik at spissen nå er i fokus, med tanke på arbeidsavstanden til målet. Før du går over til et høyere forstørrelsesmål, bruker du mikroskopmålingsverktøyet til å samle inn bredden og lengden på AFM-cantileveren ved å få tilgang til måleverktøypanelet på konfokalprogramvaren. Legg merke til disse målingene.
    MERK: Det er viktig å ikke krasje målet inn i bunnen av prøvefatet, noe som også kan føre til at prøvefatet kommer i kontakt med AFM-spissen, noe som potensielt skader den.
  11. Hvis det finnes, fjerner du laserlysfilteret og kontrollerer at AFM-laseren er på, slik at laserlyset blir synlig i optikken.
    1. Bruk laserjusteringsskivene til å flytte laseren inn i synsfeltet og i nærheten av AFM-spissen. Når laseren er på dette stedet, skift laserlysfilteret.
    2. Bruk laserjusteringsskivene til å plassere laseren på baksiden av der AFM-spissen er plassert på kantileveren. På dette punktet bør laserjusteringspanelet lese et sumsignal som er større enn 0,0 V. Hvis det ikke oppnås noe sumsignal, justerer du speilet ved hjelp av den manuelt styrte speilknappen til et sumsignal som er større enn 0,0 V, vises på skjermen.
    3. Flytt laseren i små mengder i alle retninger på AFM-kantileveren til det maksimale sumsignalet er oppnådd, men posisjonen er på AFM-spissen. Når laserposisjonen er angitt, nuller du den vertikale og laterale nedbøyningen ved hjelp av de manuelt kontrollerte nedbøyningsskivene.
    4. Ta hensyn til laserjusteringspanelet på AFM-programvaren og ved hjelp av de vertikale og laterale avbøyningsknappene på AFM-hodet, juster detektoren slik at målet er sentrert (rød prikk i midten av trådkorset) og det er ingen vertikal eller lateral nedbøyning.
  12. Åpne kalibreringsvinduet i AFM-programvaren. Skriv inn all eksperimentspesifikk informasjon. Før du kalibrerer, må du slå av den konfokale mikroskoplyskilden og lukke AFM-kabinettet, hvis aktuelt, for å dempe potensiell støy som kommer fra romlyset eller romvibrasjoner. Trykk deretter på kalibreringsknappen for å automatisk la systemet kalibrere spissen. Etter at kalibreringen er fullført, vil stivheten til kantileveren (N/m) og følsomheten (nm/V) bli gitt i kalibreringspanelet. Legg merke til disse for senere analyse.
  13. Trekk tilbake AFM-kantileveren minst 2000 μm med steppermotorene. Ta AFM-hodet av scenen og fjern kalibreringsfatet. Roter til eller sett inn ønsket mål. Trekk tilbake målet 10% av arbeidsavstanden hvis systemet er programmert til å opprettholde samme fokalplan mellom mål. Hvis dette er et oljemål, legg en dråpe nedsenkingsolje på målets øye.
    MERK: Tilbaketrekkingen av målet reduserer sannsynligheten for at objektivet kontakter prøvefatet under plassering.
  14. For å holde prøvefatet på plass på plass, bruk en bomullspinne til å påføre små dabs av vakuumfett rundt kanten av prøveringen i prøvestadiet, eller bruk prøveklips. Legg prøvefatet forsiktig inn i prøvestadiet.
  15. Når prøven er plassert, roterer du den et par ganger for å sikre en god forsegling av fatet til prøveholderen via fettet. Hev målet til bunnen av parabolen til oljen bare transporterer over øyet av målet.
  16. Bruk av mikroskopet, uten AFM-hodet på scenen, fokuserer bildesystemet slik at prøven er i fokus. Legg merke til denne z-høyden for referanse.
  17. Skift AFM-hodet forsiktig ut på plattformen.
  18. Bruk z steppermotorene til å senke tuppen mot prøven. Etter hvert som AFM-spissen senkes, justerer du oppslagstabellene (LUTs) i brightfield-bildet etter behov. Senk spissen til den er nesten skarp. Bruk de manuelt betjede AFM-spissene til å flytte AFM-hodet slik at AFM-spissen er i midten eller til venstre midtstilt i synsfeltet.
    MERK: Siden z-høyden på AFM ble notert før i trinn 3.6, kan det tas større skritt for å senke AFM-spissen, men fett er lagt til bunnen av fatet og potensielt olje til målet, så denne verdien er bare for referanse. Det anbefales å ta 50 – 100 μm trinn og justere mindre etter hvert som spissen kommer i fokus
  19. Juster laserposisjonen på nytt ved hjelp av de manuelle mikrometerene på AFM-hodet. Om nødvendig, null de vertikale og laterale nedbøyningene ved å justere de respektive knottene og rekalibrere AFM-kantileveren i prøvefatet.
    MERK: Hvis cantileveren ble kalibrert i et medium forskjellig fra prøven, må den kalibreres på nytt i skannemediet for å ta høyde for en potensiell endring i brytningsindeksen. I tillegg kan laseren drive fra baksiden av cantilever på grunn av støy eller temperaturendringer. Juster laseren på nytt og kalibrer om nødvendig og i prøvefatet over glasssubstratet hvis du bruker ikke-kontaktkalibrering. Hvis du bruker kontaktkalibrering, kalibrerer du på innsiden av kalibreringsfatet ved hjelp av prøvemediet.
  20. For å oppnå konfererte mikroskopbilder av høy kvalitet, erstatt det nåværende dempende lysfilteret med filteret som blokkerer alt AFM-laserlys. Dette lysfilteret sikrer ingen forstyrrelser fra AFM-laserens lyse lys.
  21. Ved hjelp av den automatiserte tilnærmingskommandoknappen, vanligvis merket med en nedovervendt pil, senker du spissen til bunnen av prøvefatet. Angi størrelsen/området for skanningen, oppløsningen, settpunktet, z-lengden og pikseltiden (eller bruk de kalibrerte/overførte verdiene) på bildekontrollpanelet og begynn å skanne.
  22. Når en skanning er fullført, løfter du AFM-chipen 50 – 100 μm opp før du navigerer til en ny måleposisjon i prøvefatet. Når en ny plassering er funnet, nærmer du glasset og begynner å skanne igjen ved å følge trinnene 3.21 og 3.22.
  23. Velg alternativet Lagre automatisk, eller lagre hver genererte fil manuelt fra hver enkelt skanning ved å klikke på Lagre.

4. Konfokal prosedyre

  1. Åpne den kondiske driftsprogramvaren. Kontroller at alle tilknyttede eksterne enheter, lyskilder og kontrollere er slått på og fungerer normalt.
  2. Roter eller sett inn et mål om lav forstørrelse (10x eller 20x) for å vise prøven. Sørg for at målet er i trygg arbeidsavstand fra der prøven parabolen vil være, og om nødvendig, back-out målet for å unngå eventuelle kollisjon av målet med prøven. Bruk en bomullspinne til å smøre dab-vakuum rundt kanten av prøvens fatring. Hvis du bruker et oljemål, plasserer du en enkelt dråpe nedsenkingsolje på frontlinsen på objektivet
  3. Plasser ønsket prøve i prøvestadiet. Spinn prøven rundt et par ganger for å sikre at vakuumfett har generert et tett bånd til prøvetrinnsinnsatsen eller bruk prøveklipp. Hvis du bruker et oljemål, hev målet til bunnen av fatet slik at oljen bare transporterer over glassbunnen. For å unngå overdreven bleking, minimer omgivelsesbelysning.
  4. Bruk brightfield- eller epifluorescence-moduser via kameraet eller okularene, finn prøven og bruk fokusknappen, fokuser på et interesseområde som inneholder flere celler eller en enkelt celle. Ofte vil synsfeltet i det optiske mikroskopet være større enn x-y-skannevinduet på AFM-systemet (100 x 100 μm). Foreta justeringer av AFM-posisjonen innenfor det konfokale synsfeltet ved hjelp av motorkontrollpanelet i AFM-programvaren, slik at AFM-skanningen og konfokal optikken avbilde de samme funksjonene.
    MERK: Innenfor synsfeltet er det vanligvis bare noen få celler, så det er lettere å finne ut hvilken celle som er ønsket å sondere. Etter hvert som AFM utføres, blir cellen synlig på AFM-programvaren, og derfra kan brukeren finne bestemte områder av interesse for å undersøke.
  5. Hvis ønskelig, ta bilder i lyst felt eller epifluorescence ved hjelp av et kamera eller CLSM-moduser basert på etiketten på prøven, fokusknotter og ta opp knapper på mikroskopprogramvaren.
  6. Bruk mikroskopprogramvaren til å velge alternativet eller åpne panelet for å aktivere konfokale funksjoner (f.eks. lasereog påfølgende parametere). Dette alternativet er vanligvis notert av laser linje bølgelengde verdier.
  7. Velg laserlinjene som passer for fargestoffene som brukes til å fargeprøvene. Slå på én eller flere laserlinjer for å opphisse og bilde disse funksjonene i prøven.
  8. Sett gevinsten til en verdi som optimaliserer prøvene fluorescens, men begrenser mengden støy. En typisk startverdi er en gevinst på 70.
  9. Juster laserkraften for å unngå mettede piksler, men maksimer det dynamiske området. Et typisk startområde for lasereffekten er 1 – 3 %.
  10. Sett pinholestørrelsen til 1 Luftete enhet for å maksimere oppløsningen for den optiske snittingen. Hvis prøven er svak og laserkraften allerede er høy, åpner du pinhole for å øke signalet på bekostning av å redusere z-aksen oppløsning.
  11. Angi pikselbotid(dvs.skannehastigheten). Start med en oppholdstid på 2 μs, og juster om nødvendig for å gjenspeile prøvelysheten. Velg pikselstørrelse/skannestørrelse for det valgte målet ved å la instrumentet beregne det via Nyquist-alternativknappen og det valgte antallet piksler i bildet.
    MERK: Lengre oppholdstider i tykkere prøver kan føre til overdreven bleking når z-stabler samles inn.
  12. Velg alternativet Skann på instrumentets programvare og start datainnsamling.
    MERK: Hvis instrumentet har flere lasere, kan hver optimaliseres uavhengig, og deretter kjøres samtidig for multi-fluorescerende bilder.
  13. Bruk fokusknappen til å zoome inn og ut og finne det optimale synsfeltet i prøven.
  14. Ta bilder ved hjelp av systemets Capture-knapp og lagre alle nødvendige filformater av eksemplet på en ønsket plassering / mappe på datamaskinens harddisk, eller lokal ekstern harddisk.
  15. Fortsett å justere forsterkning, laserkraft, pinhole størrelse, samplingsfrekvens og andre verdier tilsvarende for å optimalisere bildet. Pikselmetningsindeksen kan aktiveres for å sjekke om piksler er overmettet. Hvis denne overmetningen er til stede, kan forsterkning og laserkraft justeres for å eliminere mettede piksler. Bruk LUTs som en veiledning for å gjøre spesifikke justeringer.
  16. Hvis det er mulig, bruk systemets Nyquist samplingsfrekvens, som vises i programvaren som et panel eller en knapp, for å sikre at bildene samles inn med maksimal oppnåelig oppløsning.
  17. Aktiver det konfokale systemets z-stabel eller bildevolumsamlingsverktøy. Ved hjelp av et bunn-til-topp-alternativ, med bare én laserlinje, spesielt laserlinjen som lyser opp en funksjon i prøven den klareste, sett start- og sluttplanene for volumet som skal måles.
  18. Bruk den foreslåtte avstanden mellom planene i z-stakken, som er beregnet for å oppfylle Nyquist-prøvetakingskriteriene for den beste oppnåelige aksiale oppløsningen som instrumentet gir og brukte laserlinje.
  19. Når flere laserlinjer brukes, bruker du den korteste bølgelengden til beregning av avstanden. Når anskaffelsen er fullført, lagrer du filen i den aktuelle mappen.
  20. Alternativt, hvis det finnes en priori kunnskap om prøvens tykkelse, definerer du volumet ved å velge det midterste planet, den som vises som den lyseste og skarpeste. I denne situasjonen setter du toppen til halvparten av prøvetykkelsen over midtplanet og bunnen til halvparten av tykkelsen under midtplanet.
  21. Når eksempelsamlingen i dette visningsfeltet er fullført, eller prøven er bleket, bruker du det motoriserte eller manuelt kontrollerte stadiet til å finne et annet interessested i prøven og gjenta trinnene for bildesamling.

5. Rydde opp prosedyre

  1. Kontroller at alle datafiler, både fra CLSM og AFM, lagres på de riktige plasseringene.
  2. Trekk inn AFM-brikken ved hjelp av z steppermotorene minst 2000 μm eller avstanden som ble reist for å komme til prøveoverflaten. Fjern AFM-hodet fra scenen og plasser det forsiktig på hvilestedet.
  3. Trekk inn mikroskopmålet slik at det er langt unna prøven. Hvis et oljemål ble brukt, bør målet trekkes langt nok slik at det ikke lenger er kontakt mellom målet og prøvesubstratet.
  4. Bruk hansker, fjern prøven og rengjør fettet, og olje hvis det er aktuelt, fra bunnen av prøvefatet. Skaff deg en ny, ren, tom petriskål og fyll den med 70% etanolløsning en halv til tre fjerdedeler full. Plasser den i prøveholderen og sett AFM-hodet på plass slik at AFM-brikken kan suge inn etanolløsningen i 5 min.
  5. Mens AFM-brikken er bløtleggt, anbefales det å begynne å kopiere eksperimentdataene til en ekstern harddisk. Etter nedsenking av AFM-brikken i etanolløsning i minst 5 minutter, fjern AFM-hodet og sett det på hvilestedet.
  6. Bruk hansker til å fjerne AFM-sponholderen og plasser den i monteringsstasjonen. Fjern AFM-brikken forsiktig med pinsett med gummigrep. Plasser den brukte spissen tilbake i plasseringen av boksen den kom fra orientert off-akse for å betegne at den har blitt brukt. For fremtidig referanse, legg merke til hvilket tips som ble brukt i eksperimentet.
  7. Ta petriskålen fylt med etanoloppløsningen ut av systemet og kast væsken og fatet. Bruk hansker, linserenser og linseservietter til å rengjøre oljen forsiktig fra mikroskopmålet etter standardprotokoller. Rengjør prøveholderen ved å fjerne fett. Kast alt avfall i henhold til biosikkerhetsprotokoller og returverktøy til sine kjente steder.
  8. Fullfør datainnsamlingen fra datamaskinen(e) og slå dem av. Slå av alle instrumenter, tilbehør, eksterne enheter eller andre enheter som brukes til eksperimentet.

Representative Results

Conpokal-teknikken er skjematisk representert i figur 1A, og et bilde av oppsettet vises i figur 1B. For å nøyaktig samlokalisere biologiske strukturer via konfokal mikroskopi med de samme strukturene i AFM, er justeringen av de to systemene under installasjonen kritisk. Velg anerkjente konfokal- og AFM-produsenter som er kjent med hverandres romlige krav. I tillegg er vellykket implementering av teknikken avhengig av gode fargingsprosedyrer, immobilisering av den biologiske strukturen og riktig valg av AFM-spiss. Høyden på levende celler presenterer ofte en utfordring for AFM-avbildning. En AFM-skanning over en levende HEK-celle er vist i figur 2A. Høyden for denne spesielle HEK-cellen var rundt 10 μm, demonstrert av linjeskanningen i grønt (figur 2B). En AFM-spiss med enten nullforskyvning (spissen er helt på enden av cantilever) eller spissen høydestørre enn cellehøyden ( f.eks, tupphøyde≥ 10 μm) vil gi et svært løst bilde av enkelte celler. Et eksempel på en dårlig skanning på grunn av feil AFM tips valg er inkludert i figur 2C. I dette bildet dukket svarte piksler opp på toppen av cellen som indikerer at AFM piezo er utenfor rekkevidde på grunn av en stor cellehøyde. Slutten av AFM cantilever dukket opp i bildet (en avrundet firkant) på grunn av spissen forskyvning kombinert med utilstrekkelig spiss høyde sammenlignet med cellehøyde. Disse artefaktene i AFM-bildet indikerer at en annen AFM-spiss skal velges for å bilde cellen.

Effektiv merking i fluorescensfarging sammen med riktig sonde for levende celleavbildning er nødvendig for denne metoden. Vi utførte et trefarget konfokalbilde vist i figur 3A med en kjernefysisk flekk (fluoriserende blå), en mikrotubuliflekk (fluoriserende grønn) og en lipofil membranflekk (fluoriserende rød). Disse levende cellesondene ble valgt på grunn av deres begrensede spektral overlapping og deres kompatibilitet med standard filterkuber. Vi har også inkludert brightfield optisk bilde i Figur 3B.

Fra AFM produserer analyse av spissens innrykk sammen med en nanomekanisk modell et moduluskart over overflaten. Et eksempel på et moduluskart konstruert ved hjelp av en Hertz-modell passform og en parabolsk profil (radius på 8 nm) for spissen formen er vist overlaid på 3D rekonstruksjon av celleformen i figur 4A (som er de samme to cellene som vises i figur 3). Den tilsvarende 3D-projeksjonen av laserkonferansez-stakken er vist i figur 4B.

Metoden er også egnet for mindre biologiske strukturer, inkludert enkeltbakterier hvis mikro- og nanoskopiske egenskaper er vanskelige å løse ved hjelp av lett mikroskopi. En pågående studie benytter Conpokal teknikken for å utforske mekaniske mekanismer i celleveggen som påvirker antibiotikaresistens i Streptococcus mutans.74 Manipulering av celleveggkomponenter resulterte i endringer i morfologi og antibiotikaresistens. Conpokal forenkler live, in-solution, datainnsamling (f.eks,overflatemorfologi, elastisk modulus, vedheftstyrke og overflate grovhet) på samme celleprøver for å pare mekaniske egenskaper med tilstedeværelse eller fravær av celleveggkomponenter. Figur 5A,B inkluderer en AFM-skanning og målt moduluskart over en Streptococcus mutans bakterie. Bedre oppløsning ble oppnådd i denne skalaen med AFM enn med tradisjonell konfokal mikroskopi.

Figur 6 inneholder et konfokalt bilde av en koloni av Enterococcus faecalis farget med en grønn fluorescerende cellestrukturflekk, som festes til celleveggen. Figur 5 og figur 6 viser anvendelsen av Conpokal-teknikken til mikrober i tillegg til eukaryotiske celler.

Figure 1
Figur 1: Conpokal-oppsettet.
(A) Skjematisk av Conpokal teknikk. (B) Bilde av instrumentoppsettet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Atomkraftmikroskopi av levende celler.
AFM-bilde av to HEK-celler. (B) Høydeprofil (grønn linje i A) av en HEK-celle som indikerer at cellehøyden er ganske stor ved 10 μm. (C) Dårlig AFM bilde av en astrocytt celle hvor AFM piezo er utenfor rekkevidde på toppen av cellen, og det er tegn på omvendt avbildning av cantilever slutten. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Konfokal og brightfield mikroskopi av levende celler.
(A)Laserskanning av konfokal mikroskopi av levende HEK-celler farget med en kjernefysisk flekk (fluoriserende blå), en mikrotubuliflekk (fluoriserende grønn) og en lipofil membranflekk (fluoriserende rød). (B)Tilsvarende brightfield optisk bilde. Skaleringsstenger er 10 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Sammenligning av 3D-gjengivelser av AFM og konfokal mikroskopi av levende HEK-celler.
(A) Modulus kart konstruert ved hjelp av en Hertz modell passform og en parabolsk profil (radius på 8 nm) for spissen formen lagt på 3D rekonstruksjon av cellen fra AFM. (B)Den tilsvarende 3D-projeksjonen av laserkonferansestabelen med en kjernefysisk flekk (fluoriserende blå), en mikrotubuliflekk (fluoriserende grønn) og en lipofil membranflekk (fluoriserende rød). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: AFM av bakterieprøve.
(A) AFM scan og (B) målt modulus kart over en Streptococcus mutans bakterie. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Konfokal mikroskopi av bakterieprøven.
Konfokalbilde av en koloni av Enterococcus faecalis med grønn fluorescerende membran flekk. Vektstangen er 5 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Conpokal er en avansert, effektiv teknikk for å samle bilder av høy kvalitet og in situ mekaniske egenskaper av levende biomaterialer i et flytende miljø. Evnen til å samle eksepsjonell morfologi og topografi bilder kombinert med live-sample mekaniske egenskaper strekker seg forbi typiske elektron og lys mikroskopi teknikker. Separat gir et konfokalt mikroskop brightfield, epifluorescence og laserskanning konfokale evner for å oppnå detaljerte fluorescerende bilder av prøver av høy kvalitet. En AFM gir mekanisk karakterisering, men uten hjelpeoptikk blir det vanskelig å navigere prøven. Med de to systemene kombinert, kan en bruker samle både bilder og mekaniske egenskaper av nøyaktig samme celle under eksperimentet, noe som er en stor fordel over to separate instrumenter. Formålet med dette manuskriptet er å informere og veilede brukerne om de omfattende egenskapene til det kombinerte Conpokal-systemet for fremtidens biologi, ingeniørfag og helse. Protokollen innebærer utarbeidelse av instrumenter, kulturmedier, retter, valg av mikroorganismer, AFM-prosedyre, konfokal prosedyre og opprydding. De mest kritiske trinnene for en vellykket live, in-solution, Conpokal økt er prøve immobilisering, judicious tips utvalg, og live flekk utførelse. Diskusjonsseksjonen for dette manuskriptet vil utdype kulturanbefalinger, feilsøkingstips og operasjonelle retningslinjer, og fremtidig arbeid for Conpokal-teknikken. Kulturanbefalinger vil dekke veiledning om prøvekultur, immobilisering og farging. AFM, konfokale og Conpokal tips og retningslinjer vil diskutere tipsvalg og kalibrering, oppløsning, begrensninger og nær samtidig drift. Fremtidig arbeid inkluderer utsiktene og potensialet for potensielle forskningsveier.

Protokollen dekker kultur, sondering og avbildning av både levende celle- og faste bakterieprøver. En utfordring til stede når du utfører AFM i væske stammer fra cantilever bevegelse obstruksjon på grunn av prøvehindring og hydrodynamisk dra. Hvis prøven ikke er godt overholdt underlaget, er det potensial for begroing av cantilever ved deler av prøven som flyter i væsken. I så fall er målinger kompromittert siden de er en antagelse av elastisk etterlevelse og mikromekaniske egenskaper av prøven. HEK-cellene ble ikke behandlet med fikseringsmiddel, men S. mutaner og E. faecalis krever ytterligere immobilisering, lik andre prokaryotiske celler. Bakteriene som ble valgt viste aktiv bevegelse som hindret celleobring og avbildning, derfor var prøvene forsiktige, kjemisk festet for å fremme immobilisering. Det finnes alternativer til kjemisk fiksering, for eksempel filtermembraner som fysisk fanger individuelle celler i porene75.

Tipsvalg er også en kritisk komponent for oppsett og drift av AFM. Når mekaniske egenskaper basert på deformasjon av biomaterialet søkes, må man vurdere cantilever stivhet og materialstivhetskompatibilitet, som er en ikke-triviell oppgave. Hovedmålet er å best matche stivheten av materialet med stivheten til den valgte cantilever. Hvis cantilever er mye mykere enn prøven, vil det bli gjenstand for for mye nedbøyning. Hvis kantileveren er stivere enn prøven, kan det hende at AFM-detektoren ikke kan fange opp slike små nedbøyninger. Det anbefales at når du velger en passende AFM cantilever, å velge basert på eksperimentell anvendelse. For å samle detaljerte bilder i intermitterende kontaktmodus, afm tips innenfor et område på 0,1 - 0,3 N / m for stivhet og spiss radius innen 5 nm - 100 nm er effektive for live celle bildebehandling. Små koniske tips anbefales. Skarpe tips gir et lite kontaktområde og evne til å rykke inn ytterligere ved å samle inn små detaljer og funksjoner i prøvemorfologi76. Skarpe tips kan imidlertid også være problematiske da de er utsatt for punktisering av prøver når innstillingene (f.eks.settpunkt, pikseltid, tilnærmingshastighet) krever for mye innrykk eller innrykket er for raskt. For å unngå høy belastningshastighetseffekter, lokal belastningsherding nær en skarp spiss, eller bare for å kontrollere kontaktområdet og tilnærmingshastigheten, velger mange å bruke kraftspektroskopi med en kolloidal spiss for å måle en elastisk modulus.

AFM-spisser innenfor et område på 0,01 - 1,0 N/m for stivhet og spissradius innen 1 – 5 μm anbefales for å måle den elastiske modulien til levende celler. Store spissstørrelser, vanligvis glasscolloider, gir et kjent kontaktområde og er usannsynlig å punktere cellen mens den er i kontakt. Rektangulære cantilevers foretrekkes fremfor trekantede fordi den kontaktfrie metoden under kalibreringen kan brukes til rektangulær geometri sammenlignet med kontaktbasert kalibrering for trekantede geometrier. Også på grunn av den delikate naturen til AFM-spisser anbefales det at operatøren implementerer pinsett med gummispisser for å redusere potensialet for å skade den delikate AFM-brikken eller monteringsblokken. Andre parametere å huske på inkluderer tilnærmingshastigheten til AFM-spissen og mengden innrykk i prøven. En god retningslinje er å holde innrykk til ca 10% av tykkelsen (eller høyden) av prøven og velge en hastighet som utelukker potensiell hydrodynamisk motstand oppleves av cantilever38.

Intrikate eksperimentelle instrumenter leveres vanligvis med veisperringer som krever feilsøking i instrumentoppsettet, kalibreringen og driften. Krasje AFM tips eller cantilever inn i prøven eller prøve substrat er en vanlig feil for nye brukere. For å unngå dette problemet foreslår protokollen å sikkerhetskopiere cantilever ut 2000 μm. Dette trinnet sikrer at spissen ikke kommer i kontakt med bunnen av parabolen hvis den forrige brukeren glemte å sikkerhetskopiere spissen når du rydder opp etter eksperimentering. 2000 μmavstanden ble imidlertid valgt for den valgte parabolholderen som brukes i denne protokollen. Et annet område, større eller mindre, må kanskje velges avhengig av parabolholderstilen som brukes. Under justeringen av laseren og detektoren nevner protokollen justering av en speilknapp for å maksimere sumsignalet. Det kan hende at det ikke finnes en speiljusteringsknapp på alle AFM-er. Hvis det finnes, er imidlertid en måte å manipulere instrumentet til å feilsøke et lavsumsignal å justere speilknappen, som brukes til å ta hensyn til mediet der skanning vil finne sted; flytende (f.eks.vann, media, PBS) eller luft. På grunn av forskjellen i indeks for brytning for lys gjennom luft og gjennom væske, kan det hende at speilknappen må justeres. Den maksimale bøyefølsomheten til AFM-cantileveren vil være på plasseringen av AFM-spissen, derfor må laserlyset, som returnerer bøyeposisjonen gjennom plasseringen på en fotodiode, være plassert på plasseringen av AFM-spissen. Avhengig av AFM-spissen som er valgt, kan sumsignalverdien variere fra 0,3 – 3,0 V. Et baksidebelegg på AFM-cantilever som Cr-Au eller Al vil øke sumsignalet og følsomheten til målingen.

Spissgeometri er relevant når du fullfører tuppkalibrering under AFM-drift. Det er observert god enighet mellom ikke-kontakt og kontaktkalibrering. Hvis den valgte AFM-cantileveren ikke er rektangulær, må kontaktkalibrering utføres. Husk at mediet der spissen er kalibrert må være det samme som prøvemediet. Hvis disse væskene er forskjellige, må brukeren kalibrere på nytt. Når du bruker AFM-spissene i væske, bør frekvensen målt av systemet være en fjerdedel til en tredjedel av den naturlige resonansfrekvensen som produsenten har. En god måte å kontrollere at systemet kalibrerte spissen riktig er å verifisere verdiene i den termiske støyfilen som genereres. Kontroller at denne filen lagres i riktig mappe. Hvis systemet har problemer med å kalibrere eller ikke-sannsynlige verdier kommer ut, rekalibrere, eller justere laserposisjonen litt deretter rekalibrere.

En annen årsak til dårlig sumsignal kan skyldes AFM cantilever justering. Når AFM-brikken er montert i glassblokken, er det viktig at spissen av cantilever forblir innenfor det lille laservinduet (glatt glassområde). Hvis brikken er for langt frem, kan vinkelen som cantilever naturlig hviler forårsake et problem med refleksjon av cantilever, mangler fotodetector og resulterer i dårlig sumsignal. Hvis brikken er for langt tilbake, laseren vil ikke være i stand til å reflektere av baksiden av cantilever, forårsaker dårlig sum signal. Av disse grunnene kan det hende at den monterte AFM-brikken må justeres. I tillegg oppstår et annet problem som kan oppstå med høyden på prøven. AFM-instrumentet som brukes i denne protokollen har et maksimalt piezo z-område (høyde) på 15 μm. Hvis en bruker finner ut at programvaren ikke kan samle inn høydedata og tvinge kart i en bestemt piksel, vises en svart boks som indikerer at systemet er utenfor rekkevidde (figur 2C). En måte å problemer skyte dette problemet er å sette piezo høyde til en lavere verdi, for eksempel 2 eller 3 μm slik at det meste av 15 μm området er forpliktet til å kartlegge den forventede høyden på cellen. Denne teknikken bør, i de fleste celle- eller bakterierelaterte eksperimenter, løse problemet knyttet til z-området.

Experimentalists som krever en utvidet z-rekkevidde for høye prøver med høyder større enn 10 - 15 μm kan trenge å forfølge en ekstra modul på AFM. AFM-produsenter har dette alternativet tilgjengelig mot et pristillegg for de fleste systemer. Ved å utvide z-serien har eksperimentalisten tilgjengeligheten til å skanne prøver som anses høye i mikroskalaen med små problemer for ute av rekkeviddeverdier eller AFM piezo motormodifisering. Selv om disse modulene koster ekstra, kan noen, avhengig av produsenten, tilby ekstra høyde, opptil 100 μm i z-retningen. Konfokal er fortsatt mulig med høyere prøver hvis brukeren har lang arbeidsavstand, høy forstørrelsesmål eller er villig til å bruke et luftmål, kanskje en 20x eller 40x. Ved å senke mikroskop objektiv forstørrelse, øker arbeidsavstanden, og får avstand til å se toppen av en høyere prøve. Denne endringen til et lavere forstørrelsesmål vil ofre oppløsning. I Conpokal-oppsettet nevnt i dette manuskriptet, har 60x TIRF (total intern refleksjon fluorescens) målet en arbeidsavstand på nær 100 μm forbi dekkslippen på den glassbunnede prøvefatet.

Når det gjelder det konfokale mikroskopet det refereres til i dette manuskriptet, diskuteres noen viktige bestemmelser. Det konfokale systemet som brukes til produksjon av figurene i dette manuskriptet implementerte et 60x TIRF oljemål med en numerisk blenderåpning på 1,49. Laserlinjer ved 405 nm, 488 nm og 561 nm eksitasjonsbølgelengder ble brukt til levende celleprøveavbildning, vist i figur 3 og figur 4. Diffraksjonsgrensen for det confocal mikroskopet kan bestemmes ved hjelp av Abbe Resolution-ligningen, Abbe Resolution (x,y) = λ/2NA, hvor λ er eksitasjonsbølgelengden for Alexa 488, ved 488 nm, og NA er den numeriske blenderåpningen for den konokale kondensatoren, som er 0,3. Derfor bestemmes en aksial oppløsning på 272 nm. For epifluorescence imaging anses to tilfeller å bestemme oppløsningen der pinhole er satt til en luftete enhet (AU) og 0,5 AU. I sistnevnte tilfelle er pinhole stengt ned slik at betydelig lystap oppstår, men oppløsningen øker. Den confocal programvare beregner laterale innfødte og aksiale innfødte oppløsninger ved 170 nm og 290 nm for pinhole på 0,5 AU, og 200 nm og 370 nm for pinhole på 1 AU, henholdsvis. Sfæriske avvik introdusert i systemet kan redegjøres for gjennom en overføringsprosess for å øke kontrasten og oppløsningen i mikroskopbilder. På grunn av diffraksjonsbegrensningene som er iboende med konfokale mikroskoper, mangler det konfokale bildet av bakteriekolonien i figur 6 matchende oppløsning for detaljene sett i AFM-skanningen av bakterier i figur 5. AFM gir tilgang til nanoskalafunksjoner og detaljer som er vanskelige å fange med et konfokalt mikroskop. Men avhengig av den nødvendige fluorescensoppløsningen som trengs, viser figur 5 og figur 6 anvendelsen av Conpokal-teknikken til mikrober i tillegg til eukaryotiske celler.

En fordel med å bruke et konfokalt mikroskop gjør det mulig for operatøren å samle 3D-bilder av bestemte regioner i en prøve med skjerpet detalj. Disse bildene korrelerer med AFM ved å se overflaten som ble undersøkt via AFM-bildet og en konfokal skanning av samme region. Siden mikroskopet er invertert, samler et epifluorescence-bilde lysinformasjon fra motsatt side av prøven som ble undersøkt. Pinhole i konfocal systemet bidrar til å begrense til et enkelt plan fra en viss avstand mens filtrering ut lys som kommer fra resten av prøven eller til og med rommet. I hovedsak bidrar pinhole til å isolere lyset som kommer tilbake fra enkeltplan av interesse for prøven. Vanligvis må dette planet av interesse inneholde sterke fluoroformarkører fordi, for inverterte konfokale systemer, ville enkeltmolekyldeteksjon være begrenset til konfokale mikroskoper med høyere oppløsning. Epifluorescence belysning er mindre ønskelig på grunn av det faktum at i epifluorescence bildebehandling modus, er noe lys fra prøven som gjenspeiles inn i målet samlet inn og brukes til å generere bildet, derfor umulig å isolere et enkelt plan. Confocal teknikker gir et mer isolert enkeltplanbilde av den aktuelle prøvefunksjonen på grunn av pinhole77. Hvis for eksempel toppen av en eukaryotisk celle er undersøkt av AFM, kan den samme overflaten isoleres med laserskanningstrofikale evner av mikroskopet, i stedet for med epifluorescence bildebehandlingsmodus. Det anbefales å overvåke cellenes helse/form under datainnsamling via bildebehandling samtidig i differensialkontrastmodus ved hjelp av den overførte lysdetektoren og 488 nm laserlinjen. Når du fanger en z stabel av prøven, for prosedyren beskrevet ovenfor, bare forsterkning av detektoren er justert. Enhver morfologisk endring i cellene under målingen, som ikke nødvendigvis er synlig i de fluorescerende kanalene, indikerer at artefakter innføres i målingen.

Ideell avstand mellom planene kan oppnås ved å følge programvareanbefalingen for den korteste bølgelengden som brukes i bildeteknikken. Den opprinnelige oppløsningen og signal-til-støy-forholdet i bildevolumene kan effektivt forbedres ved å bruke overføringsalgoritmer som er tilgjengelige i bildebehandlingsmodulen til oppkjøpsprogramvaren. Imidlertid er det viktig å utføre fluorescerende mikroskopi, valg av spesifikke flekker og fargestoffer for å unngå tidlig bleking eller krysstale fra overlappende eksitasjon / utslippspektra. Noen ganger kan en bruker oppleve en funksjonsfeil i konfokal lysgenerering. Hvis en bruker opplever mangel på lysutslipp eller feil laserlinjer, er en måte å feilsøke på å tilbakestille systemet, vanligvis gjort ved å starte operativsystemet på nytt. Hvis problemet vedvarer, kan det hende at den overførte lysdetektoren ikke har klart å bevege seg inn eller ut av sted innenfor den optiske banen til lysmikroskopet. Tilbakestilling av senderdetektorens posisjon kan bidra til å lindre lysoppsamling eller laseravbildningsproblemer.

Fokuset til Conpokal-instrumentet er å gi brukerne muligheten til å samle optisk og kraftbasert informasjon om levende biomaterialer i et flytende miljø, samtidig og på samme celle eller funksjon. Dette arbeidet beskriver eksplisitt hvordan du utfører disse eksperimentene i væske, et naturlig hjem for mange biomaterialer, selv om tørre eksperimenter fortsatt kan utføres ved hjelp av instrumenteringen. Med prøver tilberedt i Petri-retter er parabolhøyden en begrensning. På grunn av konfigurasjonen av glassblokken som holder AFM-cantileveren, må sideveggene på oppvasken være under 10 mm i høyden; Hvis fatet er for høyt, vil ikke instrumentet kunne senke AFM-spissen til overflaten av prøven eller underlaget.

Selv om det er en begrensning for prøvestørrelse, er det ingen begrensning med instrumentet eller programvarefunksjonene med hensyn til en tidsforsinkelse. Samtidig konfokal og AFM er mulig med de riktige faktorene på plass. Begrensningen som bidrar til den nær samtidige evnen refererer til støyen som genereres når du utfører visse konfokale mikroskopifunksjoner og atomkraftmikroskopifunksjoner samtidig. Vibrasjonene fra motorene som beveger mikroskopmålet under innsamling av en z-stabel, vil bli lagt til signalet fra AFM-probespissen under bevegelsen. Støyen vil bli forbedret av et oljemål, da motorene beveger seg opp og ned i z-retningen for å belyse sekvensielle fly i prøven. Derfor inkluderer den anbefalte protokollen sekvensiell samling av AFM-skanninger og confocal z stack-bilder. Samtidig CLSM og AFM ville kreve stasjonær avbildning med konfokal, men med dagens teknikk kan forsinkelsestiden for de to instrumentene være så kort som titalls sekunder. Den faktiske tiden for å bytte fra AFM-operasjon til konfokal bildebehandling var rundt 2 - 4 minutter for bildene samlet inn i figur 2A og figur 4B. Denne verdien ble bestemt ved å trekke de to bildesamlingstidsperiodene fra den totale tiden på 33 minutter, som inkluderer tiden for å starte og fullføre AFM-skanningen, bytte instrumentmoduser for å aktivere konfokal bildebehandling, og begynne og fullføre den konokkale bilde z-stakken.

Fremtiden til Conpokal har som mål å utforske nye struktur-funksjon relasjoner i tillegg til ivrig innsikt i enkeltcelleprosesser. For eksempel vil eksperimentering av in situ-medikamentbehandlinger på celle- eller bakterieprøver for å bestemme effekten av celleelastisitet være et fremskritt for biomaterialer, biologi og biomekanikk. Behandlingsterapi i prøveretten mens avbildning og sondering ville gi kunnskap om hvordan prøven reagerer på terapeutiske midler i et levende og nøye kontrollert miljø, over tid. Innlemme en ny narkotika eller miljøutfordring ville utvide forståelsen av hvordan cytoskeleton eller organelle plassering påvirker bevegelse, topologi, stivhet, etc. En annen potensiell utvikling av Conpokal er evnen til å ha full miljøkontroll av systemet. Den nåværende Conpokal nevnt i denne protokollen er plassert inne i en akustisk kabinett designet for å redusere støy fra innsiden av laboratoriet. Fremme av dette huset ville gi muligheten til å teste innenfor, kanskje, en eller en kombinasjon av faktorer, ikke begrenset til de som et sterilt miljø, temperaturkontrollert, eller variabel-tyngdekraften. Som det står, gir Conpokal-metoden en effektiv og nyttig tilnærming for å karakterisere levende, flytende biomaterialer, men teknikkens fremtid vil bare fremme disse egenskapene ytterligere.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Vi anerkjenner NIH COBRE-finansiering under nummer P20GM130456. Vi takker UK Light Microscopy Core, som støttes av visepresidenten for forskning, for å få hjelp i dette arbeidet. Stammer av S. mutans og E. faecalis ble levert av Dr. Natalia Korotkova. Den første omtalen av play-on-words, Conpokal, for å beskrive kombinasjonen av konfokal mikroskopi og atomkraftmikroskopi tilskrives Dr. Brad Berron, Chemical and Materials Engineering, ved University of Kentucky, i diskusjon med Dr. Martha Grady (tilsvarende forfatter) i påvente av ankomsten av en seminarspeaker Dr. Jonathan Pham, som sluttet seg til fakultetet i Kjemisk og materialteknikk ved University of Kentucky høsten 2017.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acoustic Enclosure JPK-Bruker Acoustic Enclosure Chamber used to mitigate noise
BioTracker 488 Green Microtubule Cytoskeleton Dye Millipore Sigma SCT142 Used to label microtubules in mammalian cells
CP-qp-CONT-BSG AFM tips NanoAndMore CP-qp-CONT-BSG-B Collodial AFM tips good for modulus measurements on biological samples
Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3))) ThermoFischer Scientific D282 Used to label plasma membrane of mammalian cells
Dulbecco's Modified Eagle Medium VWR VWRL0100-0500 Component of cell culture media
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline ThermoFisher Scientific A1285601 Used to simulate biological environment
Fetal Bovine Serum Fischer Scientific 45000-736 Component of cell culture media
Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: Yeast Extract Fischer Scientific BP1422-500 Component of bacterial culture medium
FluoroDish Cell Culture Dish World Precision Instruments (WPI) FD35-100 Glass-bottomed dishes whose side walls are less than 10 mm, necessary for full function of Nanowizard 4a AFM
Hoechst 33342 nucleic acid stain ThermoFischer Scientific 62249 Used to label nucleus of mammalian cells, a good nuclear marker for live cells
Human embryonic kidney 293 cells ATCC Global Bioresource Center CRL-1573 Mammalian cells used in protocol
Matrigel VWR 47743-716 Coating in cell culture dish
Model: PFQNM-LC-A-CAL AFM tips Bruker PFQNM-LC-A-CAL AFM tips that work well for samples that have large heights (such as eukaryotic cells)
NanoWizard 4a JPK-Bruker NanoWizard 4a AFM
Nikon A1 Laser Scanning Confocal Microscope Nikon A1 HD25 Microscope used for brightfield, epi-fluorescence, and confocal imaging
PENICILLIN/STREPTOMYCIN VWR 16777-164 Component of cell culture media
PetriDishHeater JPK-Bruker PetriDishHeater Maintains desired Petri dish sample temperature
qp-BioAC-Cl AFM tips Nanosensors qp-BioAC-Cl-10 Three different AFM cantilevers of varying stiffness
Replaceable Carbon Fiber Tip Tweezers Ted Pella Inc. 5051 Used to carefully place and remove delicate AFM tips into the glass mounting block
Todd Hewitt Broth Bacto BD DIFCO Bacterius Ltd Bacto-249240 Component of bacterial culture medium
Vancomycin, BODIPY FL Conjugate Thermo Fisher Scientific V34850 Used to fluorescently label bacterial cell wall

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Butt, H. J., Pham, J. T., Kappl, M. Forces between a stiff and a soft surface. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 27, 82-90 (2017).
  2. Pham, J. T., Schellenberger, F., Kappl, M., Butt, H. J. From elasticity to capillarity in soft materials indentation. Physical Review Materials. 1 (1), 015602 (2017).
  3. Lee, G. Y. H., Lim, C. T. Biomechanics approaches to studying human diseases. Trends Biotechnology. 25 (3), 111-118 (2007).
  4. Qiu, H., et al. Short Communication: Vascular Smooth Muscle Cell Stiffness As a Mechanism for Increased Aortic Stiffness With Aging. Circulation Research. 107 (5), 615-619 (2010).
  5. Glenister, F. K., Coppel, R. L., Cowman, A. F., Mohandas, N., Cooke, B. M. Contribution of parasite proteins to altered mechanical properties of malaria-infected red blood cells. Blood. 99 (3), 1060-1063 (2002).
  6. Suresh, S., et al. Connections between single-cell biomechanics and human disease states: gastrointestinal cancer and malaria. Acta Biomaterialia. 1 (1), 15-30 (2005).
  7. Nash, G. B., Johnson, C. S., Meiselman, H. J. Mechanical properties of oxygenated red blood cells in sickle cell (HbSS) disease. Blood. 63 (1), 73-82 (1984).
  8. Trickey, W. R., Lee, G. M., Guilak, F. Viscoelastic properties of chondrocytes from normal and osteoarthritic human cartilage. Journal of Orthopedic Research. 18 (6), 891-898 (2000).
  9. An, S. S., Fabry, B., Trepat, X., Wang, N., Fredberg, J. J. Do Biophysical Properties of the Airway Smooth Muscle in Culture Predict Airway Hyperresponsiveness. American Journal of Respiratory Cell and Molecuar Biology. 35 (1), 55-64 (2006).
  10. Suresh, S. Biomechanics and biophysics of cancer cells. Acta Materialia. 55 (12), 3989-4014 (2007).
  11. Rebelo, L. M., de Sousa, J. S., Mendes, J., Radmacher, M. Comparison of the viscoelastic properties of cells from different kidney cancer phenotypes measured with atomic force microscopy. Nanotechnology. 24 (5), 055102 (2013).
  12. Cross, S. E., Jin, Y. S., Rao, J., Gimzewski, J. K. Nanomechanical analysis of cells from cancer patients. Nature Nanotechnology. 2 (12), 780-783 (2007).
  13. Remmerbach, T. W., et al. Oral Cancer Diagnosis by Mechanical Phenotyping. Cancer Research. 69 (5), 1728-1732 (2009).
  14. Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nature Reviews Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).
  15. Yallapu, M. M., et al. The Roles of Cellular Nanomechanics in Cancer. Medical Research Reviews. 35 (1), 198-223 (2015).
  16. Fabry, B., et al. Scaling the Microrheology of Living Cells. Physical Review Letters. 87 (14), 148102 (2001).
  17. Ingber, D. E., Prusty, D., Sun, Z., Betensky, H., Wang, N. Cell shape, cytoskeletal mechanics, and cell cycle control in angiogenesis. Jouranl of Biomechica. 28 (12), 1471-1484 (1995).
  18. Svoboda, K., Block, S. M. Biological Applications of Optical Forces. Annual Reviews of Biophysics and Biomolecular Structures. 23 (1), 247-285 (1994).
  19. Dao, M., Lim, C. T., Suresh, S. Mechanics of the human red blood cell deformed by optical tweezers. Journal of the Mechicanics and Physics of Solids. 51 (11-12), 2259-2280 (2003).
  20. Thoumine, O., Cardoso, O., Meister, J. J. Changes in the mechanical properties of fibroblasts during spreading: a micromanipulation study. European Biophys with Biophyics Letters. 28 (3), 222-234 (1999).
  21. Reynolds, N. H., et al. On the role of the actin cytoskeleton and nucleus in the biomechanical response of spread cells. Biomaterials. 35 (13), 4015-4025 (2014).
  22. Jones, W. R., et al. Alterations in the Young’s modulus and volumetric properties of chondrocytes isolated from normal and osteoarthritic human cartilage. Journal of Biomechics. 32 (2), 119-127 (1999).
  23. Radmacher, M., Fritz, M., Kacher, C. M., Cleveland, J. P., Hansma, P. K. Measuring the viscoelastic properties of human platelets with the atomic force microscope. Biophysics Journals. 70 (1), 556-567 (1996).
  24. Ketene, A. N., Roberts, P. C., Shea, A. A., Schmelz, E. M., Agah, M. Actin filaments play a primary role for structural integrity and viscoelastic response in cells. Integrative Biology. 4 (5), 540-549 (2012).
  25. Ketene, A. N., Schmelz, E. M., Roberts, P. C., Agah, M. The effects of cancer progression on the viscoelasticity of ovarian cell cytoskeleton structures. Nanomedicine-Nanotechnology. 8 (1), 93-102 (2012).
  26. Darling, E. M., Topel, M., Zauscher, S., Vail, T. P., Guilak, F. Viscoelastic properties of human mesenchymally-derived stem cells and primary osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes. Journal of Biomechics. 41 (2), 454-464 (2008).
  27. Henderson, E., Haydon, P., Sakaguchi, D. Actin filament dynamics in living glial cells imaged by atomic force microscopy. Science. 257 (5078), 1944-1946 (1992).
  28. Rotsch, C., Radmacher, M. Drug-Induced Changes of Cytoskeletal Structure and Mechanics in Fibroblasts: An Atomic Force Microscopy Study. Biophysics Jouranl. 78 (1), 520-535 (2000).
  29. Darling, E. M., Zauscher, S., Guilak, F. Viscoelastic properties of zonal articular chondrocytes measured by atomic force microscopy. Osteoarthritis Cartilage. 14 (6), 571-579 (2006).
  30. Lekka, M., et al. Local elastic properties of cells studied by SFM. Applied Surface Science. 141 (3-4), 345-349 (1999).
  31. Li, Q. S., Lee, G. Y. H., Ong, C. N., Lim, C. T. AFM indentation study of breast cancer cells. Biochemical and Biophysical Research Communication. 374 (4), 609-613 (2008).
  32. Rother, J., Noding, H., Mey, I., Janshoff, A. Atomic force microscopy-based microrheology reveals significant differences in the viscoelastic response between malign and benign cell lines. Open Biology. 4 (5), 140046 (2014).
  33. Nalam, P. C., Gosvami, N. N., Caporizzo, M. A., Composto, R. J., Carpick, R. W. Nano-rheology of hydrogels using direct drive force modulation atomic force microscopy. Soft Matter. 11 (41), 8165-8178 (2015).
  34. Raman, A., et al. Mapping nanomechanical properties of live cells using multi-harmonic atomic force microscopy. Nature Nanotechnology. 6 (12), 809 (2011).
  35. Caporizzo, M. A., et al. Strain-rate dependence of elastic modulus reveals silver nanoparticle induced cytotoxicity. Nanobiomedicine. 2, 9 (2015).
  36. Corbin, E. A., Kong, F., Lim, C. T., King, W. P., Bashir, R. Biophysical Properties of Human Breast Cancer Cells Measured Using Silicon MEMS Resonators and Atomic Force Microscopy. Lab Chip. 15 (3), 839-847 (2014).
  37. Moreno-Flores, S., Benitez, R., Vivanco, M. D., Toca-Herrera, J. L. Stress relaxation and creep on living cells with the atomic force microscope: a means to calculate elastic moduli and viscosities of cell components. Nanotechnology. 21 (44), 445101 (2010).
  38. Grady, M. E., Composto, R. J., Eckmann, D. M. Cell elasticity with altered cytoskeletal architectures across multiple cell types. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 61, 197-207 (2016).
  39. Park, S., Koch, D., Cardenas, R., Kas, J., Shih, C. K. Cell motility and local viscoelasticity of fibroblasts. Biophysical Journal. 89 (6), 4330-4342 (2005).
  40. Ribeiro, A. S., Khanna, P., Sukumar, A., Dong, C., Dahl, K. Nuclear Stiffening Inhibits Migration of Invasive Melanoma Cells. Cellular and Molecular Bioengineering. 7 (4), 1-8 (2014).
  41. Buda, A., Pignatelli, M. Cytoskeletal network in colon cancer: from genes to clinical application. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 36 (5), 759-765 (2004).
  42. Lindberg, U., Karlsson, R., Lassing, I., Schutt, C. E., Höglund, A. S. The microfilament system and malignancy. Seminars in Cancer Biology. 18 (1), 2-11 (2008).
  43. Altemeier, W. A., Sinclair, S. E. Hyperoxia in the intensive care unit: why more is not always better. Current Opinion in Critical Care. 13 (1), 73-78 (2007).
  44. Roan, E., Waters, C. M., Teng, B., Ghosh, M., Schwingshackl, A. The 2-pore domain potassium channel TREK-1 regulates stretch-induced detachment of alveolar epithelial cells. PLoS One. 9 (2), 89429 (2014).
  45. Roan, E., et al. Hyperoxia alters the mechanical properties of alveolar epithelial cells. American Journal of Physiology. 302 (12), 1235-1241 (2012).
  46. Wilhelm, K. R., Roan, E., Ghosh, M. C., Parthasarathi, K., Waters, C. M. Hyperoxia increases the elastic modulus of alveolar epithelial cells through Rho kinase. The FEBS Journal. 281 (3), 957-969 (2013).
  47. Roan, E., Wilhelm, K. R., Waters, C. M. Kymographic Imaging of the Elastic Modulus of Epithelial Cells during the Onset of Migration. Biophysical Journal. 109 (10), 2051-2057 (2015).
  48. Wagh, A. A., et al. Localized elasticity measured in epithelial cells migrating at a wound edge using atomic force microscopy. American Journal of Physiology. 295 (1), 54-60 (2008).
  49. Liu, S., Wang, Y. Application of AFM in microbiology: a review. Scanning. 32 (2), 61-73 (2010).
  50. Hayhurst, E. J., Kailas, L., Hobbs, J. K., Foster, S. J. Cell wall peptidoglycan architecture in Bacillus subtilis. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 105 (38), 14603-14608 (2008).
  51. Dover, R. S., Bitler, A., Shimoni, E., Trieu-Cuot, P., Shai, Y. Multiparametric AFM reveals turgor-responsive net-like peptidoglycan architecture in live streptococci. Nature Communications. 6 (1), 1-10 (2015).
  52. Gillis, A., Dupres, V., Delestrait, G., Mahillon, J., Dufrêne, Y. F. Nanoscale imaging of Bacillus thuringiensis flagella using atomic force microscopy. Nanoscale. 4 (5), 1585-1591 (2012).
  53. Laurent, V. M., et al. Gradient of rigidity in the lamellipodia of migrating cells revealed by atomic force microscopy. Biophysical Journal. 89 (1), 667-675 (2005).
  54. Collart-Dutilleul, P. Y., et al. Initial stem cell adhesion on porous silicon surface: molecular architecture of actin cytoskeleton and filopodial growth. Nanoscale Research Letters. 9 (1), 564 (2014).
  55. Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
  56. Ilie, M. A., et al. Current and future applications of confocal laser scanning microscopy imaging in skin oncology. Oncology Letters. 17 (5), 4102-4111 (2019).
  57. Jonkman, J., Brown, C. M. Any way you slice it-a comparison of confocal microscopy techniques. Journal of Biomolecular Techniques. 26 (2), 54 (2015).
  58. Minsky, M. Memoir on inventing the confocal scanning microscope. Scanning. 10 (4), 128-138 (1988).
  59. Paddock, S. Over the rainbow: 25 years of confocal imaging. Biotechniques. 44 (5), 643-648 (2008).
  60. Amos, W., White, J. How the confocal laser scanning microscope entered biological research. Biology of the Cell. 95 (6), 335-342 (2003).
  61. Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. Spinning-disk confocal microscopy: present technology and future trends. Methods in Cell Biology. 123, 153-175 (2014).
  62. Wolleschensky, R., Zimmermann, B., Kempe, M. High-speed confocal fluorescence imaging with a novel line scanning microscope. Journal of Biomedical Optics. 11 (6), 064011 (2006).
  63. Brakenhoff, G., Van der Voort, H., Van Spronsen, E., Nanninga, N. Three-dimensional imaging in fluorescence by confocal scanning microscopy. Journal of Microscopy. 153 (2), 151-159 (1989).
  64. Jerome, W. G., Price, R. L. Basic Confocal Microscopy. , Springer. (2018).
  65. Webb, R. H. Confocal optical microscopy. Reports on Progress in Physics. 59 (3), 427 (1996).
  66. Pawley, J. Handbook of biological confocal microscopy. , Springer. 236 (2010).
  67. Webb, D. J., Brown, C. M. Epi-fluorescence microscopy. Cell Imaging Techniques. , 29-59 (2012).
  68. Day, R. N., Davidson, M. W., Press, C. The fluorescent protein revolution. , Elseiver. (2014).
  69. Fine, A., Amos, W., Durbin, R., McNaughton, P. Confocal microscopy: applications in neurobiology. Trends in Neurosciences. 11 (8), 346-351 (1988).
  70. Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
  71. Pan, Y. A., Livet, J., Sanes, J. R., Lichtman, J. W., Schier, A. F. Multicolor Brainbow imaging in zebrafish. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (1), 5546 (2011).
  72. Fu, X., et al. Brain Region Specific Single-Molecule Fluorescence Imaging. Anals in Chemistry. 91 (15), 10125-10131 (2019).
  73. Snell, A. A., et al. Cell-Derived Vesicles for in Vitro and in Vivo Targeted Therapeutic Delivery. ACS Omega. 4 (7), 12657-12664 (2019).
  74. Edgar, R. J., et al. Discovery of glycerol phosphate modification on streptococcal rhamnose polysaccharides. Nature Chemical Biology. 15 (5), 463-471 (2019).
  75. Kailas, L., et al. Immobilizing live bacteria for AFM imaging of cellular processes. Ultramicroscopy. 109 (7), 775-780 (2009).
  76. Gavara, N. A beginner's guide to atomic force microscopy probing for cell mechanics. Microscopy Research and Technique. 80 (1), 75-84 (2017).
  77. Wilson, T. The role of the pinhole in confocal imaging system. Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 167-182 (1995).

Tags

Bioengineering Utgave 162 konfokal mikroskopi atomkraftmikroskopi AFM conpokal bakterier cellebiologi biomaterialer levende celleavbildning mekanobiologi
Nær samtidig laserskanning konfokal og atomkraft mikroskopi (Conpokal) på levende celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sandin, J. N., Aryal, S. P., Wilkop, … More

Sandin, J. N., Aryal, S. P., Wilkop, T., Richards, C. I., Grady, M. E. Near Simultaneous Laser Scanning Confocal and Atomic Force Microscopy (Conpokal) on Live Cells. J. Vis. Exp. (162), e61433, doi:10.3791/61433 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter