Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Canlı Hücrelerde Eşzamanlı Lazer Tarama Konfokal ve Atomik Kuvvet Mikroskobu (Conpokal) Yakınında

Published: August 11, 2020 doi: 10.3791/61433
Automatic Translation
1, 2, 3,4, 2,4, 1
1Department of Mechanical Engineering, University of Kentucky, 2Department of Chemistry, University of Kentucky, 3Department of Physiology, University of Kentucky, 4UK Light Microscopy Core, University of Kentucky

Summary

Burada konfokal ve atomik kuvvet mikroskobu tek bir enstrüman platformu nda birleştiren Conpokal tekniğinin protokolü sunulmuştur. Conpokal aynı hücre, aynı bölge, eşzamanlı konfokal görüntüleme ve canlı biyolojik örneklerin mekanik karakterizasyonu yakın sağlar.

Abstract

Mikro ve nano ölçekli mekanik karakterizasyon için mevcut teknikler son birkaç on yıl içinde patladı. Tarama ve iletim elektron mikroskobunun daha da geliştirilmesinden, atomik kuvvet mikroskobunun icadından floresan görüntülemedeki gelişmelere kadar, küçük malzemelerin incelenmesine olanak sağlayan teknolojilerde önemli kazanımlar elde edilmiştir. Conpokal, konfokal mikroskopi ile atomik kuvvet mikroskobu (AFM) birleştirir ve bir sonda nın yüzeyi "dürttüğü" bir portmanteaudur. Her teknik kendi nitel ve/veya nicel görüntü koleksiyonu için son derece etkili olmasına rağmen, Conpokal harmanlanmış floresan görüntüleme ve mekanik karakterizasyon ile test etme olanağı sağlar. Yakın eşzamanlı konfokal görüntüleme ve atomik kuvvet sondajı için tasarlanan Conpokal, canlı mikrobiyolojik numuneler üzerinde deneyler ilerler. Eşleştirilmiş enstrümantasyondan elde edilen ek bilgiler, ölçülen mekanik özelliklerin(örn.elastik modül, yapışma, yüzey pürüzlülüğü) AFM tarafından hücre altı bileşenler veya konfokal mikroskopi ile gözlemlenebilecek aktivite ile birlikte lokalizasyonunu sağlar. Bu çalışma, aynı anda, aynı hücre, aynı bölge, konfokal görüntüleme ve mekanik karakterizasyon elde etmek için, lazer tarama konfokal ve atomik kuvvet mikroskobu çalışması için adım protokol sağlar.

Introduction

Mikro-veya nano ölçekli mekanik değerlendirme araçları genellikle tek hücre veya mikroorganizma düzeyindeki deformasyon özelliklerini ortaya çıkarmak için kullanılırken, hücre altı süreçleri ve yapısal özellikleri görselleştirmek için ayrı yüksek çözünürlüklü mikroskopi araçları kullanılmaktadır. Conpokal, lazer tarama konfokal mikroskopi ve atomik kuvvet mikroskobu (AFM) tek bir enstrümantal platform içine kombinasyonudur. Conpokal tekniği ilk olarak biyolojik olmayan bir polimer sistemde uygulanmıştır ve amaç yumuşak yüzeylerle temas eden sert yüzeylerin yapışmasını, elastikiyeti ve yüzey gerilimini belirlemektir. Konfokal görüntüler polimer deforme nasıl görsel bir render sağlanan, yapışır, ve sert prob bültenleri1,2. Polimerlerden biyolojik numunelere kadar bu teknik, yakın eşzamanlı canlı hücre veya mikroorganizma konfokal görüntüleme ve AFM için fırsat sağlar.

Hücre elastikiyetindeki değişiklikler birçok insan hastalığının patogenezinde meydana gelmiştir.3 vasküler bozukluklar da dahil olmak üzere4Sıtma5,6, orak hücreli anemi7Artrit8Astım9, ve kanser6,10,11,12,13,14,15. Hücrelerin mekaniğini ölçmek için ortak teknikler manyetik boncuk kullanımı içerir16,17, optik cımbız18,19, mikropipet aspirasyonu8,20,21,22ve AFM11,23,24,25,26. AFM'nin canlı hücrelere uygulanmasından bu yana hücre topografyasını karakterize etmek için kolayca uyarlanmıştır.27,28 yanı sıra mekanik özellikleri11,24,29,30,31 nano ölçekli hassasiyetle. AFM mikroromatoloji için daha fazla adapte edilmiştir32,33, frekans modülasyonu34,35, ve sürünme25,36,37 çeşitli hücre hatlarının viskoelastik özelliklerini incelemek için deneyler. Uygun bir nanocontact modelinin kullanımı, AFM tarafından üretilen kuvvet girintisi ölçümlerinden nicel elastikiyet değerlerinin çıkarılması için çok önemlidir.1,2. Sitoskeletel ilaçların hücre elastikiyeti üzerindeki etkisini araştıran AFM çalışmaları elastik modülün yüksek oranda etkilendiğini göstermiştir.38. Elastik modül ölçümlerine dayanarak, birçok araştırmacı kanserli hücrelerin dönüşümsüz benzerlerinden daha yumuşak olduğunu göstermiştir.11,38,39. Artmış deformeedilebilirlik muhtemelen kanser hücrelerinin metastaz ve dokulara infiltrasyon yeteneği önemli bir rol oynar40. Bu tür davranışlar hücrelerin sitosiskelet organizasyonundaki değişikliklerle düzenlenir.38,41,42. Kansere ek olarak, mekanik bağımlı hastalıkların başka bir sınıf solunum hastalıkları vardır. Örneğin, akut solunum stres sendromu her yıl daha fazla insan etkiler. Hastalar yüksek oksijen konsantrasyonları ile mekanik ventilasyona konulduğunda durumlarının daha da kötüleşebileceği gösterilmiştir.43. AFM ile alveoler epitel makrofajları gözlemleyen bir dizi çalışmada, bilim adamları oksijen açısından zengin bir ortamın eklenmesinin aktin oluşumuna bağlı hücrelerin sertliğini artırdığını buldular; AFM'nin hücresel düzeyde solunum fonksiyonu üzerindeki atmosferik çevresel etkiyi ve nihayetinde insan iyileşmesi ve sağlığı üzerindeki detaylı anlayışımız üzerindeki etkisinin önemli bir örneği44,45,46. Bir yaraya doğru geçiş sırasında epitel hücre sertliği de AFM ile değerlendirilebilir ve gelecekteki hücre yayılma sinyali elastik modül bir varyasyon oluşur47,48. Bu nedenle, hastalıklı hücrelerin sağlıklı hücrelerden nasıl farklı olduğunu ve onlarla nasıl etkileşimde bulunduklarını anlamak için hücre mekaniğini nicel olarak ölçmeye pratik bir ihtiyaç vardır.

AFM ayrıca yapışkan özellikleri ve yüzey yapısını incelemek için de kullanılır. Bir atomik kuvvet mikroskobu, temas mekaniği kullanan bir örnek hakkında bilgi toplamak için çeşitli modlara sahiptir. Yaşayan biyolojik numuneler için, birincil hedeflerden ikisi, harita yüzey yüksekliğinin yanı sıra nicel mekanik özellik değerlerini(örn.elastik modüler, yapışkan kuvvetler) elde etmektir. Bu modlar, sabit bir sapma yı korumak için sabit bir sapma49'uyükselten veya düşüren numune yüzeyi ve temas moduyla aralıklı olarak temas eden sabit bir kantilever genliğini koruyan dokunma modunu (aralıklı temas olarak da bilinir) içerir. Yapışma haritaları AFM sisteminde kuvvet haritalama kullanılarak toplanabilir. Kantilever örneği belirli bir kuvvete indeneder ve sonra geri çekilir. Geri çekilmeye direnen kuvvet dedektör tarafından ölçülür ve bir kuvvet yer değiştirme grafiği oluşturur. Yapışma kuvveti geri çekme sırasında ölçülen maksimum kuvvettir. Yüzey morfolojisi, numunenin mikro veya nano düzeyde ayrıntılı bir görünümünü sağlar. Kantilever, her pikseldeki kantilin hareketi tarafından yakalanan girinti ve sapmaya dayanarak numune üzerinde bir raster tetkikini tamamlar ve mikro ve nano boyutlu özellikleri ortaya çıkarır. AFM ile peptidoglikan yapısı50, polimer zincir hizalama51, flagella52, lamellipodia53ve filipodia54 gibi küçük özelliklerin boyutu ölçülebilir. AFM'nin gücü kuvvet yer değiştirme eğrileri ve optik olmayan topolojik görüntülerde yer alırken, konfokal mikroskopi floresan etiketli örneklerin ayrıntılı görüntülerini sunar.

Konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) canlı hücreleri, sabit hücreleri ve dokuları görüntüleme için baskın bir tekniktir55,56,57. CLSM 1955 yılından bu yana biyolojik görüntüleme için istihdam edilmiştir yani,kuruluşundan bu yana58,59. Konfokal mikroskopların çalışma prensibi(yani,bir iğne deliği aracılığıyla odak ışığı nın reddi) büyük ölçüde aynı kalırken, teknik uygulama çok çeşitli hale gelmiştir56,57,58,60. Confocal görüntüleme çok noktalı tarama yoluyla uygulanabilir, dönen disk sistemi gibi61, tek bir lazer ışını nokta tarama, çizgi taramagibi 62, veya bir çok eleman dedektörü ile sonraki piksel reassignments ile nokta yayma fonksiyonu görüntüleme57. Konfokal görüntüleme nin yarar genişletmek Son gelişmeler lazer tarama yeteneği, yüksek hızlı rezonans tarama ve yüksek hassasiyet dedektörleri63,64,65içerir. Tüm konfokal sistemlerin geniş alan mikroskoplarına göre sahip olmasının avantajı, z ekseninde optik kesitlemeyi daha ayrıntılı olarak, özellikle kalın örneklerde gerçekleştirebilme yeteneğidir. Kamera tabanlı algılama kullanan geniş alan mikroskopları, odak düzleminden yayılan ışığı ve aynı anda aydınlatma yolunun her yerinden yayılan ışığı toplar. İğne deliğini kapatarak, sinyalin azaltılması pahasına, hem eksenel hem de yanal çözünürlükartırılabilir 66. CLSM'de, uyarma lazeri x-y görüş alanında taranırken, görüntüler emisyon sinyali toplama yoluyla piksel piksel olarak oluşturulur. Örneğin z ekseni boyunca birkaç x-y düzlemlerinin toplanması daha sonra örnek57,673 boyutlu mimarisini yeniden oluşturmak için kullanılabilir. Konfokal mikroskopi ile birlikte floresan proteinlerin tanıtılması, hücre biyolojisi anlayışımızda devrim yarattı68. Örneğin, nörolojik69önemli bir araç haline gelmiştir. CLSM düzenli olarak temizlenmiş doku gözlemlemek için kullanılır, ve bağışıklık lekeli beyin ve nöronal ağ mimarisi nin kapsamlı görüntüleri elde etmek için70. Bu uygulama beyinde nöronlar ve glial hücreler arasında sinaptik temas ve iletişim içine yeni anlayışlar sonuçlandı71. Beyin hücrelerinden veziküllere kadar floresan boyama protokolleri, tedavi tekniklerindeki ilerlemeler için konfokal mikroskopi yoluyla hücre fonksiyonlarının incelenmesini ve yakalanmasını destekler72,73.

Etkileyici ve çok yönlü araçlar ayrı ayrı olmalarına rağmen, konfokal ve atomik kuvvet mikroskobu (Conpokal) kombinasyonu, araştırmacıların çeşitli hücresel organellerin ve ilgili dinamiklerinin gözlemi ile topografik ve mikromekanik hücresel/doku özelliklerini benzersiz bir şekilde ilişkilendirmelerine olanak tanır. Eşleştirilmiş enstrümantasyon, kullanıcıların aslında neyi araştırdıklarını "görmelerini" sağlar; kendi başına bir teknik üzerinde büyük bir avantaj. Conpokal ile, AFM ile kuvvet haritalama hücre sertliği, yapışma veya morfolojiörnek içinde sitoskelet yapısı, örneğin ilişkilendirmek için konfokal görüntüler üzerine kaplanır. Conpokal yönteminin genel amacı, araştırmacıların canlı örnekleri özlü ve etkili bir şekilde incelemeleri için bir platform sağlamak ve hem görüntü hem de malzeme özellik verilerini tek bir platformda sağlamaktır. Bu çalışmada, uygun numune seçimi ve hazırlanması, cihaz kurulumu, cantilever kalibrasyonu dahil olmak üzere Conpokal'ın işleyişini göstermekte ve başarılı sorun giderme yönergeleri sayılmaktadır. Protokolden sonra, başarılı bakteri ve hücre AFM yükseklik haritalama, bakteri ve hücre AFM modülü haritalama ve aynı hücre konfokal ve AFM ile çok etiketli hücrelerin konfokal görüntüleme dahil temsili sonuçlar sağlar. Conpokal yordamı kritik adımları, sorun giderme önerileri, teknik sınırlamaları, önemi ve yöntemiçin gelecekteki görünüm bir tartışma ile sona erer.

Protocol

1. Enstrümanların, kültür medyasının, yemeklerin hazırlanması

  1. Conpokal sırasında kullanılan diğer ilişkili alet veya cihazların yanı sıra hem konfokal mikroskobun hem de atomik kuvvet mikroskobu için güç kaynaklarını açın. Ölçümlere başlamadan önce aletlerin termal olarak dengelenmesine ve stabilize olması için yeterli zaman verin. Tipik olarak, 1 saat yeterlidir.
  2. Temiz, sistem onaylı, cam dipli petri kabı hazırlayın ve yarısı dolu, ancak üçte ikisinden fazlası tam değil, fosfat tamponlu salin (PBS) veya benzer berrak sıvı ile doldurun. Bu yemek ("kalibrasyon çanak" olarak anılacaktır) örnek yemekler ayrı dır ve atomik kuvvet mikroskobu (AFM) kantilever bulmak ve kalibre etmek için kullanılacaktır.
    NOT: Flüoresans spektrumlarına herhangi bir müdahaleyi önlemek için sıvının açık olması ve düşük otofloresansa sahip olması önemlidir. PBS biyolojik ortamı taklit ettiği için önerilir.
  3. İlgili sıvının yemeği en az yarısı dolu dolduracak şekilde deneysel numune yemekleri hazırlayın. Numune floresan ise, gerekli olana kadar kapalı veya karanlık bir yerde olduğundan emin olun. Lens temizleyici ve lens mendilleri kullanarak tüm cam tabakların altını temizleyin.
  4. Bilgisayar(lar) sabit disk(leri) üzerinde confocal ve AFM için veri depolama klasörleri oluşturun.

2. Hücre veya mikroorganizmaların seçimi

  1. Bakteri stok çözeltisi oluşturmak için, bir aşılama döngüsü kullanarak, Todd Hewitt Maya 15 mL (THY) bir gecede (üstel faz için) bir% 5 CO2 kuluçka içinde Streptococcus mutans bakteri aşılamak.
  2. Gece kuluçkası tamamlanmadan 1 saat önce, 1 mL poli-l-lizin çözeltisi içeren veya cam dipli yemeğin cam kısmını kaplayacak kadar deneysel numune tabaklarını kaplayın ve biyogüvenlik dolabında 1 saat bekletin. Ayarı yaptıktan sonra, aspire poli-l-lizin çözeltisi ve PBS ile 3x bulaşıkları durulayın.
  3. 18 - 24 saat bakteriyel inkübasyondan sonra, 0,6 - 0,7 optik yoğunluk elde edilene kadar 1 mL bakteriyel süspansiyon ile THY'yi aşılayın (aşılama için tipik değerler 3 mL VE çanak başına 1 mL bakteriyel süspansiyon). Her poli-l-lizin kaplı çanak ve 1 saat kuluçka için yeni bakteri çözeltisi 1 mL ekleyin. Son 10 dakika boyunca, her çanağa 1 mL yeşil floresan membran lekesi (1 μM konsantrasyonu) ekleyin.
  4. Her yemeği PBS ile 3x durulayın. Bakterileri yaklaşık 1 mL 4 paraformaldehit çözeltisi ile 15 dakika oda sıcaklığında biyogüvenlik kabini içinde düzeltin. Fiksasyondan sonra her yemeği PBS ile 3x durulayın.
  5. İnsan Embriyonik Böbrek (HEK) 293 hücreleri sıvı nitrojen de saklayın. Kaplamadan önce 37 °C su banyosunda hızlı erime gerçekleştirin.
  6. Hücre kültürü ortamlarına 1 mL bazal membran matris çözeltisi ekleyin ve 37 °C'de 1 saat boyunca kuluçkaya yatırın (%5 CO2). Çözeltiyi aspire edin ve bulaşıkları hücre kültürü medyası ile yıkayın. Gerekli sayıda HEK 293 hücreyi(örn.35 mm çanak başına 100.000 hücre) plakalayın ve 2 mL hücre kültürü ortamı ekleyin. Daha sonra, 48 saat boyunca 37 °C'deki hücreleri kuluçkaya yatırın (%5 CO2).
  7. 48 saat sonra, her hücre numunesi çanağı için floresan mikrotübül sitoiskelet boyası (1x konsantrasyonu) 2 μL ekleyin ve 30 dakika kuluçkaya yatırın. Boya içeren çözeltiyi aspire edin, hücreleri 3x PBS ile yıkayın ve 2 mL hücre kültürü ortamı ekleyin.
  8. Numune yemeklerine 1 μL plazma membran boyası (10 μM konsantrasyonu) ekleyin ve 30 dakika kuluçkaya yatırın. Boya 3x içeren çözeltiyi PBS ile yıkayın ve 2 mL hücre kültürü ortamı ekleyin.
  9. Numune tabaklarına 1 μL'lik nükleik asit boyası (10 μM konsantrasyon) çözeltisi ekleyerek çekirdeği lekelayın ve 30 dakika kuluçkaya yatırın. Boya 3x içeren çözeltiyi PBS ile yıkayın ve 2 mL kültür ortamı ekleyin.

3. AFM prosedürü

  1. Bilgisayardaki yazılım simgesine tıklayarak atomik kuvvet mikroskobunu (AFM) işletim yazılımını açın.
  2. Düşük büyütme havası hedefini (önerilen 10x veya 20x) döndürmek veya eklemek için döndürün. Uç düşürme ve kalibrasyon sırasında 5 mm veya daha uzun çalışma mesafesi yararlıdır.
  3. Zaten yüklü değilse seçilen hücre örnek aşamasını monte edin. Canlı numuneler için, numuneyi istenilen sıcaklıkta tutmak için bir çanak ısıtıcı kullanın.
  4. Yarısı PBS (adım 1.2'de hazırlanmış) veya benzer berrak sıvı (kalibrasyon kabı) dolu temiz, sistem onaylı Petri kabını yükleyin. Örnek aşamasında yerleşik tokalar varsa, bunları kullanın, aksi takdirde, numuneyi stabilize etmek için vakum yağı kullanın.
  5. İstenilen veri toplama için uygun bir AFM kantilever seçin ve aşağıdaki adımları izleyerek yükleyin.
    1. Eldivenkullanarak, AFM yongamontaj aşaması, cımbız ve küçük bir tornavida kullanarak cam bloğa AFM çipi monte edin. AFM çipini dikkatlice cam bloğun üzerine yerleştirin ve ortalanmış olacak şekilde yönlendirin. Cantilever, artı AFM çipçok küçük bir kısmı, montaj bloğunun görünür, opak olmayan kısmında olmalıdır.
    2. Talaş cam blok anına kadar vidayı sıkarak vidayı tornavida ile sabitleyin. AFM cantilever doğru bir stereo mikroskop veya el spyglass kullanarak odaklı olup olmadığını kontrol edin. Gerektiği gibi ayarlayın. Bir kez düzgün odaklı, uygun yönde AFM kafasına cam blok yerleştirin ve yerine kilitleyin.
      NOT: AFM çipin cam blok içindeki yönü önemlidir, böylece sistem lazerleri kantilin arka tarafını hedefler ve fotodedektöre doğru bir şekilde yansır. Bu yordam AFM çip, cantilever veya ucu kırmak için neden olabilir yerleşim sırasında vidaları aşırı sıkmak için dikkatli olun.
  6. Konfokal mikroskobun parlak alan seçeneğini kullanarak, odak tonlarını kullanarak kalibrasyon kabının alt kısmını bulun. Bu z yüksekliğine dikkat edin, mikroskop amacına göre yemeğin alt kısmında ki değer olarak.
  7. Z step motorlarını çalıştıran bilgisayarda AFM sisteminin motor kontrol panelini kullanarak, AFM kandını numuneden 2000 μm yukarı doğru hareket ettirin.
  8. Her iki elinizi kullanarak, AFM çipli AFM kafasını numune aşamasına yavaşça yerleştirin ve AFM kafası üzerindeki dikey noktaların her birinin AFM aşamasında belirlenen oluklarda sıkıca ayarlandıklarından emin olun. AFM kafası yerleştirildikten sonra, kantilever tutucunun çanağa ne kadar yakın olduğunu görsel olarak görün. Çok yakın görünüyorsa, afm kafası temas halinde veya numune nin üst kısmından 1 mm içindeyse, AFM ucunu numuneye doğru indirmeden önce z step motorlarını kullanarak geri çekebilirsiniz.
  9. Brightfield aydınlatmakullanarak, AFM yazılımındaki z step motor kontrol panelini kullanarak AFM çipini cam çanağının altına yavaşça indirin. AFM kafasının x-y veya düzlem içi hareketini kontrol eden manuel mikrometreleri cihaz platformunda bulun. AFM kafasını, kantil görünüme geldiğinde düzelterek AFM cantilever'in görüş alanı içindeki konumunu ayarlayın.
    1. Kabın dibine göre konumu şu anda bilinmediğinden, Petri kabına AFM ucunu çarpmamak için 100 - 200 m'lik basamaklarla daha düşüktür. Tipik olarak, ucu800 - 2000 μm düşürülebilir gerekir. İpucu indirildikçe, AFM ucunun yemeğin altına yaklaştığını gösteren mikroskop yazılımı görünümünde bir gölgenin görünmesini izleyin.
    2. Artışları 20 -50 μm'ye düşürün. Confocal yazılımındaki LUTs panelini kullanarak, ucu çanağa doğru alçaldıkça kamera görüntüsünün yukarıya görünümünü (LUTs) ayarladıklarından emin olun. AFM ucunu çoğunlukla odak alana kadar küçük adımlar kullanarak indirmeye devam edin.
    3. İpucunun, genel şeklinin görüş alanı içinde görülebilmesi ve ortalanabilmesi için yeterince koyu olduğundan emin olun. Ayrıca ucun bulanık göründüğünden emin olun, bu da yemeğin alt kısmıyla henüz karşılaşmadığını doğrular.
  10. Mikroskop odaknoktasını, hedefin çalışma mesafesini göz önünde bulundurarak, ucun artık odakta olduğunu ayarlayın. Daha yüksek bir büyütme hedefine geçmeden önce, konfokal yazılımdaki ölçüm araçları paneline erişerek AFM kantilinin genişliğini ve uzunluğunu toplamak için mikroskop ölçüm aracını kullanın. Bu ölçümlere dikkat edin.
    NOT: Hedefin numune kabının altına çarpmaması önemlidir, bu da numune kabının AFM ucuyla temas kurarak ona zarar verme potansiyeline sahip olmasına neden olabilir.
  11. Varsa, lazer ışık filtresini çıkarın ve AFM lazerin açık olduğundan emin olun, böylece lazer ışığı optikte görünür hale gelir.
    1. Lazer hizalama kadranlarını kullanarak lazeri görüş alanına ve AFM ucunun yakınına taşıyın. Lazer bu konuma geldikten sonra, lazer ışık filtresini değiştirin.
    2. Lazer hizalama kadranlarını kullanarak lazeri AFM ucunun bulunduğu yerin arka tarafına yerleştirin. Bu noktada, lazer hizalama paneli 0.0 V'den büyük bir toplam sinyali okuması gerekir. Toplam sinyali elde edilmezse, ekrandaki 0,0 V'den büyük bir toplam sinyali okunana kadar el ile kontrol edilen ayna bilemini kullanarak aynayı ayarlayın.
    3. Maksimum toplam sinyali elde edilene ancak pozisyon AFM ucunda olana kadar lazeri AFM kantilinin her yönde küçük miktarlarda hareket ettirin. Lazer konumu ayarlandıktan sonra, elle kontrol edilen sapma kadranlarını kullanarak dikey ve yanal sapmayı sıfırlayın.
    4. AFM yazılımındaki lazer hizalama panelini gözlemleyin ve AFM başlığındaki dikey ve yanal sapma düğümlerini kullanarak dedektörü hedefin ortalanması (artı işaretinin ortasında ki kırmızı nokta) ve dikey veya yanal sapma olmayacak şekilde hizalayın.
  12. AFM yazılımındaki kalibrasyon penceresini açın. Tüm deneme özel bilgilerini girdiniz. Kalibre etmeden önce, oda Nından veya oda titreşimlerinden gelen olası gürültüyü azaltmak için konfokal mikroskop ışık kaynağını kapatın ve varsa AFM kasasını kapatın. Ardından sistemin ucu otomatik olarak kalibre etmesine izin vermek için kalibrasyon düğmesine basın. Kalibrasyon tamamlandıktan sonra kalibrasyon paneli nde kantilever (N/m) sertliği ve hassasiyeti (nm/V) sağlanacaktır. Daha sonraki analizler için bunlara dikkat edin.
  13. AFM kantilini step motorlarla en az 2000 μm geri çekin. AFM kafasını sahneden alın ve kalibrasyon kabını çıkarın. İstenilen hedefi döndürmek veya eklemek. Sistem hedefler arasında aynı odak düzlemini korumaya programlanmışsa, çalışma mesafesinin %10'u objektif ilerler. Bu bir yağ hedefi ise, hedefin gözüne daldırma yağı bir damla yerleştirin.
    NOT: Hedefin geri çekilmesi, yerleştirme sırasında numune çanağıyla temas eden hedefin olasılığını azaltır.
  14. Numune çanağını güvenli bir şekilde yerinde tutmak için, numune çemberinin kenarına numune halkasının kenarına küçük vakum yağı dabs uygulamak veya numune klipleri kullanmak için pamuklu bir bez kullanın. Numune yemeğini numune aşamasına dikkatlice yükleyin.
  15. Numune yerleştirildikten sonra, yemeğin iyi bir mührün yağ yoluyla numune tutucuya uygun olmasını sağlamak için birkaç kez döndürün. Yağ sadece objektif göz üzerinde fitil kadar çanak altına objektif yükseltin.
  16. Mikroskobu kullanarak, sahnede AFM kafası olmadan, görüntüleme sistemini odaklayın, böylece örnek odakta dır. Referans için bu z yüksekliğine dikkat edin.
  17. AFM kafasını platforma dikkatlice değiştirin.
  18. Z step motorlarını kullanarak, ucu örneğe doğru indirin. AFM ucu düşürülürken, brightfield görüntüsündeki görünüm tablolarını (LUTs) gerektiği gibi ayarlayın. Neredeyse keskin kadar ucu düşürün. Elle çalıştırılan AFM uç konumu mikrometrelerini kullanarak, AFM ucunun merkezde veya sol görüş alanında ortalanmış olması için AFM kafasını hareket ettirin.
    NOT: AFM'nin z yüksekliği daha önce 3.6 adımda belirtildiğinden, AFM ucunu düşürmek için daha büyük adımlar atılabilir, ancak, yemeğin altına gres ve hedefe potansiyel yağ eklenmiştir, bu nedenle bu değer sadece referans içindir. 50 - 100 μm adım atılması ve ucu n odak noktası haline geldikçe daha küçük ayarlamalar önerilir
  19. AFM başlığındaki manuel mikrometreleri kullanarak lazer konumunu hazırlayın. Gerekirse, ilgili düğümleri ayarlayarak dikey ve yanal sapmaları sıfırlayın ve örnek çanaktaki AFM kandını yeniden kalibre edin.
    NOT: Kantil, numuneden farklı bir ortamda kalibre edilmişse, kırılma indeksindeki olası bir değişikliği hesaba katmak için tarama ortamında yeniden kalibre edilmelidir. Ayrıca, lazer gürültü veya sıcaklık değişiklikleri nedeniyle kantilever arka sürüklenebilir. Sadece lazeri yeniden ayarlayın ve gerekirse yeniden kalibre edin ve temassız kalibrasyon kullanıyorsanız cam yüzeyin üzerindeki örnek çanakta. Kontak kalibrasyonu kullanıyorsanız, kalibrasyon kabının içini numune ortamını kullanarak yeniden kalibre edin.
  20. Yüksek kaliteli konfokal mikroskop görüntüleri elde etmek için, mevcut zayıflatıcı ışık filtresini tüm AFM lazer ışığını engelleyen filtreyle değiştirin. Bu ışık filtresi, AFM lazerin parlak ışığından parazit sağlamaz.
  21. Genellikle aşağı yassı bir okla gösterilen otomatik yaklaşım komut düğmesini kullanarak, ucu örnek yemeğin altına indirin. Taramanın boyutunu,çözünürlüğü, ayar noktasını, z uzunluğunu ve piksel süresini (veya kalibre edilmiş/yayılan değerleri kullanın) görüntüleme kontrol panelinde ayarlayın ve taramaya başlayın.
  22. Tama tamamlandıktan sonra, numune kabında yeni bir ölçüm konumuna geçmeden önce AFM çipi 50 –100 m yukarı kaldırın. Yeni bir konum bulunduğunda, cama yaklaşın ve 3.21 ve 3.22 adımlarını takip ederek yeniden tarayıp tekrar tatmaya başlayın.
  23. Otomatik Kaydetme seçeneğini seçin veya kaydet'e tıklayarak oluşturulan her dosyayı her bir taramadan el ile kaydedin.

4. Konfokal prosedür

  1. Confocal işletim yazılımını açın. İlişkili tüm çevre birimlerinin, ışık kaynaklarının ve denetleyicilerin açık olduğundan ve normal şekilde çalıştığından emin olun.
  2. Örneği görüntülemek için düşük büyütme (10x veya 20x) hedefini döndürün veya ekleyin. Hedefin, numune nin olacağı yerden güvenli bir çalışma mesafesinde olduğundan emin olun ve gerekirse, hedefin numuneyle olası bir çarpışmasını önlemek için hedefin geri tepmesini sağlayın. Bir pamuklu bez kullanarak, örnek çanak halkanın kenarına dab vakum gres. Bir yağ hedefi kullanıyorsanız, hedefin ön merceği üzerine tek bir daldırma yağı damlatın
  3. İstenilen örneği örnek aşamasına yerleştirin. Vakum yağının numune aşaması kesici uça sıkı bir bağ oluşturduğundan veya numune klipsleri kullandığından emin olmak için numuneyi birkaç kez döndürün. Bir yağ amacı kullanıyorsanız, yağ sadece cam alt üzerinde fitil böylece çanak altına objektif yükseltmek. Aşırı beyazlatma önlemek için, ortam aydınlatmasını en aza indirin.
  4. Kamera veya göz parçaları aracılığıyla parlaklık alanı veya epifloresan modları kullanarak, örneği bulun ve odak topuzunu kullanarak, birden fazla hücre veya tek bir hücre içeren ilgi alanına odaklanın. Genellikle optik mikroskop içindeki görüş alanı AFM sistemindeki x-y tarama penceresinden (100 x 100 μm) daha büyük olacaktır. AFM yazılımındaki motor kontrol panelini kullanarak konfokal görüş alanı içindeki AFM konumunu ayarlamaları yapın, böylece AFM taraması ve konfokal optikler aynı özellikleri görüntüleyebilir.
    NOT: Görüş alanı içinde, genellikle yalnızca birkaç hücre vardır, bu nedenle hangi hücrenin sondalamak istendiğini belirlemek daha kolaydır. AFM yürütüldüğü gibi, hücre AFM yazılımında görünür hale gelir ve buradan, kullanıcı araştırmak için belirli ilgi bölgelerini belirleyebilir.
  5. İstenirse, numunenin etiketine dayalı bir kamera veya CLSM modları kullanarak parlak alan veya epifloresan görüntüleri yakalayın, düğmeleri odakleyin ve mikroskop yazılımındaki düğmeleri yakalayın.
  6. Mikroskop yazılımını kullanarak, konfokal yetenekleri(örn.lazerler ve sonraki parametreler) etkinleştirmek için seçeneği seçin veya paneli açın. Bu seçenek genellikle lazer hattı dalga boyu değerleri ile belirtilir.
  7. Numuneleri boyamak için kullanılan boyalar için uygun lazer çizgilerini seçin. Örnekteki bu özellikleri heyecanlandırmak ve görüntülemek için bir veya birden çok lazer hattını açın.
  8. Kazancı, numune floresanını optimize eden ancak gürültü miktarını sınırlayan bir değere ayarlayın. Tipik bir başlangıç değeri 70 kazançtır.
  9. Doymuş piksellerden kaçınmak ancak dinamik aralığı en üst düzeye çıkarmak için lazer gücünü ayarlayın. Lazer gücü için tipik bir başlangıç aralığı % 1 -3'tür.
  10. Optik kesit çözünürlüğünü en üst düzeye çıkarmak için iğne deliği boyutunu 1 Havadar üniteye ayarlayın. Örnek loşsa ve lazer gücü zaten yüksekse, z ekseni çözünürlüğünü azaltma pahasına sinyali artırmak için iğne deliğini açın.
  11. Piksel çalışma süresini(yanitarama hızını) ayarlayın. 2 μs yaşam süresi ile başlayın ve gerekirse, örnek parlaklığını yansıtacak şekilde ayarlayın. Enstrümanın Nyquist seçeneği düğmesi ve görüntüdeki seçilen piksel sayısı yla hesaplamasını sağlayarak seçilen hedefiçin piksel boyutunu/tonu boyutunu seçin.
    NOT: Daha kalın numunelerde daha uzun süre kalma süreleri, z yığınları toplandığında aşırı beyazlatmaya yol açabilir.
  12. Cihazın yazılımındaki Tbm'yi seçin ve veri toplamaya başlayın.
    NOT: Cihazın birden fazla lazeri varsa, her biri bağımsız olarak optimize edilebilir ve aynı anda çoklu floresan görüntüler için çalıştırılabilir.
  13. Yakınlaştırmak ve uzaklaştırmak ve örnekteki en uygun görüş alanını bulmak için odak tonuzunu kullanın.
  14. Sistemin Yakalama düğmesini kullanarak görüntüleri yakalayın ve numunenin gerekli tüm dosya biçimlerini bilgisayarın sabit diskinde veya yerel harici sabit diskte istenilen konuma/klasöre kaydedin.
  15. Görüntüyü optimize etmek için kazancı, lazer gücünü, iğne deliği boyutunu, örnekleme hızını ve diğer değerleri buna göre ayarlamaya devam edin. Piksellerin aşırı doygun olup olmadığını kontrol etmek için piksel doygunluk dizini etkinleştirilebilir. Bu aşırı doygunluk varsa, kazanç ve lazer gücü doymuş piksel ortadan kaldırmak için rejustreed olabilir. Belirli ayarlamalar yapmak için LUT'ları kılavuz olarak kullanın.
  16. Mümkünse, görüntülerin elde edilebilen maksimum çözünürlükte toplanmasını sağlamak için, yazılımda panel veya düğme olarak görüntülenen sistemin Nyquist örnekleme hızını kullanın.
  17. Confocal sisteminin z yığınını veya görüntü hacmi toplama aracını etkinleştirin. Yalnızca bir lazer çizgisiyle, özellikle örnekteki bir özelliği en net şekilde aydınlatan lazer çizgisiyle, alttan üste seçeneği kullanarak, hacmin ölçülmesi için başlangıç ve bitiş düzlemlerini ayarlayın.
  18. Cihaz ve kullanılan lazer hattı tarafından sağlanan en iyi elde edilebilir eksenel çözünürlük için Nyquist örnekleme kriterlerini karşılamak için hesaplanan z yığınındaki düzlemler arasındaki önerilen aralığı kullanın.
  19. Birden çok lazer çizgisi kullanıldığında, aralığın hesaplanması için en kısa dalga boyunu kullanın. Edinme bittiğinde, dosyayı uygun klasöre kaydedin.
  20. Alternatif olarak, numunenin kalınlığı hakkında bir priori bilgisi varsa, en parlak ve keskin görünen orta düzlemi seçerek hacmi tanımlayın. Bu durumda, orta düzlemin üstündeki numune kalınlığının üst kısımlarını, orta düzlemin altındaki kalınlığın yarısını ayarlayın.
  21. Bu görüş alanında örnek toplama tamamlandıktan veya örnek ağartıldıktan sonra, örnekte başka bir ilgi çekici yer bulmak için motorlu veya manuel olarak kontrol edilen sahneyi kullanın ve görüntü toplama adımlarını tekrarlayın.

5. Temizleme prosedürü

  1. Hem CLSM hem de AFM'den tüm veri dosyalarının uygun konumlara kaydedilmesini sağlayın.
  2. En az 2000 m'lik z step motorlarını veya numune yüzeyine ulaşmak için kat edilen mesafeyi kullanarak AFM çipini geri çekin. AFM kafasını sahneden çıkarın ve dikkatlice dinlenme yerine yerleştirin.
  3. Mikroskop hedefini, örnekten uzak olacak şekilde geri çekin. Bir yağ hedefi kullanılmışsa, amaç, amaç ile örnek alt tabaka arasında artık temas olmayacak şekilde yeterince geri çekilmelidir.
  4. Eldivenkullanarak, numuneyi çıkarın ve varsa yağı ve varsa sıvı tabağın altından yağ temizleyin. Yeni, temiz, boş bir Petri kabı edinin ve %70 etanol çözeltisi ile doldurun. Örnek tutucuya yerleştirin ve AFM çipin 5 dakika boyunca etanol çözeltisine batırılabilmesi için AFM kafasını değiştirin.
  5. AFM çipi sırılsıklam olurken, deneme verilerini harici bir sabit diske kopyalamaya başlaman önerilir. AFM çipine etanol çözeltisine en az 5 dakika daldırmadan sonra AFM kafasını çıkarın ve dinlenme yerine koyun.
  6. Eldivenleri kullanarak, AFM talaş tutucuyu çıkarın ve montaj istasyonuna yerleştirin. Kauçuk kulplu cımbızkullanarak AFM çipi dikkatlice çıkarın. Kullanılmış ipucunu, kullanıldığını belirtmek için eksen dışına yönlendirilmiş olarak geldiği kutunun konumuna geri yerleştirin. İleride başvuru için, denemede hangi ipucunun kullanıldığını not edin.
  7. Etanol çözeltisi ile dolu Petri kabını sistemden alın ve sıvıyı ve kabı atın. Eldiven, lens temizleyicive lens mendilleri kullanarak, yağı standart protokolleri izleyerek mikroskop hedefinden nazikçe temizleyin. Herhangi bir yağ çıkararak numune tutucuyu temizleyin. Tüm atık malzemelerin ilerletme protokollerine uygun olarak imha edin ve araçları bilinen yerlere iade edin.
  8. Bilgisayardan veri toplamayı bitirin ve kapatın. Deney için kullanılan tüm aletleri, aksesuarları, çevre birimlerini veya diğer cihazları kapatın.

Representative Results

Conpokal tekniği Şekil 1A'da şematik olarak gösterilir ve kurulumun görüntüsü Şekil 1B'degösterilmiştir. Konfokal mikroskopi ile biyolojik yapıların AFM'de aynı yapılarla doğru bir şekilde bir araya gelmek için, kurulum sırasında iki sistemin hizalanması çok önemlidir. Birbirlerinin mekansal gereksinimlerine aşina saygın konfokal ve AFM üreticilerini seçin. Ayrıca, tekniğin başarılı bir şekilde uygulanması iyi boyama prosedürleri, biyolojik yapının immobilizasyonu ve AFM ipucu uygun seçim dayanır. Canlı hücrelerin yüksekliği genellikle AFM görüntüleme için bir sorun teşkil etmektedir. Yaşayan bir HEK hücresi üzerinde AFM tkişişekil 2A'dagösterilmiştir. Bu hek hücresinin yüksekliği yeşil çizgi tonu ile gösterilen 10 μm civarındaydı(Şekil 2B). Sıfır ofset (uç kantilever in en ucunda) veya hücre yüksekliği(örneğin,uç yüksekliği ≥ 10 μm) daha büyük bir AFM ucu tek tek hücrelerin son derece çözülmüş bir görüntü üretecektir. Uygun olmayan AFM uç seçimi nedeniyle kötü tarama örneği Şekil 2C'yedahildir. Bu resimde, afm piezo büyük bir hücre yüksekliği nedeniyle kapsama alanı dışında olduğunu belirten hücrenin en sonunda siyah pikseller belirdi. AFM kantilinin ucu, hücre yüksekliğine kıyasla yetersiz uç yüksekliğiyle birleşen uç ofset nedeniyle görüntüde (yuvarlak bir kare) belirdi. AFM görüntüdeki bu yapılar, hücreyi görüntülemek için farklı bir AFM ucu seçilmesi gerektiğini gösterir.

Bu yöntem için floresan boyamada etkin etiketleme ve canlı hücre görüntülemesi için doğru prob gereklidir. Şekil 3A'da gösterilen üç renkli konfokal görüntüyü nükleer bir leke (floresan mavi), mikrotübül lekesi (floresan yeşil) ve lipophilic membran lekesi (floresan kırmızı) ile gerçekleştirdik. Bu canlı hücre sondaları sınırlı spektral çakışma ve standart filtre küpleri ile uyumluluk nedeniyle seçildi. Ayrıca Şekil 3B'yebrightfield optik görüntüsünü de dahil ettik.

AFM itibaren, bir nanomekanik model ile birlikte uç girintileri analizi, yüzey bir modül haritası üretir. Şekil 4A'da hücre şeklinin 3Boyutlu rekonstrüksiyonuna (Şekil 3'tegösterilen iki hücre) hertz model fit ve parabolik profil (yarıçap 8 nm) kullanılarak oluşturulmuş bir modül haritası örneği gösterilmiştir. Lazer konfokal z yığınının karşılık gelen 3B projeksiyonu Şekil 4B'degösterilmiştir.

Bu yöntem, mikro ve nanoskobik özellikleri ışık mikroskobu kullanılarak çözülmesi zor olan tek bakteriler de dahil olmak üzere daha küçük biyolojik yapılar için de uygundur. Devam eden bir çalışmada Streptococcus mutans.74 Hücre duvarı bileşenlerinin manipülasyonu morfolojisi ve antibiyotik direnci değişikliklere neden hücre duvarı içinde antibiyotik direnci etkileyen mekanik mekanizmaları keşfetmek için Conpokal tekniği kullanır. Conpokal, hücre duvarı bileşenlerinin varlığı veya yokluğu ile aynı hücre örneklerinde canlı, in-solution, veri toplamayı(örn.yüzey morfolojisi, elastik modül, yapışma mukavemeti ve yüzey pürüzlülüğü) çift mekanik özelliklere kolaylaştırır. Şekil 5A,B, Streptococcus mutans bakterisinin AFM tkişive ölçülen modül haritasını içerir. Bu ölçekte AFM ile geleneksel konfokal mikroskopiye göre daha iyi çözünürlük elde edilmiştir.

Şekil 6, hücre duvarına takılan yeşil floresan hücre yapısı lekesi ile boyanmış Enterococcus faecalis kolonisinin konfokal görüntüsünü içerir. Şekil 5 ve Şekil 6, Ökaryotik hücrelere ek olarak Conpokal tekniğinin mikroplara uygulanabilirliğini göstermektedir.

Figure 1
Şekil 1: Conpokal kurulumu.
(A) Conpokal tekniği şeması. (B) Alet kurulumunun görüntüsü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Canlı hücrelerin atomik kuvvet mikroskobu.
(A) İki HEK hücresinin AFM görüntüsü. (B) Bir HEK hücresinin yükseklik profili (A'daki yeşil çizgi) hücre yüksekliğinin 10 μm'de oldukça büyük olduğunu gösterir. (C) AFM piezo hücrenin apeks aralığında olduğu bir astrosit hücrenin zayıf AFM görüntüsü ve cantilever sonunda ters görüntüleme kanıtıdır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Canlı hücrelerin konfokal ve brightfield mikroskobu.
(A)Nükleer bir leke (floresan mavi), mikrotübül lekesi (floresan yeşil) ve lipophilic membran lekesi (floresan kırmızı) ile boyanmış yaşayan HEK hücrelerinin lazer tarama konfokal mikroskobu. (B) Karşılık gelen brightfield optik görüntü. Kireç çubukları 10 μm'dir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: AFM'nin 3Boyutlu görüntülemelerinin ve yaşayan HEK hücrelerinin konfokal mikroskopisinin karşılaştırılması.
(A) Modül haritası, AFM'den hücrenin 3Boyutlu rekonstrüksiyonuna kaplanmış uç şekli için Hertz modeli fit ve parabolik profil (8 nm yarıçapı) kullanılarak oluşturulmuştur. (B) Nükleer bir leke (floresan mavi), mikrotübül lekesi (floresan yeşil) ve lipophilic membran lekesi (floresan kırmızı) ile lazer konfokal z yığınıkarşılık gelen 3D projeksiyon. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Bakteri örneğinin AFM'si.
(A) AFM tkişi ve (B) ölçülen bir Streptococcus mutans bakterisinin modül haritası. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6: Bakteri örneğinin konfokal mikroskopisi.
Yeşil floresan membran lekeile Enterococcus faecalis bir koloni konfokal görüntü. Ölçek çubuğu 5 μm'dir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Conpokal sıvı bir ortamda canlı biyomalzemelerin yüksek kaliteli görüntüleri ve yerinde mekanik özellikleri toplamak için gelişmiş, etkili bir tekniktir. Olağanüstü morfoloji ve topografya görüntülerini canlı numune mekanik özellikleriyle birleştirebilme yeteneği tipik elektron ve ışık mikroskobu tekniklerini geride kılmaktadır. Ayrıca, bir konfokal mikroskop örneklerin yüksek kaliteli, ayrıntılı floresan görüntüleri elde etmek için parlak alan, epifloresan ve lazer tarama konfokal yetenekleri sağlar. Bir AFM mekanik karakterizasyon sağlar, ancak yardımcı optik olmadan örnek gezinmek zor laşır. İki sistem biraraya getirildiğinde, kullanıcı deney sırasında aynı hücrenin hem görüntülerini hem de mekanik özelliklerini toplayabilir, bu da iki ayrı alete göre büyük bir avantajdır. Bu makalenin amacı, biyoloji, mühendislik ve sağlığın geleceği için birleştirilmiş Conpokal sisteminin geniş yetenekleri hakkında kullanıcıları bilgilendirmek ve yönlendirmektir. Protokol, enstrümanların hazırlanmasını, kültür ortamını, yemekleri, mikroorganizmaların seçimini, AFM prosedürünü, konfokal prosedürü ve temizliği içerir. Başarılı bir canlı, in-çözüm için en kritik adımlar, Conpokal oturum örnek immobilizasyon, akıllıca uç seçimi ve canlı leke yürütme vardır. Bu makalenin tartışma bölümünde kültür önerileri, sorun giderme ipuçları ve operasyonel yönergeler ve Conpokal tekniği için gelecekteki çalışmalar ayrıntılı olacaktır. Kültür önerileri örnek kültür, immobilizasyon ve boyama konusunda rehberlik kapsayacaktır. AFM, confocal ve Conpokal ipuçları ve yönergeleri ipucu seçimi ve kalibrasyonu, çözünürlük, sınırlamalar ve yakın eşzamanlı çalışma tartışacaktır. Gelecekteki çalışmalar, olası araştırma yollarının görünümünü ve potansiyelini içerir.

Protokol, hem canlı hücre hem de sabit bakteri örneklerinin kültürünü, sondasını ve görüntülemesini kapsamaktadır. Sıvı içinde AFM iletildiğinde bir sorun, numune engeli ve hidrodinamik sürükleme nedeniyle cantilever hareket tıkanıklığı ndan kaynaklanır. Numune substrata iyi yapışmazsa, numunenin sıvı içinde yüzen bölümleri tarafından kantilin kirlenme potansiyeli vardır. Bu durumda, numunenin elastik yapışma ve mikromekanik özelliklerinin bir varsayımı olduğu için ölçümler tehlikeye girer. HEK hücreleri fiksatif ile tedavi edilmedi, ancak, S. mutans ve E. dışkı ek immobilizasyon gerektirir, diğer prokaryotik hücrelere benzer. Seçilen bakteriler hücre sondalama ve görüntüleme engel aktif hareket gösterdi, bu nedenle, örnekler yavaşça, kimyasal immobilizasyon teşvik etmek için sabit edildi. Tek tek hücreleri gözeneklerde fiziksel olarak hapseden filtre membranları gibi kimyasal fiksasyona alternatifler vardır75.

İpucu seçimi, AFM'nin kurulumu ve çalışması için de kritik bir bileşendir. Biyomalzemenin deformasyonuna dayalı mekanik özellikler arandığında, önemsiz olmayan bir görev olan kantilever sertliği ve malzeme sertliği uyumluluğu göz önünde bulundurulmalıdır. Ana hedefi en iyi seçilen cantilever sertliği ile malzemenin sertlik maç etmektir. Eğer cantilever örnekten çok daha yumuşaksa, çok fazla sapmaya maruz kalır. Eğer cantilever örnekten daha sertse, AFM dedektörü bu kadar küçük sapmaları yakalayamayabilir. Uygun bir AFM kantili seçerken, deneysel uygulamaya göre seçim yapmak önerilir. Aralıklı temas modunda ayrıntılı görüntüler toplamak için, 5 nm - 100 nm içinde sertlik ve uç yarıçapı için 0,1 - 0,3 N/m aralığında ki AFM ipuçları canlı hücre görüntülemesi için etkilidir. Küçük konik ipuçları önerilir. Keskin ipuçları küçük bir temas alanı ve örnekmorfolojisi 76küçük ayrıntıları ve özellikleri toplama daha fazla yardımcı girinti yeteneği sağlar. Ancak, ayarlar(örneğin,ayar noktası, piksel zamanı, yaklaşma hızı) çok fazla girintinasyon gerektirdiğinde veya girintinçok hızlı olduğunda, keskin ipuçları da numuneleri delmeye yatkın olduğundan sorunlu olabilir. Yüksek gerinim hızı etkileri önlemek için, keskin bir ucu yakınında yerel gerinim sertleşme, ya da sadece temas alanı ve yaklaşma hızını kontrol etmek için, birçok elastik bir modül ölçmek için bir kolloidal ucu ile kuvvet spektroskopisi kullanmayı tercih.

Canlı hücrelerin elastik modülerliğini ölçmek için 1 - 5 m'lik sertlik ve uç yarıçapı için 0,01 - 1,0 N/m aralığındaki AFM uçları önerilir. Büyük uç boyutları, genellikle cam kolloidler, bilinen bir temas alanı sağlamak ve temas halinde iken hücre delmek olası değildir. Dikdörtgen kantiller üçgene göre tercih edilir, çünkü kalibrasyon sırasında üçgen geometriler için temas tabanlı kalibrasyona göre dikdörtgen geometri için temassız yöntem kullanılabilir. Ayrıca, AFM ipuçlarının hassas doğası nedeniyle, operatörün hassas AFM çipe veya montaj bloğuna zarar verme potansiyelini azaltmak için cımbız ları kauçuk uçlu şekilde uygulaması önerilir. Akılda tutulması gereken diğer parametreler arasında AFM ucunun yaklaşma hızı ve numuneye girintisi miktarı yer alır. İyi bir kılavuz, numunenin kalınlığının (veya yüksekliğinin) yaklaşık %10'una girintiyi tutmak ve38cantilever'in yaşadığı potansiyel hidrodinamik direnci engelleyen bir hız seçmektir.

Karmaşık deneysel araçlar genellikle alet kurulumu, kalibrasyonu ve işletiminde sorun giderme gerektiren engellerle birlikte gelir. AFM ucunu veya cantilever'i örnek veya örnek alt tabakaya çarpmak yeni kullanıcılar için yaygın bir hatadır. Bu sorunu önlemek için, protokol 2000 μm dışarı cantilever destek önerir. Bu adım, önceki kullanıcı denemeden sonra temizlik yaparken ucu geri çekmeyi unutmuşsa, ucun yemeğin alt kısmıyla temas olmamasını sağlar. Ancak, bu protokolde kullanılan seçili çanak tutucu için 2000 μm mesafe seçilmiştir. Kullanılan çanak tutucu stiline bağlı olarak daha büyük veya daha küçük farklı bir aralığın seçilmesi gerekebilir. Lazer ve dedektörün hizalanması sırasında protokol, toplam sinyalini en üst düzeye çıkarmak için bir ayna tonunun ayarlanmasından bahseder. Tüm AFM'lerde ayna ayar ı snob olmayabilir. Ancak, düşük toplamlı bir sinyali gidermek için aleti manipüle etmenin bir yolu, taramanın gerçekleşeceği ortamı hesaba katmak için kullanılan ayna tonuzunu ayarlamaktır; sıvı(örn.su, ortam, PBS) veya hava. Hava ve sıvı yoluyla ışık kırılma indeksindeki fark nedeniyle, ayna knob ayarlanması gerekebilir. AFM kantilinin maksimum bükme hassasiyeti AFM ucunun bulunduğu yerde olacaktır, bu nedenle, bir fotodiyot üzerine yerleştirilmesi yle bükme pozisyonunu döndüren lazer ışığı, AFM ucunun bulunduğu yerde bulunmalıdır. Seçilen AFM ucuna bağlı olarak, toplam sinyal değeri 0,3 - 3,0 V arasında değişebilir. Cr-Au veya Al gibi AFM kantilinde bir arka cephe kaplaması toplam sinyalini ve ölçümün hassasiyetini artıracaktır.

AFM işlemi sırasında uç kalibrasyonu tamamlanırken uç geometrisi uygundur. Temassız ve temaslı kalibrasyon arasında iyi bir anlaşma gözlenmiştir. Seçilen AFM kantilever dikdörtgen değilse, kontak kalibrasyonu yapılmalıdır. İpucunun kalibre edildiği ortamın numune ortamıyla aynı olması gerektiğini unutmayın. Bu sıvılar farklıysa, kullanıcı yeniden kalibre etmelidir. AFM ipuçları sıvı olarak kullanırken, sistem tarafından ölçülen frekans, üretici tarafından belirtilen doğal rezonans frekansının dörtte biri ila üçte biri olmalıdır. Sistemin ucu doğru şekilde kalibre olup olmadığını kontrol etmek için iyi bir yol oluşturulan termal gürültü dosyası içindeki değerleri doğrulamaktır. Bu dosyanın uygun klasöre kaydeddiğinden emin olun. Sistem de kalibrasyonda sorun yaşıyorsa veya olası olmayan değerler ortaya çıkıyorsa, lazer konumunu biraz daha kalibre edin veya ayarlayın.

Düşük toplam sinyalinin bir diğer nedeni de AFM cantilever hizalanmasından kaynaklanıyor olabilir. AFM çipi cam bloğa monte edildiğinde, kantilin ucunun küçük lazer pencere (düz cam alan) içinde kalması esastır. Çip çok ilerideyse, kantilin doğal olarak dayandığı açı, kantilin in yansımasıile ilgili bir soruna neden olabilir, fotodedektörü kaçırAbilir ve toplam sinyali zayıfolabilir. Çip çok geri ise, lazer kantilever arka kapalı yansıtmak mümkün olmayacaktır, kötü toplam sinyali neden. Bu nedenlerden dolayı, monte edilmiş AFM çipin ayarlanması gerekebilir. Ayrıca, karşılaşılabilecek başka bir sorun örnek yüksekliği ile oluşur. Bu protokolde kullanılan AFM cihazı maksimum piezo z aralığına (yükseklik) 15 μm'dir. Bir kullanıcı, yazılımın belirli bir pikseldeki yükseklik verilerini ve kuvvet haritalarını toplayamadığını tespit ederse, sistemin kapsama alanı dışında olduğunu gösteren bir kara kutu görüntülenir(Şekil 2C). Bu sorunu çözmenin bir yolu piezo yüksekliğini 2 veya 3 m gibi daha düşük bir değere ayarlamaktır, böylece 15 m aralığının çoğu hücrenin beklenen yüksekliğini eşlemeye kendini adamıştır. Bu teknik, çoğu hücre veya bakteri ile ilgili deneylerde, z aralığı ile ilişkili sorunu gidermek gerekir.

Yükseklikleri 10 -15 μm'den büyük olan uzun numuneler için genişletilmiş z aralığı gerektiren deneyselcilerin AFM üzerinde ek bir modül izlemesi gerekebilir. AFM üreticileri, çoğu sistem için ek maliyetlerle bu seçeneği sunar. Z aralığını genişleterek, deneyci, mikro ölçekte uzun olduğu düşünülen numuneleri, aralık dışı değerler veya AFM piezo motor modifikasyonu için çok az sorunla taramaya hazırdır. Bu modüller ekstra maliyet rağmen, bazı, üreticiye bağlı olarak, ek yükseklik sunabilir, z yönünde 100 μm kadar. Kullanıcı uzun bir çalışma mesafesi, yüksek büyütme hedefi veya bir hava hedefi, belki 20x veya 40x kullanmak isteyen varsa Konfokal hala uzun örnekler ile mümkündür. Mikroskop nesnel büyütme düşürerek, çalışma mesafesi artar, uzun bir örnek apeks görüntülemek için mesafe kazanıyor. Daha düşük bir büyütme hedefine yapılan bu değişiklik çözümden fedakarlık edecektir. Bu el yazmasında bahsedilen Conpokal kurulumda, 60x TIRF (toplam iç yansıma floresansı) hedefi, cam dipli numune kabının kapağını 100 μm'ye yakın bir çalışma mesafesine sahiptir.

Bu el yazmasında bahsedilen konfokal mikroskop ile ilgili olarak birkaç önemli şart tartışılmıştır. Bu el yazmasında yer alan rakamların üretiminde kullanılan konfokal sistem, 1.49 sayısal diyafram açıklığı ile 60x TIRF yağ amacını hayata geçirmiştir. Şekil 3 ve Şekil 4'tegösterilen canlı hücre örnek görüntülemesi için 405 nm, 488 nm ve 561 nm uyarma dalga boylarında lazer çizgileri kullanılmıştır. Konfokal mikroskobun kırınım sınırı Abbe Çözünürlük denklemi, Abbe Çözünürlük(x,y) = λ/2NA kullanılarak belirlenebilir, burada λ Alexa 488 için uyarma dalga boyu 488 nm, ve NA confocal kondansatör için sayısal diyafram, 0.3 olan. Bu nedenle 272 nm eksenel çözünürlük belirlenir. Epifloresan görüntüleme için, iğne deliğinin bir havadar birim (AU) ve 0.5 AU olarak ayarlandığı çözünürlüğü belirlemek için iki olgu dikkate alınır. İkinci durumda, iğne deliği önemli ışık kaybı oluşur gibi kapatılır, ancak çözünürlük artar. Konfokal yazılım, 0,5 AU'da iğne deliği için 170 nm ve 290 nm, 1 AU'daki iğne deliği için 200 nm ve 370 nm'de yanal yerli ve eksenel çözünürlükleri hesaplar. Sisteme getirilen küresel sapmalar, mikroskop görüntülerinde kontrastı ve çözünürlüğü artırmak için bir dekonvolution işlemi ile hesaplanabilir. Konfokal mikroskoplar ile doğasında olan kırınım sınırlamaları nedeniyle, Şekil 6'daki bakteri kolonisinin konfokal görüntüsü, Şekil 5'tekibakterilerin AFM tararsında görülen ayrıntı için eşleşen çözünürlüğe sahip değildir. AFM, konfokal mikroskopla yakalanması zor nano ölçekli özelliklere ve ayrıntılara erişim sağlar. Ancak, gerekli floresan çözünürlüğüne bağlı olarak Şekil 5 ve Şekil 6, Conpokal tekniğinin ökaryotik hücrelere ek olarak mikroplara uygulanabilirliğini göstermektedir.

Konfokal mikroskop kullanmanın bir avantajı, operatörün belirli bölgelerin 3Boyutlu görüntülerini keskinleştirilmiş ayrıntılarla bir örnekte toplamasına olanak tanır. Bu görüntüler, AFM görüntüsü ve aynı bölgenin konfokal tonu ile incelenen yüzeyi görüntüleyerek AFM ile ilişkilidir. Mikroskop ters çevrildiğinden, epifloresan görüntüsü incelenen numunenin karşı tarafından ışık bilgileri toplar. Konfokal sistem içindeki iğne deliği, numunenin geri kalanından ve hatta odadan gelen ışığı filtrelerken belirli bir mesafeden tek bir düzlemle sınırlanmasına yardımcı olur. Esasen, iğne deliği numunedeki tek ilgi düzleminden gelen ışığı izole etmeye yardımcı olur. Tipik olarak, bu ilgi düzlemi güçlü florofor belirteçleri içermelidir, çünkü ters konfokal sistemler için, tek molekül algılama yüksek çözünürlüklü konfokal mikroskoplarla sınırlı olacaktır. Epifloresan aydınlatma, epifloresan görüntüleme modunda, hedefe yansıyan örnekherhangi bir ışık toplanır ve görüntü oluşturmak için kullanılan, bu nedenle, tek bir düzlem izole etmek imkansız olması nedeniyle daha az arzu edilir. Konfokal teknikler iğne deliği77nedeniyle söz konusu örnek özelliğinin daha izole tek düzlem görüntüsü sağlar. Örneğin, ökaryotik bir hücrenin apeksi AFM tarafından incelenirse, aynı yüzey epifloresan görüntüleme modu yerine mikroskobun lazer tarama konfokal yetenekleri yle izole edilebilir. İletilen ışık dedektörü ve 488 nm lazer hattı yardımı ile diferansiyel girişim kontrast modunda eş zamanlı görüntüleme yoluyla veri toplama sırasında hücrelerin sağlık / şekil izlemek için tavsiye edilir. Yukarıda ayrıntılı olarak belirtilen işlem için numunenin bir z yığınını yakalarken, yalnızca dedektörün kazancı ayarlanır. Ölçüm sırasında hücrelerdeki herhangi bir morfolojik değişim, floresan kanallarda mutlaka görülemeyecek, objelerin ölçüme dahil edildiğini gösterir.

Görüntüleme tekniğinde kullanılan en kısa dalga boyu için yazılım önerisi izleyerek düzlemler arasında ideal aralık elde edilebilir. Yerel çözünürlük ve görüntü hacimlerinde gürültü oranı sinyali, edinme yazılımının görüntü işleme modülünde bulunan deconvolution algoritmaları ile etkin bir şekilde geliştirilebilir. Ancak, floresan mikroskopi, belirli lekeler ve boyalar seçimi erken set beyazlatma veya örtüşen uyarma / emisyon spektrumları crosstalk önlemek için hayati önem taşımaktadır. Zaman zaman, bir kullanıcı konfokal ışık üretiminde bir arıza yaşayabilir. Bir kullanıcı ışık emisyon eksikliği veya arızalı lazer hatları yaşıyorsa, sorun giderme nin bir yolu, genellikle işletim yazılımını yeniden başlatarak yapılan sistemi sıfırlamaktır. Sorun devam ederse, iletilen ışık dedektörü ışık mikroskobunun optik yolu içinde yer inip çıkamamış olabilir. Verici dedektörünün konumunun sıfırlanması ışık toplama veya lazer görüntüleme sorunlarını hafifletmeye yardımcı olabilir.

Conpokal enstrümanın odak noktası, kullanıcılara sıvı bir ortamda, aynı anda ve aynı hücre veya özellikte canlı biyomalzemeler hakkında optik ve kuvvet edayalı bilgi toplama olanağı sağlamaktır. Bu çalışma, birçok biyomalzeme için doğal bir ev olan sıvıda bu deneylerin nasıl yapılacağını açıkça açıklamaktadır, ancak, kuru deneyler hala enstrümantasyon kullanılarak yapılabilmektedir. Petri kaplarında hazırlanan numunelerle çanak yüksekliği bir sınırlamadır. AFM kantilini tutan cam bloğun konfigürasyonu nedeniyle, tabakların yan duvarları yüksekliği 10 mm'nin altında olmalıdır; çanak çok uzunsa, alet AFM ucunu numunenin veya substrat yüzeyine indiremez.

Örnek boyutu için bir sınırlama olmasına rağmen, bir zaman gecikmesi ile ilgili olarak araç veya yazılım yetenekleri ile herhangi bir sınırlama yoktur. Doğru faktörler yerinde olmak ile eşzamanlı konfokal ve AFM mümkündür. Yakın eşzamanlı yeteneğine katkıda bulunan sınırlama, belirli konfokal mikroskopi fonksiyonları ve atomik kuvvet mikroskopi işlevlerini aynı anda gerçekleştirirken oluşan gürültüyü ifade eder. Z destesinin toplanması sırasında mikroskop hedefini hareket ettiren motorlardan gelen titreşimler, hareket sırasında AFM prob ucundan gelen sinyale eklenir. Motorlar numunedeki sıralı düzlemleri aydınlatmak için z yönünde yukarı ve aşağı hareket ettikçe gürültü bir yağ hedefi tarafından geliştirilecektir. Bu nedenle, önerilen protokol AFM taramaları ve confocal z yığın görüntüleri sırayla toplama içerir. Eşzamanlı CLSM ve AFM konfokal ile sabit görüntüleme gerektirir, ancak, mevcut teknik ile, iki enstrüman için gecikme süresi olarak on saniye onlarca kısa olabilir. Şekil 2A ve Şekil 4B'detoplanan görüntüler için AFM operasyonundan konfokal görüntülemeye geçiş için gerçek süre 2 -4 dakika civarındaydı. Bu değer, afm taraması nın başlama ve tamamlama süresini içeren toplam 33 dakikalık süreden iki görüntü toplama süresi çıkarılarak belirlendi, konfokal görüntülemeyi etkinleştirmek için enstrüman modlarını değiştirdi ve konfokal görüntü z yığınını başlatıp tamamladı.

Conpokal'ın geleceği, tek hücreli süreçlerin keskin içgörüsünün yanı sıra yeni yapı-işlev ilişkilerini de keşfetmeyi amaçlamaktadır. Örneğin, hücre elastikiyetinin etkilerini belirlemek için hücre veya bakteri örnekleri üzerinde yerinde ilaç tedavileri deney biyomalzemeler, biyoloji ve biyomekanik alanlarında bir ilerleme olacaktır. Görüntüleme ve probing sırasında örnek çanak içine tedavi tedavisi, zaman içinde, canlı ve dikkatle kontrol edilen bir ortamda, örnek terapötik yanıt nasıl bilgi sağlayacaktır. Yeni bir ilaç veya çevresel sorun içeren sitoiskelet veya organel konumu lokomotif, topoloji, sertlik, vb nasıl etkilediğini anlayışını genişletmek olacaktır. Conpokal'ın bir diğer potansiyel ilerlemesi de sistemin tam çevresel kontrolüne sahip olabilmesidir. Bu protokolde bahsedilen mevcut Conpokal, laboratuvarın içinden gelen gürültüyü azaltmak için tasarlanmış bir akustik muhafazanın içinde yer almaktadır. Bu gövdenin ilerlemesi, steril bir ortam, sıcaklık kontrollü ve hatta değişken yerçekimi gibi faktörlerin bir veya bir arada, içinde test etmek için yeteneği sağlayacaktır. Conpokal yöntemi canlı, sıvı içi biyomateryalleri karakterize etmek için etkili ve yararlı bir yaklaşım sağlar, ancak tekniğin geleceği bu yetenekleri daha da ilerletecektir.

Disclosures

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan.

Acknowledgments

P20GM130456 numarası altında NIH COBRE finansmanını kabul ediyoruz. Araştırmadan Sorumlu Başkan Yardımcısı tarafından desteklenen Birleşik Krallık Işık Mikroskobu Çekirdeği'ne bu çalışmadaki yardımları için teşekkür ederiz. S. mutans ve E. faecalis suşları Dr Natalia Korotkova tarafından sağlanmıştır. Conpokal' ın confokal mikroskopi ve atomik kuvvet mikroskobu kombinasyonunu tanımlamak için ilk kez kentucky Üniversitesi' nden Dr. Brad Berron' a atfedilir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acoustic Enclosure JPK-Bruker Acoustic Enclosure Chamber used to mitigate noise
BioTracker 488 Green Microtubule Cytoskeleton Dye Millipore Sigma SCT142 Used to label microtubules in mammalian cells
CP-qp-CONT-BSG AFM tips NanoAndMore CP-qp-CONT-BSG-B Collodial AFM tips good for modulus measurements on biological samples
Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3))) ThermoFischer Scientific D282 Used to label plasma membrane of mammalian cells
Dulbecco's Modified Eagle Medium VWR VWRL0100-0500 Component of cell culture media
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline ThermoFisher Scientific A1285601 Used to simulate biological environment
Fetal Bovine Serum Fischer Scientific 45000-736 Component of cell culture media
Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: Yeast Extract Fischer Scientific BP1422-500 Component of bacterial culture medium
FluoroDish Cell Culture Dish World Precision Instruments (WPI) FD35-100 Glass-bottomed dishes whose side walls are less than 10 mm, necessary for full function of Nanowizard 4a AFM
Hoechst 33342 nucleic acid stain ThermoFischer Scientific 62249 Used to label nucleus of mammalian cells, a good nuclear marker for live cells
Human embryonic kidney 293 cells ATCC Global Bioresource Center CRL-1573 Mammalian cells used in protocol
Matrigel VWR 47743-716 Coating in cell culture dish
Model: PFQNM-LC-A-CAL AFM tips Bruker PFQNM-LC-A-CAL AFM tips that work well for samples that have large heights (such as eukaryotic cells)
NanoWizard 4a JPK-Bruker NanoWizard 4a AFM
Nikon A1 Laser Scanning Confocal Microscope Nikon A1 HD25 Microscope used for brightfield, epi-fluorescence, and confocal imaging
PENICILLIN/STREPTOMYCIN VWR 16777-164 Component of cell culture media
PetriDishHeater JPK-Bruker PetriDishHeater Maintains desired Petri dish sample temperature
qp-BioAC-Cl AFM tips Nanosensors qp-BioAC-Cl-10 Three different AFM cantilevers of varying stiffness
Replaceable Carbon Fiber Tip Tweezers Ted Pella Inc. 5051 Used to carefully place and remove delicate AFM tips into the glass mounting block
Todd Hewitt Broth Bacto BD DIFCO Bacterius Ltd Bacto-249240 Component of bacterial culture medium
Vancomycin, BODIPY FL Conjugate Thermo Fisher Scientific V34850 Used to fluorescently label bacterial cell wall

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Butt, H. J., Pham, J. T., Kappl, M. Forces between a stiff and a soft surface. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 27, 82-90 (2017).
  2. Pham, J. T., Schellenberger, F., Kappl, M., Butt, H. J. From elasticity to capillarity in soft materials indentation. Physical Review Materials. 1 (1), 015602 (2017).
  3. Lee, G. Y. H., Lim, C. T. Biomechanics approaches to studying human diseases. Trends Biotechnology. 25 (3), 111-118 (2007).
  4. Qiu, H., et al. Short Communication: Vascular Smooth Muscle Cell Stiffness As a Mechanism for Increased Aortic Stiffness With Aging. Circulation Research. 107 (5), 615-619 (2010).
  5. Glenister, F. K., Coppel, R. L., Cowman, A. F., Mohandas, N., Cooke, B. M. Contribution of parasite proteins to altered mechanical properties of malaria-infected red blood cells. Blood. 99 (3), 1060-1063 (2002).
  6. Suresh, S., et al. Connections between single-cell biomechanics and human disease states: gastrointestinal cancer and malaria. Acta Biomaterialia. 1 (1), 15-30 (2005).
  7. Nash, G. B., Johnson, C. S., Meiselman, H. J. Mechanical properties of oxygenated red blood cells in sickle cell (HbSS) disease. Blood. 63 (1), 73-82 (1984).
  8. Trickey, W. R., Lee, G. M., Guilak, F. Viscoelastic properties of chondrocytes from normal and osteoarthritic human cartilage. Journal of Orthopedic Research. 18 (6), 891-898 (2000).
  9. An, S. S., Fabry, B., Trepat, X., Wang, N., Fredberg, J. J. Do Biophysical Properties of the Airway Smooth Muscle in Culture Predict Airway Hyperresponsiveness. American Journal of Respiratory Cell and Molecuar Biology. 35 (1), 55-64 (2006).
  10. Suresh, S. Biomechanics and biophysics of cancer cells. Acta Materialia. 55 (12), 3989-4014 (2007).
  11. Rebelo, L. M., de Sousa, J. S., Mendes, J., Radmacher, M. Comparison of the viscoelastic properties of cells from different kidney cancer phenotypes measured with atomic force microscopy. Nanotechnology. 24 (5), 055102 (2013).
  12. Cross, S. E., Jin, Y. S., Rao, J., Gimzewski, J. K. Nanomechanical analysis of cells from cancer patients. Nature Nanotechnology. 2 (12), 780-783 (2007).
  13. Remmerbach, T. W., et al. Oral Cancer Diagnosis by Mechanical Phenotyping. Cancer Research. 69 (5), 1728-1732 (2009).
  14. Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nature Reviews Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).
  15. Yallapu, M. M., et al. The Roles of Cellular Nanomechanics in Cancer. Medical Research Reviews. 35 (1), 198-223 (2015).
  16. Fabry, B., et al. Scaling the Microrheology of Living Cells. Physical Review Letters. 87 (14), 148102 (2001).
  17. Ingber, D. E., Prusty, D., Sun, Z., Betensky, H., Wang, N. Cell shape, cytoskeletal mechanics, and cell cycle control in angiogenesis. Jouranl of Biomechica. 28 (12), 1471-1484 (1995).
  18. Svoboda, K., Block, S. M. Biological Applications of Optical Forces. Annual Reviews of Biophysics and Biomolecular Structures. 23 (1), 247-285 (1994).
  19. Dao, M., Lim, C. T., Suresh, S. Mechanics of the human red blood cell deformed by optical tweezers. Journal of the Mechicanics and Physics of Solids. 51 (11-12), 2259-2280 (2003).
  20. Thoumine, O., Cardoso, O., Meister, J. J. Changes in the mechanical properties of fibroblasts during spreading: a micromanipulation study. European Biophys with Biophyics Letters. 28 (3), 222-234 (1999).
  21. Reynolds, N. H., et al. On the role of the actin cytoskeleton and nucleus in the biomechanical response of spread cells. Biomaterials. 35 (13), 4015-4025 (2014).
  22. Jones, W. R., et al. Alterations in the Young’s modulus and volumetric properties of chondrocytes isolated from normal and osteoarthritic human cartilage. Journal of Biomechics. 32 (2), 119-127 (1999).
  23. Radmacher, M., Fritz, M., Kacher, C. M., Cleveland, J. P., Hansma, P. K. Measuring the viscoelastic properties of human platelets with the atomic force microscope. Biophysics Journals. 70 (1), 556-567 (1996).
  24. Ketene, A. N., Roberts, P. C., Shea, A. A., Schmelz, E. M., Agah, M. Actin filaments play a primary role for structural integrity and viscoelastic response in cells. Integrative Biology. 4 (5), 540-549 (2012).
  25. Ketene, A. N., Schmelz, E. M., Roberts, P. C., Agah, M. The effects of cancer progression on the viscoelasticity of ovarian cell cytoskeleton structures. Nanomedicine-Nanotechnology. 8 (1), 93-102 (2012).
  26. Darling, E. M., Topel, M., Zauscher, S., Vail, T. P., Guilak, F. Viscoelastic properties of human mesenchymally-derived stem cells and primary osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes. Journal of Biomechics. 41 (2), 454-464 (2008).
  27. Henderson, E., Haydon, P., Sakaguchi, D. Actin filament dynamics in living glial cells imaged by atomic force microscopy. Science. 257 (5078), 1944-1946 (1992).
  28. Rotsch, C., Radmacher, M. Drug-Induced Changes of Cytoskeletal Structure and Mechanics in Fibroblasts: An Atomic Force Microscopy Study. Biophysics Jouranl. 78 (1), 520-535 (2000).
  29. Darling, E. M., Zauscher, S., Guilak, F. Viscoelastic properties of zonal articular chondrocytes measured by atomic force microscopy. Osteoarthritis Cartilage. 14 (6), 571-579 (2006).
  30. Lekka, M., et al. Local elastic properties of cells studied by SFM. Applied Surface Science. 141 (3-4), 345-349 (1999).
  31. Li, Q. S., Lee, G. Y. H., Ong, C. N., Lim, C. T. AFM indentation study of breast cancer cells. Biochemical and Biophysical Research Communication. 374 (4), 609-613 (2008).
  32. Rother, J., Noding, H., Mey, I., Janshoff, A. Atomic force microscopy-based microrheology reveals significant differences in the viscoelastic response between malign and benign cell lines. Open Biology. 4 (5), 140046 (2014).
  33. Nalam, P. C., Gosvami, N. N., Caporizzo, M. A., Composto, R. J., Carpick, R. W. Nano-rheology of hydrogels using direct drive force modulation atomic force microscopy. Soft Matter. 11 (41), 8165-8178 (2015).
  34. Raman, A., et al. Mapping nanomechanical properties of live cells using multi-harmonic atomic force microscopy. Nature Nanotechnology. 6 (12), 809 (2011).
  35. Caporizzo, M. A., et al. Strain-rate dependence of elastic modulus reveals silver nanoparticle induced cytotoxicity. Nanobiomedicine. 2, 9 (2015).
  36. Corbin, E. A., Kong, F., Lim, C. T., King, W. P., Bashir, R. Biophysical Properties of Human Breast Cancer Cells Measured Using Silicon MEMS Resonators and Atomic Force Microscopy. Lab Chip. 15 (3), 839-847 (2014).
  37. Moreno-Flores, S., Benitez, R., Vivanco, M. D., Toca-Herrera, J. L. Stress relaxation and creep on living cells with the atomic force microscope: a means to calculate elastic moduli and viscosities of cell components. Nanotechnology. 21 (44), 445101 (2010).
  38. Grady, M. E., Composto, R. J., Eckmann, D. M. Cell elasticity with altered cytoskeletal architectures across multiple cell types. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 61, 197-207 (2016).
  39. Park, S., Koch, D., Cardenas, R., Kas, J., Shih, C. K. Cell motility and local viscoelasticity of fibroblasts. Biophysical Journal. 89 (6), 4330-4342 (2005).
  40. Ribeiro, A. S., Khanna, P., Sukumar, A., Dong, C., Dahl, K. Nuclear Stiffening Inhibits Migration of Invasive Melanoma Cells. Cellular and Molecular Bioengineering. 7 (4), 1-8 (2014).
  41. Buda, A., Pignatelli, M. Cytoskeletal network in colon cancer: from genes to clinical application. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 36 (5), 759-765 (2004).
  42. Lindberg, U., Karlsson, R., Lassing, I., Schutt, C. E., Höglund, A. S. The microfilament system and malignancy. Seminars in Cancer Biology. 18 (1), 2-11 (2008).
  43. Altemeier, W. A., Sinclair, S. E. Hyperoxia in the intensive care unit: why more is not always better. Current Opinion in Critical Care. 13 (1), 73-78 (2007).
  44. Roan, E., Waters, C. M., Teng, B., Ghosh, M., Schwingshackl, A. The 2-pore domain potassium channel TREK-1 regulates stretch-induced detachment of alveolar epithelial cells. PLoS One. 9 (2), 89429 (2014).
  45. Roan, E., et al. Hyperoxia alters the mechanical properties of alveolar epithelial cells. American Journal of Physiology. 302 (12), 1235-1241 (2012).
  46. Wilhelm, K. R., Roan, E., Ghosh, M. C., Parthasarathi, K., Waters, C. M. Hyperoxia increases the elastic modulus of alveolar epithelial cells through Rho kinase. The FEBS Journal. 281 (3), 957-969 (2013).
  47. Roan, E., Wilhelm, K. R., Waters, C. M. Kymographic Imaging of the Elastic Modulus of Epithelial Cells during the Onset of Migration. Biophysical Journal. 109 (10), 2051-2057 (2015).
  48. Wagh, A. A., et al. Localized elasticity measured in epithelial cells migrating at a wound edge using atomic force microscopy. American Journal of Physiology. 295 (1), 54-60 (2008).
  49. Liu, S., Wang, Y. Application of AFM in microbiology: a review. Scanning. 32 (2), 61-73 (2010).
  50. Hayhurst, E. J., Kailas, L., Hobbs, J. K., Foster, S. J. Cell wall peptidoglycan architecture in Bacillus subtilis. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 105 (38), 14603-14608 (2008).
  51. Dover, R. S., Bitler, A., Shimoni, E., Trieu-Cuot, P., Shai, Y. Multiparametric AFM reveals turgor-responsive net-like peptidoglycan architecture in live streptococci. Nature Communications. 6 (1), 1-10 (2015).
  52. Gillis, A., Dupres, V., Delestrait, G., Mahillon, J., Dufrêne, Y. F. Nanoscale imaging of Bacillus thuringiensis flagella using atomic force microscopy. Nanoscale. 4 (5), 1585-1591 (2012).
  53. Laurent, V. M., et al. Gradient of rigidity in the lamellipodia of migrating cells revealed by atomic force microscopy. Biophysical Journal. 89 (1), 667-675 (2005).
  54. Collart-Dutilleul, P. Y., et al. Initial stem cell adhesion on porous silicon surface: molecular architecture of actin cytoskeleton and filopodial growth. Nanoscale Research Letters. 9 (1), 564 (2014).
  55. Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
  56. Ilie, M. A., et al. Current and future applications of confocal laser scanning microscopy imaging in skin oncology. Oncology Letters. 17 (5), 4102-4111 (2019).
  57. Jonkman, J., Brown, C. M. Any way you slice it-a comparison of confocal microscopy techniques. Journal of Biomolecular Techniques. 26 (2), 54 (2015).
  58. Minsky, M. Memoir on inventing the confocal scanning microscope. Scanning. 10 (4), 128-138 (1988).
  59. Paddock, S. Over the rainbow: 25 years of confocal imaging. Biotechniques. 44 (5), 643-648 (2008).
  60. Amos, W., White, J. How the confocal laser scanning microscope entered biological research. Biology of the Cell. 95 (6), 335-342 (2003).
  61. Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. Spinning-disk confocal microscopy: present technology and future trends. Methods in Cell Biology. 123, 153-175 (2014).
  62. Wolleschensky, R., Zimmermann, B., Kempe, M. High-speed confocal fluorescence imaging with a novel line scanning microscope. Journal of Biomedical Optics. 11 (6), 064011 (2006).
  63. Brakenhoff, G., Van der Voort, H., Van Spronsen, E., Nanninga, N. Three-dimensional imaging in fluorescence by confocal scanning microscopy. Journal of Microscopy. 153 (2), 151-159 (1989).
  64. Jerome, W. G., Price, R. L. Basic Confocal Microscopy. , Springer. (2018).
  65. Webb, R. H. Confocal optical microscopy. Reports on Progress in Physics. 59 (3), 427 (1996).
  66. Pawley, J. Handbook of biological confocal microscopy. , Springer. 236 (2010).
  67. Webb, D. J., Brown, C. M. Epi-fluorescence microscopy. Cell Imaging Techniques. , 29-59 (2012).
  68. Day, R. N., Davidson, M. W., Press, C. The fluorescent protein revolution. , Elseiver. (2014).
  69. Fine, A., Amos, W., Durbin, R., McNaughton, P. Confocal microscopy: applications in neurobiology. Trends in Neurosciences. 11 (8), 346-351 (1988).
  70. Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
  71. Pan, Y. A., Livet, J., Sanes, J. R., Lichtman, J. W., Schier, A. F. Multicolor Brainbow imaging in zebrafish. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (1), 5546 (2011).
  72. Fu, X., et al. Brain Region Specific Single-Molecule Fluorescence Imaging. Anals in Chemistry. 91 (15), 10125-10131 (2019).
  73. Snell, A. A., et al. Cell-Derived Vesicles for in Vitro and in Vivo Targeted Therapeutic Delivery. ACS Omega. 4 (7), 12657-12664 (2019).
  74. Edgar, R. J., et al. Discovery of glycerol phosphate modification on streptococcal rhamnose polysaccharides. Nature Chemical Biology. 15 (5), 463-471 (2019).
  75. Kailas, L., et al. Immobilizing live bacteria for AFM imaging of cellular processes. Ultramicroscopy. 109 (7), 775-780 (2009).
  76. Gavara, N. A beginner's guide to atomic force microscopy probing for cell mechanics. Microscopy Research and Technique. 80 (1), 75-84 (2017).
  77. Wilson, T. The role of the pinhole in confocal imaging system. Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 167-182 (1995).

Tags

Biyomühendislik Sayı 162 konfokal mikroskopi atomik kuvvet mikroskobu AFM conpokal bakteri hücre biyolojisi biyomalzemeler canlı hücre görüntüleme mekanobiyoloji
Canlı Hücrelerde Eşzamanlı Lazer Tarama Konfokal ve Atomik Kuvvet Mikroskobu (Conpokal) Yakınında
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sandin, J. N., Aryal, S. P., Wilkop, … More

Sandin, J. N., Aryal, S. P., Wilkop, T., Richards, C. I., Grady, M. E. Near Simultaneous Laser Scanning Confocal and Atomic Force Microscopy (Conpokal) on Live Cells. J. Vis. Exp. (162), e61433, doi:10.3791/61433 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter