Denne protokollen er en effektiv, kostnadseffektiv og robust metode for å isolere primærmikroglia fra levende, voksent, menneskelig hjernevev. Isolert primær human mikroglia kan tjene som et verktøy for å studere cellulære prosesser i homeostase og sykdom.
Microglia er bosatt medfødte immunceller i sentralnervesystemet (CNS). Microglia spiller en kritisk rolle under utviklingen, i å opprettholde homeostase, og under infeksjon eller skade. Flere uavhengige forskningsgrupper har fremhevet den sentrale rollen som microglia spiller i autoimmune sykdommer, autoinflammatoriske syndromer og kreft. Aktiveringen av microglia i noen nevrologiske sykdommer kan direkte delta i patogene prosesser. Primær mikroglia er et kraftig verktøy for å forstå immunresponsene i hjernen, cellecelleinteraksjoner og dysregulerte mikrogliafenotyper i sykdom. Primær microglia etterligne in vivo mikrogliale egenskaper bedre enn udødeliggjort mikroglial cellelinjer. Human voksen microglia viser forskjellige egenskaper sammenlignet med humant foster og gnagermikroglia. Denne protokollen gir en effektiv metode for isolering av primær mikroglia fra voksen menneskelig hjerne. Å studere disse mikroglia kan gi kritisk innsikt i cellecelleinteraksjoner mellom microglia og andre fastboende cellulære populasjoner i CNS, inkludert oligodendrocytter, nevroner og astrocytter. I tillegg kan microglia fra forskjellige menneskelige hjerner dyrkes for karakterisering av unike immunresponser for personlig medisin og et mylder av terapeutiske applikasjoner.
Sentralnervesystemet (CNS) er konstruert av et komplekst nettverk av nevroner og glialceller1. Blant glialcellene fungerer microglia som de medfødte immuncellene i CNS2,3. Microglia er ansvarlig for å opprettholde homeostase i den sunne CNS4. Microglia spiller også en viktig rolle i nevroutvikling, ved beskjæring synapser2. Microglia er sentrale i patofysiologien til flere nevrologiske sykdommer, inkludert, men ikke begrenset til; Alzheimers sykdom5, Parkinsons sykdom6, hjerneslag7, multippel sklerose8, traumatisk hjerneskade9, nevropatisk smerte10, ryggmargsskade11 og hjernesvulster som gliomer12.
Studier relatert til CNS homeostase og sykdommer benytter gnagermikroglia på grunn av en mangel på kostnadseffektive og tidseffektive menneskelige primære mikrogliaiisolasjonsprotokoller13. Rodent microglia ligner primær human mikroglia i uttrykk for gener som Iba-1, PU.1, DAP12 og M-CSF reseptor og har vært effektive i å forstå normal samt syk hjerne13. Interessant, uttrykket av flere immunrelaterte gener som TLR4, MHC II, Siglec-11 og Siglec-3 varierer mellom menneskelig og gnager microglia13. Uttrykket av flere gener varierer også i timelig uttrykk og i nevrodegenerative sykdommer i beggeartene 14,15. Disse signifikante forskjellene gjør menneskelig mikroglia til en viktig modell for å studere mikrogliafunksjon i homeostase og sykdom. Primær menneskelig microglia kan også være et effektivt verktøy for preklinisk screening av potensielle legemiddelkandidater16. De ovennevnte årsakene understreker det økende behovet for kostnadseffektive protokoller for isolering av primær menneskelig mikroglia.
Vi har utviklet en protokoll for isolering av primær menneskelig mikroglia fra voksent menneskelig hjernevev samlet som følge av kirurgisk vindu opprettet for tumorreseksjoner eller andre kirurgiske reseksjoner. Metoden her er betydelig forskjellig fra eksisterende metoder. Vi var i stand til å isolere og kultur microglia etter en transitttid på ca 75 minutter fra vevsamlingsstedet for å starte isolasjonsprotokollen i laboratoriet. Vi har brukt supernatant av L929 fibroblast celler for å fremme veksten av isolertmikroglia. Denne metoden fokuserer spesielt på kultur og utvikling av bare primære microglia. Den resulterende kulturen utarbeidet er ca 80% microglia. Mens andre protokoller gir en beriket kultur av mikroglia ved tetthet gradient sentrifugering, strømningscytometri og magnetiske perler, er protokollen en rask, enkel, robust og kostnadseffektiv måte å kultur primære menneskelige microglia17,18,19,20. Evnen til å utnytte kirurgisk fjernet levende voksen hjernevev i stedet for fast hjernevev fra beviser en ekstra fordel med denne metoden i motsetning til eksisterende prosedyrer18,21.
Microglia sikre homeostase i normal hjerne og spille sentrale roller i patofysiologien til ulike nevrologiske sykdommer4. Microglia er sentrale for nevroutvikling og dannelse av synapser2. Mikrogliale studier har vist seg avgjørende for å forstå utviklingen og utviklingen av ulike nevrologiske sykdommer4. Rodent microglia er den utbredte modellen for primære mikrogliale studier, selv om gnagermikroglia er forskjellig fra primær menneskelig mikro…
The authors have nothing to disclose.
SJs laboratorium ble etablert med institusjonelle tilskudd fra IITJ og er finansiert av tilskudd fra Institutt for bioteknologi (BT/PR12831/MED/30/1489/2015) og Ministry of Electronics and Information Technology Government of India (Nr. 4(16)/2019-ITEA). De menneskelige hjernevevsseksjonene ble hentet fra All India Institute of Medical Sciences (AIIMS) Jodhpur etter institusjonell etikkkomitéklarering. Vi takker Mayank Rathor, B.Tech Student medlem av Design and Arts Society IIT Jodhpur, for videografi støtte.
Antibiotic-Antimycotic solution | Himedia | A002 | |
Calcium chloride | Sigma | 223506 | |
Centrifuge (4 °C) | Sigma | 146532 | |
Centrifuge tubes | Abdos | P10203 | |
CO2 incubator | New Brunswik | Galaxy 170 S | |
D-Glucose | Himedia | GRM077 | |
DMEM medium with glutamine | Himedia | AL007S | |
Fetal bovine serum | Himedia | RM9955 | |
Flacon tube (50 ml) | Thermo Fsiher Scientific | 50CD1058 | |
Fluorescein Ricinus communis agglutinin-1 | Vector | FL-1081 | |
Fluorescent microscope | Leica | DM2000LED | |
Fluoroshield with DAPI | Sigma | F6057 | |
GFAP antibody | GA5 | 3670S | |
Incubator shaker | New Brunswik Scientific | Innova 42 | |
L929 cell line | ATCC | NCTC clone 929 [L cell, L-929, derivative of Strain L] (ATCC CCL-1) | |
Laminar air flow | Thermo Fsiher Scientific | 1386 | |
Magnesium chloride | Himedia | MB040 | |
Monosodium phosphate | Merck | 567545 | |
Nutrient Mixture F-12 Ham Medium | Himedia | Al106S | |
Petri dish | Duran Group | 237554805 | |
Phosphate buffered saline | Himedia | ML023 | |
Potassium chloride | Himedia | MB043 | |
Serological pipette | Labware | LW-SP1010 | |
Sodium bicarbonate | Himedia | MB045 | |
Sucrose | Himedia | MB025 | |
Syringe filter (0.2μ, 25 mm diameter) | Axiva | SFPV25R | |
T-25 tissue culture flasks suitable for adherent cell culture. | Himedia | TCG4-20X10NO | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200-056 |