Summary
Presentamos un método genético modificado-libre (GM-libre) para obtener las células con un fenotipo neuronal de glóbulos periféricos reprogramados. La activación de una vía de señalización vinculada a la nueva proteína humana ligada a GPI revela un método eficiente libre de GM para la obtención de células madre pluripotentes humanas.
Abstract
Muchos trastornos neurológicos humanos son causados por la degeneración de las neuronas y las células gliales en el cerebro. Debido a las limitaciones en las estrategias farmacológicas y otras estrategias terapéuticas, actualmente no hay cura disponible para el cerebro lesionado o enfermo. El reemplazo celular aparece como una estrategia terapéutica prometedora para las condiciones neurodegenerativas. Hasta el día de hoy, las células madre neurales (NSC) se han generado con éxito a partir de tejidos fetales, células embrionarias humanas (CE) o células madre pluripotentes inducidas (iPSC). Un proceso de desdiferenciación se inició por la activación de la nueva glicoproteína humana ligada a GPI, que conduce a la generación de células madre pluripotentes. Estas células madres pluripotentes sangre-derivadas (BD-PSCs) diferencian in vitro en las células con un fenotipo de los nervios según lo mostrado por microscopia del brightfield y de la inmunofluorescencia. El análisis ultraestructural de estas células por medio de microscopía electrónica confirma su estructura primitiva así como neuronal-como morfología y características subcelulares.
Introduction
El desarrollo de métodos básicos y preclínicos de investigación con células madre fomenta la aplicación clínica de terapias basadas en células madre para enfermedades neurológicas. Tal terapia potencial depende críticamente del método para la generación de células neuronales humanas que conducen a la recuperación funcional1.
Las células madre neurales (NSCs) se auto-renuevan y se diferencian en nuevas neuronas a lo largo de la vida en un proceso llamado neurogénesis adulta. Sólo las áreas cerebrales muy restringidas albergan NSCs competentes para generar neuronas recién nacidas en la edad adulta. Tales NSCs pueden dar lugar a las neuronas maduras, que están implicadas en el aprendizaje y la memoria, substituyendo así las neuronas perdidas o dañadas. Desafortunadamente, estos NSCs están presentes en cantidades restringidas y esta neurogénesis limitada disminuye rápidamente durante el desarrollo juvenil2. Por lo tanto, otras fuentes de células neurales deben considerarse en un objetivo de terapia celular.
Las enfermedades neurológicas degenerativas son difíciles de curar usando acercamientos farmacológicos estándar. Las nuevas estrategias terapéuticas para abrazar muchos desordenes neurológicos inmédicos se basan en terapias del reemplazo de la célula del tejido enfermo y dañado. El trasplante de NSC podría reemplazar las células dañadas y proporcionar efectos beneficiosos. Otras fuentes para el reemplazo de células neuronales incluyen las células madre embrionarias humanas (ESC), que se derivan de la masa celular interna de los blastocistos de mamíferos3,así como los iPSCs4,que tienen una amplia capacidad de autorre renovación como los CES y son capaces de diferenciarse en varios linajes celulares. Los NSC también pueden generarse mediante reprogramación directa de fibroblastos humanos evitando el estado pluripotente5.
La terapia de reemplazo celular sigue siendo un problema desafiante. Aunque esc, fetal, o iPS puede ser una fuente para la generación de células neuronales para el tratamiento de muchas enfermedades neurológicas incurables, el reemplazo de células de SCs adultos autólogos de tejidos dañados es una mejor alternativa que elude las preocupaciones inmunológicas, éticas y de seguridad.
La activación de la proteína humana ligada al GPI mediante reticulación de anticuerpos a través de la fosforilación de PLCγ/PI3K/Akt/mTor/PTEN inicia una desdiferenciación de las células progenitoras sanguíneas y la generación de células madre pluripotentes derivadas de la sangre (BD-PSCs)6. Estas células se diferencian in vitro hacia las células neuronales según lo confirmado por medio de brightfield, inmunofluorescencia y análisis de microscopía electrónica de transmisión (TEM).
En este trabajo se describe la generación libre de GM de BD-PSCs y su exitosa re-diferenciación en células con fenotipo neuronal.
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Protocol
Se obtuvieron aprobaciones éticas al realizar los experimentos.
1. Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMNCs)
- Asegúrese de que todos los donantes firmaron el consentimiento informado antes de la extracción de sangre de conformidad con las directrices institucionales.
- Tome 30 mL de sangre de donantes sanos por personal médico capacitado de acuerdo con el protocolo estándar.
- Aísle los PBMNCs por medios de gradiente de densidad. Utilizar 10 mL de medio con 25 mL de sangre 1:1 diluida con solución salina tampón de fosfato (PBS), y centrífuga a 300 x g durante 30 min.
- Aísle la capa de interfase entre el plasma y el medio de gradiente de densidad mediante pipeteo. Lavar las células aisladas con 5 mL de PBS estéril y centrífuga a 300 x g durante 10 min. Repetir dos veces.
- Cuente el número de celdas por métodos estándar utilizando una cámara de conteo.
2. Activación de la glicoproteína GPI-anclada humana por el crosslinking del anticuerpo en la superficie de PBMNCs
- Colocar las 6 x 106 células mononucleares (MNCs) en tubos de 15 mL y realizar la reticulación de anticuerpos incubando las células con anticuerpos específicos de proteínas de membrana ligadas a GPI humanos (30 μg/mL) durante 30 min en PBS con albúmina sérica bovina (BSA) al 1% a 37 °C.
- Reemplace el medio de incubación con el medio modificado de Dulbecco de Iscove complementado con suero bovino fetal al 10% (FBS).
- Cultivar las células en tubos de poliestireno de 15 mL, poner los tubos en una incubadora a 37 °C y 5% de CO2 durante 8-10 días (sin agitar). En D5, agregue 1-2 mL adicionales del medio de Iscove complementado con FBS al 10% a cada tubo de 15 mL.
3. Clasificación de celdas desdiferenciadas recién generadas
- Cuente las células con un contador automatizado de la célula (suspensión de la célula de 18 μL + tinte de la fluorescencia del 2μL) o en un compartimiento de la cuenta.
- Centrífuga cultivada suspensión celular (5-7 x 106) a 300 x g durante 10 min y aspirar el sobrenadante resultante con una pipeta Pasteur estéril.
- Vuelva a suspender el pellet celular en 90 μL de PBS preenfriado pH 7,2, BSA al 0,5% y EDTA de 2 mM.
- Añadir cd45 positivo nano-tamaño magnético perlas (80 μL) a la suspensión de la célula e incubar en el hielo durante 15 min.
- Lave las células agregando 2 mL de tampón de PBS y centrífuga a 300 x g durante 10 min.
- Vuelva a suspender las células en 500 μL de tampón PBS.
- Lave la columna con 500 μL de tampón PBS preenfriado y colócalo en el campo magnético.
- Coloque la suspensión celular en la columna y lávela con 500 μL de tampón PBS (dos veces) y el flujo de centrífuga que contiene células CD45 negativas. Recogerlos en el medio de Iscove complementado con 1% BSA.
- Cuente las celdas de la cámara de recuento.
4. Preparación de platos de cultivo celular para la diferenciación neuronal de células madre recién generadas
- Recubre los vasos de cultivo con poli-L-ornitina y laminina para el crecimiento de las células neuronales.
- Coloque las tapas de vidrio en placas de 4 pocillos y recuérdelo con 1:5 diluida poli-L-ornitina (0,1 mg/mL en ddH2O) en ddH2O. Coloque los cubrebocas en una incubadora de 37 °C durante 1 h. Luego lavar con ddH2O.
- Descongelar lentamente laminina (0.5-2.0 mg /mL) y añadir a la parte superior de las cubiertas. Incubarlo a 37 °C durante 2 h.
- Preparar el medio de inducción neuronal N2 consistente en 49 mL de D-MEM/F12, 500 μL de suplemento de N2, 400 μL de aminoácidos no esenciales (NEAA), solución básica de FGF a 20 ng/mL de concentración final (preparada a partir de 100 μg/mL de solución madre) y heparina a 2 ng/mL de concentración final.
- Eliminar el exceso de laminina por pipeteo y añadir el medio neuronal N2 a los platos de cultivo.
5. Cultivo de células sanguíneas desdiferenciadas neuronales
- Cultivo de células CD45 derivadas de BD en cubiertas de vidrio recubiertas de laminina /ornitina durante 2 días en una incubadora a 37 °C y 5% de CO2 en medio N2 para iniciar una diferenciación neuronal de las células recién generadas por BD.
- Cultivar células más a fondo en medio de diferenciación neuronal consistente en 48 mL de medio neurobasal, 500 μL de L-glutamina, 1 mL de Suplemento B27, 500 μL de ANEAA, 50 μL de factor neurotrófico derivado de glial humano recombinante (GDNF) a 5 μg/250 μL en PBS/0,1% BSA, y 50 μL de factor neurotrófico derivado del cerebro humano recombinante (BDNF) a 5 μg/200 μL en PBS/0,1% BSA y 50 μL de solución de ácido ascórbico 2,9 g/50 mL en PBS. Colocar las placas en una incubadora a 37 °C y al 5% deCO2.
6. Análisis de microscopía de inmunofluorescencia de células neurales derivadas de la sangre
- Cultíe las células como se describió anteriormente durante 16 días y retire los medios.
- Incubar con fijador precalentado consistente en 75 mL de agua estéril, 4 g de paraformacionaldehído. Agregue 10 N NaOH según sea necesario y revuelva hasta que la solución se aclare. A continuación, añadir 10 mL de 10x PBS, 0,5 mL de MgCl2, 2 mL de 0,5 M EGTA, y 4 g de sacarosa. Valorar a pH 7,4 con 6 N HCl, y llevar a 100 mL de agua estéril durante 15 min, según Marchenko et al.7.
- Deseche el fijador y lave las células 3 veces durante 5 min cada vez. Inmediatamente añadir una solución X de Tritón recién hecha al 0,3% y permeabilizar las células durante 5 min. Lavar 3 veces con PBS y añadir una solución de bloqueo hecha por PBS y 5% BSA.
- Bloquee las celdas a temperatura ambiente en una placa basora durante 1 hora.
- Preparar la dilución adecuada de anticuerpos en BSA/PBS al 1% e incubar las células con diluciones de anticuerpos en placa basculante durante 1,5 h a temperatura ambiente. Lave las células 3 veces con PBS durante 5 minutos cada una, incube las células con DAPI y monte las cubiertas con medios de montaje para su visualización en un microscopio.
NOTA: Los anticuerpos etiquetados directamente utilizados en este experimento se enumeran en la Tabla de materiales.
7. Análisis de microscopía electrónica de transmisión de células recién generadas
- Sembra las células para TEM en portaobjetos de cámara de 8 pozos.
- Fijar las células en glutaraldehído al 3,5% durante 1 h a 37 °C, post-fijar en 2% OsO4 durante una hora adicional a temperatura ambiente y manchar en acetato de uranilo al 2% en la oscuridad a 4 °C durante 2 h 30 min.
- Finalmente, enjuague las células en agua destilada, deshidrate en etanol e incruste en resina epoxi durante la noche. Al día siguiente transferir las muestras a un horno de 70 °C durante 72 h para el endurecimiento de la resina.
- Suelte los cultivos celulares incrustados de la diapositiva de la cámara y pegue a los bloques de aralditar.
- Corte las secciones semidelgadas en serie (1,5 μm) con una máquina, monte en portaobjetos de vidrio y filtre ligeramente con azul toluidina al 1%.
- Pegue las secciones semidelgadas seleccionadas a bloques de aralditar y desprenda del portaobjetos de vidrio mediante la congelación repetida (en nitrógeno líquido) y la descongelación.
- Preparar secciones ultratinas (0.06-0.08 μm) con una máquina y contrastar aún más con citrato de plomo.
- Obtenga micrografías utilizando microscopio de barrido electrónico con cámara digital.
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Representative Results
Los resultados proporcionan evidencia de que este nuevo método libre de GM es capaz de revertir las células progenitoras sanguíneas a su estado más primitivo sin actuar directamente sobre el genoma humano.
Hemos demostrado previamente que la reticulación de anticuerpos específicos de proteínas ligadas a GPI se inicia a través de PLCγ/IP3K/Akt/mTOR/PTEN regulación al alza de genes altamente conservados y relevantes para el desarrollo como WNT, NOTCH y C-Kit, iniciando así un proceso de desdiferenciación que conduce al primer paso a la generación de HSCs y un segundo y último a una generación de BD-PSCs6,8.
Las culturas activadas del MNC fueron sujetadas a la clasificación inmunomagnética usando las microperlas CD45. Las células sanguíneas maduras que no se pueden reprogramar con este método (por ejemplo, células CD45 positivas) se retuvieron en la columna, mientras que la fracción negativa que contiene células reprogramadas (células CD45 negativas) se utilizó para la generación de varias células de linaje neuronal.
Primero estudiamos los aspectos morfológicos de las células BD-dedifferentiated periféricas por medio de luz y de TEM. Como se muestra en la Figura 1,la reticulación específica de anticuerpos de glicoproteínas anclados en GPI de las MNCs humanas genera una nueva población de células en constante crecimiento(Figura 1A). Analizamos estas células mediante TEM. Las células BD-dedifferentiated son pequeñas en tamaño y muestran las características de células agranulares inmaduras, con gradualmente menos orgánulos y núcleos grandes con la cromatina condensada, similar a ESCs (Figura 1B). Las culturas no tratadas mostraron una tendencia hacia una desaparición gradual.
Las células negativas BD-CD45 fueron sujetadas a la diferenciación neuronal en dos pasos. Iniciamos la diferenciación hacia linajes neuronales sembrando las células negativas CD45 en las placas de cultivo recubiertas de poli-L-ornitina/laminina durante 2 días en el medio N2 después del cultivo en el medio de diferenciación neuronal. Los cuadros de Brightfield fueron adquiridos en los días 4, 8, 10, 14 y 30 respectivamente sobre comenzar la diferenciación neuronal de células madres BD-generadas.
Tan pronto como 4 días después de comenzar la diferenciación dirigida de las células recién generadas, las primeras células de tipo neuronal con largas estructuras de ramificación podrían ser detectadas. Observamos los cambios morfológicos de D2 a D30 con una estructura más compleja que incluye la ramificación, lo que implica un proceso activo hacia la diferenciación a linajes neuronales a lo largo del período de tiempo de cultivo (Figura 2). Para confirmar las características neuronales de las células re-diferenciadas después de cultivarlas en medio neuronal durante 16 días, las células se fijaron de acuerdo con un protocolo anterior7,y la inmunocitoquímica (ICC) se realizó mediante la detección de anticuerpos a nestina, proteína ácida fibrilosa glial (GFAP), proteína asociada a microtúbulos 2 (MAP2) y beta-tubulina de clase III específica de la neurona (Tuj1).
GFAP es la proteína que constituye una porción de citoesqueleto en astrocitos que representa el principal filamento intermedio de astrocitos maduros. Como se muestra en la Figura 3,el anticuerpo contra GFAP reconoce estas estructuras en las células neuronales recién generadas, confirmando que los BD-PSCs son capaces de re-diferenciación hacia astrocitos humanos9.
MAP2 es una proteína citoesqueleto que se une a los tubuli y estabiliza los microtúbulos. Se expresa dentro de axones, dendritas y cuerpos celulares y esta expresión es específica del tejido y del desarrollo. Los resultados de la microscopía de inmunofluorescencia confirman la expresión de esta proteína en células re-diferenciadas10.
Tuj1 es el marcador celular neuronal típico. Su función es estabilizar el microtubili en el cuerpo celular neuronal y los axones. También está implicado en el transporte axonal11. Las células nuevamente re-diferenciadas confirmaron claramente la expresión de esta proteína en D16 sobre comenzar la diferenciación neuronal bajo condición descrita aquí.
Nestin se caracterizó por primera vez en NSCs y representa una proteína de células madre neuro epiteliales, que pertenece a la proteína de filamento intermedio (IF)12 que distingue las células progenitoras neuronales de las células neuronales más diferenciadas. Estas proteínas IF se expresan principalmente en las células nerviosas donde están implicadas en el crecimiento radial del axón, pero también están presentes en una serie de tejidos adicionales. Nestin como marcador de predominante NSCs se expresa débilmente en las células ya en el camino para distinguir en linajes neuronales específicos como es el caso con las células BD-re-diferenciadas en D16.
Figura 1: Generación de células madre desdiferenciadas (pluripotentes). (A) las células mononucleares Ficoll-aisladas fueron crecidas en el medio de Iscove complementado con el 10% FBS. Las micrografías de células cultivadas activadas fueron tomadas en los días 1, 5 y 10, respectivamente. Los MNCs no activados fueron estudiados como control. Barra de escala: 50 μm. (B) El análisis TEM de células recién generadas a lo largo del tiempo de cultivo muestra que los orgánulos de células maduras (D1) desaparecen gradualmente (D8), lo que lleva a la generación de células completamente desdiferenciadas que se asemejan a ces. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 2:Re-diferenciación neura de BD-PSCs. (a) las células BD-dedifferentiated fueron colocadas en platos revestidos ornitina/laminina de la cultura y cultivadas por 30 días según lo descrito en protocolo. Las micrografías se toman en los días 4, 8, 10, 14 y 30 respectivamente, después de crecer en condiciones de diferenciación neuronal. La mayoría de las células en el cultivo cambiaron su morfología de pequeñas formas esféricas a formas más grandes y alargadas y, en algunos casos, células ramificadas. Barra de escala: 100 μm. (B) Las células BD-dedifferentiated fueron cultivadas por 16 días en medio neuronal, fijadas en el análisis del glutaraldehído y del EM realizado según lo descrito en la sección del protocolo. El cuerpo celular y los procesos de estas células mostraron una mayor complejidad que los de las células indiferenciadas en cuanto a orgánulos y citoesqueleto presentando una alta densidad de cisternas apiladas de retículo endoplásmico rugoso y abundantes haces de filamentos de actina (a, b). A diferencia de las BD-células indiferenciadas, las células que crecen en medios de diferenciación con frecuencia establecen contactos de célula a célula. Algunos de estos contactos especializados implicaron el cuerpo celular (c) mientras que otros implicaron procesos celulares en neurite-como la manera (d). Barras de escala: a) 20 μm; (b-d), 500 nm. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 3: Inmunofenotipado de células neuronales recién generadas. las células BD-dedifferentiated fueron cultivadas según lo descrito en el protocolo por 16 días y el análisis del immunocytochemistry fue realizado usando los anticuerpos al nestin neuronal de los marcadores, a GFAP, a MAP2 y a Tuj1. Se muestran micrografías de campo brillante de células re-diferenciadas acompañadas de imágenes de inmunofluorescencia con DAPI como tinción nuclear, así como tinción con anticuerpos relevantes. Se representan los campos que muestran una población particular que expresa una de las características del marcador neuronal específico para líneas específicas. Barra de escala: 100 μm. El control se presenta en la figura complementaria 1. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura suplementaria 1: Control de células BD-dedifferentiated. las undifferentiatedcells BD-derivadas fueron cultivadas en iscove' el medio modificado de Dulbecco complementado con el 10% FBS por 16 días según lo descrito en protocolo y manchado con el anticuerpo al nestin GFAP, a Tuj1 y a MAP2. DAPI fue utilizado para la coloración nuclear. Barra de escala: 100 μm. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
El método no-GM de reprogramación de células humanas descritas en este trabajo se basa en la activación de membrana a núcleo de la maquinaria de señalización detrás de la glicoproteína de membrana humana ligada a GPI que inicia el proceso de desdiferenciación que conduce a la generación ex vivo y la expansión de pscs autorrenuevas obtenidos de sangre periférica humana no manipulada. Estas células cuando se cultivan en medios apropiados son capaces de re-diferenciación en células pertenecientes a diferentes capas germinales6.
Los datos presentados en este trabajo muestran que las células BD-PSCs generadas libres de GM cuando se cultivan en un medio de diferenciación neuronal adquirieron un fenotipo completamente diferente, con formas alargadas, mayor desarrollo de sus orgánulos y establecieron interacciones más complejas entre las células. Por otra parte, la re-diferenciación usando la condición descrita aquí, implica la diferenciación neuronal hacia varios linajes neuronales.
Para obtener el número óptimo y la mejor calidad de células reprogramadas para su uso en estudios de re-diferenciación, las preparaciones frescas de MNC pudieron ser ventajosas en comparación con las preparaciones congeladas de MNC. El método de clasificación inmunomagnética que separó BD-PSCs de células terminalmente diferenciadas que no pueden ser reprogramadas por este método podría ser incompleto requiriendo que el procedimiento se repita, lo que es muy estresante para las células y resulta en sus muertes prematuras.
El paso crítico dentro del protocolo se refiere al número y la calidad de las MNCs que podrían obtenerse por el método descrito. La modificación de los medios de diferenciación neuronal, así como el tiempo de cultivo, puede mejorar el potencial de diferenciación de BD-PSCs, lo que conduce a la generación de tipos específicos de células neuronales.
Una limitación de este método es la naturaleza no teratógena de estas células reprogramadas, ya que no es posible generar las líneas celulares con este método. Una vez que las células desdiferenciadas han alcanzado la etapa final, la de pluripotencia, se vuelven en su mayoría quietas y una nueva porción de las MNCs debe ser desdiferenciada de nuevo para obtener un mayor número de BD-PSCs.
La reprogramación descrita aquí se basa en la activación de la reticulación de anticuerpos en la superficie de las células progenitoras sanguíneas. Este paradigma proporciona numerosas ventajas potenciales con respecto a la seguridad clínica en comparación con los métodos de GM. El objetivo de lograr células madre autólogas para la generación de tejidos neurales se puede lograr mediante una manipulación mínimamente ex vivo; por lo tanto sugiriendo fuertemente que esta terapia celular podría ser un candidato prometedor para el acercamiento clínico eficiente y seguro en neurología.
La enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer y la isquemia cerebral se encuentran entre las enfermedades con la mayor carga social y económica para la sociedad en Europa y en todo el mundo. Se espera que la carga de trastornos neurodegenerativos aumente con el envejecimiento de la población, convirtiéndose en un importante problema socioeconómico y creando una necesidad desesperada de una respuesta al problema. El actual método abre una nueva avenida para las estrategias terapéuticas no invasores utilizando un procedimiento simple y rentable para generar las poblaciones autólogas convenientes de la célula de vástago que sostienen una esperanza para la curación de enfermedades neurológicas actualmente insuperables.
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Disclosures
La autora correspondiente declara que es titular de una patente relacionada con Novel Human GPI-linked Protein, así como que cofundó y trabaja para ACA CELL Biotech. Los otros autores declaran que no tienen ningún conflicto de intereses.
Acknowledgments
Dedicado a la memoria del Dr. Rainer Saffrich.
Los autores están especialmente agradecidos a José Manuel García-Verdugo y Vicente Herranz-Pérez por realizar experimentos y análisis em en el Laboratorio de Neurobiología Comparada, Instituto Cavanilles de Biodiversidad y Biología Evolutiva, Universidad de Valencia, CIBERNED, Valencia, España, que fue apoyado por la financiación de la investigación de la Beca Prometeo para grupos de investigación de excelencia PROMETEO/2019/075. El resto de este trabajo fue apoyado por ACA CELL Biotech GmbH Heidelberg, Alemania.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Albumin Fraction V | Roth | T8444.4 | |
| Anti-GFAP Cy3 conjugate | Merck Millipore | MAB3402C3 | |
| Anti-MAP2 Alexa Fluor 555 | Merck Millipore | MAB3418A5 | |
| Anti-Nestin Alexa Fluor 488 | Merck Millipore | MAB5326A4 | |
| Anti-Tuj1 Alexa Fluor 488 | BD Pharmingen | 560381 | |
| AO/PI Cell Viability kit | Biozym | 872045 | Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems. |
| Ascorbic acid 2-phosphate sequimagnes | Sigma Aldrich | A8960-5G | |
| B27 Serum free 50x | Fisher Scientific (Gibco) | 11530536 | |
| Basic FGF solution | Fisher Scientific (Gibco) | 10647225 | |
| Biocoll | Merck Millipore | L6115-BC | density gradient media |
| BSA Frac V 7.5% | Gibco | 15260037 | |
| CD45 MicroBeads | Miltenyi | 130-045-801 | nano-sized magnetic beads |
| Cell counting slides Luna | Biozym | 872010 | Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems. |
| Chamber Slides Lab-Tek | Fisher Scientific | 10234121 | |
| D-MEM/F12 | Merck Millipore | FG4815-BC | |
| Durcupan | Sigma Aldrich | 44610 | epoxy resin |
| FBS | Merck Millipore | S0115/1030B | Discontinued. Available under: TMS-013-B |
| GDNF recombinant human | Fisher Scientific (Gibco) | 10679963 | |
| GlutaMax 100x | Gibco | 35050038 | L-glutamine |
| Glutaraldehyde grade | Sigma-Aldrich | G5882-50ML | |
| Heparin sodium cell | Sigma-Aldrich | H3149-50KU | |
| Human BDNF | Fisher Scientific (Gibco) | 11588836 | |
| Iscove (IMDM) | Biochrom | FG0465 | |
| Laminin mouse | Fisher Scientific (Gibco) | 10267092 | |
| Lead citrate | Sigma-Aldrich | 15326-25G | |
| Luna FL Automated Cell Counter | Biozym | 872040 | Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems. |
| MACS Buffer | Miltenyi | 130-091-221 | |
| MEM NEAA 100x | Gibco | 11140035 | |
| MiniMACS Trennsäulen | Miltenyi | 130-042-201 | |
| Morada digital camera | Olympus | ||
| Multiplatte Nunclon 4 wells | Fisher Scientific | 10507591 | |
| N2 Supplement 100x | Fisher Scientific (Gibco) | 11520536 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 10888022 | |
| PBS sterile | Roth | 9143.2 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957-50ML | |
| Super Glue-3 Loctite | Henkel | ||
| TEM FEI Technai G2 Spirit | FEI Europe | ||
| Ultracut UC-6 | Leica | ||
| Uranyl acetate C | EMS | 22400 |
References
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