Summary
हम एक आनुवंशिक रूप से संशोधित मुक्त (जीएम मुक्त) विधि प्रस्तुत करने के लिए एक न्यूरोनल फेनोटाइप के साथ कोशिकाओं को पुनः प्रोग्रामेड परिधीय रक्त कोशिकाओं से प्राप्त करने के लिए । उपन्यास मानव जीपीआई से जुड़े प्रोटीन से जुड़े एक सिग्नलिंग मार्ग की सक्रियता मानव pluripotent स्टेम सेल प्राप्त करने के लिए एक कुशल जीएम मुक्त विधि से पता चलता है ।
Abstract
कई मानव तंत्रिका संबंधी विकार मस्तिष्क में न्यूरॉन्स और ग्लियल कोशिकाओं के पतन के कारण होते हैं। औषधीय और अन्य चिकित्सीय रणनीतियों में सीमाओं के कारण, वर्तमान में घायल या रोगग्रस्त मस्तिष्क के लिए कोई इलाज उपलब्ध नहीं है। सेल रिप्लेसमेंट न्यूरोडीजेनेरेटिव स्थितियों के लिए एक आशाजनक चिकित्सीय रणनीति के रूप में दिखाई देता है। इस दिन के लिए, तंत्रिका स्टेम सेल (एनएससी) सफलतापूर्वक भ्रूण ऊतकों, मानव भ्रूण कोशिकाओं (ES) या प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (आईपीएससी) से उत्पन्न किया गया है । उपन्यास मानव जीपीआई से जुड़े ग्लाइकोप्रोटीन की सक्रियता द्वारा डिफेक्शन की एक प्रक्रिया शुरू की गई थी, जिससे प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल का उत्पादन होता है। ये रक्त-व्युत्पन्न pluripotent स्टेम सेल (बीडी-पीएससी) ब्राइटफील्ड और इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा दिखाए गए तंत्रिका फेनोटाइप के साथ कोशिकाओं में विट्रो में अंतर करते हैं। इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के माध्यम से इन कोशिकाओं का अल्ट्रास्ट्रक्चरल विश्लेषण उनकी आदिम संरचना के साथ-साथ न्यूरोनल जैसी आकृति विज्ञान और उपकोशिक विशेषताओं की पुष्टि करता है।
Introduction
बुनियादी और पूर्व नैदानिक स्टेम सेल अनुसंधान विधियों का विकास न्यूरोलॉजिकल रोगों के लिए स्टेम सेल आधारित उपचारों के नैदानिक आवेदन को प्रोत्साहित करता है। इस तरह की संभावित चिकित्सा गंभीर रूप से मानव तंत्रिका कोशिकाओं के उत्पादन के लिए विधि पर निर्भर करती है जिससे कार्यात्मक वसूली होती है1.
तंत्रिका स्टेम सेल (एनएससी) वयस्क न्यूरोजेनेसिस नामक प्रक्रिया में जीवन भर नए न्यूरॉन्स में आत्म-नवीनीकरण और अंतर करते हैं। केवल बहुत प्रतिबंधित मस्तिष्क क्षेत्रों में वयस्कता में नवजात न्यूरॉन्स उत्पन्न करने के लिए सक्षम एनएससी बंदरगाह। इस तरह के एनएससी परिपक्व न्यूरॉन्स को जन्म दे सकते हैं, जो सीखने और स्मृति में शामिल हैं, इस प्रकार खोए हुए या क्षतिग्रस्त न्यूरॉन्स की जगह लेते हैं। दुर्भाग्य से, ये एनएससी प्रतिबंधित मात्रा में मौजूद हैं और किशोर विकास2के दौरान यह सीमित न्यूरोजेनेसिस तेजी से घटता है। इसलिए, तंत्रिका कोशिकाओं के अन्य स्रोतों पर सेल थेरेपी उद्देश्य में विचार किया जाना चाहिए।
डिजेनेरेटिव न्यूरोलॉजिकल बीमारियों को मानक औषधीय दृष्टिकोणों का उपयोग करके इलाज करना मुश्किल है। कई इम्मीडिकेबल न्यूरोलॉजिकल विकारों को गले लगाने के लिए नई चिकित्सीय रणनीतियां रोगग्रस्त और घायल ऊतकों के सेल प्रतिस्थापन उपचारों पर आधारित हैं। एनएससी प्रत्यारोपण क्षतिग्रस्त कोशिकाओं की जगह ले सकता है और लाभकारी प्रभाव प्रदान कर सकता है । तंत्रिका कोशिका प्रतिस्थापन के लिए अन्य स्रोतों में मानव भ्रूणस्टेम कोशिकाएं (ईएससी) शामिल हैं, जो स्तनधारी ब्लास्टोसिस्ट3के भीतरी सेल द्रव्यमान के साथ-साथ आईपीएससी4से प्राप्त होती हैं, जिनके पास ईएसएसी जैसी व्यापक आत्म-नवीकरण क्षमता होती है और विभिन्न सेल वंशों में अंतर करने में सक्षम होते हैं। एनएससी को मानव फाइब्रोब्लास्ट से सीधे रीप्रोग्रामिंग द्वारा भी उत्पन्न किया जा सकता है, जो pluripotent राज्य5से बचते हैं ।
सेल रिप्लेसमेंट थेरेपी अभी भी एक चुनौतीपूर्ण मुद्दा है। हालांकि ईएससी, भ्रूण, या आईपीएस कई असाध्य तंत्रिका संबंधी रोगों के इलाज के लिए न्यूरोनल कोशिकाओं की पीढ़ी के लिए एक स्रोत हो सकता है, क्षतिग्रस्त ऊतकों के ऑटोलॉगस वयस्क एससी सेल प्रतिस्थापन एक बेहतर विकल्प है जो प्रतिरक्षा, नैतिक और सुरक्षा चिंताओं को दरकिनार करता है।
PLCγ/PI3K/Akt/mTor/PTEN के फॉस्फोरिलेशन के माध्यम से एंटीबॉडी-क्रॉसलिंकिंग द्वारा मानव जीपीआई से जुड़े प्रोटीन की सक्रियता रक्त जनक कोशिकाओं और रक्त व्युत्पन्न pluripotent स्टेम सेल (बीडी-PSCs)6की पीढ़ी के एक अलग शुरू करती है । ये कोशिकाएं ब्राइटफील्ड, इम्यूनोफ्लोरेसेंस और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (TEM) विश्लेषण के माध्यम से पुष्टि के रूप में न्यूरोनल कोशिकाओं की ओर विट्रो में अंतर करती हैं।
इस काम में हम बीडी-पीएससी की जीएम-मुक्त पीढ़ी और न्यूरोनल फेनोटाइप के साथ कोशिकाओं में उनके सफल पुनर्भेदन का वर्णन करते हैं।
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Protocol
प्रयोग करते समय नैतिकता अनुमोदन प्राप्त किए गए थे ।
1. मानव परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं का अलगाव (पीबीएमएनसी)
- सुनिश्चित करें कि सभी दानदाताओं ने संस्थागत दिशा-निर्देशों के अनुपालन में रक्त वापस लेने से पहले सूचित सहमति पर हस्ताक्षर किए ।
- मानक प्रोटोकॉल के अनुसार प्रशिक्षित चिकित्सा कर्मियों द्वारा स्वस्थ रक्तदाताओं से 30 एमएल रक्त लें।
- घनत्व ढाल मीडिया द्वारा पीबीएमएनसी को अलग करें। 1:1 रक्त के 25 एमएल के साथ मीडिया के 10 एमएल का उपयोग करें फॉस्फेट बफर नमकीन (पीबीएस) के साथ पतला, और 30 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र।
- प्लाज्मा और घनत्व ढाल मीडिया के बीच इंटरफेज परत को पिपटिंग करके अलग करें। अलग कोशिकाओं को बाँझ पीबीएस के 5 एमएल और अपकेंद्रित्र के साथ 10 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर धोएं। दो बार दोहराएं।
- गिनती कक्ष का उपयोग करके मानक तरीकों से कोशिकाओं की संख्या गिनें।
2. पीबीएमएनसी की सतह पर एंटीबॉडी क्रॉसलिंकिंग द्वारा मानव जीपीआई-एंकर ग्लाइकोप्रोटीन की सक्रियता
- 15 एमएल ट्यूब में 6 x10 6 मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (बहुराष्ट्रीय कंपनियों) को रखें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 1% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) के साथ पीबीएस में 30 मिनट के लिए मानव जीपीआई से जुड़ी झिल्ली प्रोटीन-विशिष्ट एंटीबॉडी (30 माइक्रोग्राम/एमएल) के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेटिंग करके एंटीबॉडी क्रॉसलिंकिंग करें।
- इनक्यूबेशन माध्यम को इस्कोव के संशोधित डल्बेको के माध्यम से प्रतिस्थापित किया गया है जो 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) के साथ पूरक है।
- 15 एमएल पॉलीस्टीरिन ट्यूब में कोशिकाओं को बढ़ाएं, ट्यूबों को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में रखें और 8-10 दिनों (बिना हिलाए) 5% सीओ2। डी 5 पर, प्रत्येक 15 एमएल ट्यूब में 10% एफबीएस के साथ इस्कोव के माध्यम पूरक का अतिरिक्त 1-2 एमएल जोड़ें।
3. नए उत्पन्न डिफरेंट कोशिकाओं की छंटाई
- एक स्वचालित सेल काउंटर (18 माइक्रोन सेल निलंबन + 2 μL फ्लोरेसेंस डाई) या एक गिनती कक्ष में के साथ कोशिकाओं की गणना करें।
- 10 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर सेंट्रलाइज्ड सेल सस्पेंशन (5-7 x 106)और एक बाँझ पाश्चर पिपेट के साथ परिणामी सुपरनाट को एस्पिरेट करें।
- प्री-कूल्ड पीबीएस पीएच 7.2, 0.5% बीएसए और 2 एमएम ईडीटीए के 90 माइक्रोन में सेल पेलेट को फिर से निलंबित करें।
- कोशिका निलंबन और 15 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करने के लिए CD45 सकारात्मक नैनो आकार चुंबकीय मोती (८० μL) जोड़ें ।
- 10 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर पीबीएस बफर और अपकेंद्रित्र के 2 एमएल जोड़कर कोशिकाओं को धोएं।
- पीबीएस बफर के 500 माइक्रोल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
- कॉलम को प्री-कूल्ड पीबीएस बफर के 500 माइक्रोन से धोएं और इसे मैग्नेटिक फील्ड में रखें।
- सेल सस्पेंशन को कॉलम पर रखें और इसे पीबीएस बफर (दो बार) के 500 माइक्रोन और सीडी 45 नकारात्मक कोशिकाओं वाले सेंट्रलाइज फ्लो से धोएं। उन्हें 1% बीएसए के साथ इस्कोव के माध्यम पूरक में ले लीजिए।
- मतगणना कक्ष में कक्षों की गणना करें।
4. नए उत्पन्न स्टेम कोशिकाओं के न्यूरोनल भेदभाव के लिए सेल संस्कृति व्यंजन तैयार करना
- बढ़ते न्यूरोनल कोशिकाओं के लिए पॉली-एल-ऑर्निथिन और लेमिनिन के साथ संस्कृति जहाजों को कोट करें।
- ग्लास कवरस्लिप को 4-वेल प्लेट्स में रखें और इसे 1:5 पतला पॉली-एल-ऑर्निथिन (डीडीएच2ओमें ०.१ मिलीग्राम/एमएल) के साथ कोट करें । कवरस्लिप को 1 घंटे के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें । फिर डीडीएच2ओ से धोएं।
- धीरे-धीरे लैमिनिन (0.5-2.0 मिलीग्राम/एमएल) पिघलाएं और कवरस्लिप के शीर्ष में जोड़ें। इसे 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
- डी-एमईएम/एफ 12 के 49 एमएल, एन2 सप्लीमेंट के 500 माइक्रोन, गैर-जरूरी अमीनो एसिड (एनईएए) के 400 माइक्रोन, 20 एनजी/एमएल फाइनल कंसंट्रेशन (100 μg/mL स्टॉक समाधान से तैयार) पर बेसिक एफजीएफ सॉल्यूशन शामिल होकर न्यूरल इंडक्शन मीडियम एन2 तैयार करें और 2 ng/ml अंतिम एकाग्रता पर हेपरिन।
- पिपिंग द्वारा अतिरिक्त लेमिनिन निकालें और संस्कृति व्यंजनों में न्यूरोनल मध्यम N2 जोड़ें।
5. न्यूरोनल डिफरेंटेटेड रक्त कोशिकाओं की संस्कृति
- संस्कृति बीडी-व्युत्पन्न सीडी 45 नकारात्मक कोशिकाओं पर लेमिनिन/ऑर्निथाइन-लेपित ग्लास कवरलिप 2 दिनों के लिए एक इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस और N2 माध्यम में 5% सीओ2 नए बीडी जनित कोशिकाओं के एक न्यूरोनल भेदभाव शुरू करने के लिए ।
- न्यूरोबेसल विभेदन माध्यम में संस्कृति कोशिकाएं आगे न्यूरोबेसल माध्यम के 48 एमएल, एल-ग्लूटामाइन के 500 माइक्रोन, बी 27 पूरक की 1 मिलील, एनईएए के 500 माइक्रोन शामिल हैं, 50 माइक्रोनिनेंट मानव ग्लियल-व्युत्पन्न न्यूरोट्रोफिक फैक्टर (जीडीएनएफ) पीबीएस/0.1% बीएसए में 5 μg/250 μL पर, और 50 माइक्रोन्डिनेंट मानव मस्तिष्क ने पीबीएस/0.1% बीएसए में 5 माइक्रोग्राम/200 माइक्रोन में न्यूरोट्रोफिक फैक्टर (बीडीएनएफ) और पीबीएस में एस्कॉर्बिक एसिड समाधान 2.9 ग्राम/50 एमएल का 50 माइक्रोन प्राप्त किया। प्लेटों को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर इनक्यूबेटर में रखें।
6. रक्त व्युत्पन्न तंत्रिका कोशिकाओं का इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी विश्लेषण
- संस्कृति कोशिकाओं के रूप में 16 दिनों के लिए ऊपर वर्णित है और मीडिया को दूर ।
- पूर्व-गर्म फिक्सेटिव के साथ इनक्यूबेट जिसमें बाँझ पानी का 75 एमएल, 4 ग्राम पैराफॉर्मल्डिहाइड शामिल है। आवश्यकतानुसार 10 एन नाओएच जोड़ें और समाधान साफ होने तक हिलाएं। इसके बाद 10x पीबीएस का 10 एमएल, एमजीसीएल2 का 0.5 एमएल, 0.5 एम ईजीटीए का 2 एमएल और 4 ग्राम सुक्रोज डालें। 6 एन एचसीएल के साथ पीएच 7.4 के लिए टाइट्रेट, और मार्चेंको एट अल7के अनुसार, 15 मिनट के लिए बाँझ पानी के 100 एमएल लाने के लिए।
- फिक्सेटिव को छोड़ दें और कोशिकाओं को हर बार 5 मिनट के लिए 3 बार धोएं। तुरंत एक हौसले से बनाया 0.3% ट्राइटन एक्स-समाधान जोड़ें और 5 मिनट के लिए कोशिकाओं को पार करें। पीबीएस के साथ 3 बार धोएं और पीबीएस और 5% बीएसए द्वारा किए गए एक ब्लॉकिंग समाधान जोड़ें।
- 1 घंटे के लिए एक घुमाव प्लेट पर कमरे के तापमान पर कोशिकाओं को ब्लॉक करें।
- 1% बीएसए/पीबीएस में एंटीबॉडी के उचित कमजोर पड़ने को तैयार करें और कमरे के तापमान पर 1.5 घंटे के लिए रॉकर प्लेट पर एंटीबॉडी कमजोर पड़ने के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। कोशिकाओं को 5 मिनट प्रत्येक के लिए पीबीएस के साथ 3 बार धोएं, कोशिकाओं को DAPI के साथ इनक्यूबेट करें और माइक्रोस्कोप पर दृश्य के लिए बढ़ते मीडिया के साथ कवरस्लिप को माउंट करें।
नोट: सीधे इस प्रयोग में इस्तेमाल एंटीबॉडी लेबल सामग्री की तालिकामें सूचीबद्ध हैं ।
7. नई उत्पन्न कोशिकाओं का ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी विश्लेषण
- 8-अच्छी तरह से कक्ष स्लाइड में TEM के लिए कोशिकाओं बीज ।
- 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए 3.5% ग्लूटारल्डिहाइड में कोशिकाओं को ठीक करें, कमरे के तापमान पर एक अतिरिक्त घंटे के लिए 2% ओसो4 में पोस्ट-फिक्स और अंधेरे में 2% यूरिल एसीटेट में दाग 2 डिग्री सेल्सियस के लिए 2 घंटे 30 मिनट के लिए।
- अंत में, आसुत पानी में कोशिकाओं को कुल्ला, इथेनॉल में निर्जलित और epoxy राल में रातोंरात एंबेड। अगले दिन नमूनों को राल सख्त के लिए 72 घंटे के लिए 70 डिग्री सेल्सियस ओवन में स्थानांतरित करें।
- चैंबर स्लाइड और गोंद से अराल्डाइट ब्लॉक के लिए एम्बेडेड सेल संस्कृतियों को अलग करें।
- एक मशीन के साथ धारावाहिक अर्द्ध पतली वर्गों (1.5 μm) में कटौती, कांच स्लाइड पर माउंट और हल्के से 1% toluidine नीले रंग के साथ दाग।
- गोंद का चयन अर्ध-पतली वर्गों को अराल्डाइट ब्लॉक में किया जाता है और उन्हें बार-बार ठंड (तरल नाइट्रोजन में) और विगलन द्वारा ग्लास स्लाइड से अलग कर देता है।
- एक मशीन के साथ अल्ट्राथिन सेक्शन (0.06-0.08 माइक्रोन) तैयार करें और लीड साइट्रेट के साथ आगे विपरीत।
- डिजिटल कैमरे के साथ इलेक्ट्रॉन स्कैनिंग माइक्रोस्कोप का उपयोग करके माइक्रोग्राफ प्राप्त करें।
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Representative Results
परिणाम इस बात का सबूत प्रदान करते हैं कि यह उपन्यास जीएम-मुक्त विधि मानव जीनोम पर सीधे अभिनय किए बिना रक्त जनक कोशिकाओं को उनके सबसे आदिम राज्य में वापस करने में सक्षम है।
हमने पहले दिखाया है कि जीपीआई से जुड़े प्रोटीन विशिष्ट एंटीबॉडी क्रॉसलिंकिंग PLCγ/IP3K/Akt/mTOR/PTEN upregulation के माध्यम से शुरू करता है अत्यधिक संरक्षित विकासात्मक प्रासंगिक जीन जैसे WNT, पायदान और सी-किट, इस प्रकार dediffentiation की एक प्रक्रिया शुरू है कि HSCs के उत्पादन के लिए पहला कदम है और बीडी-PSCs6,8की एक पीढ़ी के लिए एक दूसरा और अंतिम ।
सक्रिय एमएनसी संस्कृतियों को सीडी 45 माइक्रोमोतियों का उपयोग करके इम्यूनोमैग्नेटिक छंटाई के अधीन किया गया था। परिपक्व रक्त कोशिकाओं जिन्हें इस विधि (जैसे सीडी 45 सकारात्मक कोशिकाओं) के साथ पुनर्प्रोग्राम नहीं किया जा सकता है, कॉलम पर बनाए रखा गया था, जबकि पुनर्प्रोग्राम्ड कोशिकाओं (सीडी 45 नकारात्मक कोशिकाओं) वाले नकारात्मक अंश का उपयोग विभिन्न न्यूरोनल वंश कोशिकाओं के उत्पादन के लिए किया जाता था।
हमने सबसे पहले प्रकाश और TEM के माध्यम से परिधीय बीडी-डिफरेंटीट कोशिकाओं के रूपात्मक पहलुओं का अध्ययन किया। जैसा कि चित्र 1में दिखाया गया है, विशिष्ट जीपीआई-एंकर ग्लाइकोप्रोटीन एंटीबॉडी मानव बहुराष्ट्रीय कंपनियों की क्रॉसलिंकिंग कोशिकाओं की एक स्थिर बढ़ती नईआबादी (चित्रा 1 ए)उत्पन्न करती है। हमने TEM के माध्यम से इन कोशिकाओं का विश्लेषण किया। बीडी-डिफरेंटेड कोशिकाएं आकार में छोटी होती हैं और अपरिपक्व अग्रीय कोशिकाओं की विशेषताओं को दिखाती हैं, जिसमें धीरे-धीरे कम ऑर्गेनेल्स और बड़े नाभिक के साथ गाढ़ा क्रोमेटिन होता है, जो ईएसएक्स(चित्रा 1 बी)के समान होता है। गैर-उपचारित संस्कृतियों ने क्रमिक रूप से गायब होने की ओर रुझान दिखाया।
बीडी-सीडी 45 नकारात्मक कोशिकाओं को दो चरणों में न्यूरोनल भेदभाव के अधीन किया गया था। हमने न्यूरोनल विभेदन माध्यम में संस्कृति के बाद एन2 माध्यम में 2 दिनों के लिए पॉली-एल-ऑर्निथिन/लेमिनिन कोटेड कल्चर प्लेटों पर सीडी 45 नकारात्मक कोशिकाओं को सीडिंग करके न्यूरोनल वंश के प्रति भेदभाव शुरू किया । ब्राइटफील्ड चित्रों को बीडी-जनित स्टेम कोशिकाओं के न्यूरोनल भेदभाव शुरू करने पर क्रमशः 4, 8, 10, 14 और 30 दिनों में अधिग्रहीत किया गया था ।
नई उत्पन्न कोशिकाओं के लक्षित भेदभाव को शुरू करने के 4 दिनों के बाद, लंबी ब्रांचिंग संरचनाओं वाली पहली न्यूरोनल जैसी कोशिकाओं का पता लगाया जा सकता है। हम डी 2 से डी 30 में अधिक जटिल संरचना के साथ रूपात्मक परिवर्तनों का निरीक्षण करते हैं, जिसमें रैमरिफिकेशन सहित अधिक जटिल संरचना होती है, जिसका अर्थ है संस्कृति समय अवधि(चित्रा 2)में न्यूरोनल वंशों के लिए भेदभाव की ओर एक सक्रिय प्रक्रिया। 16 दिनों के लिए न्यूरोनल माध्यम में उन्हें खेती करने के बाद पुनः विभेदित कोशिकाओं की न्यूरोनल विशेषताओं की पुष्टि करने के लिए, कोशिकाओं को पिछले प्रोटोकॉल7के अनुसार तय किया गया था, और इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री (आईसीसी) को एंटीबॉडी डिटेक्शन का उपयोग करके नेस्टिन, ग्लियल फिब्रिलरी अम्लीय प्रोटीन (जीएफएपी), माइक्रोटूबुल से जुड़े प्रोटीन 2 (एमएपी2) और न्यूरॉन-विशिष्ट वर्ग III बीटा-टूबुलिन (टी 1) के लिए किया गया था।
जीएफएपी वह प्रोटीन है जो एस्ट्रोसाइट्स में साइटोस्केलेटन के एक हिस्से का गठन करता है जो परिपक्व एस्ट्रोसाइट्स के प्रिंसिपल इंटरमीडिएट फिलामेंट का प्रतिनिधित्व करता है। जैसा कि चित्र 3में दिखाया गया है, जीएफएपी के लिए एंटीबॉडी नए उत्पन्न न्यूरोनल कोशिकाओं में इन संरचनाओं को पहचानता है, इस बात की पुष्टि करता है कि बीडी-पीएससी मानव एस्ट्रोसाइट्स9के प्रति फिर से भेदभाव करने में सक्षम हैं।
MAP2 एक साइटोस्केलेटन प्रोटीन है जो ट्यूबली को बांधता है और माइक्रोट्यूबुल को स्थिर करता है। यह अक्षों, dendrites और सेल निकायों के भीतर व्यक्त किया जाता है और यह अभिव्यक्ति ऊतक और विकास-विशिष्ट है। इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी परिणाम इस प्रोटीन की अभिव्यक्ति को पुनः विभेदित कोशिकाओं में पुष्टि करते हैं10.
Tuj1 ठेठ न्यूरोनल सेल मार्कर है। इसका कार्य न्यूरोनल सेल बॉडी और एक्सॉन में माइक्रोटुबिली को स्थिर करना है। इसे अक्षांल परिवहन11में भी फंसाया गया है . नई पुनः विभेदित कोशिकाओं ने यहां वर्णित स्थिति के तहत न्यूरोनल भेदभाव शुरू करने पर D16 में इस प्रोटीन की अभिव्यक्ति की स्पष्ट रूप से पुष्टि की।
नेस्टिन को पहली बार एनएससी में विशेषता दी गई थी और यह न्यूरो एपिथेलियल स्टेम सेल प्रोटीन का प्रतिनिधित्व करता है, जो मध्यवर्ती फिलामेंट (आईएफ) प्रोटीन12 विशिष्ठ न्यूरोनल प्रोजेनिटर कोशिकाओं से अधिक विभेदित न्यूरोनल कोशिकाओं से संबंधित है। ये अगर प्रोटीन ज्यादातर तंत्रिका कोशिकाओं में व्यक्त किए जाते हैं जहां वे अक्षतंश के रेडियल विकास में शामिल होते हैं, लेकिन वे कई अतिरिक्त ऊतकों में भी मौजूद होते हैं। मुख्य रूप से एनएससी के मार्कर के रूप में नेस्टिन को विशिष्ट न्यूरोनल वंश में अंतर करने के लिए पहले से ही कोशिकाओं में कमजोर रूप से व्यक्त किया जाता है क्योंकि यह D16 में बीडी-री-विभेदित कोशिकाओं के मामले में है।
चित्रा 1:डिफरेंट (pluripotent) स्टेम सेल की पीढ़ी। (क) इस्कोव के माध्यम में 10% एफबीएस के साथ फिकोल-पृथक मोनोन्यूक्लियर कोशिकाएं उगाई गई थीं । सक्रिय सुसंस्कृत कोशिकाओं के माइक्रोग्राफ क्रमशः 1, 5 और 10 दिनों में लिए गए थे । गैर-सक्रिय बहुराष्ट्रीय कंपनियों को नियंत्रण के रूप में अध्ययन किया गया। स्केल बार: संस्कृति के समय में नव उत्पन्न कोशिकाओं के 50 माइक्रोन (बी) टेम विश्लेषण से पता चलता है कि परिपक्व कोशिकाओं (डी 1) के ऑर्गेनेल्स धीरे-धीरे गायब हो जाते हैं (डी 8), जिससे ईएसएससी जैसी पूरी तरह से डिफरेंट कोशिकाओं का उत्पादन होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2-बीडी-पीएससी का न्यूरो री-विभेदन। (क) बीडी-डिफरेंटेड कोशिकाओं को ऑर्निथाइन/लेमिनिन लेपित संस्कृति व्यंजनों में रखा गया था और प्रोटोकॉल में वर्णित 30 दिनों के लिए सुसंस्कृत किया गया था । न्यूरोनल विभेदन स्थितियों में वृद्धि के बाद क्रमशः 4, 8, 10, 14 और 30 दिनों में माइक्रोग्राफ लिया जाता है। संस्कृति में अधिकांश कोशिकाओं ने अपने आकृति विज्ञान को छोटे गोलाकार आकारों से बड़े, लम्बी आकृतियों और कुछ मामलों में शाखाओं में बंटी कोशिकाओं में बदल दिया। स्केल बार: 100 माइक्रोन (बी) बीडी-डिफरेंटीट कोशिकाओं को न्यूरोनल माध्यम में 16 दिनों के लिए उगाया गया था, जो प्रोटोकॉल अनुभाग में वर्णित ग्लूटारल्डिहाइड और ईएम विश्लेषण में तय किया गया था। इन कोशिकाओं के कोशिका शरीर और प्रक्रियाओं ने ऑर्गेनेल्स और साइटोस्केलेटन के संदर्भ में अविभेदित कोशिका की तुलना में उच्च जटिलता दिखाई, जिसमें किसी न किसी एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम के खड़ी सिस्टर्न और ऐक्टिन फिलामेंट्स (ए, बी)के प्रचुर मात्रा में बंडलों का उच्च घनत्व पेश किया गया । अविभेदित बीडी-कोशिकाओं के विपरीत, भेदभाव मीडिया में बढ़ने वाली कोशिकाएं अक्सर सेल-टू-सेल संपर्कों की स्थापना करती हैं। इनमें से कुछ विशेष संपर्कों में सेलुलर शरीर (ग) शामिल था जबकि अन्य में न्यूराइट-जैसे फैशन (डी) में सेलुलर प्रक्रियाएं शामिल थीं। स्केल बार: (क) 20 माइक्रोन; (बी-डी), 500 एनएम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 3:नए उत्पन्न न्यूरोनल कोशिकाओं का इम्यूनोफेनोटाइपिंग। बीडी-डिफरेंटेड कोशिकाओं को 16 दिनों के लिए प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में सुसंस्कृत किया गया था और इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री विश्लेषण न्यूरोनल मार्कर नेस्टिन, जीएफएपी, MAP2 और Tuj1 के लिए एंटीबॉडी का उपयोग करके किया गया था। दिखाया गया है कि परमाणु धुंधला के रूप में DAPI के साथ इम्यूनोफ्लोरेसेंस चित्रों के साथ-साथ प्रासंगिक एंटीबॉडी के साथ धुंधला करने वाली पुनः विभेदित कोशिकाओं के ब्राइटफील्ड माइक्रोग्राफ हैं। चित्रित क्षेत्र एक विशेष आबादी दिखा रहे हैं जो विशिष्ट लाइनों के लिए विशिष्ट न्यूरोनल मार्कर विशेषता में से एक को व्यक्त करते हैं। स्केल बार: 100 माइक्रोन। नियंत्रण अनुपूरक चित्र 1में प्रस्तुत किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
अनुपूरक चित्रा 1: बीडी-डिफरेंट सेल कंट्रोल। बीडी-व्युत्पन्न अविभेदित सेल को इस्कोव के संशोधित डल्बेको के माध्यम में 16 दिनों के लिए 10% एफबीएस के साथ पूरक किया गया था जैसा कि प्रोटोकॉल में वर्णित है और एंटीबॉडी के साथ नेस्टिन जीएफएपी, तुज1 और MAP2 के लिए दाग है। DAPI परमाणु धुंधला करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। स्केल बार: 100 माइक्रोन करें. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
इस कार्य में वर्णित मानव कोशिकाओं को पुन: प्रोग्राम करने की गैर-जीएम विधि जीपीआई से जुड़ी मानव झिल्ली ग्लाइकोप्रोटीन के पीछे सिग्नलिंग (एस) मशीनरी के नाभिक सक्रियण के लिए झिल्ली पर आधारित है जो अपवर्तन की प्रक्रिया शुरू करती है जिससे पूर्व वीवो पीढ़ी और गैर-हेरफेर मानव परिधीय रक्त से प्राप्त स्वयं-नवीनीकरण पीएससी का विस्तार होता है। ये कोशिकाएं जब उपयुक्त मीडिया में सुसंस्कृत होती हैं तो विभिन्न रोगाणु परतों से संबंधित कोशिकाओं में फिर से भेदभाव करने में सक्षम होती हैं6।
इस कार्य में प्रस्तुत आंकड़ों से पता चलता है कि जीएम-मुक्त उत्पन्न बीडी-पीएससी कोशिकाओं जब एक न्यूरोनल भेदभाव मीडिया में सुसंस्कृत एक पूरी तरह से अलग फेनोटाइप का अधिग्रहण किया, लम्बी आकार के साथ, उनके ऑर्गेनेल्स के उच्च विकास और कोशिकाओं के बीच और अधिक जटिल बातचीत की स्थापना की । इसके अलावा, यहां वर्णित स्थिति का उपयोग करके पुनः भेदभाव, विभिन्न न्यूरोनल वंशों के प्रति न्यूरोनल भेदभाव का तात्पर्य है।
पुनर्प्रभेदन अध्ययनों में उनके उपयोग के लिए इष्टतम संख्या और पुनर्प्रोग्राम्ड कोशिकाओं की सर्वोत्तम गुणवत्ता प्राप्त करने के लिए, जमे हुए एमएनसी तैयारियों की तुलना में ताजा एमएनसी तैयारी लाभप्रद हो सकती है। इम्यूनोमैग्नेटिक छंटाई की विधि है कि मरणासन्न विभेदित कोशिकाओं है कि इस विधि से पुनः प्रोग्राम नहीं किया जा सकता है से बीडी-PSCs अलग अधूरा हो सकता है की आवश्यकता है कि प्रक्रिया दोहराया जा सकता है, जो कोशिकाओं के लिए बहुत तनावपूर्ण है और उनके समय से पहले मौतों में परिणाम है ।
प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम बहुराष्ट्रीय कंपनियों की संख्या और गुणवत्ता से संबंधित है जिसे वर्णित विधि द्वारा प्राप्त किया जा सकता है । तंत्रिका भेदभाव मीडिया के साथ-साथ संस्कृति समय के संशोधन से बीडी-पीएससी की भेदभाव क्षमता में सुधार हो सकता है, जिससे विशिष्ट प्रकार की न्यूरोनल कोशिकाओं का उत्पादन होता है।
इस विधि की एक सीमा इन पुनर्प्रोग्राम्ड कोशिकाओं की गैर-टेराटोजेनिक प्रकृति है क्योंकि इस विधि के साथ कोशिका रेखाओं को उत्पन्न करना संभव नहीं है। एक बार जब डिफरेंट सेल अंतिम चरण में पहुंच जाते हैं, तो वे ज्यादातर शांत हो जाते हैं और बहुराष्ट्रीय कंपनियों के एक नए हिस्से को बीडी-पीएससी की अधिक संख्या प्राप्त करने के लिए फिर से अलग किया जाना चाहिए ।
यहां वर्णित रीप्रोग्रामिंग रक्त जनक कोशिकाओं की सतह पर एंटीबॉडी क्रॉसलिंकिंग एक्टिवेशन पर निर्भर करता है। जीएम विधियों की तुलना में यह प्रतिमान नैदानिक सुरक्षा के संबंध में कई संभावित लाभ प्रदान करता है। तंत्रिका ऊतक (ओं) की पीढ़ी के लिए ऑटोलॉगस स्टेम कोशिकाओं को प्राप्त करने का लक्ष्य न्यूनतम पूर्व वीवो हेरफेर द्वारा प्राप्त किया जा सकता है; इसलिए दृढ़ता से सुझाव है कि इस सेल थेरेपी न्यूरोलॉजी में कुशल और सुरक्षित नैदानिक दृष्टिकोण के लिए एक आशाजनक उंमीदवार हो सकता है ।
पार्किंसंस रोग, अल्जाइमर रोग और सेरेब्रल इस्केमिया यूरोप और दुनिया भर में समाज के लिए सबसे अधिक सामाजिक और आर्थिक बोझ के साथ रोगों में से हैं । उम्र बढ़ने की आबादी के साथ न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों का बोझ बढ़ने, एक महत्वपूर्ण सामाजिक-आर्थिक समस्या बनने और समस्या के जवाब के लिए एक हताश जरूरत पैदा करने की उम्मीद है। प्रस्तुत विधि वर्तमान में असभ्य न्यूरोलॉजिकल रोगों के इलाज के लिए एक आशा रखने वाले उपयुक्त ऑटोलॉगस स्टेम सेल आबादी पैदा करने के लिए एक सरल और लागत प्रभावी प्रक्रिया का उपयोग करके गैर-इनवेसिव चिकित्सीय रणनीतियों के लिए एक नया अवसर खोलती है।
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Disclosures
इसी लेखक की घोषणा की है कि वह एक पेटेंट उपंयास मानव GPI से संबंधित धारक से जुड़े प्रोटीन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से वह सह की स्थापना की और एसीए सेल बायोटेक के लिए काम करता है । अन्य लेखक घोषणा करते हैं कि उनके हितों का कोई टकराव नहीं है ।
Acknowledgments
डॉ रेनर कुसुम की स्मृति को समर्पित।
लेखक विशेष रूप से जोस मैनुअल गार्सिया-वर्डुगो और विसेंट हेरांज-पेरेज के लिए आभारी हैं, जो तुलनात्मक न्यूरोबायोलॉजी की प्रयोगशाला में ईएम प्रयोगों और विश्लेषण, कैवनेल्स इंस्टीट्यूट ऑफ बायोडायलॉजी एंड इवोल्यूशनरी बायोलॉजी, वेलेंसिया विश्वविद्यालय, CIBERNED, वालेंसिया, स्पेन, जो उत्कृष्टता अनुसंधान समूहों PROMETEO/2019/075 के लिए Prometeo अनुदान से अनुसंधान वित्तपोषण द्वारा समर्थित था । इस काम के बाकी एसीए सेल बायोटेक GmbH हीडलबर्ग, जर्मनी द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Albumin Fraction V | Roth | T8444.4 | |
| Anti-GFAP Cy3 conjugate | Merck Millipore | MAB3402C3 | |
| Anti-MAP2 Alexa Fluor 555 | Merck Millipore | MAB3418A5 | |
| Anti-Nestin Alexa Fluor 488 | Merck Millipore | MAB5326A4 | |
| Anti-Tuj1 Alexa Fluor 488 | BD Pharmingen | 560381 | |
| AO/PI Cell Viability kit | Biozym | 872045 | Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems. |
| Ascorbic acid 2-phosphate sequimagnes | Sigma Aldrich | A8960-5G | |
| B27 Serum free 50x | Fisher Scientific (Gibco) | 11530536 | |
| Basic FGF solution | Fisher Scientific (Gibco) | 10647225 | |
| Biocoll | Merck Millipore | L6115-BC | density gradient media |
| BSA Frac V 7.5% | Gibco | 15260037 | |
| CD45 MicroBeads | Miltenyi | 130-045-801 | nano-sized magnetic beads |
| Cell counting slides Luna | Biozym | 872010 | Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems. |
| Chamber Slides Lab-Tek | Fisher Scientific | 10234121 | |
| D-MEM/F12 | Merck Millipore | FG4815-BC | |
| Durcupan | Sigma Aldrich | 44610 | epoxy resin |
| FBS | Merck Millipore | S0115/1030B | Discontinued. Available under: TMS-013-B |
| GDNF recombinant human | Fisher Scientific (Gibco) | 10679963 | |
| GlutaMax 100x | Gibco | 35050038 | L-glutamine |
| Glutaraldehyde grade | Sigma-Aldrich | G5882-50ML | |
| Heparin sodium cell | Sigma-Aldrich | H3149-50KU | |
| Human BDNF | Fisher Scientific (Gibco) | 11588836 | |
| Iscove (IMDM) | Biochrom | FG0465 | |
| Laminin mouse | Fisher Scientific (Gibco) | 10267092 | |
| Lead citrate | Sigma-Aldrich | 15326-25G | |
| Luna FL Automated Cell Counter | Biozym | 872040 | Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems. |
| MACS Buffer | Miltenyi | 130-091-221 | |
| MEM NEAA 100x | Gibco | 11140035 | |
| MiniMACS Trennsäulen | Miltenyi | 130-042-201 | |
| Morada digital camera | Olympus | ||
| Multiplatte Nunclon 4 wells | Fisher Scientific | 10507591 | |
| N2 Supplement 100x | Fisher Scientific (Gibco) | 11520536 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 10888022 | |
| PBS sterile | Roth | 9143.2 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957-50ML | |
| Super Glue-3 Loctite | Henkel | ||
| TEM FEI Technai G2 Spirit | FEI Europe | ||
| Ultracut UC-6 | Leica | ||
| Uranyl acetate C | EMS | 22400 |
References
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